Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Митохондриальная дисфункция как патогенетическое звено глаукомного процесса

На правах рукописи

НИКИТИН ДМИТРИИ НИКОЛАЕВИЧ

МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДИСФУНКЦИЯ КАК ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗВЕНО ГЛАУКОМНОГО ПРОЦЕССА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИИЕ)

14.01.07 - глазные болезни 14.03.02 - патологическая анатомия

1 7 ОКТ 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2013 005535216

005535216

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный Государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор АЛЕКСЕЕВ Владимир Николаевич

доктор медицинских наук профессор, член-корреспондент РАМН

АНИЧКОВ Николай Мильевич

Официальные оппоненты:

БАЛАШЕВИЧ Леонид Иосифович, доктор медицинских наук профессор

Санкт-Петербургский филиал Федерального Государственного бюджетного учреждения «межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н.Федорова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, директор.

РЫБАКОВА Маргарита Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика ИЛ. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой патологической анатомии с пагологоанагомическим отделением.

Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 11 ноября 2013 г. в 14 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.09 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ.

Автореферат разослан « октября 2013 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ СОВЕТА

доктор медицинских наук КУЛИКОВ Алексей Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Проблема первичной глаукомы по праву считается одним из приоритетных направлений в офтальмологии в силу своей медико-социальной значимости (Мошетова JI.K., Корецкая Ю.М., 2005; Либ-ман Е.С. и соавт., 2006; Суркова В.К. и соавг., 2007; Либман Е.С., 2010; Разумовский М.И. и соавт., 2010; Скоробогатова Е.С. и соавт., 2010; Авдеев Р.П., 2011; Аксенова С.В., Куликова М.П., 2011; Бабушкин А.Э., 2011; Бабушкин А.Э. и соавт., 2011; Кантаржи Е.П., 2011). До сих пор это заболевание является причиной необратимой слепоты и слабовидения, занимая одно из ведущих мест в перечне инвалидизирующих заболеваний органа зрения (Егоров Е.А. и соавт., 2001; Золотарев A.B. и соавт., 2004; Шевченко М.В., Карлова Е.В., 2004; Либман Е.С., Шахова Е.В., 2005; Алексеев В.Н. и соавт., 2008; Куроедов A.B., Городничий В.В., 2008; Нестеров А.П., 2008; Авдеев Р.П., 2011; Кантаржи Е.П., 20И; Goldberg I., 2000; Quigley H.A., Broman A.T., 2006).

Среди клинических форм заболевания наибольшее значение имеет первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), на долю которой приходится от 70,0 % (Егоров Е.А. и соавт. 2001) до 92,0 % (Quigley H.A., 1996) всех случаев глаукомы. На сегодняшний день ПОУГ поражено примерно около 80 млн. человек в мире (Либман Е.С., 2008; Goldberg I., 2000) и эта цифра с течением времени неуклонно увеличивается.

Конец XX века характеризовался лавинообразным накоплением знаний о сущности глаукомного процесса. Однако, несмотря на многочисленные исследования, проводящиеся в области изучения этиологии и патогенеза, диагностики и лечения ПОУГ в настоящее время у большинства больных (86,0%), длительно страдающих глаукомой, установлено прогрессивное ухудшение зрительных функций с переходом заболевания в более тяжелую стадию (Алексеев В.Н., Малеванная O.A., 2003; Малеванная O.A., 2005; Малеванная O.A. и соавт., 2009), то есть количество слепых и слабовидящих вследствие глаукомы с течением времени неуклонно увеличивается.

На наш взгляд причиной данной сложившейся ситуации могут быть неизученные на сегодняшний день механизмы патогенеза и факторы риска данного заболевания.

На сегодняшний день, одним из перспективных направлений является изучение митохондриальной дисфункции, служащей базой, на основе которой развиваются многие сочетанные заболевания, а некоторые из них протекают более тяжело (Клембовский АЛ., Сухорукое B.C., 1997; Нарциссов Р.П., 1999; Wei Y.H. et al., 1998,2001).

Существуют отдельные немногочисленные публикации о значении митохондриальной дисфункции в развитии и течении некоторых заболеваний, таких как детские болезни, болезни ЦНС, нервной и мышечной систем организма (De Vivo D., 1993; Scharfe С. et al., 1999). Публикации и научные исследования по данному вопросу в области офтальмологии немногочисленные. Однако если учесть, что сетчатка глаза, зрительные пути и центральная нервная система являются единым целым, можно предположить, что наличие митохондриальной дисфункции, усугубляет течение и развитие не только заболеваний ЦНС, но и заболеваний органа зрения.

Поскольку ПОУГ является хрониче«® текущим неизлечимым заболеванием, при котором, прежде всего, страдает сетчатка и зрительный нерв (а, возможно, и более высокие отделы зрительного пути, вплоть до структур коры головного мозга), особый интерес представляет изучение митохондриальной дисфункции этих отделов и определение ее значения в течение и прогрессировали« глаукомного процесса. Данная проблема представляет определенный научный интерес и этим определяется актуальность настоящего научного исследования.

Цель исследования - изучить состояние митохондриального аппарата различных отделов зрительного пути при экспериментальной адреналин-индуцированной глаукоме и определить его роль в прогрессировании глаукомного процесса.

