Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Молекулярная гетерогенность госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium в гематологии

На правах рукописи

ООЗДЭЗЬэ 1 г

БРИЛЛИАНТОВА Анна Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ВАНКОМИЦИН-УСТОЙЧИВЫХ ЕМегососсиь faecШт В ГЕМАТОЛОГИИ

14.01.21 гематология и переливание крови 03.01.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

" 4 МА? 2010

003493617

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научные руководители:

кандидат медицинских наук Г.АКпясова

доктор химических наук, профессор В.И.Тишков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е.Н.Паровичникова

доктор биологических наук, профессор П.М.Рубцов

Ведущее научное учреждение:

Федеральное Государственное Учреждение Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.АГерцена

Защита состоится » М С^РТА 2010г. в час. на заседании

диссертационного совета Д 001.042.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан « 40 » ^С^Ь^А N51 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время энтерококки занимают одну из лидирующих позиций среди возбудителей госпитальных инфекций. Особую опасность для пациентов с иммуносупрессией представляют Enterococcus faecium устойчивые к ванкомицину (Сидоренко C.B., 2002). Частота инфекций, вызванных этими микроорганизмами, возрастает в последние годы. Описано шесть фенотипов устойчивости к ванкомицину (VanA, VanB, VanC, VanD, VanE и VanG). Наибольшее клиническое значение отводится фенотипу VanA, который определяется преимущественно у штаммов Enterococcus faecium (Coque Т.М. et al., 1995). Для этого фенотипа характерен высокий уровень резистентности к ванкомицину. Определено, что гены, кодирующие устойчивость у энтерококков с фенотипом VanA, входят в состав транспозона Tní546. Этот транспозон может перемещаться из хромосомной ДНК бактерий в плазмиды, которые передаются от устойчивых к ванкомицину энтерококков к чувствительным штаммам (Weaver К.Е. et al., 2002). Благодаря такому обмену происходит быстрое распространение в стационаре резистентных к ванкомицину штаммов энтерококков. Полагают, что мутации в составе транспозона Тп 1546 влияют на уровень резистентности энтерококков к ванкомицину, а также на способность Tní546 перемещаться из хромосомной ДНК в плазмидную (Park I.J. et al., 2007). До сих пор значение структурных изменений в эволюции генов резистентности энтерококков к ванкомицину окончательно не выяснено.

При распространении энтерококков в стационаре немалое значение имеют и факторы вирулентности, которые могут индуцировать инфекционный процесс у человека. Факторы вирулентности изучены недостаточно. В то же время известно, что некоторые гены, кодирующие факторы вирулентности, объединены в кластер - островок патогенное™, который может передаваться от более вирулентных менее вирулентным штаммам энтерококков (Leavis H. et al., 2004).

В последние годы выявлено, что большинство изолятов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки инфекций, относятся к клональному комплексу штаммов Enterococcus faecium 17 (clonal complex 17 - CC17). Существование клонального комплекса СС17 было доказано при мультилокусном секвенировании (Multilocus Sequence Typing - MLST) фрагментов генов клеточного метаболизма и транспорта ванкомицин-устойчивых энтерококков. Штаммы Enterococcus faecium, входящие в кпональный комплекс СС17, характеризуются особой структурой этих генов и более высокой вирулентностью (Hendrickx А.А. et al., 2007). В связи с этим исследование молекулярной изменчивости транспозонов Тл 1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, выявление генов вирулентности, а также определение принадлежности энтерококков к клональному комплексу госпитальных штаммов СС17 является актуальным и необходимым в изучении ванкомицин-устойчивых штаммов энтерококков, выделенных от больных в отделениях гематологии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярных особенностей ванкомицин-устойчивых штаммов ЕЫегососсиз faecium, выделенных от гематологических больных. В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести генотипирование госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых ЕМегососсиз ¡аесшт, выделенных от больных опухолями системы крови, и определить клональный состав популяции этих микроорганизмов.

2. Исследовать молекулярную структуру транспозонов Тп)54б, кодирующих резистентность энтерококков к ванкомицину, и их эволюцию в процессе циркуляции штаммов в стационаре.

3. Изучить гены вирулентности у ванкомицин-устойчивых штаммов ЕЫегососсиь faecium и провести сравнение с ванкомицин-чувствительными ЕМегососсиэ ¡аеаит.

4. Выявить принадлежность эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых ЕЫегососсиз faec¡um к госпитальной популяции штаммов клональному комплексу СС17.

Научная новизна исследования. Впервые в России проведено исследование по изучению молекулярных особенностей госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых ЕМегососсиз Iаесшт. При исследовании энтерококков методом пульс-электрофореза выявлено преобладание в стационаре двух эпидемических клонов ванкомицин-устойчивых ЕЫегососсиз ¡аесшт, содержащих 74% штаммов.

При изучении молекулярной структуры транспозонов Тп1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, зарегистрировано преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1), содержащих полный набор генов резистентности к ванкомицину. Определены также транспозоны Тп 1546, содержащие структурные изменения (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли при циркуляции штаммов в стационаре. Выявлены такие мутации, как делеция фрагмента гена огП, инсерция (S■Í2Í6V в области 0/11, а также инсерция \S1251 между генами \zanS и уапН транспозона 1п1546. Установлено, что транспозоны одного типа распространяются между генетически неродственными штаммами ЕЫегососсиз Iаесшт.

Исследование генов вирулентности доказало, что у ванкомицин-устойчивых ЕЫегососсиз Iаесшт по сравнению с чувствительными к ванкомицину штаммами достоверно чаще преобладают гены вирулентности евр (92% против 6%) и де1Е (67% против 22%). Частота выявления гена Лу/, напротив, значимо ниже для устойчивых штаммов по сравнению с чувствительными к ванкомицину изолятами (27% против 66%). Показано, что наличие гена вирулентности езр является характерным для эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых ЕМегососсиз faecium и обеспечивает эволюционные преимущества микроорганизмам при распространении в стационаре.

Мультилокусное секвенирование эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых ЕМегососсиз Iаесшт доказало, что в России циркулируют изоляты, которые относятся к популяции штаммов ЕМегососсиз faecium, вызывающих госпитальные вспышки

энтерсжокковых инфекций в разных странах мира - клональному комплексу СС17. Впервые в международный банк данных по эпидемиологии и эволюции энтерококков (MLST enterococci) включены результаты исследований структуры генов резистентности к ванкомицину, генов вирулентности, а также данные мультилокусного секвенирования эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium из России.

Научно-практическая ценность работы. Определено, что эволюционное превосходство при распространении от пациента к пациенту имеют изоляты ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, относящиеся к популяции эпидемических штаммов клональному комплексу СС17, а также обладающие генами вирулентности esp. В этой связи необходимо изолировать больных, которые являются носителями ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium. Принадлежность этих микроорганизмов к эпидемическим штаммам достоверно определяется на основании мультилокусного секвенирования; косвенной характеристикой является присутствие генов вирулентности esp, а также консервативной структуры транспозонов Тп 1546.

Положения, выносимые на защиту.

1. Преобладает клональный механизм распространения госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium в гематологии.

2. Большинство госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium имеет транспозоны Tni546 консервативной структуры без каких-либо мутаций. В процессе циркуляции штаммов в стационаре выявлены структурные изменения транспозонов Tni546.

3. Основным геном вирулентности у штаммов Enterococcus faecium устойчивых к ванкомицину является ген esp, чувствительных к ванкомицину - ген hyl.

4. Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium, выделенные от больных опухолями системы крови, принадлежат к клональному комплексу штаммов СС17, вызывающих вспышки госпитальных инфекций в разных странах мира.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи и 9 тезисов (2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК).

Апробация диссертации. Основные положения работы доложены на 16 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ницца, 2006), 17 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007), Международной гематологической школе "Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования" (Москва, 2008), 18 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008), на 48 Межнаучной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Вашингтон, 2008), Всероссийском декаднике по гематологии (Москва, 2009), 19 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 124 зарубежных литературных источника.

