Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Механизмы регуляции постгеморрагического и посттравматического эритродиереза (Экспериментально-клиническое исследование)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Гематологический научный центр

На правах рукописи

ЕРШОВА Людмила Ивановна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПОСТГЕМОРРАГИЧЕСКОГО И ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО ЭРИТРОДИЕРЕЗА

(Экспериментально-клиническое исследование)

14.00.29 — Гематология и переливание крови 14.00.16— Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1992

I

г' к*

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Гематологический научный центр

На правах рукописи

ЕРШОВА Людмила Ивановна

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ПОСТГЕМОРРАГИЧЕСКОГО И ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО ЭРИТРОДИЕРЕЗА

(Экспериментально-клиническое исследование)

14.00.29 — Гематология и переливание крови 14.00.16— Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Гематологическом научном центре Российской Академии медицинских наук

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Н. А. Горбунова

Официальные оппоненты:

1. Доктор медицинских наук, профессор Л. Д. Серова

2. Доктор медицинских наук, профессор Л. А. Жеребцов

3. Доктор медицинских наук, профессор В. И. Корольков

Ведущее учреждение - Ленинградский институт гематологии и переливания крови, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится ". Р..".. .J......199J г. в/у час.

на заседании специализированного Совета Д 074.03.01 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан "....".......................... 1992 г.

Ученый секретарь Совета-

кандидат биологических наук В. Д. Г-'еук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Известно, что при действии многих экстремальных факторов (механическая, тепловая энергия, ультразвук, кровопотеря, воздействие чужеродных агентов-канцерогенов, антигенная стимуляция, ультрафиолетовое облучение, ускорения, гемическая, гипоксическая гипоксия и т.д.) наблюдается стереотипная реакция системы красной крови - эритродиерез, проявляющейся разрушением эритроцитов, укорочением их продолжительности жизни и предшествующий активации регенерации эритроидного ростка кроветворения (V. 1леге, 1936; ТаШо«., 1936; А. Г. Агамалян, С.С.Оганесян, 1983; V. ВогоУз'а^т et а1. ,1987; А. БаЬеШсоу ей а1. , 1985; Р. А. Маяу-кян, Г. Г. Аруруни, 1986; Ф. Б. Атауллаханов с соавт. ,1987; Р. Д. Ад-зерихо с соавт. ,1987; Ф. И. Брагинская с соавт., 1987; А. Г. Сабельников, 1988; Е. Д. Гольдберг с соавт. ,1991;Г. К. Гогичадзе,1991;)

Если констатация факта так называемого экстремального эритро-диереза , в частности, постгеморрагического ЭД, не вызывает сомнения и его интенсивность зависит от ряда условий (об'ема и возмещения кровопотери, воздействия медикаментозной или трансфузи-онной терапии и т. д.), то в отношении механизмов, его обусловливающих, до настоящего времени нет единого мнения и, следовательно, затруднен поиск средств патогенетического управления процессами регенерации крови, тканей при действии таких распространенных чрезвычайных раздражителях, как кровопотеря, травма.

Механизм усиления разрушения эритроцитов связывают с иммунным компонентом, реализующимся сенсибилизацией в связи с появлением новых аутоантигенных детерминант в результате изменения метаболизм-зависимых лиганд эритроцитов при стресс- воздействиях (Я. И. Пухова, 1978), повышением гемолитической активности сыворотки крови вследствие образования эндогенных веществ селезеночного

происхождения (Н. А. Горбунова, 1985), лизолецитина, продуктов пе-рекисного окисления, неспецифическими гуморальными сдвигами в постгеморрагическом периоде ([.аЬоШ,1970; Блохин,1980; Кулагин,1978; Fгideгíchs а1. ,1984). Однако спленэктомия не снимает процесс постгеморрагического разрушения эритроцитов, а рядом авторов (Н. А. Федоров с соавт. ,1976) оспаривается мнение об иммунологическом компоненте постгеморрагической сыворотки.