Основные задачи исследования:

1. Воспроизвести в эксперименте модель адреналин-индуцированной глаукомы у лабораторных животных (Липовецкая Е.М., 1966).

2. Изучить морфологические изменения структур зрительного пути лабораторных животных в норме и при наличии адреналин-индуцированной глаукомы.

3. Дать сравнительную морфологическую оценку изменениям структур зрительного пути лабораторных животных в норме и при наличии адреналин-индуцированной глаукомы.

4. Изучить состояние митохондрий клеток в различных отделах зрительного пути в норме и на модели адреналин-индуцированной глаукомы у лабораторных животных на разных этапах эксперимента.

5. Провести сравнительную оценку состояния митохондрий клеток в различных отделах зрительного пути у лабораторных животных в норме и при наличии адреналин-индуцированной глаукомы.

Научная новизна исследования. Впервые дана оценка морфологических изменений в различных структурах зрительного пути (от зрительного нерва до зрительной коры) у лабораторных животных в норме и при наличии адреналин-индуцированной глаукомы. Впервые изучено состояние митохондрий клеток в различных отделах зрительного пути у лабораторных животных в норме и при наличии адреналин-индуцированной глаукомы (на разных этапах эксперимента). Впервые выявлено значение митохондриальной дисфункции в патогенезе глаукомного процесса.

Научно-практическая значимость. Теоретическая значимость: выявлено наличие митохондриальной дисфункции в различных отделах зрительного пути при воспроизведении модели адреналин-индуцированной глаукомы у лабораторных животных. Дана оценка степени выраженности структурных изменений митохондрий в изучаемых тканях на разных этапах эксперимента.

Практическая значимость: выявленные изменения митохондрий клеток различных отделов зрительного пути позволят определить наличие митохондриальной дисфункции при глаукомном процессе. Результаты проведенного научного исследования, могут быть взяты за основу для изучения наличия митохондриальной дисфункции у пациентов, страдающих первичной глаукомой и определения новых подходов к консервативному лечению данной группы больных. Разработанные практические рекомендации могут быть использованы для последипломной подготовки специалистов и при обучении студентов медицинских вузов.

Методология и методы исследования. В ходе эксперимента, для подтверждения развития глаукомного симпотомокомплекса, использовались клинические методы исследования лабораторных животных, которые включали тонометрию, тонографию и офтальмоскопию. Далее в работе проводилось морфологическое исследование структур глаза и центральной нервной системы, иммуногистохимическое исследование зрительной коры экспериментальных животных, а также электронно-микроскопическое исследование для выявления структурных изменений митохондрий в клетках анализируемых тканей глаза и центральной нервной системы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Дегенеративные изменения, обнаруживаемые в тканях при воспроизведении модели адреналин-индуцьбированной глаукомы, развиваются не только в структурах глаза, но и в более высоких отделах зрительного пути -хиазме, подкорковых центрах и зрительной коре лабораторных животных.

2. Воспроизведение в эксперименте глаукомного симптомокомплекса сопровождается появлением патологических структурных изменений митохондрий, являющихся основной энергетической единицей в клетках нервной ткани на протяжении всего зрительного пути - хиазме, подкорковых центрах и зрительной коре лабораторных животных.

3. Патологические структурные изменения митохондрий, обнаруживаемые при адреналин-индуцированной глаукоме, становятся более выраженными в зависимости от длительности эксперимента.

4. Экспериментально выявленные дегенеративные изменения в структурах глаза, а также и в более высоких отделах зрительного пути - хиазме, подкорковых центрах и зрительной коре дают основание считать митохонд-риальную дисфункцию патогенетическим звеном глаукомного процесса.

Реализация работы. Материалы и выводы диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность органов и учреждений здравоохранения Санкт-Петербурга, представлены в методических рекомендациях, определяющих преимущества экспериментального воспроизведения различных моделей, глаукомного процесса. Фрагменты работы используются в

учебном процессе со студентами и клиническими ординаторами кафедры офтальмологии №1 ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.

Публикации. Основные положения и выводы опубликованы в 26 печатных работах, 8 из которых опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация материалов исследований. Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на:

- IX Всероссийской школе офтальмологов (Москва, 2010);

- научно-практической конференции офтальмологов с международным участием, посвященной 75-летию со дня основания Института им. В.П. Филатова (Одесса, 2011);

- заседании Санкт-Петербургского научного медицинского общества офтальмологов (Санкт-Петербург, 2011);

- IX международной конференции «Глаукома: теории, тенденции, технологии» (Москва, 2011);

- научно-практической конференции офтальмологов с международным участием института им. В.П. Филатова (Одесса, 2012).

Личное участие автора в получении результатов. Автором лично воспроизводилась модель адреналин-индуцированной глаукомы кроликам основной группы (30 животных). В ходе эксперимента диссертантом проводилось клиническое исследование у всех лабораторных животных контрольной и основной групп (36 кроликов), которое включало тонометрию, тоно-графию и офтальмоскопию. Автором лично осуществлялось выведение кроликов из эксперимента и забор структур глаза и головного мозга для дальнейшего морфологического, иммуногистохимического и электронно-микроскопического исследований. Принимал участие в подготовке и окраске материалов (анализируемых структур глаза и центральной нервной системы) для дальнейшего исследования.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 131 машинописной странице, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций. В работе исполь-

зовано 175 отечественных и 96 иностранных источников литературы. Диссертация содержит 2 таблицы и 32 рисунка.