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр (ГНЦ) РАМН в лаборатории клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии (заведующая лабораторией к.м.н. Г.А.Кпясова) при научном сотрудничестве с сотрудниками группы генетической инженерии и белкового дизайна Химического факультета МГУ (руководитель - д.х.н., профессор В.И.Тишков), лаборатории клинической микробиологии Государственного научного центра по антибиотикам (руководитель - д.м.н., профессор С.В.Сидоренко), лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (заведующий лабораторией к.б.н. АБ.Судариков), лаборатории молекулярной биологии Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (ФНКЦ ДГОИ) (заведующая лабораторией к.м.н. В.О. Бобрынина).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Материалы исследования

Проведено исследование 129 клинических штаммов £. faecium устойчивых к ванкомицину. Эти штаммы были выделены от 125 больных опухолями системы крови, находящихся на лечении в ГНЦ РАМН и 4 пациентов ФНКЦ ДГОИ, в период с 2004 по 2007 гг. Штаммы ванкомицин-устойчивых Е. faecium были выделены из следующих локусов: слизистой оболочки прямой кишки (п=107), мочи (п=9), ран (п=4), жидкости бронхоальвеолярного лаважа (п=4), крови (п=2), слизистой оболочки зева (п=2) и цервикального канала (п=1).

Методы исследования

Выделение и идентификация энтерококков. В исследование были включены штаммы Е. faecium устойчивые к ванкомицину. Значения минимальной подавляющей концентрации ванкомицина этих штаммов, согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards - CLSI, 2006), составили 32 мг/л и выше. Для выделения ванкомицин-устойчивых энтерококков клинические образцы инкубировали в трипказо-соевом бульоне (bioMe'rieux, Франция) с добавлением 32 мг/л ванкомицина (Sigma Chemical Co., США) 24 ч. при 35°С. При помутнении бульона высевали содержимое на желче-эскулиновый агар (bioMe'rieux, Франция), содержащий 32 мг/л ванкомицина. При получении результата проводили микроскопию по Граму, для идентификации энтерококков использовали тест-системы BBL Crystal GP (Becton Dickinson, США).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Исследование генотипа резистентности, генов вирулентности, а также изучение структуры транспозонов Тп 1546 ванкомицин-устойчивых

E. faecium проводили методом ПЦР. Для приготовления образцов ДНК штаммы культивировали на колумбийском агаре с добавлением 5% крови (bioMerieux, Франция) при 35°С в течение суток. Выделение ДНК осуществляли при помощи реагента ДНК-экспресс (Литех, Россия). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 1 ед. Taq ДНК полимеразы (Сибэнзим, Россия), 0,1 мМ каждого dNTP (Сибэнзим, Россия), 0,1 мМ каждого праймера (Синтол, Россия), 5 мкл образца ДНК. Реакции ПЦР-амплификации проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия). ПЦР-продуеты разделяли в 1% агарозном геле (Helicon, Россия) с добавлением этидия бромида (BioRad, США) при 200 В в 1хТВЕ буфере (Литех, Россия). Для подтверждения идентификации бактерий проводили амплификацию фрагментов генов, кодирующих фермент Ddl-лигазу (сЫ/е taedum)- Генотипы резистентности определяли амплификацией фрагментов генов устойчивости энтерококков к ванкомицину (vanA, vanB, vanC1 и vanC2/3). Реакции проводили согласно методике Dutka-Malen S. и соавт. (1995). Исследование структуры транспозонов Тп1546, кодирующих устойчивость энтерококков к ванкомицину, проводили посредством амплификации областей транспозона и сравнения результатов с полученными для контрольного штамма Е. faecium ВМ4147 в соответствии с методиками Schouten М.А. и соавт. (2001) и Willems R.L. и соавт. (1999). Для выявления генов вирулентности проводили ПЦР-амплификацию фрагментов генов, кодирующих факторы вирулентности энтерококковый поверхностный протеин (esp), гиалуронидазу (hyl), желатиназу (ge/E), субстанцию агрегации (agg), и цитолизин (су/Л) (Billstrom Н. et al., 2008; Eaton Т. J. et al, 2001).

Пульс-электрофорез (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE). Генотипирование £ faecium проводили с использованием наборов реагентов Genepath Reagent Kits group 1, (BioRad, США) в соответствии с инструкциями производителя. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в 1% агарозе и 1 х электрофорезном буфере (Electrophoresis Running Buffer) в аппарате GenePath (BioRad, США) при температуре буфера 14°С. Сравнение и учет электрофореграмм производился при помощи компьютерного анализа (GelCompar, BioNumerics Applied Maths, США). Был использован метод невзвешенного попарного среднего на основе коэффициента корреляции Пирсона.

Мультилокусное секвенироеание (Multiiocus Sequence Typing - MLST). Была проведена ПЦР-амплификация фрагментов следующих генов: adk (аденилаткиназа), afp (АТФ-синтаза), ddl (D-аланин-О-аланин лигаза), gyd (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), gdh (глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа), ригК (фосфорибозил аминоимидазол карбоксилаза АТФазная субъединица), pstS (переносчик АТФ-связывающей кассеты). Секвенирование проводили в соответствии с методикой Homan W. L. и соавт. (2002). Для этого использовали амплификатор GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, США) с 96-луночным планшетом MicroAmp 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, США). Был использован генетический анализатор 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и готовый набор реагентов для секвенирования ABI

PRISM BigDye Terminator v 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Обработка результатов проводилась при помощи базы данных MLST для Е. faecium (http://www.mlst.net).

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась при использовании программы математической обработки Statistica, версия 5.5. Для оценки достоверности отличий использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при вероятности ошибки pä0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Молекулярное типирование штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium

При молекулярном типировании 129 штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium методом PFGE было выявлено 23 различных типа, соответствующих рестрикционным профилям изолятов (A-W) (рис. 1).

Типы изолятов (PFGE)

•—W, •.....»•>

».....»1

I—

V— S»

•— HS

t—fl

Рис. 1. Рестрикционные профили ванкомицин-устойчивых Е. ¡аес'шт. Л-ДНК маркер (конкатамеры ДНК фага А), справа указаны размеры ДНК фрагментов (кБ).

Генетическое родство всех исследованных штаммов представлено на дендрограмме (рис. 2). Определены клоны бактерий, в состав которых входили два и более генетически идентичных штаммов. Эти клоны были представлены типами А-О. Наибольшее число исследованных штаммов ванкомицин-устойчивых Е. ¡аеаит было отнесено к клонам А и Р, которые содержали 84 (65,1%) и 12 (9,3%) штаммов, соответственно. Клоны А и Р определены эпидемическими. Клон А и клон Я формировали два основных кластера изолятов (рис. 2). Более редкие клоны В, С, Э, Е и О содержали от двух до пяти штаммов Е. ^аеаит, суммарно они включали 17 (13,2%) изолятов. Остальные 16 (12,4%) штаммов были спорадическими и относились к типам (Н-\Л/).

Рестрикционные профили изолятов, относящихся к одному клону, отличались в пределах трех полос. Учитывая эти различия, были выделены 30 субклонов А (А1-А30), восемь - Р (Р1-Р8), пять - С (С1-05); четыре - С (С1-С4) и Е (Е1-Е4), а в клонах В и О по два субклона (В1 и В2: 01 и 02).

IL4», О.Р.О.». S.I,

Рис. 2. Дендрограмма генетического родства 129 штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium. Горизонгальная ось дендрограммы отражает степень сходства штаммов. Прерывистые линии отделяют кластеры штаммов, соответствующие различным типам. В скобках представлены выявленные субклоны Е. faecium.

