Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Место пробиотиков в профилактике и лечении лекарственно-индуцированной диареи

На правах рукописи

Ивашкина Наталья Юрьевна

МЕСТО ПРОБИОТИКОВ В ПРОФИЛАКТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ДИАРЕИ

14.01.04 - внутренние болезни (мед. науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 8 АВГ 2014

Москва -2014

005552007

005552007

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ)

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ Маев Игорь Вениаминович

Официальные оппоненты:

Калинин Андрей Викторович - доктор медицинских наук, профессор, ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф Владимирского, кафедра гастроэнтерологии, профессор

Халиф Игорь Львович - доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ ГНЦК МЗ РФ, отделение гастроэнтерологии, заведующий

Эрдес Светлана Ильинична - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М.Сеченова» МЗ РФ, кафедра пропедевтики детских болезней педиатрического факультета, заведующая

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский Клинический Научно - практический Центр» Департамента здравоохранения города Москвы (ГБУЗ «МКНЦ» ДЗМ)

Защита диссертации состоится « 16 » сентября 2014 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 208.041.01 при Московском Государственном Медико-стоматологическом Университете (127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова» Минздрава России (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а) и на сайте http://dissov.msmsu.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Лобанова Елена Георгиевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

За последние десятилетия диарейный синдром - наиболее часто встречающийся побочный эффект антибиотикотерапии - стал одной из самых распространенных гастроэнтерологических патологий. По различным данным до 30% всех пациентов, получающих антибиотики, страдают от развития этого побочного явления [Маев И.В. 2007; D'Souza A.L. 2002]. Еще более высокая частота наблюдается у детей и пожилых пациентов [Учайкин В.Ф. 2002; Бельмер С.В. 2004; Allen S.J. 2012; Jonston B.C. 2007]. Патогенез лекарственно-индуцированной диареи остается не до конца понятным, ряд авторов склоняются к теории о качественном и колотественном изменении микрофлоры кишки под воздействием антибиотиков. Также называется ряд других факторов, способствующих развитию диареи. Антибиотики, содержащие клавулановую кислоту, стимулируют двигательную функцию кишечника. Диарея, возникающая после приёма цефоперазона и цефиксима, является следствием неполного всасывания этих антибиотиков в кишечнике. Изменение состава бактериальной флоры кишечника, возникающее на фоне терапии антибиотиками, может привести к нарушению расщепления углеводов на короткоцепочечные жирные кислоты, в норме осуществляемого бактериями в толстой кишке, и развитию осмотической диареи [Ивашкин В.Т. 2002; Халиф И.Л. 2009; Bartlett J.G. 1992].

Одним из часто встречающихся и тяжело протекающих осложнений применения антибиотиков считается диарея, вызванная анаэробной флорой, например Clostridium difficile [Калинин А.В 2006; Badger V.O. 2012]. Распространенность носительства Clostridium difficile у взрослых составляет до 3% [Noren Т. 2004, Wilcox МН. 2008], резко возрастая у больных, находящихся в стационарах и получающих антибиотики (до 15-40%) [Allen S.J. 2012]. Сложности своевременного распознавания лекарственно-индуцированной диареи, вызванной Clostridium difficile, объясняются трудностями культивирования микроорганизма [Cohen S.H. 2010; Wilcox М.Н. 2008;].

Несмотря на достижения последних лет, проблема лечения лекарственно-индуцированной диареи на фоне основного заболевания остается сложной задачей. Многочисленные зарубежные исследования показывают эффективность превентивного применения пробиотиков для предотвращения развития лекарственно-индуцированной диареи [Dendukuri N. 2005, D'Souza A.L. 2002, McFarland L.V. 2006]. В нашей стране отсутствие статистических данных по распространенности этого осложнения, его плохая диагностика и отсутствие стандартов профилактики не привели к повсеместному назначению пробиотиков при применении антибиотиков в широкой практике. Также этому способствует отсутствие достоверных критериев по выявлению тех пациентов, у которых разовьется антибиотико-ассоциированная диарея. Для профилактики развития лекарственно-индуцированной диареи применяются представители нормофлоры человека Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, а также дрожжевых грибков Saccharomyces [Эрдес С.И. 2009; Can М. 2006; Jonston B.C. 2012, Sazawal S. 2006, Szajewski H. 2005].

Современные тенденции применения пробиотиков заключаются в применении определенных штаммов при конкретной патологии [Reid G. 2003]. Поэтому важным оказывается определение систематического таксономического положения микроорганизмов, составляющих основу пробиотических препаратов, с применением современных методов исследования, а также молекулярно-генетических характеристик пробиотических свойств их штаммов, применяемых для профилактики и лечения лекарственно-индуцированной диареи. Кроме того, особенно важным оказывается способность пробиотика выдерживать низкие значения рН и присутствие солей желчи с сохранением пробиотического потенциала и антагонистической активности микроорганизмов, составляющих основу пробиотических препаратов. В связи с этим актуальной является задача определения данных свойств у штаммов микроорганизмов, применяемых при лечении антибиотико-ассоциированной диареи (ААД).

Цель исследования: изучение клинических свойств пробиотических препаратов и их эффективности в профилактике и лечении лекарственно-индуцированной диареи.

Задачи исследования:

1. Выяснить встречаемость лекарственно-индуцированной диареи в популяции пациентов, принимающих антибиотики длительностью не менее Зх дней;

2. Показать возможность профилактики развития антибиотико-ассоциированной диареи при назначении пробиотиков;

3. Получить данные о пробиотических культурах, которые могут быть рекомендованы как средство выбора для профилактики развития антибиотико-ассоциированной диареи;

4. Показать необходимость применения молекулярно-биологических методик при определении видовой принадлежности лактобацилл. Использовать для идентификации и внутривидовой дифференциации бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Lactobacillus методику анализа последовательности гена 16S рРНК;

5. Выявить разрешающую способность метода RAPD-PCR для пггаммовой идентификации лактобацилл и провести генетическую паспортизацию природных и промышленных культур бактерий родов Lactobacillus с применением этой методики;

6. Протестировать штаммы Lactobacillus на наличие пробиотических свойств (способность переносить низкие значения рН и присутствие солей желчи, синтезировать экзополисахариды, витамины, биогенные амины).

Научная новизна

1. В работе изучена встречаемость лекарственно-индуцированной диареи при приеме антибиотиков у пациентов общетерапевтического профиля, находящихся на стационарном лечении;

2. Проведен сравнительный анализ частоты выявления антибиотико-ассоциированной диареи при использовании ретроспективного и проспективного методов исследования;

3. Изучена частота носительства С. difficile у пациентов при длительном назначении антибиотиков и нахождении в стационаре;

4. Проведен анализ снижения риска развития антибиотико-ассоциированной диареи при назначении пробиотического препарата;

5. Идентифицировны пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus с использованием филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S РНК и генетическая паспортизация этих штаммов с применением методики молекулярного типирования (РАПД-ПЦР);

6. Установлены молекулярно-генетические характеристики и пробиотический потенциал данных штаммов;

7. Проведена сравнительная характеристика метаболических свойств различных штаммов лактобацилл;

8. Проведено определение устойчивости штаммов к низким значениям рН и присутствию солей желчи;

9. Изучена способность производственных штаммов пробиотического препарата для профилактики антибиотико-ассоциированной диареи вырабатывать полисахариды, осуществлять синтез витаминов, продукцию биогенных аминов, их гипохолистеринемическая активность, устойчивость к антибактериальным веществам и антагонистическая активность;

Практическая значимость

Показано, что пациенты с ААД составляют более десяти процентов среди общего числа взрослых пациентов и более трети случаев - среди детей, получающих лечение антибиотиками.