Работа выполнена на кафедрах офтальмологии №1 (заведующий кафедрой — доктор медицинских наук, профессор В.Н. Алексеев) и патологической анатомии (заведующий кафедрой - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Н.М. Аничков) ГБОУ ВПО «СевероЗападный государственный медицинский университет И.И. Мечникова» Минздрава РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для постановки хронического эксперимента было взято 36 кроликов породы «Серая Шиншилла», обоего пола, возрастом около 2-х лет, весом 2,53 кг и сформированы контрольная и основная группы животных. Контрольную группу составили интактные кролики (6 животных). В основную группу вошли животные, которым создавалась модель адреналин-индуцированной глаукомы (30 кроликов).

Модель экспериментальной АИГ воспроизводилась по методике, предложенной Е.М. Липовецкой (1966). С этой целью парентерально в ушную вену опытным животным вводили 0,1 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида. Инъекции выполняли через день в течение трех месяцев.

В ходе эксперимента в основной группе животных были сформированы следующие подгруппы:

- группа № 1 - кролики со сроком глаукомного процесса 3 месяца, после окончания введения адреналина (10 животных);

- группа № 2 - кролики со сроком глаукомного процесса 6 месяцев, после окончания введения адреналина (10 животных);

- группа № 3 - кролики со сроком глаукомного процесса 12 месяцев, после окончания введения адреналина (10 животных).

Для подтверждения развития глаукомного симптомокомплекса в ходе эксперимента у лабораторных животных использовались следующие клинические методы исследования: тонометрия, тонография и офтальмоскопия.

Уровень ВГД кроликам контрольной и основной групп измеряли при помощи тонометра Маклакова по принятой методике с использованием груза мае-

сой 7,5 грамм. Измерение ВГД у кроликов контрольной группы проводилось в ходе исследования дважды в начале и в конце эксперимента. В результате рассчитывался средний показатель уровня офтальмотонуса на правом и левом глазу. В основной группе у животных средний показатель уровня офтальмотонуса был получен в ходе измерения ВГД каждые 10 дней в течение 3-х месяцев введения адреналина, затем 1 раз в месяц до окончания исследования.

Параллельно с контролем тонометрических показателей исследовалась гидродинамика глаза. Тонография выполнялась с помощью тонографа ТНЦ-100 под местной анестезией 0,5% раствором дикаина при надежной фиксации кроликов в станке. Определялись средние показатели истинного ВГД (Рс), коэффициента легкости оттока водянистой влаги (С), продукции камерной влаги в минуту (F), коэффициента Беккера (Р</С). Показатели С, F, PJC рассчитывали по таблицам Фриденвальда. Тонографические показатели у кроликов контрольной группы измерялись в ходе исследования дважды, в начале и в конце исследования, а в основной группе животных — 1 раз в месяц на протяжении всего эксперимента.

Состояние диска зрительного нерва у лабораторных животных оценивалось визуально при помощи прямой офтальмоскопии. С этой целью использовали электрический офтальмоскоп ВЕТА-200 фирмы «HEINE» (Германия). Прямая офтальмоскопия у кроликов контрольной группы выполнялась в ходе работы однократно, в начале исследования, в основной группе животных — в начале и в конце эксперимента.

Математическую обработку данных, полученных в ходе клинического исследования, проводили методами вариационной статистики на персональном компьютере Intel® Celeron ® CPU 420 с пакетом прикладных программ и использованием программы «Microsoft Excel». Определяли среднее значение (X), стандартное отклонение (а), дисперсию (а2), ошибку среднего (ш), достоверность различий между группами сравнения с вычислением критерия Стьюдента (t) и уровня значимости (а), доверительный интервал (р), который для медицинской статистики равен 0,05.

После окончания исследования и выведения кроликов из эксперимента путем воздушной эмболии, в течение 15-20 минут выполнялась энуклеация

глаз, а также забор материала головного мозга (проводящих путей, подкорковых и корковых зрительных центров) для проведения морфологического и электронно-микроскопического исследований.

Морфологическое исследование у лабораторных животных проводилось с целью обнаружения структурных изменений радужно-роговичного угла, подтверждающих развитие в ходе эксперимента глаукомного симптомо-комплекса, а также для выявления атрофии проводящих путей, подкорковых центров и корковых структур. Для этого исследуемые ткани окрашивались несколькими способами.

Структуры переднего отрезка глаз лабораторных животных (радужно-роговичный угол), проводящие пути (зрительный нерв и хиазма), а также подкорковые зрительные центры (бугры и четверохолмия) окрашивались гематоксилином и эозином. Затем в ходе работы фрагменты зрительных бугров и четверохолмий кроликов окрашивались специальной методикой, использующейся для окрашивания клеток нервной ткани при помощи метиленового синего (окраска по Нисслю). Этот метод является основной методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них патологических и структурно-функциональных изменений.

Гистологическое и морфометрическое исследования проведены при помощи светооптического микроскопа Микмед-5. Морфометрическое исследование выполнено с помощью окуляр- и объект-микрометров «Reichert», а также демонстрационной насадки к микроскопу «Ампливал» со стандартной масштабной сеткой по методике, предложенной Б.С. Сережиным (1993).