Таким образом, несмотря на доказанность существования стереотипной реакции системы красной крови - эритродиереза в физиологических условиях и при действии стрессоров, его участие в поддержании эритроцитарного гомеостаза при воздействии продуктов распада эритроцитов на элементы кроветворной ткани прямо или опосредованно через гуморальные стимуляторы, детальные патофизиологические механизмы активации разрушения эритроцитов .при стрессе неясны; до настоящего времени не разработаны методические подходы к системному управлению процессами регенерации эрит-рона, тканей.

На основании вышеизложенного мы считали необходимым комплексно изучить механизмы экстремального эритродиереза при кровопоте-рях, травме с использованием современных методов исследования. В работе проводится идентифицикация гуморальных гемолитических факторов постгеморрагической сыворотки крови, определение зависимости развития повышенного разрушения эритроцитов с почечным и другими компонентами эритродиереза, анализ механизмов участия морфологических структур почек в активности процессов эритродиереза при массивной кровопотере, предложен способ повышения эффективности инфузий эритромассы, основанный на определении показателей гемолитической активности сыворотки крови и устойчивости донорских эритроцитов.

Цель» является исследование механизмов регуляции

эритродиереза при анемиях в условиях действия экстремальных факторов (кровопотеря, травма).

Задачи исследования,-

1. Изучение особенностей развития постгеморрагической, пост-равматической анемий, интенсивности эритродиереза в условиях моно-,билатеральном нефрэктомии, адреналзктомии, перевязке мочеточников.

2. Характеристика гуморального компонента постгеморрагического зритродиереза. Выделение и идентификация поченозависимого гемолитического фактора при кровопотере.

3. Исследование аутоиммунных клеточных механизмов разрушения эритроцитов в постгеморрагическом и постравматическом периодах.

4. Определение зависимости интенсивности постгеморрагического зритродиереза от морфологических изменений эпителиоидных почечных элементов.

5. Выяснение возможных механизмов регуляции почечнозависимого гемолиза на модели перфузии почек. Сравнительный анализ степени повреждения эритроцитов при прохождений крови через сосуды печени, почек, легких, сердца, селезенки.

6. Выявление гуморального механизма развития нефрогенкой анемии у больных хронической почечной недостаточностью в зависимости от сеанса гемодиализа.

7. Разработка теста оценки эффективности инфузий эритромас-сы при постгеморрагической, посттравматической, нефрогенной анемиях.

Научная поекзнэ. Показано, что при действии экстремальных факторов (острая невозмещенная кровопотеря, травма) развивается стереотипная реакция системы красной крови - зритродиерез, -интенсивность которого снижена при тотальной нефрэктомии, что играет важную роль в патогенезе пастгеморрагической, постравмати-ческой анемий.

Конкретный механизм гемолиза эритроцитов в раннем (1-24 час.) периоде после массивной (40 Z ОВД) кровопотери, травмы связан с почечнозависимыми гуморальным, аутоиммунным и локально-почечным процессами разрушения эритроцитов.

Хроматографическими и злектрофоретическими методами выделен и идентифицирован специфический почечнозависимый гемолитический компонент постгеморрагической сыворотки крови, имеющий молекулярную массу 80-100 кД, относящийся к фракции альфа-1-глобулинов с активностью 6,86 ЕА/мкг белка. Исследование in vivo доказало наличие дозозависимого эффекта.

Механизм действия гуморальных эритродиеретических факторов при кровопотере связан с активацией системы комплемента по альтернативному пути, не зависит от действия ингибиторов протеаз,

реализуется в раннем периоде (до 1 суток) преимущественно на эритроциты старой фракции, на 3-7 сутки - на эритроциты молодой фракции.

Установлена зависимость повышения гемолитической активности сыворотки крови от интенсивности гипергранулированности эпитеяи-оидных клеток югстагломерулярного аппарата почек, обусловливающего ц-АМФ-зависимый постгеморрагический эритродиерез.