Нами было определено, что клональный состав популяции ванкомицин-устойчивых Е. faecium изменялся в период с 2004 по 2007 гг. (табл. 1). Первый игтамм Е. faecium, устойчивый к ванкомицину, был выявлен в 2004 г. и относился к эпидемическому кпону А. В 2004 г., наряду с клоном А, был обнаружен штамм, который относился ко второму эпидемическому клону F, и один спорадический изолят J. В 2005 г. одновременно с циркуляцией эпидемических клонов А и F был зарегистрирован новый клон D, а число спорадических штаммов возросло до четырех (L, М, N, О). К 2006 г. выявляли уже пять различных клонов бактерий (A, D, Е, F, G), количество спорадических штаммов при этом составило десять (Н, К, Р, Q, R, S, Т, U, V, W). В 2007 г. число циркулирующих клонов сократилось до трех (А, В, С) и был выявлен лишь один спорадический штамм I.

Типы изолятов (РРСЕ) Число изолятов по годам

2004 2005 2006 2007 всего

А 6 32 43 3 84

В 2 2

С 4 4

й 1 1 2

Е 4 4

Р 1 10 1 12

в 5 5

Спорадические типы (Н-\Л/) 1 4 10 1 16

всего 8 47 64 10 129

Из полученных данных следует, что эпидемические клоны А и Я не только включали наибольшее число штаммов, но и были наиболее стабильными. Период циркуляции клона А составил два с половиной года, а клона Р - один год, в то время как малочисленные клоны (В, С, Э, Е, в) циркулировали в стационаре от восьми дней до восьми месяцев.

Таким образом, в результате молекулярного типирования была зарегистрирована клональность циркулирующих штаммов, определено два эпидемических клона (А и Р), включающих 74% изолятов ванкомицин-устойчивых Е. faecíum. Наряду с циркуляцией эпидемических штаммов, были зарегистрированы спорадические изоляты, а также клоны, содержащие небольшое число молекулярно-родственняых штаммов (В, С, В, Е, в). Результаты проведенных исследований свидетельствует о наличии разных источников ванкомицин-устойчивых Е. faec¡um в стационаре.

Структура транспозонов Тп754б, кодирующих резистентность Е. faecШт к ванкомицину

Наряду с определением клонального родства 129 исследуемых штаммов ванкомицин-устойчивых Е. Iаесшт, нами был проведен анализ структур транспозонов ТпУ54б, кодирующих резистентность к ванкомицину. Все исследованные штаммы были отнесены к четырем различным типам в соответствии со структурными отличиями, выявленными при ПЦР-амплификации фрагментов 9 генов (огП, ог!2, уапЯ, узлв, уапН, уз л Л, \/апХ, уапУ, чап2), входящих в состав Тп 1546. Результаты анализа сравнивали с данными, полученными для контрольного штамма Е. Iаесшт ВМ4147. Структуры транспозонов, даты и частота их выявления представлены на рис. 4.

«»» 68Я390 19120007 Э9Й4М1

2Д-16? 1141-3090 35MJP"* 13 «961-lSi

9J1W0S77

п штаммов

IRt

IZI 2 51

дата выявления

118

(91%)

(1%)

(7%|

Рис. 4. Структура Тп1546 (тип 1), и родственных транспозонов (тип 2 - тип 4). Сверху указаны области, амплифицируемые в данном исследовании, а также размер транспозона Тп1546 (пар оснований - п.о.). Депеции и инсерции (IS), выявленные при анализе, обозначены пунктирными линиями и треугольниками.

При исследовании был выявлен ряд структурных изменений в межгенной области vanS-vanH и в гене orfl транспозона Tni546. На основании выявленных изменений были определены типы транспозонов (тип 1 - тип 4). К типу 1 были отнесены штаммы, с транспозонами, которые были идентичны консервативным транспозонам Тп)546, обнаруженным у контрольного штамма Е. faecium ВМ4147. К этому типу относились 118 (91%) изолятов.

Для транспозонов тип 2 была выявлена инсерция в области между генами vanS и vanH (рис. 4). Инсерция ISf25i между генами vanS и vanH выявляли у штаммов из США, Норвегии и Ирландии, а также Греции и Бразилии (Willems R.J.L. et al., 1999; Camargo I.L. et al., 2004). Транспозон тип 2 имел только один изолят (1%).

У транспозонов тип 3 была выявлена делеция нуклеотидов 42-1141 гена orfl и определена инсерция в межгенной области vanSH. Дополнительный анализ структур транспозонов тип 3 с прямым праймером, специфичным к инсерции IS 1216V, и обратным праймером, специфичным к гену orfi, выявил частичную замену гена orfl инсерцией IS1216V (рис. 4). Замену фрагмента гена orfl инсерцией IS 1216V регистрировали в составе транспозонов Тп 1546 Brown A. R. и соавт. (2001). К типу 3 относилось 9 (7%) исследуемых штаммов.

К типу 4 был отнесен один штамм (1%), у которого была обнаружена делеция в области нуклеотидов 42-3007 гена orfi. У этого штамма также определялась инсерция в области между генами vanS и vanH (рис. 4). Такие делеции в области левого конца Tn i546 (ген orfl) достаточно часто встречаются среди клинических штаммов Е. faecium, выделенных в Европе (Schouten М. А., et al., 2001).

На рис. 5 представлена эволюция транспозонов Тп?546, при этом нумерация транспозонов соответствует очередности их выявления. Первым был выявлен тип 1,

затем тип 2, тип 3 и тип 4. Порядковый номер отражает структурные изменения, возникающие в процессе циркуляции транспозонов. Согласно представленной схеме, изменения в структурах транспозонов происходили поэтапно. После инсерции \S1251 в область между генами уапв и уапН транспозона Тп1546 (тип 1) произошло образование транспозона тип 2. Затем, вероятнее всего, из транспозона тип 2 независимо образовались транспозоны тип 3 и тип 4 за счет делеций фрагмента гена о/И, а также инсерции 1Б1216)/. Поскольку транспозон тип 2 обнаружили лишь у одного исследованного штамма, то можно полагать, что его роль в эволюции кластера генов резистентности к ванкомицину была промежуточной.

Рис. 5. Схема эволюции транспозонов ТП7546.

Следует отметить, что транспозоны тип 1 и тип 3 были определены не только у штаммов одного клона, но и у генетически неродственных изолятов. Транспозон Тп 7546 консервативной структуры (тип 1) изначально выявляли у изолятов, относящихся к основному эпидемическому кпону А. Затем этот транспозон был зарегистрирован у штаммов, принадлежащих к клонам О, Р и в, а также у спорадических изолятов (Э, Т, и). Транспозон тип 3 первично выявляли у спорадического штамма (V), а затем произошло его распространение среди других спорадических (I, №) и клонапьных изолятов (В). Транспозон тип 2 был обнаружен лишь у одного штамма, относящегося к эпидемическому клону Р. Аналогично транспозон тип 4 был выявлен у единичного спорадического штамма (Н). Выявленные закономерности свидетельствуют о передаче транспозонов Тп 1546 между генетически неродственными изолятами Е /аесшт.

Таким образом, в процессе исследования было выявлено преобладание транспозонов 1п1546 консервативной структуры (тип 1) без каких-либо мутаций. Наряду с ними были определены транспозоны других типов (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли в процессе циркуляции ванкомицин-устойчивых Е. Iаесшт в гематологическом стационаре. У этих транспозонов были выявлены делеций и инсерции \S1216V в области гена огП, а также инсерции \S1251 между генами уапЭ и УапН. Транспозоны тип 1 и тип 3

были определены у генетически неродственных штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, что свидетельствует о передаче транспозонов Tn J546 между штаммами.

Результаты исследования генов вирулентности Е. faecium

Вирулентность ванкомицин-устойчивых штаммов Е. faecium. Наряду с изучением структуры транспозонов Тп 1546, кодирующих устойчивость к ванкомицину у энтерококков, были исследованы гены вирулентности у 129 ванкомицин-устойчивых штаммов Е. faecium методом ПЦР. Ген вирулентности esp, который кодирует энтерококковый поверхностный протеин, способствующий адгезии микроорганизмов к различным поверхностям, был выявлен у 92% (п=119) штаммов. Частота обнаружения гена gelE, который кодирует желатиназу - белок, обладающий цитотоксическим действием, составила 67% (п=87). Ген вирулентности hyl, кодирующий гиалуронидазу - фактор, который повышает инвазивную способность микроорганизмов, был обнаружен у 27% (п=35) штаммов. Гены адд и су/А, кодирующие факторы агрегации и лизиса микроорганизмов (субстанцию агрегации и цитолизин), не были выявлены ни у одного ванкомицин-устойчивого штамма Е. faecium. Гены вирулентности esp, gelE и hyl присутствовали в различных комбинациях, только у 9% (п=12) изолятов был определен один ген esp. Обнаружение одновременно двух генов esp и де/Е было у 56% (п=72) штаммов, генов esp и hyl - у 16% (п=20), трех генов вирулентности - esp, hyl и ge/E - у 12% (п=15) исследуемых энтерококков.