Было выявлено, что имеет место недооценка симптоматики ААД, значительно уменьшающая уровень диагностики данного заболевания. Так, в реальной практике в популяции взрослых пациентов не диагностированные случаи антибиотико-ассоциированной диареи могут составить от 4,5% до 15,5%, а у детей в возрасте до 3 лет — от 36% до 66%.

С использованием бактериологического метода диагностики было показано, что у больных, получающих антибиотики из группы пенициллинов и цефалоспоринов и находившихся в стационаре более Зх недель, частота носительства С. difficile составляет 7,1 %.

Было показано, что среди взрослых пациентов, получающих пробиотические штаммы бактерий рода Lactobacillus, антибиотико-ассоциированная диарея встречается менее чем в одном проценте случаев.

Продемонстрирована лечебно-профилактическая эффективность пробиотического препарата, содержащего L. acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12, при антибиотико-ассоциированной диарее у пациентов, получающих антибактериальную терапию. Применение пробиотического препарата одновременно с назначением антибиотиков позволяет снизить вероятность ее развития на 5,6 - 17%, уменьшить степень выраженности и продолжительность диареи на 40%. С использованием метода секвенирования гена 16S РНК идентифицирована таксономическая принадлежность пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, BC401, BC416, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BC421, BC423, Lactobacillus casei BC431, BC433.

Продемонстрировано отсутствие у пробиотических штаммов L.acidophilus NKb NK.2, NK5, NK12 экстрахромосомной ДНК, то есть мобильной генетической информации и собственной вирулентности.

Была показана способность пробиотических штаммов Ь.ас1йорЫ1ш синтезировать экзополисахариды и выживать в средах с низким значением рН (2) и с 20% содержанием желчи, что позволяет им преодолеть верхние отделы желудочно-кишечного тракта и проявить свою биологическую активность. Были выявлены минимальные уровни продукции биогенных аминов лактобактериями Ь.аас1орЫ1т №С1, ИК2, №С5, №С12, что позволяет их применять при аллергических состояниях, не увеличивая биологически активную нагрузку на организм.

Обнаружена способность штаммов лактобактерий Ь.ас1с1орЫ\т №С1, N£2, №С5, N102 к синтезу витаминов группы В, в том числе витамина В^. Данное свойство позволяет использовать штаммы для профилактики гиповитаминозов витаминов группы В.

Обоснованы рекомендации по использованию при выборе культур для лекарственного пробиотического препарата с целью профилактики ААД штаммов с точно определенной видовой принадлежностью и с наиболее выраженными пробиотическими свойствами.

Реализация результатов исследования

Результаты исследований и материалы диссертации могут быть использованы терапевтами, гастроэнтерологами, пульмонологами, нефрологами как в условиях стационара, так и поликлиники.

Предложенные в работе методики используются в стационарах клинических баз кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова МЗ РФ (Центральная клиническая больницы № 1 ОАО «Российские железные дороги», Центральная клиническая больницы № 2 ОАО «Российские железные дороги», ГБУЗ «Медико-санитарная часть № 33 Департамента здравоохранения города Москвы»), Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного факультета с 2010 г. и используются

преподавателями кафедры на теоретических занятиях со студентами П-1У курсов лечебного факультета, клиническими интернами, ординаторами и аспирантами кафедры, курсантами цикла ФПДО и ФПКП, в лекционном материале и методических рекомендациях.

Личный вклад автора. Автору принадлежит существенная роль в выборе направления и программы диссертационного исследования, анализе и обобщения полученных результатов. В разделах исследования, выполненных в соавторстве, автором лично проведены набор материала и научной информации по теме диссертации, статистческие и аналитические расчеты, обобщение полученных результатов. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования, в том числе при формулировке цели и определении задач, их реализации, обсуждении результатов, подготовке выводов и практических рекомендаций, освещении материалов в печати и на различных форумах, внедрении результатов исследования в практику.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Анализ клинической картины стационарных больных, получающих антибактериальную терапию по поводу различной соматической патологии, свидетельствует о высокой встречаемости лекарственно индуцированной диареи. Ретроспективный анализ историй болезни пациентов, принимавших антибиотики, показал низкое выявление данной патологии. Сравнение частоты выявления антибиотико-ассоциированной диареи при ретроспективном и проспективном методах исследования впервые выявило гиподиагностику этого осложнения.

2. Клиническая картина лекарственно индуцированной диареи характеризуется появлением неоформленного жидкого стула более трех раз в день с развитием водно-электролитных нарушений, что существенно осложняет течение основного заболевания.

3. Основным методом эффективной профилактики развития лекарственно-индуцированной диареи в стационарных и амбулаторных условиях является

назначение пробиотических препаратов не позднее 48 часов от начала антибиотикотерапии.

4. Продолжительность применения пробиотиков должна составлять не менее 10 дней. Профилактический прием пробиотических препаратов существенно снижает риск возникновения лекарственно индуцированной диареи, а также обладает терапевтическим эффектом и приводит к статистически значимому снижению длительности ААД и более легкому течению этого осложнения.

5. При использовании для профилактики лекарственно индуцированной диареи пробиотических штаммов необходимо руководствоваться данными об определении видовой принадлежности молекулярно-биологическими методами, а также доказать отсутствие мобильной генетической информации.

6. Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно индуцированной диареи, должны демонстрировать возможность выживания в кислой среде и присутствии солей желчи (устойчивость в кислой среде, к солям желчи).

7. Пробиотические штаммы, применяемые в целях профилактики лекарственно-индуцированной диареи, должны обладать способностью к ферментации дисахаридов, а также к синтезу витаминов. В то же время необходимо, чтобы у них отсутствовало свойство синтеза биогенных аминов. Результаты исследований штаммов Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 демонстрируют их видовую принадлежность к виду Lactobacillus acidophilus и полное отсутствие мобильной генетической информации, способность переносить низкие значения рН и присутствие солей желчи, способность к синтезу витаминов В5, В12, РР, минимальную концентрацию биогенных аминов в среде культивирования, что делает эти штаммы средством выбора для профилактики ААД.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены на: XIV Российской

гастроэнтерологической неделе (Москва, октябрь 2008 г.); VII Конгрессе детских

ю

инфекционистов России (Москва, декабрь 2008); XVIII Европейской гастроэнтерологической неделе (Лондон, ноябрь 2009 г.); XVI конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009); XV Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2009 г.).

Диссертация апробирована на межкафедральной научно-методической конференции кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии и кафедры госпитальной терапии Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета им. А.И. Евдокимова «18 » октября 2013 г. (протокол № 14).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 научных работ, в т.ч. 15 в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 главы в руководствах и монографиях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста и включает введение, 3 главы (обзор литературы, описание материала и методов исследования, результаты), заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы из 294 источников (30 отечественных и 264 иностранных авторов). Работа иллюстрирована 33 таблицами и 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач был обследован 481 взрослый пациент (261 женщина, 220 мужчин) и 705 детей в возрасте от Зх месяцев до 15 лет с острыми инфекционными заболеваниями, находившихся в стационаре и получавших антибиотики. Курс антибиотикотерапии продолжался не менее Зх дней и назначался по поводу острой пневмонии - 218 случаев, острого пиелонефрита и

обострения хронического пиелонефрита - 71, язвенной болезни желудка и

и

12перстной кишки Н. pylori + - 84, острого бронхита и обострения хронического обструктивного бронхита - 10, острых заболеваний женских половых органов - 20, гнойных осложнений, связанных с сахарным диабетом - 42, др. заболеваний - 36. Средний возраст составлял 57,4 ± 8,7 лет. В детской группе пациенты получали антибиотики по поводу острого бронхита - 293 случая, ОРВИ - 284, острой пневмонии 37, острого пиелонефрита 55, острого отита 4, др. заболеваний — 32 случая. Истории болезней детей с острыми кишечными инфекциями не учитывались.