Морфологическое исследование, включающее описание материала и морфометрию клеток анализируемых структур было выполнено на кафедре патологической анатомии ГБОУ ВПО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России под руководством доктора медицинских наук профессора Аничкова Н.М.

К сожалению, традиционные методы окраски (гематоксилином и эозином, по Нисслю) не позволяют в полной мере оценить характер реакции нервной ткани на повреждение головного мозга, поскольку не дают возможности определить изменения в состоянии нейроглии, важная роль которой в

обеспечении восстановительных процессов в центральной нервной системе не подвергается сомнению. Поэтому для более полноценного исследования и качественного сравнительного анализа полученных результатов выполнялось иммуногистохимическое исследование зрительной коры лабораторных животных контрольной и основной групп.

Иммуногистохимическое исследование зрительной коры лабораторных животных проводилось в Лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, под руководством доктора медицинских наук, заведующего отделом общей и частной морфологии Коржевского Д.Э. Исследование выполнено при помощи микроскопов Микмед-5, Axioskop - Zeiss.

Целью электронно-микроскопического исследования было выявление структурных изменений митохондрий в клетках анализируемого материала. Для этого исследования фрагменты зрительного нерва, а также подкорковых и корковых отделов зрительного пути забирались сразу после выведения животных из эксперимента и в дальнейшем подвергались необходимой обработке и фиксации. Ультратонкие срезы изготавливались на ультратоме LKB-3 и изучались в электронном микроскопе JEM-100 S. Микрофотографирование препаратов проводили при помощи цифровых фотокамер Olympus С-3020, Polaroid Digital Camera DMC 1.

Описание полученных фотографий и оценка структурных изменений митохондрий клеток анализируемых структур выполнялась под руководством главного научного сотрудника Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России, доктора медицинских наук, профессора В.Ф. Ивановой.

Результаты клинического исследования кроликов основной группы показали, что период трехмесячного введения адреналина сформировал отчетливое, статистически достоверное повышение ВГД у всех животных основной группы (группа №1, №2, №3), выявленное уже через 1 месяц с момента начала введения адреналина, что подтверждалось результатами тонометриче-ских показателей. По результатам тонометрии было установлено, что введение адреналина уже в первый месяц эксперимента приводит к статистически

достоверному нарастанию уровня ВГД с 13,8±0,27 мм рт.ст. до 20,6±0,28 мм рт.ст. на правом глазу (р<0,001), с 14,6±0,26 мм рт.ст. до 21,2±0,28 мм рт.ст. (р<0,001) на левом глазу с незначительной асимметрией между ОБ и ОБ.

На втором и, особенно, третьем месяце течения экспериментальной глаукомы показатели тонометрии свидетельствовали о прогрессирующем статистически достоверном повышении ВГД (р<0,001) как на правом, так и на левом глазу у кроликов основной группы. В конечном итоге нарастание офтальмогипертензии в среднем составило около 67%.

Анализ результатов тонометрии обусловил необходимость экспериментального изучения гидродинамических показателей глаз лабораторных животных. У кроликов основной группы тонографическое исследование выявило достоверное повышение уровня истинного ВГД (Р0) по сравнению с исходными показателями в среднем на 32%. Наблюдалась тенденция к снижению коэффициента легкости оттока (С), а также уменьшение минутного объема камерной влаги (Р) как на правом, так и на левом глазу у всех животных основной группы. В ходе эксперимента также отмечалось повышение коэффициента Беккера (Р</С). Полученные результаты тонографии оставались практически неизменными (р<0,05) спустя 3 месяца после окончания введения адреналина.

Нарушения гидростатики и гидродинамики глаза у всех кроликов основной группы были подтверждены клиническими изменениями состояния диска зрительного нерва. При прямой офтальмоскопии визуализировался крупный ДЗН с глубокой экскавацией, которая в основной группе лабораторных животных в отличие от интактных кроликов приобретала краевой характер.

При морфологическом исследовании структур переднего отрезка глаза кроликов контрольной и основной групп, включающего трабекулярный аппарат и шлеммов канал, были получены следующие результаты.

В контрольной группе у интактных кроликов соединительная ткань трабекулярного аппарата не прокрашивалась альциановым синим, что говорило об отсутствии гликозаминогликанов - маркеров денегерации. Колла-геновые волокна в строме были в незначительном количестве, аргирофиль-ный каркас развит хорошо вокруг сосудов и в трабекулах. Эндотелий трабе-

кул был уплощенный и располагался ритмично по ходу щелей. Трабекуляр-ный аппарат был с четко прослеживавшимся каркасом корнеоувеальной и корнеомышечной части.

В отличие от интактных животных у всех кроликов основной группы, не зависимо от срока глаукомного процесса, при морфологическом исследовании структур переднего отрезка глаза отмечалось укорочение гребенчатой связки, а также атрофия корнеомышечной и корнеоувеальной частей трабе-кулы различной степени выраженности.

При исследовании состояния зрительного нерва и хиазмы у кроликов контрольной и основной групп были получены схожие данные: эпиневрий тонкий, эндоневральные соединительнотканные структуры, топографически связанные с микроциркуляторным руслом, были представлены рыхлой соединительной тканью, зонами отека (более выраженного у кроликов основной группы) и наличием клеток фибробластического ряда.

Выявленные отклонения у интактных кроликов контрольной группы могут быть объяснены появлением острых пренекротических изменений, развивающихся в результате смерти животного от воздушной эмболии легочных артерий.