Было выявлено, что ген вирулентности esp присутствовал у всех штаммов, входящих в эпидемические клоны А и F. Значимо реже он был зарегистрирован у других клонально-родственных штаммов (76% против 100, р<0,001) и у спорадических изолятов (63% против 100%, р<0,001) (табл. 2). Аналогичные результаты были получены другими исследователями. В работе Vankerckhoven V. и соавт. (2004) ген вирулентности esp был определен в качестве маркера эпидемических клонов £ faecium. В нашем исследовании ген вирулентности gelE также достоверно чаще определялся у эпидемических штаммов по сравнению с другими клонально-родственными изолятами (88% против 18%, р<0,001). Спорадические штаммы ванкомицин-устойчивых Е. faecium не содержали этот ген.

Таблица 2. Частота обнаружения генов вирулентности у штаммов ванкомицин-устойчивых

Е. faecium, принадлежащих к различным клонам, и у спорадических изолятов.

Ген вирулентно сти Частота выявления генов вирулентности у ванкомицин-устойчивых £ faecium п (%) Р

эпидемические клоны А и F число штаммов - 96 другие клоны G, С, Е, В, D число штаммов -17 спорадические штаммы число штаммов -16

esp 96 (100%) 13 (76%) 10 (63%) р<0,001

gelE 84 (88%) 3 (18%) 0 (0%) р<0,001

hyl 23 (24%) 7 (41%) 5 (31%) р>0,7

Ген вирулентности hyl выявляли с одинаковой частотой у изолятов, входящих в эпидемические клоны А и F (24%), в другие клонально-родственные штаммы, (41%) и у спорадических штаммов Е. faecium (31%). В исследовании Rice L. В. и соавт. (2003) ген

hyl был определен как маркер эпидемических штаммов £. faecium. Нами, напротив, было показано, что наличие hyl не является характерным для эпидемических штаммов.

Таким образом, исследование генов вирулентности ванкомицин-устойчивых изолятов Е faecium показало, что эпидемические штаммы клонов А и F представляют собой более вирулентную группу микроорганизмов по сравнению со спорадическими штаммами и изолятами, входящими в другие клоны. Было выявлено, что ген вирулентности esp является маркером эпидемических штаммов Е. faecium и обеспечивает эволюционные преимущества изолятов при распространении от пациента к пациенту. Значение генов вирулентности hyl и gelE в распространении ванкомицин-устойчивых Е. faecium не определено.

Характеристика вирулентности Е. faecium, устойчивых и чувствительных к ванкомицину. Наличие генов вирулентности esp, gelE, hyl, адд и cylA было исследовано у 89 изолятов Е. faecium, чувствительных к ванкомицину. Все штаммы были выделены из крови гематологических больных. Характеристика генов вирулентности у чувствительных и устойчивых к ванкомицину штаммов Е. faecium представлена в табл. 3. Преобладание генов вирулентности esp (92% против 6%, р<0,001) и gelE (67% против 22%, р<0,001) у ванкомицин-устойчивых штаммов Е. faecium, в сравнении со штаммами чувствительными к ванкомицину, доказывает важное значение факторов Esp и Gel в распространении ванкомицин-устойчивых штаммов Е. faecium в стационаре.

Таблица 3. Характеристика вирулентности Е. faecium, устойчивых и чувствительных к ванкомицину.___

Ген вирулентности Гены вирулентности штаммов Е. faecium Р

устойчивых к ванкомицину (п=129) чувствительных к ванкомицину (п=89)

esp 92% 6% р<0,001

gelE 67% 22% р<0,001

hyl 27% 66% р<0,001

Частота обнаружения гена вирулентности Лу/, напротив, была выше у чувствительных к ванкомицину штаммов Е. faecium и составила 66% против 27% для устойчивых изолятов. Возможно, эти отличия были обусловлены тем, что все чувствительные к ванкомицину Е. ¡аесшт были выделены из гемокультур, а среди устойчивых к ванкомицину штаммов преобладали изоляты из кишечника. Известно, что фактор Ну) обеспечивает инвазивные свойства энтерококков и таким образом участвует в развитии инфекционного процесса. Можно полагать, что высокая частота выявления гена /?у/у штаммов, выделенных из крови, является закономерной. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования по изучению генов вирулентности у штаммов энтерококков чувствительных и устойчивых к ванкомицину, которые выделены из гемокультур.

Мультилокусное секвенирование эпидемических штаммов Е. faecium

Для определения принадлежности эпидемических изолятов к клональному комплексу эпидемических штаммов Е. faecium СС17, вызывающих вспышки энтерококковых инфекций в странах Европы, Америки и Азии было проведено исследование методом MLST. Были проанализированы 16 изолятов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, относящихся к наиболее широко распространившимся субклонам (А1, A3, А8, А10, А16, А26, F1, F3). Филогенетическое родство эпидемических штаммов определяли на основании структурного полиморфизма генов, кодирующих белки внутриклеточного метаболизма и клеточного транспорта. Были определены нуклеотидные последовательности фрагментов следующих генов: atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk. В табл. 4 представлены результаты исследования эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium методом MLST. Полученные результаты были обработаны на web-сайте http://www.mlst.net/, который содержит данные MLST международных исследований. Каждой выявленной нуклеотидной последовательности приписывался соответствующий аллельный номер. Номера аллелей, полученные для семи исследуемых генов каждого штамма, формируют аллельные профили. Согласно этими аллельными профилями была определена принадлежность штаммов к трем группам, так называемым сиквенс типам, ST202, ST18 и ST262 (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика 16 эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium,

Номер штамма Дата выделения Субклон (PFGE) Сиквенс топ Аллельный профиль

atpA ddl gdh purK gyd pstS adk

1 04.10.2004 А1 ST202 1 1 1 1 1 7 1

2 11.10.2004 А1 ST202 1 1 1 1 1 7 1

3 21.10.2004 А1 ST202 1 1 1 1 i 7 1

4 27.10.2004 F1 ST202 1 1 1 1 1 7 1

5 10.11.2004 А1 ST202 1 1 1 1 1 7 1

6 31.01.2005 A3 ST202 1 1 1 1 1 7 1

7 28.03.2005 А8 ST202 1 1 1 1 1 7 1

S 23.4.2005 F3 ST202 1 1 1 1 1 7 1

9 17.08.2005 А10 ST18 7 1 1 1 5 1 1

10 12.12.2005 А16 ST18 7 1 1 1 5 1 1

11 26.12.2005 А1 ST202 1 1 1 1 1 7 1

12 18.04.2006 А16 ST18 1 1 1 5 1 1

13 24.04.2006 А8 ST202 1 1 1 1 1 7 1

14 25.04.2006 А10 ST202 1 1 1 1 1 7 1

15 15.05.2006 А26 ST262 7 1 1 1 5 7 1

16 12.07.2006 А26 ST262 7 1 1 1 5 7 1

Примечание. Номера аллелей отражают и ас1к (1 - мутации в составе генов положениях генов).

присутствие мутации не обнаружены, 5,7

в генах atpA, - выявлены

ddl, gdh, purK, gyd, pstS мутации в различных

У 11 из 16 изолятов была выявлена только одна нуклеотидная замена гуанина на аденин в положении 452 гена рв/Э. Оставшиеся пять штаммов содержали мутации в генах а1рА и дуй (табл. 5). В положениях 95 и 128 гена э?рЛ тимин был заменен на цитозин. Замены цитозина и гуанина на тимин были выявлены в положениях 239 и 542 гена а/рА В составе гена дуб тимин был заменен на цитозин в положениях 160 и 331. Гены айк, ddl, дбЬ и ригК оказались наиболее консервативными, мутации в этих генах не были выявлены.