Пациенты были распределены на следующие группы:

• группа ретроспективного анализа, в которой изучались истории болезни пациентов, находившихся в стационаре и получавших антибактериальную терапию не менее Зх дней;

• опытная группа, в который пациенты получали пробиотический препарат на фоне проведения антибиотикотерапии в стационарных условиях;

• контрольная группа — пациенты, получали антибактериальную терапию не менее Зх дней в условиях стационара.

В таблице 1 представлено количество больных с различными заболеваниями в опытной, контрольной группах и группе ретроспективного анализа (отличие не достоверно). В таблице 2 представлено количество пациентов детского возраста с различными заболеваниями в группе ретроспективного анализа (отличие не достоверно).

Таблица 1

Контрольная группа (п= 75) Опытная группа (п= 150) Группа ретроспективного анализа (п= 200)

Острая пневмония 39 (52%) 81 (54%) 98 (49%)

Острый бронхит, обострение хр. бронхита 4 (5%) 6 (4%)

Обострение хр. пиелонефрита 11 (15%) 24 (16%) 36(18%)

Язвенная болезнь желудка и 12 перстной кишки Н. pylori + 18(24%) 39 (26%) 46 (23%)

Острые воспалительные заболевания женских половых органов 20 (10%)

Другие заболевания 3 (4%)

Таблица 2

Группа ретроспективного анализа (пробиотик)(п= 105) Группа ретроспективного анализа (п= 600)

Острый бронхит 41 (39%) 252 (42%)

ОРВИ 36 (38%) 246(41%)

Острая пневмония 1 (1%) 36 (6%)

Острый пиелонефрит 20 (19%) 35 (6%)

Острый отит 4 (3%)

Др. заболевания 1 (1%) 31 (5%)

В состав иробиотического препарата, применяемого в опытных группах, входили штаммы Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12 в количестве

107.

Появление диарейного синдрома оценивалось как наличие неоформленного стула до 5 раз в течение 48 часов. Для исключения инфекционного характера

диареи проводились анализы, направленные на выявление бактериальных и вирусных возбудителей кишечных инфекций (в т.ч. Rapid Strip Rota-Adeno, Meridian Bioscience Inc, Италия). Для определения частоты носительства С.difficile у стационарных больных проводились посевы кала больных, находящихся в стационаре и получающих антибиотики, на кровяной агар и среду Эндо. Чашки Петри культивировались при 37 °С в анаэростатах в течение 7 дней. Наличие токсинов определялось при помощи тест системы ImmunoCari/® Toxins А & В (TechLab, Blacksburg, Va., США).

Объектами исследования служили 10 штаммов лактобацилл из коллекции молочнокислых бактерий лаборатории генетики бактерий ФГУП ГосНИИ Генетика, пробиотических бактерий, а также лактобацилл, выделенных из содержимого кишечника здоровых людей и из кисломолочных продуктов домашнего изготовления. Это штаммы: Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, BC401, BC416, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BC421, BC423, Lactobacillus casei BC431, BC433.

Микробиологические методы исследования. В работе использовались классические микробиологические методы работы с непатогенными бактериальными культурами. Основными средами для культивирования штаммов бактерий служили среды М21 и MRS. При выращивании бактерий на плотных питательных средах применялись анаэростаты и газогенерирующие пакеты (bioMerieux, Франция), обеспечивающие атмосферу, содержащую 10% С02. Для изучения морфологических характеристик изучаемых культур готовили препараты, окрашенные по Граму и метиленовым синим, далее их микроскопировали с иммерсией при увеличении 90x15. Биохимическая идентификация проводилась с использованием тест-системы API-50CHL (bioMerieux, Франция), позволяющей оценивать ферментативную активность 50 субстратов, и программного обеспечения к ней API WEB, согласно инструкции к набору.

Способность бактерий переносить низкие значения рН. Свежие ночные культуры бактерий, выращенные в жидкой среде МРС при рН 6,2, засевались в

14

среду MPC с рН 2,0. Измерения титра культур проводились через 30, 60 ,90 ,120 мин после засева культур. Контролем в опыте служили клетки бактерий, внесённые в среду MPC с рН 6,2, титр которых определялся через 120 мин после внесения.

Устойчивость к желчи тестировалась в присутствии 20% и 40 % желчи в среде культивирования бактерий.

Способность бактерий продуцировать витамины определялась методом ВЭЖХ с использованием колонки «Эликсис-1» С18-150х4,6 mm, 5.0 nm. Температура колонки - 50° С, инжекция -10 мкл, X — 210 нм, градиент: А -ацетонитрил, В - 0,1%, трифторуксусная кислота, С- метанол. Прием и обработку данных производили с использованием компьютерной системы "Empower Pro". Синтез биогенных аминов. Количественное определение биогенных аминов проводили высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе "Alliance" (Séparations Module Waters 2695, Photodiode Array Detector Waters 2996). Дериватизация исследуемых образцов, содержащих биогенные амины, осуществлялась дансилхлоридом. Полученный раствор в количестве 5 мкл наносили на колонку Cl8 250x4,0 мм, 5,0 цм и анализировали при длине волны Х=254 нм, t=40 °С. Тестировали способность бактерий продуцировать путресцин, кадаверин, гистамин, тирамин. Прием и обработку данных производили с использованием компьютерной системы "Empower Pro".

Способность штаммов ферментировать углеводы тестировали в среде MRS с анализируемым углеводом (лактоза, галактоза) в концентрации 10 г/л и красителем бромкрезоловым пурпурным в концентрации 32 мг/л. Об утилизации сахара судили по приобретению колониями и питательной средой желтой окраски.

Для исследования антибиотикочувствительности был применен диско-диффузионный метод на основе методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (МУК 4.2.1890-04).

Способность штаммов синтезировать экзополисахариды оценивалась при росте бактерий на среде следующего состава: сухое молоко с пониженным содержанием жира - 10% (или цельное обезжиренное молоко в качестве основы среды), дрожжевой экстракт - 0,5%, агар - 1,5%, сахароза - 1%, рутениевый красный — 80 мг/л.