Однако были выявлены и различия: у интактных кроликов контрольной группы изменения миелина отсутствовали, в отличие от лабораторных животных основной группы, у которых была выявлена неравномерная плотность миелина, мелкоочаговая вакуолизация (чаще периваскулярная), а также уменьшение количества и истончение нервных волокон. Изменения нарастали прямо пропорционально сроку эксперимента.

При морфологическом исследовании срезов зрительных бугров и четверохолмий у интактных кроликов контрольной группы сосуды микроциркуля-торного русла были с неравномерным кровенаполнением, тонкими стенками, просветы их были равномерно расширены. Нейроны находились в состоянии ишемического повреждения. При окраске по Нисслю выявлялся выраженный тигролиз, некробиоз большинства нервных клеток, без реакции глии, что свидетельствовало о развитии острых пренекротических изменений.

При морфологическом исследовании зрительных бугров и четверохолмий кроликов основной группы в анализируемых структурах выявлялись спавшиеся сосуды микроциркуляторного русла (капилляры, артериолы), просвет их был неравномерно сужен или зиял в пределах одного сегмента - участки дистонии сочетались с микроаневризматическими расширениями, стенки их были несколько утолщены, гомогенизированы, особенно в группе лабораторных животных со сроком глаукомного процесса 12 месяцев.

Также отмечались явления выраженной атрофии нервной ткани, которая проявлялась наличием крупных участков группового расположения пик-нотичных, сморщенных нейронов с истонченными отростками. Цитоплазма этих клеток была гомогенна, тигроид не определялся, ядра были пикнотичны, что свидетельствовало о скорой гибели клетки. В зонах распространения таких клеток выявлялись разные этапы атрофии нейронов - с участками разрежения и очаговой пролиферацией микроглии, что говорит о наличии длительно текущего процесса. Атрофия имела распространенный характер.

При иммуногистохимическом исследовании коры головного мозга лабораторных животных исследовалось состояние микроглии и астроцитов. Были получены следующие данные.

В контрольной группе у интактных кроликов микроглия в сером веществе коры была представлена преимущественно одной формой - мелкими клетками с небольшим объемом перинуклеарной цитоплазмы и многочисленными ветвящимися очень тонкими отростками равномерно пронизывающими нейропиль. По слоям коры микроглиоциты распределялись относительно равномерно. Несколько больше их отмечалось в IV слое коры. Вдоль мелких кровеносных сосудов обнаруживались редкие периваскулярные микроглиоциты с небольшим числом отростков. Микроглиоциты субкортикального белого вещества отличались формой (были ближе к веретеновидной) и более толстыми и короткими отростками.

Иммунопозитивные астроциты в сером веществе коры у интактных кроликов в контрольной группе определялись преимущественно в глубоких слоях (IV-VI). В I слое на поверхности коры визуализировалась иммунопозитивная прерывистая пластинка — поверхностная глиапьная пограничная мембрана,

образованная астроцитами. Субповерхностный слой содержал единичные им-мунопозитивные отростки астроцитов. Глубже в I слое и на границе со II встречались небольшие звездчатые астроциты с тонкими, маловетвящимися отростками. В Ш слое коры иммунопозитивные астроциты практически не определялись. Иногда встречались астроциты со слабой реакцией на глиальный фибриллярный кислый белок, расположенные периваскулярно. В глубоких слоях коры определялись многочисленные астроциты с тонкими маловетвящимися отростками, которые нередко были направлены к капиллярам коры.

При иммуногистохимическом исследовании зрительной коры кроликов основной группы также оценивалось состояние микроглии и изменения астроцитов. Были получены следующие результаты.

У кроликов основной группы, не зависимо от сроков глаукомного процесса, не наблюдалось существенных изменений типичной формы мик-роглиоцитов коры и их распределения по сравнению с контрольной группой животных. Однако у лабораторных животных со сроком глаукомного процесса 3 и 6 месяцев отмечалась тенденция к увеличению контактов отростков микроглиоцитов с капиллярами и увеличению перинуклеарной цитоплазмы микроглиоцитов глубоких слоев коры (IV-VI). У кроликов со сроком глаукомного процесса 12 месяцев в глубоких слоях коры иногда встречались группы активированных микроглиоцитов, что может свидетельствовать о постепенном развитии нейродегенерации, сопровождающейся микроглиальной реакцией.

В белом веществе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца число микроглиоцитов было увеличено по сравнению с контрольной группой животных. Было отмечено появление крупных безотростчатых клеток или их скоплений, что свидетельствовало о развитии микроглиальной реакции (возможно, в связи с повреждением афферентных нервных волокон). У лабораторных животных со сроком глаукомного процесса 6 месяцев в белом веществе сохранялись признаки микроглиальной активации, хотя выражены они бьши в меньшей степени, чем у кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца. В белом веществе кроликов со сроком глаукомного процесса 12 месяцев число

микроглиоцитов также было увеличено по сравнению с лабораторными животными контрольной группы.

Таким образом, микроглиальная реакция в зрительной коре у экспериментальных животных основной группы присутствовала, но ограничивалась преимущественно белым веществом и глубокими слоями коры. Этот факт заставляет предполагать первичное поражение проводников, а не эфферентных нейронов неокортекса. Выраженность микроглиальной реакции была неодинакова. Больший спектр изменений был характерен для кроликов со сроком глаукомного процесса 3 и 6 месяцев.