Таблица 5. Замены в нуклеотидных последовательностях генов аф<4, дуг}, ря/Э, выявленные методом МЧ-БТ, у эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. ¡аеаит._

Ген Замены в нуклеотидных последовательностях Номер штамма (табл. 4)

atpA 95 Т-»С 128 Т-»С 239 С-*Т 542 G-»T 8, 10, 12, 15, 16

9yd 160 Т-»С 331 Т->С 8, 10, 12, 15, 16

pstS 452 G-»A 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 16

Все 16 эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, выделенные нами, относились к сиквенс типам ST202, ST18 и ST262 и входили в состав клонального комплекса штаммов Е. faecium СС17, вызывающих госпитальные вспышки инфекций в клинических отделениях разных стран.

Структура популяции Е. faecium СС17 схематически представлена на рис. 6. Схема отражает результаты MLST типирования штаммов Е. faecium, выделенных в Европе, Америке, Австралии, Африке и Азии. Первичным штаммом Е. faecium в популяции СС17 является изолят, для которого характерна консервативная структура исследуемых генов atpA, ddl, gdh, ригК, gyd, pstS и adk. Он относится к сиквенс типу ST17. Этот сиквенс тип занимает центральное положение на схеме (рис. 6) и обозначен большим черным кружком. Другие сиквенс типы, которые представлены на диаграмме серыми и черными кружками, происходят от сиквенс типа ST17 и отличаются от него мутациями в генах atpA, ddl, gdh, ригК, gyd, pstS и adk. Размер каждого кружка отражает частоту встречаемости сиквенс типа в базе данных MLST. При этом сиквенс типы, отличающиеся мутациями лишь в одном гене, соединены между собой линиями. Числа на схеме представляют собой номера сиквенс типов. Выявленные в нашем исследовании сиквенс типы представлены на рис.6 в овалах.

Все сиквенс типы ванкомицин-устойчивых E.faecium (ST202, ST18, ST262), выделенных от больных в двух гематологических центрах в России были определены исследователями в других странах (табл. 6). Среди обнаруженных в нашем исследовании сиквенс типов наиболее распространенным в мире является ST18. Штаммы энтерококков, относящиеся к ST18, были обнаружены в 10 странах Европы, а также в Австралии, Китае и Африке. Эти изоляты были выделены от пациентов, находящихся на лечении в

медицинских учреждениях, однако, наряду с клиническими изолятами, относящимися к типу 5Т18, в Бельгии аналогичный энтерококк был выявлен у животных (свиней). Таким образом, нельзя исключить происхождение госпитальной популяции штаммов ванкомицин-устойчивых Е. Iаеаит из внешнего источника, в частности, от животных. Все штаммы Е. ¡аеаит, которые относились к сиквенс типу 5Т202, были выделены из клинических образцов, в Германии и Италии. Изоляты Е. ¡аеаит, относящиеся к сиквенс типу 8Т262, отличались от изолятов, принадлежащих к типу ЭТ18, лишь мутацией в гене Сиквенс тип вТ262 ранее выявляли только среди госпитальных штаммов Е. ¡аеаит в Нидерландах.

Рис. 6. Структура госпитальной популяции СС17, содержащей 1126 штаммов Е. ¡aecium, в основе которой результаты MLST анализа (http://www.mlst.net/).

Таблица 6. Распространение сиквенс типов ST18, ST202 и ST262 штаммов Е. ¡aecium в странах Европы, Африке и Австралии._

Число зарегистрированных штаммов Е. ¡aecium

Сиквенс тип Германия Нидерланды Испания Италия Великобритания Дания Португалия Бельгия Сербия Франция Китай Африка Австралия

ST18 29 28 14 11 10 2 2 2 1 1 3 2 1

ST262 14

ST202 9 7

Примечание. Данные получены на сайте http://www.mlst.net/.

Можно полагать, что исследованные нами эпидемические штаммы ванкомицин-устойчивых Е. faecium, которые относились к сиквенс типам ST202 и ST18, произошли от первичного изолята Е. faecium, принадлежащего к сиквенс типу ST17, вследствие генетических изменений. Эти изменения происходили по двум независимым направлениям. Вероятно, штаммы сиквенс типа ST202 произошли от изолятов, принадлежащих к сиквенс типу ST17, в результате мутации в гене pstS, а штаммы, относящиеся к типу ST18, вследствие мутаций в двух генах atpA и дуб. Изоляты сиквенс типа ST262, в свою очередь, происходили от штаммов, принадлежащих к типу ST18, в результате мутации в гене psfS. Эволюционные изменения эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium представлены на рис. 7.

Мутация в pstS

Мутация в pstS

Мутация в atpA и gyd

ST202 (1-1-1-1-1-7-1)

ST262 (7-1-1-1-5-7-1)

ST18 (7-1-1-1-5-1-1)

Рис. 7. Эволюционные изменения эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, выделенные от больных опухолями системы крови. Аллельные профили указаны в скобках. Их различия выделены подчеркиванием.

Таким образом, доказана принадлежность исследованных эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, выделенных от больных в гематологических центрах, к клональному комплексу штаммов Е. ¡аес'/ит СС17. Такие штаммы вызывают госпитальные вспышки энтерококковых инфекций в разных странах мира.

выводы

1. Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium в отделениях гематологии представлены в основном (96 из 129 штаммов) двумя клонами.

2. Кодирующие устойчивость к ванкомицину транспозоны Tnf546 с консервативной структурой генов (тип 1) преобладают у госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium; частота выявления составляет 91%.

3. В процессе циркуляции штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium изменяется структура транспозонов Тп1546, обнаружены делеции и инсерции IS 1216V в области гена orfi, а также инсерции ISÎ25Î между генами vanS и VanH.

4. Основной ген ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, кодирующий вирулентность, - ген esp, выявлен у 119 (92%) из 129 изолятов; определены также другие гены - gelE и hyl.

5. Основной ген ванкомицин-чувствительных Enterococcus faecium - ген hyl, выявлен у 59 (66%) из 89 штаммов, обнаружены также гены - esp и gelE.

6. Эпидемические изоляты ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, выделенные от больных опухолями системы крови, принадлежат к госпитальной популяции штаммов, входящих в состав клонального комплекса СС17.

Сокращения, используемые в тексте

ПЦР - полимеразная цепная реакция

п.о. - пар оснований

Кб - тысяча оснований

MLST - multilocus sequence typing, мультипокусное секвенирование

PFGE - pulsed-field electrophoresis, пульс-электорофорез

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Клясова Г.А., Бриллиантова А.Н., Миронова А.В. Генотипирование грамотрицательных бактерий, выделенных из крови при сепсисе у больных с гематологическими заболеваниями. Терапевтический архив, 2007, т.79, N 7, с.74-80.

2. Клясова Г.А., Сперанская Л.Л., Миронова А.В., Масчан М.А., Байдильдина Д.Д., Верещагина С.А, Капорская Т.С., Юрицина Н.Ю., Поспелова Т.И., Крайнова Л.Е., Маркина О.А., Трушина Е Е., Бриллиантова АН., Фролова И.Н. Возбудители сепсиса у иммунокомпрометированных больных: структура и проблемы антибиотикорезистентности (результаты многоцентрового исследования). Гематология и трансфузиология, 2007, N1, с.11-19.

3. Brilliantova А N.. Kliasova G. A., Mironova А. V., Tishkov V. I., Novichkova G. A, Bobrynina V. О., Sidorenko S. V. Spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in two haematological centers in Russia. International Journal of Antimicrobial Agents, 2010, Vol. 35, p.177-181. Опубликовано на сайте журнала 06.10.2009, doi: 10.1016/j. ¡jantimicag.2009.10.006.