Молекулярно-биологические методы исследования: генетические методы,

используемые в работе (выделение плазмидной ДНК из микроорганизмов,

выделение хромосомной ДНК, электрофорез ДНК, рестрикция ДНК и др.),

являются модификацией известных методов [Маниатис Т., 1984]. Получение

препаратов плазмидной ДНК из молочнокислых бактерий проводили согласно

методике [Anderson Т.,1983]. Компьютерный анализ подбора праймеров

проводили с применением компьютерных программ: NCBI Blast2 - определение

гомологии при изучении сиквенсов с соответствующих праймеров, Oligo 6.31 -

основной расчет характеристик ПЦР, возможности образования праймерами

дуплексов и вторичных структур, определение мест неспецифического

праймирования на матрице, Oligonucleotide Properties Calculator - определение

температуры отжига праймеров и % GC состава. Полимеразная цепная реакция

(ПЦР) и её модификации (видоспецифическая, штаммоспецифическая, RAPD-

PCR) проводилась по стандартным или модифицированным методикам. Для

постановки ПЦР использовали реактивы фирмы "Fermentas", праймеры,

специально подобранных нами и синтезированные фирмой "Синтол",

амплификатор фирмы "Perkin Elmer". Выделение и очистку ДНК из арагозного

геля проводили с использованием набора для очистки амплифицированной ДНК

фирмы "Sigma" согласно рекомендациям фирмы-производителя. Секвенирование

фрагментов генов осуществляли по методу Сэнгера [Senger S., 1977] на

автоматическом анализаторе ДНК ABI PRISM™ фирмы "Applied Biosystems", с

набором реактивов "ABI Prism BygDye Terminator Cycle Sequencing Ready

Reaction Kit" фирмы "Applied Biosystems". Пульс-гель электрофорез геномной

ДНК проводили в 1% агарозном геле, приготовленном на агарозе "Sigma", тип А

при напряженности поля 6 В/см в 0,5 % буфере TBE при 14°С в аппарате CHEF-

16

DRIII фирмы "BioRad" с режимом постепенного изменения времени пульса с 5 до 15 сек в течение 24 ч. Изображение гелей получали при помощи цифрового фотоаппарата "Casio QV-3500 EX", изображения сохранялись в виде графических файлов с расширением .TIFF и экспортировались в программу для обработки гелей. Геномный анализ проводился по полным последовательностям геномов бактерий, доступных в базе GenBank, на основе гомологии к нуклеотидным последовательностям интересующих генов у молочнокислых бактерий с помощью программы Blast.

Филогенетический анализ. Для анализа полученных последовательностей генов применяли программу Blast. Результаты секвенирования анализировались с использованием программы Vector NTI: ContigExpress. Множественное выравнивание последовательностей проводилось в программе ClustalX, филогенетический анализ, расчет генетических дистанций, построение дендрограмм - в программе Mega4.0. Анализ рестриктограмм геномных ДНК, полученных методом PFGE, и анализ фореграмм, полученных методом RAPD-PCR, построение филогенетических дендрограмм осуществлялся с применением компьютерного обеспечения BioNumerics (версия 4.0; Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Для анализа рестриктограмм проводилось вычисление подобия геномных фингерпринтов согласно алгоритму Дисе (Dice) и по методу корреляции Пирсона (с учетом коэффициента корреляции для континуальных переменных). Для построения дендрограмм использовали матрицу подобия, полученную согласно алгоритму последовательной кластеризации. Для вычисления статистической значимости были применены два основных инструмента программы: метод выключения кластеров (cluster cut-off method) и кофенетическая корреляция (cophenetic correlation). Подсчет величин фрагментов рестрикции осуществлялся в программе BioNumerics.

Микробиологические исследования, в т.ч. посевы в анаэробных условиях, были выполнены под руководством заведующего кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова д.м.н., профессора В.Н. Царева.

Методы исследования:

1. Клиническое обследование (сбор анамнеза, осмотр). Отделения гастроэнтерологии, нефрологии Центральной клинической больницы № 1 ОАО «Российские железные дороги», отделение общей терапии ГБУЗ «Медико-санитарной части № 33 Департамента здравоохранения города Москвы», отделения пульмонологии, гастроэнтерологии, общей терапии Центральной клинической больницы № 2 ОАО «Российские железные дороги»;

2. Ретроспективный анализ историй болезни пациентов, получавших антибиотики;

3. Медицинская документация клинических баз кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова; кафедры инфекционных болезней у детей № 1 РНИМУ им. Н.И. Пирогова;

4. Микробиологические методы исследования молочно-кислых культур (культивирование, изучение морфологических характеристик, биохимическая идентификация, способность бактерий переносить низкие значения рН, устойчивость к желчи, синтез биогенных аминов, способность штаммов синтезировать экзополисахариды, способность бактерий продуцировать витамины, исследование антибиотикочувствительности, способность штаммов подавлять рост условно-патогенной микрофлоры);

5. Молекулярно-биологические методы исследования: (выделение плазмидной ДНК из микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электрофорез ДНК, рестрикция ДНК и др.);

6. Филогенетический анализ (анализ рестриктограмм геномной ДНК, расчет генетических дистанций);

7. Микробиологические исследование кала больных длительно находящихся в стационаре и получающих антибиотики (посев на среде Эндо, кровяном агаре, анаэростат для анаэробного культивирования микроорганизмов);

8. Копрологические тесты для определения наличия токсинов С. difficile (ToxAB-EIA; TechLab, Blacksburg, Va., США), антигенов к рота- и аденовирусам (Rapid Strip Rota-Adeno, Meridian Bioscience Inc, Италия);

9. Статистическая обработка данных с использованием методик описательной статистики (расчет доверительного интервала доли, разности средних и т.д.). Лечение

Наряду с антибактериальной терапией пациенты с острой пневмонией, острым бронхитом, обострением хронического обструктивного бронхита получали бронхолитические и отхаркивающие средства; острым пиелонефритом и обострением хронического пиелонефрита — ангиопротекторы, корректоры микроциркуляции и нестероидные противовоспалительные средства; язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки — антисекреторные препараты (ингибиторы протонной помпы, антациды), в ряде случаев — метронидазол и препараты висмута; острыми респираторными вирусными инфекциями -нестероидные противовоспалительные средства, муколитики, Hj-антигистаминные средства, острыми заболеваниями женских половых органов -противовоспалительную терапию.

Частота назначаемых антибиотиков представлена в таблице 3.

Таблица 3.

Частота использования антибиотиков

Применяемые антибиотики Частота использования, %

Цефалоспорины Зго поколения 34,0

Цефалоспорины 1 го поколения 30,0

Макролиды 21,0

Цефалоспорины 4го поколения 7,0

Полусинтетические пенициллины 6,7

Аминогликозиды 1,0

С целью профилактики развития диареи при применении антибиотиков пациенты получали пробиотический лекарственный препарат, содержащий штаммы L. acidophilus NKb NK2, NK5, NK12 в количестве 107 два раза в сутки течение всего курса антибиотикотерапии.

При развитии диареи пациентам назначались вяжущие средства и пробиотики.

Статистическая обработка данных

Для характеристики результатов исследования использовались методики описательной статистики с вычислением точных значений доверительных интервалов первичных результатов (биноминальное распределение). Применение описательной статистики по обобщению данных включало следующие этапы: сбор, категоризация, обобщение, представление. Первичные результаты оценивались как качественные признаки, выражающие существенное неотъемлемое свойство предмета.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Частота выявления антибиотико-ассоциированной диареи. Полученные данные опираются на результаты обследования 481 пациента. При ретроспективном исследовании было проанализировано 200 историй болезней пациентов, находившихся в стационарах клинических баз кафедры пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии МГМСУ (Центральная клиническая больницы № 1 ОАО «Российские железные дороги», Центральная клиническая больницы № 2 ОАО «Российские железные дороги», ГБУЗ «Медико-санитарная часть № 33 Департамента здравоохранения города Москвы») и получавших антибиотики не менее 3-х дней с целью выявления диарейного синдрома. Истории болезней пациентов с острыми кишечными инфекциями не учитывались. Развитие диарейного синдрома было отмечено в 4-х случаях. При проведении микробиологического исследования кала патогенных энетробактерий не обнаружено. Длительность диарейного синдрома составила 8,1±2,3 дней, отмечена диарея средней степени тяжести (количество дефекаций 4-6 раз в сутки

с развитием ранней дегидратации). На основании этих данных частота антибиотико-ассоциированной диареи составила 2 % (доверительный интервал 04 %, р<0.05) всех случаев применения антибиотиков. Диарея возникала на 2-ой день применения антибиотиков, течение диареи средней тяжести (классификация тяжести диареи ВОЗ).