Усиленный эритродиерез после острой кровопотери дополняется повреждением эритроцитов, проходящим через почечные сосуды. Локально-почечный процесс разрушения эритроцитов зависит от осво-бовдения простатландинов, не связан с вазоконстрикцией, осуществляется с участием аутоиммунных механизмов: реактивных популяций аутобляшкообразующих клеток почек, фагоцитирующих почечных элементов, адгезивные 1а-а+ -фракции которых способны к антигенпре-зентации.с образованием лимфокинов, активирующих миграцию макрофагов in vitro.

Электронномикроскопическими исследованиями и по данным кис лотных эритрограмм показано, что в первые сутки после кровопотери, краш-синдрома в крови, проходящей через сосуды почек, легких, селезенки значительно увеличено содержание эритроцитов в стадии предгемолиза.

Процесс разрушения эритроцитов после острой кровопотери, травматическом повреждении заключается также в почечнозависимом аутоиммунном клеточном механизме эритродиереза, реализация которого связана с активностью Т-супрессоров, системы мононуклеарных фагоцитов.

Научно практическая ценность результатов исследований в том, что у больных нефрогенной анемией наблюдается усиление процессов гемолиза, механизм которого связан с повышением гемолитической активности сыворотки крови, обусловленной повышением содержания среднемодекулярных пептидов, количество которых снижается в конце сеанса гемодиализа, и гемолитических факторов молекулярной массы 80-100 кД, концентрация которых увеличивается в процессе гемодиализа.

Установлено, что инфузии эритромассы больным с терминальной уремией в период увеличения гемолитической активности сыворотки крови неэффективны в связи с гемолизом низкорезистентных доноре-

ких эритроцитов, что сопровождается понижением количества эритроцитов и повышением свободного гемоглобина плазмы уже через сутки после трансфузии.

С целью повышения эффективности инфузий эритромассы при кро-вопотере, травме, почечной патологии рекомендуется определять in vitro показатели гемолитической активности сыворотки крови и устойчивости донорских эритроцитов к диеретическому воздействию сыворотки крови реципиента: инфузия более устойчивых эритроцитов (неоцитов) способствует более выраженному эффекту антианемического, -гипоксического действия инфузируемых эритроцитов.

Разработан тест количественной оценки гемолитической активности сыворотки крови и показателя устойчивости донорских эритроцитов по интегральным показателям кислотных эритрограмм, позволяющий предупреждать развитие посттрансфузионного гемолиза при патологических процессах, сопровождающихся повышением эритродиере-тической активности сыворотки крови (авторское свидетельство - N 1770001 от 25.12.90).

Основные полозэикя, кьявиггеьаэ на зацоту.

Показано, что при острой кровопотере, травме развивается по-чечнозависимый эритродиерез, активация которого связана с гуморальным, аутоиммунным клеточным (Т-супресеорно-, макрофагозависи-мым) и локально-почечными механизмами.

Гемолитическая активность сыворотки крови максимальна через 1 сутки после воздействия стрессоров, дифференцированно действует на эритроциты различных популяций, реализуется за счет ц-АШ>-за-висимой активации гипергранулированных эпителиоидных клеток югс-тагдомерулярного аппарата почек, связана с компонентом сыворотки, имеющим молекулярную массу 80-100 кД, относящимся к фракции альфа-1-глобулинов с активностью б,86 ЕА/мкг белка

Усиленный эритродиерез в раннем (1-24 час) постгеморрагическом, посттравматическом периодах дополняется повреждением эритроцитов, проходящих через почечные сосуды животных, зависящим от освобождения простатландинов, не связанным с вазоконстрикцией, осуществляется с участием аутоиммунных механизмов: реактивных популяций аутобляшкообразующих клеток почек, фагоцитирующих почечных элементов.

При терминальной уремии в конце сеанса гемодиализа наблюдается повышение содержания гемолитических факторов молекулярной 3- /V/y

массы 80-100 кД, в связи с чем для повышения эффективности инфу-зий эритромассы рекомендуется определять показатели гемолитической активности сыворотки крови и устойчивости донорских эритроцитов к диеретическому воздействию сыворотки крови реципиента.