При оценке изменений астроцитов в основной группе лабораторных животных были получены следующие результаты. В группе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца наблюдалось существенное усиление реакции в области поверхностной глиальной пограничной мембраны и в астроцитах поверхностных слоев коры. Наиболее выраженные изменения астроцитов были зафиксированы в III слое зрительной коры.

Если в контрольной группе у интакгных кроликов в этом слое зрительной коры на неокрашенном поле определялись редкие слабоокрашенные аст-роциты, то в данной группе животных почти все участки этого слоя были пронизаны сетью иммунопозитивных отростков астроцитов, которые располагались не только около капилляров, но и вне периваскулярных областей. Иногда в средних слоях зрительной коры встречались гипертрофированные астроциты с увеличенной перинуклеарной областью.

В группе кроликов со сроком глаукомного процесса 6 месяцев в поверхностных слоях коры распределение астроцитов и их иммунореактив-ность не менялась по сравнению с предыдущей группой лабораторных животных. При этом в III слое зрительной коры отсутствовала выраженная глиальная реакция, характерная группы кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца.

По сравнению с группами кроликов со сроком глаукомного процесса 3 и 6 месяцев в группе кроликов со сроком глаукомного процесса 12 месяцев в поверхностных слоях коры распределение астроцитов и их иммунореактив-ность не менялась, однако несколько снижалась интенсивность окраски по-

верхностной глиальной пограничной мембраны. Глиальная реакция в III слое, в данной группе животных, была более выражена, чем у интактных животных и у кроликов со сроком глаукомного процесса 6 месяцев, но менее распространена, чем в группе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца.

При этом в глубоких слоях коры у лабораторных животных основной группы не зависимо от сроков эксперимента существенного изменения числа и иммунореактивности астроцитов, по сравнению с интактными кроликами контрольной группой, не определялось.

Таким образом, астроцитарная реакция в зрительной коре у экспериментальных животных была наиболее выражена в поверхностных слоях коры в группах лабораторных животных со сроком глаукомного процесса 3 и 6 месяцев и несколько меньше у кроликов со сроком глаукомного процесса 12 месяцев. В средних слоях коры астроцитарная реакция была максимальна в группе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца, слабо выражена в группе кроликов со сроком глаукомного процесса 6 месяцев и вновь усиливалась в группе кроликов со сроком глаукомного процесса 12 месяцев, не достигая, однако, максимума, наблюдавшегося в первой группе лабораторных животных. В глубоких слоях коры усиление реакции астроцитов на гли-альный фибриллярный кислый белок было не столь отчетливым.

При выполнении электронно-микроскопического исследования различных отделов зрительного пути нами визуально оценивались структурные изменения митохондрий волокон зрительного нерва, хиазмы, подкорковых зрительных центров (зрительные бугры и четверохолмия), а также зрительной коры у интактных животных.

При электронной микроскопии срезов в контрольной группе у интактных животных, митохондрии всех анализируемых структур в норме имеют удлиненную или округлую форму (в зависимости от направления среза), электронно-плотный матрикс, относительно редкие пластинчатые кристы, а также мелкие единичные вакуоли.

При электронной микроскопии аксонов зрительного нерва и хиазмы кроликов основной группы на всех этапах эксперимента обнаруживались структурные нарушения митохондрий в той или иной степени.

Структурные изменения митохондрий аксонов зрительного нерва лабораторных животных основной группы нарастали прямо пропорционально срокам эксперимента. В группе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца некоторые митохондрии имели нормальное строение, а некоторые из них были вакуолеподобно расширены. Отмечалось правильное расположение крист, матрикс митохондрий был с очагами просветления. В группах кроликов со сроком глаукомного процесса 6 и 12 месяцев большинство митохондрий было с просветленным матриксом, явлениями набухания, кристы были укорочены и редуцированы, расположены вблизи мембран. Практически всю полость митохондрий занимали крупные вакуоли. Особое внимание обращало на себя отслоение и расслоение миелиновой оболочки аксонов зрительного нерва, степень которой также была прямо пропорциональна срокам эксперимента.

Значимых отличий в структурных изменениях митохондрий зрительного нерва и хиазмы у лабораторных животных основной группы на всех сроках эксперимента зафиксировано не было. Миелиновые оболочки были резко разволокнены. Аксоны деформированы. Митохондрии встречались крайне редко, с характерными изменениями, нарастающими прямо пропорционально срокам эксперимента.

Структурные изменения митохондрий в нервных волокнах зрительных бугров и четверохолмий лабораторных животных основной группы, также как и в других структурах, нарастали прямо пропорционально срокам эксперимента. В группе кроликов со сроком глаукомного процесса 3 месяца встречались единичные вакуолеподобно расширенные митохондрии. Расположение крист было достаточно правильным, в матриксе митохондрий отмечались зоны просветления. В группах кроликов со сроком глаукомного процесса 6 и 12 месяцев почти все митохондрии были с просветленным матриксом, явлениями набухания, отмечались укороченные и редуцированные кристы, расположены вблизи мембран. Практически всю полость митохондрий занимали крупные вакуоли. В мякотных нервных волокнах отмечалось раз-волокнение миелиновой оболочки и деформация некоторых аксонов.