Для уточнения частоты развития антибиотико-ассоциированной диареи у пациентов, получающих антибиотики, был выбран метод проспективного открытого сравнительного клинического исследования в двух группах, который стремится избежать наличия систематической ошибки при сравнении эффективности то или иного вмешательства. В опытную группу было включено 150 пациентов, получавших антибактериальную терапию не менее Зх дней и пробиотический лекарственный препарат Lactobaccilus acidophilus в течение 10 дней, в контрольной группе (75 пациентов) не назначался пробиотик. В контрольной группе диарейный синдром возник у 9 пациентов, средний возраст 47,1 ± 6,1 лет. Диарея возникала на 4,3 ± 2,1 день, длительностью до 5,1 ± 2,9 дней, лёгкой и средней степени тяжести. При проведении бактериологических и вирусологических исследований кала не было обнаружено энтеропатогенов. Частота развития антибиотико-ассоциированной диареи составила 12,0% (доверительный интервал 4,5-19,5%, р<0.05).

Расчёт достоверности различия для разницы долей (сравнение достоверности отличия между цифрами встречаемости 12% и 2%) показал гиподиагностику осложнения антибактериальной терапии.

Итак, с вероятностью 95% можно утверждать, что истинная величина различия попадает в интервал между 4,5% и 15,5%. Т.о. можно сделать заключение о достоверном различии величин частоты развития антибиотико-ассоциированной диареи (р<0,05) и гиподиагностики этого состояния в реальной практике.

В опытной группе диарейный синдром лёгкой степени возник в 1 -ом случае

из 150 наблюдений на 3-ий день применения антибиотиков. Лабораторные

исследования кала не выявили наличия бактериальных или вирусных

21

возбудителей кишечных инфекций. Т.о. при профилактическом применении L. acidophilus антибиотико-ассоциированная диарея возникала в 0,7 % (доверительный интервал 0,05-2%, р<0.05) случаев применения антибиотиков.

Итак, с вероятностью 95% можно утверждать, что истинная величина различия попадает в интервал между 5,6 и 17%. Т.о. можно сделать заключение о достоверном снижении распространенности антибиотико-ассоциированной диареи при применении L. acidophilus (р<0,05).

Качество диагностики антибиотико-ассоциированной диареи. Анализ историй болезни пациентов (п=600) у детей, получавших антибиотики по поводу острых инфекционных заболеваний, выявил наличие диарейного синдрома в 33%. Характеристика пациентов и доля пациентов с диареей представлена на рисунке 1. В половине случаев диарея зафиксирована на 2-ой день от начала антибиотикотерапии. Для купирования диареи применялись вяжущие средства и пробиотические препараты. Т.о. в реальной практике антибиотико-ассоциированная диарея диагностируется в интервале 29-37 % всех случаев применения антибиотиков. Для сравнения с литературными данными была взята частота выявления антибиотико-ассоциированной диареи 62 % для детей, получавших антибиотики в течение 10 дней, что сопоставимо с выборкой. Для ответа на вопрос имеется ли гиподиагностика этого состояния, был произведен расчёт достоверности различия для разницы долей. Тем самым, 95 % доверительный интервал для различия распространенности антибиотико-ассоциированной диареи имеет вид: 0,05< pi - р2 < 0,45. Т.о. можно сделать заключение о достоверном различии величин распространенности антибиотико-ассоциированной диареи (р<0,05). При сравнении данных ретроспективного анализа и обзоров литературы отмечается выраженная гиподиагностика ААД.

Количество пациентов с диарейным синдромом

Общее количество пациентов

Рисунок 1

Распределение пациентов ретроспективного анализа по нозологическим

единицам

Превентивное назначение Lactobacillus acidophilus. При анализе историй болезни пациентов детского возраста частота возникновения диареи в случаях превентивного назначения L. acidophilus (средний возраст 10,4±6,9 месяцев) снижается на 22%. Средняя длительность диареи у маленьких детей была 5,1 ±1,4 день, при применении пробиотика средняя продолжительность диарейного синдрома сокращалась до 3,2±1,3 дней (р<0.001). При оценке частоты встречаемости у детей старшего возраста (от Зх до 15 лет) встречаемость ААД составила 25 % (доверительный интервал 4-46 %). При применении пробиотика диарея в этой возрастной группе была зафиксирована в одном случае из 39 наблюдений, т.е. в 3 % (доверительный интервал 0-8 %).

Частота носительства С. difficile. Для выявления частоты носительства С.difficile у стационарных больных проводились посевы кала пациентов (42 чел), находящихся в стационаре более Зх недель и получающих антибиотики из группы пенициллинов и цефалоспоринов, на кровяной агар и среду Эндо. Только в 1-ом

случае был выявлен рост нетоксигенных штаммов С. difficile. Т.о. частота

23

носительства С. difficile у больных, длительно находящихся в стационаре, составила 2,4 % (доверительный интервал 0,9-12%, 95%).

Идентификация культур молочнокислых бактерий. Молекулярно-генетическая идентификация осуществлялась с использованием анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Проведенное секвенирование гена 16S РНК штаммов L. acidophilus NKb NK2, NK5, NKi2 доказало их принадлежность к виду Lactobacillus acidophilus (см. табл. 4).

Таблица 4

Уровень гомологии последовательности 16S РНК различных штаммов __Lactobacillus acidophilus

Эталонные Сравниваемые последовательности

последовательности L. acidophilus / уровень гомологии

L. acidophilus NK1 NK2 NK5 NK12

LH5 99%

NCFM 98% 99% 99%

LH4 98%

DLH 3501 98%

IDCC 3301 100%

YI 99%

JVT5 99%

АТСС 4356 97% 99%

JCM 11047 97% 99% 98%

HB APT 1 99%

АТСС 521 98% 98%

СССВ1209 98%

По результатам проведенных исследований используемые в данной работе штаммы отнесены к трем видам: Lactobacillus acidophilus: NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, BC401, BC416, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus: BC421, BC423, Lactobacillus casei BC431, BC433. Филогенетическое древо, отражающее родственные взаимоотношения исследуемых штаммов, изображено на рис.1. Как видно из данных, схематически представленных на рисунке, культуры трёх видов лактобацилл обнаруживают высокую степень гомологии с типовыми представителями этих видов, нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных NCBI. Таким образом, по результатам

строения фрагмента гена 16S рРНК, протяженностью в 500 пар нуклеотидов, штаммы лактобацилл обнаруживают гомологию с последовательностями типовых представителей этих видов на довольно высоком уровне 98 - 100%. Следует отметить, что данная часть гена выбрана для анализа не случайно, поскольку именно проксимальная и дистальная части гена 16S рРНК являются наиболее вариабельными у молочнокислых бактерий родов Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus и Lactococccus.

Определение плазмидного профиля бактериальных клеток направлено на выявление наличия мобильной генетической информации (плазмиды, трансферроны) и возможности её передачи. Для этого с помощью ультрацентрифугирования клеток бактерий добиваются сепарации ядерной (заключенной в хромосомах) и экстрахромосомной ДНК с дальнейшим электрофоретическим разделением и визуализацией экстрахромосомной фракции в агарозным геле. На рисунке За показан электрофорез в агарозном геле экстрахромосомной ДНК, направленный на выявление кольцевой ДНК. В качестве контроля взяты другие штаммы того же вида Lactobacillus acidophilus 1217 и 1214, содержащие плазмиды, что хорошо визуализируется на форезе. На следующем этапе был проведен рестрикционный анализ, ДНК этих же штаммов была обработана рестриктазой Hind III для образования линейных структур. Однако, как и на первом, форезе не обнаружилось наличия каких-либо включений (рисунок ЗБ), что убедительно доказывает отсутствие в штаммах L. acidophilus NKi, NK-2, NK5, NK12 мобильной генетической информации.