4. Brilliantova A, Kliasova G., Mironova A., Novichkova G., Bobrynina V. Spread of epidemic vancomycin-resistant Enterococcus faecium clonal complex 17 in haematological patients in Russia. Clinical Microbiology and Infection, 2009, Vol.14, Supp.4, p.S631, abst. R2141.

5. Brilliantova A., Kliasova G., Mironova A, Sidorenko S., Tishkov V. Molecular Characteristic and Virulence Evaluation of Vancomycin-resistant Enterococcus faecium in Hematological

Patients. 48m Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) 2008, Washington DC, abstr. C-2 1999.

6. Brilliantova A., Mironova A, Kliasova G., Sidorenko S. Evaluation of virulence and resistance genes structure in vancomycin-resistant E faecium. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S624, abst. P2113.

7. Brilliantova A., Kliasova G., Mironova A., Sidorenko S. Clonal dissemination of Gramnegative bacteria causing bloodstream infections in patients with haematological malignancies. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S176, abst. P722.

8. Kliasova G., Speranskaya L., Trushina E., Mironova A., Ptitcin S., Maschan M., Vereschagina S., Kaporskaya T., Yuritcina N., Pospelova T., Krainova L., Brilliantova A., Markina O. Bacteraemia and fungaemia in haematologic patients. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S174, abst. P717.

9. Mironova A., Brilliantova A., Trushina E., Phrolova I., Speranskaya L. Prevalence of antimicrobial resistance of enterococcus species isolated from blood of patients with haematological malignancies in Russia. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S143, abst. P598.

10. Mironova A., Brilliantova A. Prevalence and epidemiology of vancomycin-resistant enterococci in a Russian haematology center. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S624, abst. P2114.

11. Mironova A., Kliasova G., Brilliantova A. Comparison of antibiotics susceptibility of different vancomycin-resistant Enterococcus faecium clones. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S169, abst. P700.

12. Mironova A., Cherkashin E., Kliasova G., Tishkov V., Brilliantova A., Rezvan S., Sidorenko S. First detection of vancomycin-resistant enterococci in Russia: genetic background. Clinical Microbiology and Infection, 2006, Vol.12, Supp.4, p.S131, abst. P1819.

Актуальность темы.

В настоящее время энтерококки занимают одну из лидирующих позиций среди возбудителей госпитальных инфекций [122, 126]. Особую опасность для пациентов с иммуносупрессией представляют устойчивые к ванкомицину Enterococcus faecium [12, 46, 50, 91, 112, 127, 131]. Частота инфекций, вызванных этими микроорганизмами, возрастает, особенно в последние годы. Описано шесть фенотипов устойчивости к ванкомицину (VanA, VanB, VanC, VanD, VanE и VanG). Наибольшее клиническое значение отводится фенотипу VanA, который определяется преимущественно среди Enterococcus faecium [34, 70, 102]. Для этого фенотипа характерен высокий уровень резистентности к ванкомицину. Определено, что гены, кодирующие устойчивость у энтерококков с фенотипом VanA, входят в состав транспозона Тп154б. Этот транспозон может перемещаться из хромосомной ДНК бактерий в плазмиды, которые передаются от ванкомицин-устойчивых энтерококков к чувствительным штаммам [18]. Благодаря такому обмену происходит быстрое распространение в стационаре резистентных к ванкомицину штаммов энтерококков. Полагают, что мутации транспозона Тп1546 влияют на уровень резистентности энтерококков к ванкомицину, а также на способность Тп1546 транспонироваться из хромосомной ДНК в плазмидную [83, 98]. До сих пор значение структурных изменений в эволюции генов резистентности энтерококков к ванкомицину окончательно не выяснено.

При распространении энтерококков в стационаре немалое значение имеют и факторы вирулентности, которые могут индуцировать инфекционный процесс у человека. Факторы вирулентности изучены недостаточно. В то же время известно, что некоторые гены, кодирующие факторы вирулентности, входят в состав островка патогенности, который может передаваться от более вирулентных менее вирулентным штаммам энтерококков [36, 73, 74, 80].

В последние годы выявлено, что большинство изолятов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки инфекций, относятся к клональному комплексу штаммов Enterococcus faecium 17 (clonal complex 17 - CC17). Существование CC17 было подтверждено методом мультилокусного секвенирования (Multilocus Sequence Typing - MLST) фрагментов генов клеточного метаболизма и транспорта Enterococcus faecium. Штаммы энтерококков, входящие в клональный комплекс CCI7, характеризуются особой структурой и повышенной вирулентностью [59]. В связи с этим исследование молекулярной изменчивости генов резистентности к ванкомицину, выявление генов вирулентности, а также определение принадлежности энтерококков к клональному комплексу госпитальных штаммов CCI7 является актуальным и необходимым в изучении механизмов эволюции энтерококков в стационаре.

Цель исследования.

Изучить молекулярные особенности ванкомицин-устойчивых штаммов Enterococcus faecium, циркулирующих в гематологическом стационаре.

Задачи исследования.

1. Провести геноиширование госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, выделенных от больных опухолями системы крови, и определить клональный состав популяции этих микроорганизмов.

2. Исследовать молекулярную структуру транспозонов Тп1546, кодирующих резистентность энтерококков к ванкомицину, и их эволюцию в процессе циркуляции штаммов в стационаре.

3. Изучить гены вирулентности у ванкомицин-устойчивых штаммов Enterococciis faecium и провести сравнение с ванкомицин-чувствительными Enterococcus faecium.

4. Выявить принадлежность эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium к госпитальной популяции штаммов СС17.

Научная новизна исследования.

Впервые в России проведено исследование по изучению молекулярных особенностей ванкомицин-устойчивых штаммов Enterococcus faecium. При изучении энтерококков методом пульс-электрофореза отмечен клональный характер распространения ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium в стационаре, выявлено преобладание двух эпидемических клонов (А и F), содержащих 74% штаммов.

При изучении молекулярной структуры транспозонов Тп1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, зарегистрировано преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1), содержащих полный набор генов резистентности к ванкомицину. Определены также транспозоны, содержащие структурные изменения (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли при циркуляции штаммов в стационаре. Выявлены такие мутации, как делеция фрагмента гена orfl, инсерция IS1216V в области orfl, а также инсерция IS125I между генами vanS и vanH транспозона Тп1546.

Установлено, что транспозоны одного тала распространяются между генетически неродственными штаммами Enterococcus faecium.

Исследование генов вирулентности доказало, что у ванкомицинустойчивых Enterococcus faecium по сравнению с чувствительными к ванкомицину штаммами достоверно чаще преобладают гены вирулентности esp (91% против 6%) и gelE (67% против 22%). Частота выявления гена hyl, напротив,. значимо ниже для устойчивых штаммов по сравнению с 8 чувствительными к ванкомицину изолятами (27% против 66%). Показано, что наличие гена вирулентности esp является характерным для эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium и обеспечивает эволюционные преимущества микроорганизмам при распространении в стационаре.

Мультилокусное секвенирование эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium доказало, что в России циркулируют штаммы, которые относятся к популяции Enterococcus faecium CCI7, вызывающей госпитальные вспышки энтерококковых инфекций в разных странах мира. Впервые в международный банк данных по эпидемиологии и эволюции энтерококков (MLST enterococci) включены результаты исследований структуры генов резистентности к ванкомицину, генов вирулентности, а также данные мультилокусного секвенирования эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium из России.

Научно-практическая ценность работы.

Проведенное исследование доказало, что распространение ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium в стационаре носит клональный характер. Определено, что эволюционное превосходство при распространении в госпитальной среде имеют изоляты ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, относящиеся к популяции эпидемических штаммов CCI7, а также обладающие генами вирулентности esp. В этой связи необходимо изолировать больных, которые являются носителями этих опасных штаммов. Принадлежность к эпидемическим штаммам может быть достоверно определена на основании мультилокусного секвенирования, косвенным свидетельством может служить присутствие гена вирулентности esp, а также консервативная структура транспозона Тп1546.

Выводы.

1. Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium в отделениях гематологии представлены в основном (96 из 129 штаммов) двумя клонами А и F.

2. Кодирующие устойчивость к ванкомицину транспозоны Тп1546 с консервативной структурой генов (тип 1) преобладают у госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium; частота выявления составляет 91%.

3. В процессе циркуляции штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium изменяется структура транспозонов Тп1546, обнаружены делеции и инсерции 1§1216Уъ области гена orfl, а также инсерции IS1251 между генами vanS и VanH.

4. Основной ген ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, кодирующий вирулентность, - ген esp выявлен у 119 (92%) из 129 изолятов; определены также другие гены - gelE и hyl.

5. Основной ген ванкомицин-чувствительных Enterococcus faecium - ген hyl выявлен у 59 (66%) из 89 штаммов, также обнаружены другие гены - esp и gelE.

6. Эпидемические изоляты ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, выделенные от гематологических пациентов, принадлежат к госпитальной популяции эпидемических штаммов, входящих в состав клонального комплекса CCI7.

Заключение.

За последние два десятилетия у штаммов Е. faeciurn выявлены новые генетические характеристики, к которым относятся гены резистентности к антибиотикам и вирулентности. Нельзя исключить, что эволюционные изменения, происходящие у Е. faecium, ведут к возникновению новой госпитальной линии штаммов с особыми характеристиками. Известно, например, что возбудитель чумы Yersinia pestis произошел от Yersinia pseudotuberculosis приблизительно 1500—20000 лет назад, но в отличие от своего предшественника, обладал дополнительными генами вирулентности [10]. Причины возникновения нового вида Yersinia, который распространился по всему миру, до сих пор не определены. Можно предположить, что эволюция микроорганизма произошла после приобретения определенного набора генов, кодирующих факторы вирулентности. Похожие изменения наблюдаются и в геноме Е. faecium. Международные исследования в области молекулярной эпидемиологии выявили существование популяции штаммов Е. faecium, вызывающих вспышки госпитальных инфекций. Для изолятов, относящихся к этой популяции, была характерна консервативная структура семи генов клеточного метаболизма и транспорта Е. faecium - adk (аденилаткиназы), atpA (АТФ-синтазы), ddl (Б-аланин-О-аланин лигазы), gyd (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы), gdh (глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы), ригК (АТФазной субъединицы фосфорибозил аминоимидазол карбоксилазы) и pstS (переносчика АТФ-связывающей кассеты). Также у этих штаммов присутствовал ген esp, кодирующий фактор вирулентности - энтерококковый поверхностный протеин. Эта госпитальная популяция штаммов Е. faecium представлена клональным комплексом изолятов, который обозначается в базе данных по MLST как СС17. Распространение штаммов, принадлежащих к клональному комплексу СС17, регистрируется в клиниках Европы, США, Австралии, Африки и Азии [27,

28, 54, 76, 87, 99, 115, 123, 132, 135]. При этом крайне мало госпитальных вспышек инфекций вызвано ванкомицин-устойчивыми Е. faecium, которые не принадлежат к СС17 [104, 124]. Также следует отметить, что эволюционные изменения в геноме Е. faecium имеют и региональные особенности, которые определяются локальным наличием циркулирующих генов вирулентности и антибиотикорезистентности.

В России резистентные к ванкомицину энтерококки не выявляли, длительное время [5, 9]. Однако в последние годы регистрируется их распространение в стационаре, зафиксировано выделение этих микроорганизмов из крови. В связи с этим все большую актуальность приобретает изучение механизмов возникновения и эволюции госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых энтерококков.

В настоящем исследовании мы изучили 129 клинических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, которые были выделены от больных опухолями системы крови, находящихся на лечении в двух клинических центрах Москвы. Рестрикционное типирование штаммов методом PFGE выявило их клональное распространение. Были определены два лидирующих клона бактерий А и F, которые включали 96 (74,4%) штаммов. Наряду с этим было определено 5 малочисленных клонов микроорганизмов (каждый клон включал от 2 до 5 штаммов), суммарно в них входили 17 (13,3%) изолятов. Остальные 16 (12,4%) изолятов ванкомицин-устойчивых Е. faecium были спорадическими. Было выявлено, что клональный состав исследуемой популяции штаммов изменялся во времени. Эти результаты согласуются с данными литературы. Так, клональное распространение ванкомицин-устойчивых энтерококков было зарегистрировано в клиниках Европы, Америки и Австралии. При этом в стационарах циркулировали один или несколько клонов бактерий [25, 72, 58, 81, 125].

Наряду с рестрикционным типированием 129 госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Е. /аес'шт, нами был изучен структурный полиморфизм транспозонов Тп1546, кодирующих устойчивость к ванкомицину этих штаммов методом ПЦР. Транспозоны Тп1546 являются мобильными элементами ДНК, которые могут перемещаться из хромосомы в плазмиды и передаваться между штаммами энтерококков. При транспозиции зачастую в структуре транспозонов возникают мутации. В процессе исследования структурного полиморфизма транспозонов Тп1546 нами было выявлено преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1). Наряду с ними были определены транспозоны других типов (тип 2, тип 3, тип 4). Для этих транспозонов были характерны следующие мутации: делеция фрагмента гена ог/1, инсерция \S1216V в области ог/1, а также инсерция 131251 между генами уап8 и уапН. Аналогичные результаты были получены и в других исследованиях [22, 31, 65, 133]. Известно, что мутации в структуре транспозонов Тп1546 накапливаются в процессе их циркуляции [18, 93]. Следовательно, выявленное в нашем исследовании преобладание транспозонов Тп1546 консервативной структуры (тип 1) может быть объяснено недавним появлением генов устойчивости к ванкомицину в стационаре. Наши данные согласовались с результатами, полученными исследователями из Италии [22]. В других работах преобладали транспозоны Тп1546, содержащие точечные мутации, делеции, а также инсерции [29, 31, 65, 71]. Значение структурных изменений транспозонов Тп1546 при их распространении в стационаре не определено окончательно. Так БсЬоЩеп М. А. и соавт. полагают, что возникающие делеции генов ог/7 и ог/2 в составе транспозонов Тп1546 уменьшают их мобильность. Такое заключение объясняется тем, что гены ог/1 и ог/2 кодируют белки транспозазу и резолвазу, которые участвуют в транспозиции Тп1546 из бактериального генома в плазмиды Е./аесшт [109]. Однако другими исследователями были получены противоположные данные: частота транспозиции Тп1546, наоборот, возрастала при появлении делеций в области генов orfl и orf2 [98]. В работе Woodford N. и соавт. было предположено, что инсерция IS12J6V, выявленная нами в составе транспозонов тип 3, также может влиять на мобильность генов устойчивости к ванкомицину. Было показано, что две инсерций IS 1216V в составе транспозонов Тп1546 могут мобилизовать гены устойчивости к ванкомицину, находящиеся между этими инсерциями [137]. Следовательно, на основании полученных нами данных можно предположить, что транспозоны тип 3, содержащие по одной инсерции IS 1216V, являются предшественниками новых мобильных элементов.

При исследовании клонального распространения транспозонов Тп 1546 различной структуры было выявлено, что транспозоны тип 1 и тип 3 определялись не только у штаммов одного клона, но и у неродственных изолятов. Транспозон Тп1546 консервативной структуры (тип 1) изначально выявлялся у изолятов, относящихся к основному эпидемическому клону А. Затем этот транспозон был зарегистрирован у штаммов, принадлежащих к лонам D, F и G, а также у спорадических изолятов (S, Т, U). Транспозон тип 3 первично выявлялся у спорадического штамма (V), а затем распространился среди других спорадических (I, W) и клональных изолятов (В). Аналогичное распространение транспозонов Тп1546 определенной структуры среди генетически неродственных штаммов энтерококков было зарегистрировано и в других исследованиях [76, 99, 104]. Выявленные закономерности свидетельствуют о передаче транспозонов Тп1546 между штаммами Е. faecium.