При электронной микроскопии зрительной коры головного мозга кроликов основной группы были обнаружены митохондрии различного размера

со структурными изменениями различной степени выраженности. Митохондрии нейроцитов небольшого размера имели структуру близкую к норме. Крупные митохондрии были с явлениями набухания и с образованиями ва-куолеобразных структур. Полученные структурные изменения митохондрий в клетках зрительной коры были менее выражены, чем в подкорковых центрах (зрительных буграх и четверохолмиях) лабораторных животных.

ВЫВОДЫ

1. При экспериментальном воспроизведении глаукомы внутривенное введение 0,1% раствора адреналина гидрохлорида способствует развитию глаукомного симптомокомплекса, характеризующегося повышением уровня внутриглазного давления на 67%, ухудшением гидродинамических показателей, морфологическими изменениями угла передней камеры глаза и зрительного нерва.

2. На модели адреналин-индуцированной глаукомы установлена взаимосвязь клинической симптоматики (показания тонографии, тонометрии и дискоскопии) и морфологических проявлений глаукомного процесса.

3. Нами установлено, что воспроизведение в эксперименте глаукомного процесса сопровождается развитием дегенеративных изменений не только в структурах глазного яблока подопытных животных, но и в более высоких отделах зрительного пути - хиазме, подкорковых центрах и зрительной коре.

4. Дегенеративные изменения, выявленные в ходе эксперимента в структурах глаза, в проводящих путях и подкорковых центрах лабораторных животных, становятся более выраженными в зависимости от срока глаукомного процесса.

5. При обзорном морфологическом и иммуногистохимическом исследовании зрительной коры экспериментальных животных выявлено наличие реакции микроглии, которая наиболее выражена в белом веществе и глубоких слоях коры. Это свидетельствует о первичном поражении проводящих путей, а не эфферентных нейронов неокортекса.

6. Морфологические изменения при экспериментальной глаукоме проявляются на ультраструктурном уровне появлением патологических изменений в митохондриях - органеллах, отвечающих за энергообеспечение клеток. Указанные изменения митохондрий отмечены нами на протяжении всего зрительного пути экспериментальных животных.

7. Выраженность патологических структурных изменений митохондрий клеток во всех анализируемых отделах зрительного пути прогрессирует в ходе эксперимента в прямопропорциональной зависимости по отношению к срокам исследования.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявленные патологические структурные изменения митохондрий клеток различных отделов зрительного пути у экспериментальных животных могут быть взяты за основу для дальнейшего изучения функциональных изменений митохондрий в ходе экспериментальных и клинических исследований.

2. Результаты проведенного научного исследования могут послужить базой для изучения наличия митохондриальной дисфункции у пациентов, страдающих первичной глаукомой и определения новых подходов к консервативному лечению данной группы больных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеев В.Н. Экспериментальное изучение состояния митохондрий аксонов зрительного нерва при адреналин-индуцированной глаукоме / В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, Д.Н. Никитин, O.A. Малеванная, В.Е. Корелина, И.Р. Газизова // Сб. науч. трудов конф. «Глаукома: теория и практика». -СПб., 2011.-С. 3-5.

2. Алексеев В.Н. Значение митохондриальной патологии в медицине и в офтальмологии (обзор) / В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, O.A. Малеванная, Д.Н. Никитин, В.И. Садков, И.Р. Газизова // Сб. науч. трудов конф. «Глаукома: теория и практика». - СПб., 2011. - С. 5-12.

3. Алексеев В.Н. Возможные причины прогрессивного течения глау-комного процесса / В.Н. Алексеев, O.A. Малеванная, Надер Самих Ел Хаж, Д.Н. Никитин // Сб. науч. трудов конф. «Глаукома: теория и практика». -СПб., 2011.-С. 12-15.

4. Алексеев В.Н. Изучение состояния митохондрий аксонов зрительного нерва при экспериментальной глаукоме / В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, Д.Н. Никитин, O.A. Малеванная // Матер, науч.-практич. конф. офтальмологов с междунар. участием, посвященная 75-летию со дня основания института им. В.П. Филатова. - Одесса, 2011. - С. 96.

5. Алексеев В.Н. Анализ основных причин прогрессирования первичной открытоугольной глаукомы / В.Н. Алексеев, O.A. Малеванная, Надер Самих Ел Хаж, Д.Н. Никитин // Офтальмол. ведомости. — 2011. -Т.4, №2. — С. 31-34.

6. Алексеев В.Н. Роль нарушений энергетического обмена в прогресси-ровании первичной открытоугольной глаукомы / Алексеев В.Н., Газизова И.Р., Никитин Д.Н // Сб. науч. трудов конф. IV Российского общенационального офтальмологического форума.-Москва, 2011. -Т. 1.-С. 210-213.

7. Алексеев В.Н. Структурные и функциональные нарушения митохондрий у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова // Матер. IX междунар. конф. «Глаукома: теории, тенденции, технологии». - Москва, 2011. - С. 21-26.

8. Алексеев В.Н. Современные морфологические данные об изменениях заднего отрезка глаза при экспериментальной глаукоме / В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин, O.A. Малеванная // Сб. науч. трудов Всероссийской школы офтальмолога. - Москва, 2011. - С. 20-22.