L.acidophilus 100

L. delbrueckii sp

bulgaricus

100

NK 1 NK 2 NK 5 NK 12 ВС 401 NCFM ВС 416 ATCC 11842 ВС 423 ВС 421

ВС 431 ATCC 334 ВС 433

L. casei

100

0.02

Рисунок 2

Дендрограмма сходных отношений штаммов рода Lactobacillus, созданная на основе однородности нуклеотидов проксимального участка гена 16S рРНК, длиной в 500 нуклеотидов. На рисунке представлены 3 ветви, сформированные тремя видами: Lactobacillus delbrueckii sp. bulgaricus (ATCC 11842*), Lactobacillus acidophilus (NCFM*), Lactobacillus casei (ATCC 334*).* - в скобках указаны названия референтных штаммов, полная нуклеотидная последовательность которых сохранена в базе данных NCBI, чьи сиквенсы гена 16S рРНК и применялись для оценка гомологии. Достоверность кластеризации основана на данных bootstrap анализа (цифры в разветвлениях дерева)

Молочнокислые лактобациллы, относящиеся к видам Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbmeckii sp. bulgaricus, Lactobacillus casei, широко используются при изготовлении лекарственных препаратов. Природные изоляты и промышленные штаммы молочнокислых бактерий близкородственных видов, либо принадлежащих к одному виду, не всегда удаётся дифференцировать на штаммовом уровне, основываясь на их физиологически-биохимических характеристиках.

ПН

1217 1214 NK1NK2 NKi NK12 NK1 NK2 NK5 NK12

А. Б.

Рисунок 3

Изучение плазмидного профиля штаммов Lactobacillus acidophilus 1217, 1214, NK), NK2, NK5, NK12. А. Электрофорез экстрахромосомной ДНК штаммов Lactobacillus acidophilus 1217, 1214, NKb NK2, NK5, NK,2. Кольцевидные структуры показаны стрелками (3000 п.н. и 1800 п.н.) в контрольных штаммах. Б.Электрофорез ДНК Lactobacillus acidophilus NKb NK2, NK5, NK,2 после взаимодействия с ферментом Hind III.

Поэтому актуальным является использование различных методов ДНК-типирования для разграничения культур бактерий на уровне штамма, а также для изучения внутривидового разнообразия молочнокислых пробиотических бактерий. Идентификация культур на штаммовом уровне проводилась с применением методики РАПД-ПЦР с неспецифическим праймером ERIC1. Использование данной методики позволяет получать фингерпринты геномов штаммов молочнокислых лактобацилл и проводить сравнительный анализ и выявление геномного родства между исследуемыми культурами. На рисунке 4 приведены индивидуальные паттерны штаммов рода Lactobacillus. Как видно из данных, представленных на рисунке, штаммы Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12 очень близки, гомология их геномов при использовании этого метода составляет 94%. Штаммы Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus образуют одну ветвь дерева, тогда как две культуры

Lactobacillus casei отнесены к другой ветви с более низким процентом родства по отношению к остальным изучаемым в данной работе штаммам. Полученные результаты могут быть объяснены тем, что Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus ssp. bulgaricus относятся к одной филогенетической группе -Lactobacillus delbrueckii, a Lactobacillus casei образует другую группу со штаммами видов L. paracasei и L.ramnosus - группу Lactobacillus casei. На основании полученных результатов можно сделать заключение о предпочтительности использования метода RAPD-PCR с применением праймера ERIC-1 для паспортизации бактерий изучаемых видов на уровне штамма. Таким образом, использование этого праймера даёт возможность проводить сравнительный анализ фингерпринтов и получать данные о внутривидовом разнообразии изолятов лактобацилл изучаемых видов.

ERIC I

к я ........

§| gsg i

II I I I I I

rd

11 I

I I

I III

I

I II II

I I II II

Lactobacillus acidophilus NK1 Lactobacillus acidophilus NK2 Lactobacillus acidophilus NK5 Lactobacillus acidophilus NK12 Lactobacillus acidophilus BC401 Lactobacillus acidophilus BC416 Lactobacillus bulgaricus BC421 Lactobacillus bulgaricus BC 423 Lactobacillus casei BC 431 Lactobacillus casei BC 433

Рисунок 4

Дендрограмма родственных связей штаммов рода Lactobacillus, созданная по результатам сравнительного анализа фингерпринтов, полученных с использованием методики RAPD-PCR с применением праймера ERIC-1, согласно корреляции Пирсона

Способность бактерий переносить низкие значения рН. Данный параметр учитывается при рассмотрении вопроса о включении штамма в состав лекарственных препаратов пробиотиков, поскольку обеспечивает сохранение

жизнеспособности клеток при прохождении их через кислую среду желудка и жизнеспособность штаммов в кишечнике. По результатам проведенных исследований (рисунок 4) было показано, что штаммы Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, BC401, BC416 обладают повышенной кислотоустойчивостью по сравнению с культурами Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BC421, BC423 и Lactobacillus casei BC431, BC433. Титр штамма NK-1 после 1, 5 часов инкубации при рН 2,0 падает на один порядок, культур NK-2, NK-5, NK-12 - на два порядка, штаммов ВС401, ВС416 - на четыре порядка за 90 минут. Также на 4 и 5 порядков падает титр культур бактерий Lactobacillus casei, при этом культуры Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus BC421, BC423 оказались наименее устойчивыми. Низкий первоначальный титр культур Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12 по сравнению с другими исследуемыми лактобциллами объясним физиологическими потребностями этих штаммов к анаэробным условиям инкубации.

В верхних отделах желудочно-кишечного тракта штаммы бактерий сталкиваются с неблагоприятными условиями среды, обусловленными низкими значениями рН (значение составляет 2 и 3-5 во время приема пищи) и высокой концентрацией желчи. Низкое значение рН снижает продукцию ферментов, чувствительных к кислоте, и приводит к повреждению белков и ДНК. Желчные кислоты обладают мощной антибактериальной активностью, разрушая мембраны бактериальной клетки. Для обеспечения жизнедеятельности штаммов в кишечнике осуществлять селекцию и отбор культур пробиотических лактобацилл по устойчивости к низким значениям рН для включения именно таких штаммов в состав пробиотических продуктов и препаратов. Было показано, что некоторые штаммы L. casei и L. acidophilus, после культивирования при рН 2, а также в присутствии желчи, сохраняют концентрацию клеток более 107 КОЕ/мл.

1--

о -I-т-т-т-,

О мин 30 мин 60 мин 90 мин время пребывания в кислой среде -«-NKl -«-NK2 -*-NK5 -NK 12 -^-ВС401 -»-ВС416

Рисунок 4

Графическое изображение выживаемости при рН 2 штаммов

Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, BC401, BC416 (p<0.05)

Явление перекрестной адаптации у бактерий, проявляющееся в том, что устойчивость к одному из стрессовых факторов, позволяет выживать при суммарном воздействии обоих, подразумевает наличие общих механизмов защиты.

Способность штаммов синтезировать экзополисахариды. Штаммы

Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12 и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus: BC421, BC423 оказались способны продуцировать экзополисахариды. Данное свойство штаммов является ценным признаком при использовании в производстве и обеспечивает культурам более высокую способность к выживанию в неблагоприятных для бактерий условиях среды верхних отделах ЖКТ.