Наряду с изучением структурного полиморфизма транспозонов Тп1546, было проанализировано наличие следующих генов, кодирующих факторы вирулентности: esp, hyl, gelE, agg, cylA. Наиболее часто выявлялся ген вирулентности esp, он был обнаружен у 119 (91%) штаммов ванкомицинустойчивых Е. faecium. Следует отметить, что этот ген был выявлен у всех эпидемических изолятов, которые относились к клонам А и F. Полученные результаты доказывают, что ген вирулентности esp может рассматриваться как эпидемический маркер. Известно, что фактор Esp участвует в адгезии микроорганизмов к эукариотическим клеткам, а также существуют предположения о его участии формировании биопленок. В связи с этим наличие фактора вирулентности Esp у штаммов Е. faecium приводит к их повышенной выживаемости в стационаре [58, 85, 90].

Значение факторов вирулентности Gel и Ну1 в госпитальном распространении ванкомицин-устойчивых Е. faecium не определено окончательно. В нашем исследовании ген вирулентности gelE был выявлен у 87 (67%) штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, тогда как в исследовании Eaton Т. J. и соавт. ген gelE присутствовал лишь у единичных изолятов Е. faecium [45]. Нами ген вирулентности hyl был обнаружен у 35 (27%) исследуемых штаммов. При этом его наличие не было характерным для эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Е. faecium. В исследовании Rice L. В. и соавт., напротив, было выявлено, что hyl является маркером эпидемических штаммов Е. faecium [103]. Необходимо отметить, что гены вирулентности agg и cylA не были выявлены ни у одного исследуемого штамма Е. faecium, что согласуется с результатами других исследований, где гены вирулентности agg и cylA определяли лишь у единичных изолятов Е. faecium [105, 130]. Некоторые отличия наших данных от результатов, полученных в других работах, могут быть следствием наличия определенного набора циркулирующих генов вирулентности в исследуемых центрах. Нами также было отмечено, что гены вирулентности esp, hyl, gelE присутствовали в различных комбинациях у штаммов одного клона. Эти результаты дают основание полагать, что отдельные изоляты в составе клона приобретали гены вирулентности посредством передачи мобильных элементов ДНК островков патогенности и плазмид. Аналогичные результаты были получены в исследовании Vankerckhoven V. И соавт. [130].

Сравнение вирулентности клинических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium и чувствительных к ванкомицину изолятов выявило преобладание генов вирулентности esp и gelE у штаммов Е. faecium, устойчивых к ванкомицину, в сравнении с чувствительными к ванкомицину изолятами (92% против 6% и 67% против 22%, р<0,001). Ген вирулентности hyl преобладал у чувствительных к ванкомицину изолятов (66% против 27%, р<0,001). Было выявлено, что у 119 (92%) устойчивых к ванкомицину штаммов присутствовали от одного до трех генов вирулентности {esp, gelE и hyl). Тогда как у ванкомицин-чувствительных Е. faecium эти гены выявлялись значительно реже, они присутствовали у 59 из 89 штаммов (66%), р<0,001. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ванкомицин-устойчивые штаммы Е. faecium более вирулентны, чем чувствительные к ванкомицину изоляты.

Для определения принадлежности эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium к генетической линии микроорганизмов CCI7, вызывающих вспышки инфекций в клиниках разных стран, был проведен MLST анализ. Исследованы штаммы, которые относились к наиболее широко распространившимся клонам Е. faecium А (А1, A3, А8, А10, А16, А26) и F (Fl, F3). Изучение структуры фрагментов генов клеточного транспорта и метаболизма (atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk) выявило принадлежность эпидемических изолятов к госпитальной линии штаммов Е. faecium CCI7. Эти штаммы были впервые описаны нами в России. На основании структурного полиморфизма генов atpA, gyd и pstS исследуемые изоляты были отнесены к трем сиквенс типам ST202, ST18 и ST262. При анализе структуры популяции Е. faecium CCI7 нами было выявлено, что сиквенс типы ST202, ST18 и ST262 являлись близкородственными сиквенс типу ST17 - родоначальнику клонального комплекса штаммов Е. faecium CCI7. В связи с этим, можно полагать, что распространению эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, которые относились к сиквенс типам ST202, ST18 и ST262, предшествовала циркуляция штаммов, относящихся к сиквенс типу ST17. В то же время нельзя исключить происхождение эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, относящихся к сиквенс типам ST202, ST18 и ST262 из независимых внегоспитальных источников.

В нашем исследовании наряду с эволюционными изменениями в консервативных хромосомных генах циркулирующих в стационаре клонов ванкомицин-устойчивых Е. faecium было зарегистрировано приобретение этими клонами генов резистентности к ванкомицину, а также генов вирулентности. При этом преимущества в распространении получали штаммы Е. faecium, относящиеся к популяции CCI7, а также обладающие генами резистентности к ванкомицину и геном вирулентности esp. Интересно отметить, что выявленное преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1) свидетельствует о сравнительно недавнем появлении генов резистентности в исследуемой популяции Е. faecium. Мировые исследования также подтверждают, что возникновению госпитальных вспышек, ванкомицин-резистентных Е. faecium, зачастую предшествует широкое распространение чувствительных к ванкомицину, но устойчивых к ампициллину штаммов, принадлежащих к CCI7. Данные литературы свидетельствуют о том, что часть этих штаммов приобретают ген вирулентности esp в последствии [67].

В заключение, необходимо отметить, что результаты нашего исследования выявили генетически неоднородную эволюционирующую популяцию штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, в которой преобладали два клона микроорганизмов А и F. В условиях циркуляции генов вирулентности и резистентности к ванкомицину, происходящей одновременно с изменениями в консервативных генах клеточного транспорта и метаболизма штаммов Е. faecium, образовывались клоны бактерий, обладающие эволюционными преимуществами при распространении в стационаре. Такие преимущества имели изоляты ванкомицин-устойчивых Е. faecium, относящиеся к генетической линии штаммов CCI7, а также обладающие генами вирулентности esp. Одновременно с этим происходила передача транспозонов 1x11546, кодирующих резистентность к ванкомицину, между генетически неродственными штаммами Е. faecium. В ходе этого процесса эволюционным изменениям подвергалась и структура транспозонов Тп1546. Зарегистрированная нами генетическая изменчивость исследуемой популяции бактерий доказывает необходимость комплексного подхода при определении механизмов эволюции ванкомицин-устойчивых Efaecium стационаре.

Предположительно существует два пути происхождения эпидемических Е. faecium, относящихся к генетической линии штаммов CCI7, в России. С одной стороны, их возникновение может являться следствием эволюционных изменений генома Е. faecium, происходящих под селективным давлением условий госпитальной среды, таких как использование антибиотиков. С другой стороны, нельзя исключить происхождение этих эпидемических штаммов из внешних источников окружающей среды, в частности от животных, поскольку в Бельгии штамм Е. faecium, относящийся к клональному комплексу CCI7, был выявлен у свиней.

Инфекции, вызванные ванкомицин-устойчивыми Е. faecium, являются серьезной проблемой, в особенности для иммунокомпрометированных пациентов. В этой связи крайне важным для предотвращения их распространения в стационаре является своевременное выявление эпидемических клонов ванкомицин-устойчивых Е. faecium, а также определение механизмов эволюции этих микроорганизмов. Первичное определение клонального родства большого числа штаммов и выявление эпидемических изолятов целесообразно проводить методом PFGE. Однозначно установить, что штамм Е. faecium является эпидемическим можно только методом MLST, определив его принадлежность к клональному комплексу CCI7. Наряду с этим, выявление маркера вирулентности esp методом ПЦР также является информативным диагностическим критерием при выявлении эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Е. faecium. Исследование структурного полиморфизма транспозонов Тп1546, кодирующих устойчивость энтерококков к ванкомицину, необходимо для выявления передачи генов вирулентности между штаммами Е. faecium. Таким образом, для определении наиболее опасных эпидемических клонов ванкомицин-устойчивых штаммов Е. faecium в стационаре и выявления механизмов их эволюции необходимо использовать комплекс молекулярных методов исследования микроорганизмов.