9. Алексеев В.Н. Нарушения энергетического обмена клетки как фактор прогрессирования глаукомного процесса / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова // Профнлакт. и клинич. медицина: Матер. XVI Российского национального конгресса «Человек и его здоровье». - СПб., 2011.-С. 12-15.

10. Алексеев В.Н. Роль митохондриальной патологии в современной медицине и офтальмологии (научный обзор) / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова // Профилакт. и клинич. медицина. — 2011. - № 3 (40). -С. 326-331.

11. Алексеев В.Н. Прогрессирующая глаукома - неизбежность или недоработка? / В.Н. Алексеев, O.A. Малеванная, Тубаджи Ессам, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова // Глаукома. - 2012. - № 3. — С. 26-32.

12. Алексеев В.Н. Нарушения энергетического обмена у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, В.И. Садков, М.С. Захряпин, И.Р. Газизова // Сб. науч. трудов конф. «Глаукома: теория и практика». - СПб., 2012. - С. 20-23.

13. Алексеев В.Н. Структурные изменения митохондрий клеток трабекулярной зоны у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин // Современная оптомет-рия. - 2012. - №3. - С. 18-21.

14. Алексеев В.Н. Внутриклеточные биоэнергетические нарушения у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин // Сб. трудов науч.-практ. конф. с междунар. участием «Восток-Запад». - Уфа., 2012. - С. 163-165.

15. Алексеев В.Н. Морфологические изменения митохондрий клеток шлеммова канала у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин // Сб. трудов науч.-практ. конф. с междунар. участием «Восток-Запад». — Уфа., 2012. — С. 165-167.

16. Алексеев В.Н. Дегенеративные изменения проводящих путей зрительного анализатора у больных первичной открытоугольной глаукомой / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова, Ринджибал Алмайсам // Сб. трудов науч.-практ. конф. с междунар. участием «Восток-Запад». - Уфа., 2012.-С. 167-169.

17. Никитин Д.Н. О роли митохондриальной дисфункции в про-грессировании глаукомной нейрооптикопатии / Д.Н. Никитин, Фар-

зад Захеди, Ринджибал Ал-Майсам // Практик, медицина. — 2012. - № 4(59). - С. 221-223.

18. Аничков Н.М. Головной мозг и открытоугольная глаукома / Н.М. Аничков, Д.Э. Коржевский, М.С. Захряпин, Д.Н. Никитин, Ринджибал Алмайсам, Фарзад Захеди И Практич. медицина. - 2012. - № 4 (59). - С. 157-161.

19. Алексеев В.Н. Изменения центральных отделов зрительного анализатора при первичной открытоугольной глаукоме / В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, И.Р. Газизова // Матер, науч.-практич. конф. офтальмологов с между-нар. участием. - Одесса, 2012. - С. 95-96.

20. Алексеев В.Н. Первичная открытоугольная глаукома и дегенеративные изменения в центральных отделах зрительного анализатора / В.Н. Алексеев, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин, Тубаджи Ессам, Ринджибал Алмайсам, Фарзад Захеди // Офтальмол. ведомости. - 2012. - Т.5, №3. - С. 23-29.

21. Алексеев В.Н. Роль митохондриального аппарата в прогрессирова-нии открытоугольной глаукомы / В.Н. Алексеев, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин, М.С. Захряпин // Матер, науч. конф. офтальмологов «Невские горизонты». - СПб, 2012. - С. 305-308.

22. Алексеев В.Н. Морфологические изменения зрительного тракта при первичной открытоугольной глаукоме / В.Н. Алексеев, Н.М. Аничков, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин // Матер. X междунар. конф. «Глаукома: теории, тенденции, технологии». - Москва, 2012. - С. 18-21.

23. Алексеев В.Н. Головной мозг и открытоугольная глаукома / В.Н. Алексеев, Н.М. Аничков, Д.Э. Коржевский, Д.Н. Никитин, Ринджибал Алмайсам, Фарзад Захеди // Сб. науч. статей конф. «Глаукома: теория и практика». - СПб., 2013. - С. 3-9.

24. Алексеев В.Н. Дегенеративные изменения в центральных отделах зрительного анализатора при первичной открытоугольной глаукоме // В.Н. Алексеев, Е.Б. Мартынова, Д.Н. Никитин, В.И. Садков, Тубаджи Ессам,

Ринджибал Алмайсам, Фарзад Захеди // Сб. науч. статей конф. «Глаукома: теория и практика». - СПб., 2013. — С. 16-22.

25. Алексеев В.Н. Дегенеративные изменения проводящих путей зрительного анализатора у больных первичной открытоугольной глаукомой // В.Н. Алексеев, Д.Н. Никитин, Ринджибал Алмайсам, Т.Н. Медведникова, В.Е. Корелина II Сб. науч. статей конф. «Глаукома: теория и практика». -СПб., 2013.-С. 23-25.

26. Алексеев В.Н. Морфологические изменения зрительного тракта при первичной открытоугольной глаукоме / В.Н. Алексеев, Н.М. Аничков, И.Р. Газизова, Д.Н. Никитин // Новости глаукомы. - 2013. - №1. - С. 30-31.

27. Заявка на патент №2013135846; заявл. 30.07.2013. «Способ прогнозирования риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии» / Алексеев В.Н., Егоров Е.А., Газизова И.Р., Никитин Д.Н.

Подписано в печать 02.10.13 Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 612

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.