Для молочнокислых пробиотических бактерий способность продуцировать экзополисахариды штаммоспецифична. Количественная продукция экзополисахарида (ЭПС) в значительной степени зависит от состава питательной среды (источник углерода и азота) и условий роста (температура, соотношение N/C, рН, аэрация и т.д.). Продукция ЭПС у молочнокислых бактерий часто напрямую связана со скоростью роста, то есть максимальный выход ЭПС

30

наблюдается при максимальной скорости роста. Бактериальные ЭПС задействованы в осуществлении различных функций. Они обеспечивают защиту от токсических воздействий окружающей среды, способствуют колонизации, поглощению катионов, определяют антигенные свойства клетки. Высокий колонизационный потенциал и адгезивные свойства пробиотических микроорганизмов играют основную роль в формировании клеточной биопленки на поверхности эпителия кишечника.

Способность штаммов синтезировать витамины п биогенные амины. К основным физиологическим свойствам пробиотических культур относится синтез ими витаминов. Способность производственных штаммов к синтезу витаминов определялась по их содержанию в среде культивирования (табл. 5).

Таблица 5

Содержание витаминов (мг/л) после 16ч культивирования штаммов

Витамины NK1 NK2 NK5 NK12

В5 (Са пантотенат) 400.125 334.140 346.170 341.136

В5 (D пантенол) 54.825 15.387 16.154 14.404

В12 4.113 3.419 4.337 3.665

РР 9.022 8.394 9.891 9.740

Культуры Lactobacillus acidophilus NK-1, NK-2, NK-5, NK-12 способны к синтезу витаминов группы В, в том числе витамина В12; что является редким положительным свойством лактобактерий и позволяет использовать культуры для профилактики гиповитаминоза витаминов группы В.

Биогенные амины (БА) образуются в результате реакции а-декарбоксилирования аминокислот под влиянием декарбоксилаз микроорганизмов. Продукты, содержание БА в которых превышает 100 мг/л, не рекомендуются к употреблению. Уровень синтеза БА штаммами L. acidophilus NK], NK2, NK5, NK12 определялся по содержанию БА в среде культивирования микроорганизмов (табл. 6).

Таблица 6.

Уровень продукции биогенных аминов (мг/л) после 16ч культивирования

Биогенные амины ]ЧК1 1МК2 ]ЧК5 ]МК12

Гистамин 0 0 0 0

Кадаверин 1.508 0.536 0 0.687

Путресцин 0,825 2,368 0,508 0,695

Тирамин 0 0 0 0,162

Результаты определения синтеза биогенных аминов лактобактериями показали минимальные уровни продукции кадаверина, путресцина и полное отсутствие в среде культивирования гистамина. Это свойство лактобацилл позволяет применять их при аллергических состояниях, нисколько не увеличивая биологически активную нагрузку на организм.

ВЫВОДЫ:

1. Анализ клинической картины стационарных больных, принимающих антибиотики по поводу различной соматической патологии, выявил высокую частоту антибиотико-ассоцированной диареи (11,4%). Ретроспективный анализ больных, принимавших антибиотики, показал низкое выявление антибиотико-ассоцированной диареи (менее 2%), свидетельствующее о недостаточной диагностике этого осложнения. Антибиотико-ассоциированная диарея является прямым осложнением применения антибактериальной терапии, что обусловливает высокую социальную значимость этой патологии.

2. Клиническая картина антибиотико-ассоцированной диареи характеризуется появлением неоформленного, жидкого стула более Зх раз в день, что существенно осложняет течение основного заболевания.

3. Основным методом эффективной профилактики развития антибиотико-ассоцированной диареи в стационарных и амбулаторных условиях является назначение пробиотических препаратов не позднее 48 часов от начала

32

антибиотикотерапии. Продолжительность применения пробиотиков должна составлять не менее 10 дней. Профилактический прием пробиотических препаратов снижает риск возникновения антибиотико-ассоциированной диареи в 5 раз (до 2,3%).

4. Профилактический прием пробиотических препаратов приводит к статистически значимому снижению длительности антибиотико-ассоцированной диареи и более лёгкому течению этого осложнения, по сравнению со случаями возникновения антибиотико-ассоцированной диареи на фоне только антибактериальной терапии.

5. Показана возможность использования методики анализа данных о последовательности гена 16S РНК для видовой идентификации и внутривидовой дифференциации: штаммы Lactobacillus casei: ВС431, ВС433, Lactobacillus acidophilus: BC401, BC416, NK-1, NK-2, NK-5, NK-12, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus: BC421, BC423 обладают гомологией на высоком уровне 98 - 100% с последовательностями типовых представителей этих видов.

6. Показана разрешающая возможность применения методики RAPD-PCR для видовой и штаммовой дифференциации бактерий L. casei, L. rhamnosus, L. acidophilus. Продемонстрированы преимущества применения праймера ERIC-1 метода RAPD-PCR для паспортизации перечисленных видов лактобацилл.

7. Определено наличие пробиотических свойств (устойчивость в кислой среде, к солям желчи), способность синтезировать экзополисахариды, витамины и утилизировать ди- и полисахариды) у штаммов Lactobacillus, что позволило выявить наиболее перспективные культуры.

8. Результаты исследований штаммов Lactobacillus acidophilus NK1, NK2, NK5, NK12 демонстрируют их видовую принадлежность к виду Lactobacillus acidophilus и полное отсутствие мобильной генетической информации, способность к выживанию в верхних отделах ЖКТ, способность к синтезу витаминов В5, В12, РР, минимальную концентрацию биогенных аминов в среде

культивирования, что делает эти штаммы средством выбора для профилактики развития антибиотико-ассоцированной диареи.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Антибиотико-ассоциированная диарея - осложнение, появляющееся на фоне уже имеющейся патологии, требующей применения антибиотиков, развитие ААД утяжеляет течение основного заболевания. Следует уделять особое внимание адекватному и рациональному применению антибиотиков, не применять антибактериальные препараты не по показаниям, оптимизировать длительность применения антибиотиков.

2. Одновременное применение пробиотических препаратов совместно с антибиотиками является действенной мерой профилактики развития ААД. Пробиотические препараты следует назначать не позднее 48 часов с момента начала курса антибиотикотерапии длительностью не менее 10 дней.

3. При таксономической идентификации штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus следует опираться на результаты исследований, полученных с применением молекулярно-биологических методов, основанных на анализе последовательности рибосомальных генов. При генетической паспортизации промышленных штаммов молочнокислых бактерий следует использовать метод RAPD-PCR, позволяющий получать индивидуальные геномные паттерны -дактилоскопические характеристики штамма.

4. Применение в лабораторной практике комплексного подхода, реализуемого с помощью молекулярно-биологических методов при видовой идентификации, молекулярно-генетической паспортизации, определение в составе геномов генов, отвечающих за антибиотикорезистентность, выявление пробиотического потенциала микроорганизмов позволяет проводить отбор безопасных производственных культур с целью их использования в составе пробиотических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ивашкина, Н.Ю. Распространенность носительства Clostridium difficile у стационарных больных, получающих антибиотики / Н.Ю. Ивашкина, О.Н Дрожжина, Е.А. Горбачёва, Е.В. Ипполитов, А.Н. Казюлин, В.Н. Царёв, И.В. Маев // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопроктологни - 2008. - №5.- с.57

2. Ивашкина, Н.Ю. Распространенность антибиотико-ассоциированной диареи / Н.Ю. Ивашкина, А.А. Самсонов, А.Н. Казюлин, Е.С. Вьючнова, Н.Н. Голубев, Е.А. Карманова, О.Н. Дрожжина, Е.Г. Лебедева, И.В. Маев // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологни -

2008.-№5.- с.58

3. Самсонов, А.А. Эффективность применения пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus для профилактики антибиотико-ассоциированной диареи / А.А. Самсонов, Н.Н. Голубев, Е.А. Карманова, Н.Ю. Ивашкина, И.В. Маев // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологни - 2008.-№5.- с.63

4. Ивашкина, Н.Ю. Генетические характеристики пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus/ Н.Ю.Ивашкнна, С.Г. Ботина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопроктологни -

2009.-№1.-с.93

5. Ивашкина, Н.Ю. Способность пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus подавлять рост патогенных бактерий / Н.Ю. Ивашкина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологни, колопроктологни 2009.-№1.-с.94

6. Ивашкина, Н.Ю. Устойчивость пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus к воздействию среды верхних отделов желудочно-кишечного тракта/ Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологин - 2009.-№1.-с.93

7. Кладова, О. В. Профилактическая и терапевтическая эффективность Аципола® при антибиотико-ассоциированной диареи у детей / О. В. Кладова, Н. Ю. Ивашкина, А. М. Шустер, В. А. Мартьянов, В. Ф. Учайкии, В. Д. Русакова, И. М. Доннн, Н. Н. Шевченко, Т. В. Агафонова, JI. В. Глазунова, JI. А. Пронина // Детские инфекции - 2009. - №1 - с. 44-47.

8. Шустер, A.M. Возможности оптимизации применения пробиотиков в клинической практике на примере отечественного препарата Аципол®/ A.M. Шустер, В.А. Мартьянов, Н.Ю. Ивашкина, С.А. Пиявский, Б.Л. Медников // Русский медицинский журнал — 2009. - №3 — с.1-5.

9. Ивашкина, Н. Ю. Оригинальный отечественный иробиотик Аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики / Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 2009. -№2 — с. 58-63.

10. Маев, И. В. Возможности профилактики идиопатической анитибиотикоассоциированной диареи у взрослых / И.В. Маев, Н.Ю. Ивашкина, А.А. Самсонов, А.Н. Казюлин, Е.С. Вьючнова, A.M. Шустер, В.А. Мартьянов // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии — 2009. - №2 с. 75-78.

11. Ivashkina, N. Effectiveness and tolerability of Lactobacillus Acidophilus (strains NK1, NK2, NK5, NK12) in the prevention of antibiotic-associated diarrhea/ N. Ivashkina, I.Maev, A. Samsonov, A. Kazyulin, E. Vyuchnova// Gut - 2009. -№ 58 - p. 462

12. Ивашкина, Н.Ю. Сопоставление частоты возникновения диареи у детей, получавших антибиотики, по данным ретроспективного анализа и открытого сравнительного исследования / Н.Ю. Ивашкина, В.Ф. Учайкии, О.В. Кладова, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2009.-№5. -с. 120

13. Ивашкина, Н.Ю. Частота возникновения антибиотико-ассоциированной диареи у детей разных возрастных групп. / Н.Ю.

Ивашкина, В.Ф. Учайкин, О.В. Кладова, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2009.-№5.-с. 120.

14. Ивашкина, Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать биогенные амины/ Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии -2009.-№5. -с.55.

15. Ивашкина, Н.Ю. Определение способности штаммов лактобактерий продуцировать витамины/ Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии -2009.- №5.-с. 56.

16. Ивашкина, Н.Ю. Ферментирование полисахаридов штаммами лактобактерий. / Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина, И.В. Маев //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии - 2009.-№5.- с.56.

17. Ивашкина, Н.Ю. Данные изучения носительства Clostridium difficile у стационарных больных, получающих антибиотики/ Н.Ю. Ивашкина, О.Н. Дрожжина, Е.А. Горбачёва, Е.В. Ипполитов, А.Н. Казюлин, В.Н. Царёв, И.В. Маев // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство»,- 2009.-е. 114-115

18. Ивашкина, Н.Ю. Результаты сравнительного исследования частоты возникновения антибиотико-ассоциированной диареи./ Н.Ю. Ивашкина, А.А. Самсонов, А.Н. Казюлин, Е.С. Вьючнова, Н.Н. Голубев, Е.А. Карманова, О.Н. Дрожжина, Е.Г. Лебедева, И.В. Маев // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство»,- 2009.-е. 115

19. Ивашкина, Н.Ю. Влияние превентивного назначения пробиотических штаммов Lactobacillus acidophilus на развитие антибиотико-асоциированной диареи / Н.Ю. Ивашкина, А.А. Самсонов, А.Н. Казюлин, Е.С. Вьючнова, Н.Н. Голубев, Е.А. Карманова, О.Н. Дрожжина, Е.Г. Лебедева, И.В. Маев // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство».- 2009.-c.243

20. Ботина, С.Г. Молекулярно-генетическая характеристика и пробиотический потенциал бактерий рода Lactobacillus/ С.Г. Ботина, Н.Ю. Ивашкина, И.В. Маев // Молекулярная медицина. - 2011.- №1.- С.53-57.

37

21. Ивашкина, Н.Ю. Методология выбора микроорганизма для использования в качестве пробиотика/ Н.Ю. Ивашкина, С.Г. Ботина // Российские медицинские вести. - 2011. - №1. - С.49-56.

22. Маев, И.В. Эффективность Смекты при острой диарее у взрослых/ И.В. Маев, Ю.А. Кучерявый, Н.Ю. Ивашкина, H.H. Данилевская // Врач. - 2012. - № 1. С. 42-45.

23. Маев, И.В. Диагностика и лечение синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке/ И.В. Маев, Н.Ю. Ивашкина, Ю.А. Кучерявый, Т.С. Оганесян // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2011. - № 3. -С.125-129

24. Маев, И.В. Пробиотики и пребиотики в клинической практике/ И.В. Маев, A.A. Самсонов, И.Н. Никушкина, Н.Ю. Ивашкина, Е.Ю. Плотникова // Фарматека. - 2011. - № 5. - С. 33-41.

25. Ивашкин, В.Т. Глава 16. Пробиотики/ В.Т.Ивашкин, Т.Л. Лапина, Н.Ю. Ивашкина // Рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищеварения: Руководство для практикующих врачей. М.: «Литтерра» 2011 - 848 с.

26. Шифрин, О.С. Глава 31. Заболевания тонкой кишки. Синдром избыточного роста бактерий в тонкой кишке./ Шифрин, О.С., Секачева М.И., Ивашкина Н.Ю. // Рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищеварения: Руководство для практикующих врачей. М.: «Литтерра» 2011 - 848 с.

Список сокращений

ААД - антибиотико-ассоциированная диарея БА - биогенные амины

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

ДД - дневная дозировка

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДП - диарея путешественников

ЖКТ — желудочно-кишечныей тракт

КОЕ - колониеобразующая единица

НПВС - нестероидные противовоспалительные препараты

РАГТД - ПЦР - полимеразно-цепная реакция со случайной амплификацией

полиморфной дезоксирибонуклеиновой кислотой

РНК - рибонуклеиновая кислота

РНаза - рибонуклеаза

СРК - синдром раздраженного кишечника

СИБР - синдром избыточного бактериального роста

16S - малая субъединица рибосомы

Н. pylori - Helicobacter pylori

С. difficile - Clostridium difficile

L. acidophilus - Lactobacillus acidophilus

Подписано в печать. Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж ЮОэкз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39