Разаботан тест количественной оценки гемолитической активности сыворотки крови и показателя устойчивости донорских эритроцитов по интегральным показателям кислотных эритрограмм, позволяющий предупреждать развитие посттрансфузионного гемолиза при патологических процессах, сопровождающихся повышением эритродиере-тической активности сыворотки крови (авторское свидетельство - N 1770001 от 25.12.90).

Внедрение в практику.

1. Изданы утвержденные Ш Российской Федерации методические рекомендации "Методика прогнозирования эффективности инфузий эритромассы", 1992 г.

2. Методика прогнозирования эффективности инфузий эритромассы внедрена в отделении гемодиализа и трансплантации почек больницы "Стройгаз" (г.Барнаул), клинике Рязанского медицинского института , 2 гематологической клинике НИИГПК МЗ РУЗ, кафедре гематологии и переливания крови Ташкентского института усовершенствования врачей.

3. Предложенные рекомендации внедрены в Алтайском медицинском институте через изложение основных положений диссертации в лекционных курсах по патологической физиологии, терапии при расмот-рении вопросов этиологии и патогенеза гипоксических состояний, анемий. Методика определения эритродиеретической активности сыворотки крови включена в методические разработки практических занятий по теме "Патофизиология системы крови".

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на II, 1У Всесоюзных с'ездах патофизиологов (Ташкент, 1976; Кишинев,1989); 4 Всесоюзном симпозиуме "Механизмы регуляции в системе крови", (Красноярск, 1978); Всесоюзной конференции "кислородный режим организма и его обеспечение" (Барнаул,1978); Пленумах патофизиологов Западной Сибири (Барнаул,1981; Красноярск, 1984; Кемерово,1985; Новокузнецк,1990); Всесоюзном с'езде нефрологов (1980 ), Всесоюзном симпозиуме "Фагоцитоз и иммунитет" ( Москва, 1983); III с'езде гематологов и трансфузиологов (Киров,1991); Международном Конгрессе патофизиологов (1991 ).

Публикации. Основные положения диссертации предствлены в 41 научных работах, опубликованных в центральных отечественных жур-

налах, материалах Всесоюзных и Международных с'ездов и конференций, сборниках центральных издательств, получено авторское свидетельство N 1770001 от 25.12.1990.

Структура диссертации Материалы диссертации изложены на 359 страницах машинописного текста, иллюстрированы 79 таблицами, 58 рисунками. Диссертация состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 217 отечественных и 120 иностранных источника.

Глава 1 содержит общие сведения об эритродиерезе при действии экстремальных факторов и анализ данных литературы о роли процессов гемолиза в патогенезе постгеморрагической и постравматичес-кой анемий.

В главе 2 изложены методики проведения опытов и исследований физико-химических свойств эритроцитов, иммунного ответа и некоторых показателей, характеризующих состояние жидкой части крови. Кроме того дана общая характеристика обследованных больных.

В главе 3 приводятся результаты собственных исследований механизма постгеморрагического .эритродиереза, роли в нем нефрог-генного компонента.

В главе 4 анализируются механизмы повышения гемолитической активности сыворотки крови, выделения и идентификация гуморальных эритродиеретических факторов хроматографическоми методами.

Глава 5 посвящена описанию результатов исследований иммунологических механизмов постгеморрагического эритродиереза.

В главе б представлены сведения участия почек в механизмах постгеморрагического гемолиза на модели "эндокринной почки".

В главе 7 проведен анализ усиленного разрушения эритроцйтов на экспериментальной модели "краш-синдрома".

В главе 8 приводятся сведения о гуморальном механизме гемолиза эритроцитов у больных с хронической почечной недостаточностью.

В заключении обобщены результаты проведенных исследований.

В работе сделано 13 выводов с рекомендациями научно-практического характера.

В выполнении совместных исследований принимали участие к. м. н. А. М. Зейналов, к. м. н. М. А. Ажигирова, Т. А. Дереза, к. м. н. 3. Г. Ши шканова, к. м. н. Л. М. Логинова, к. м. н.' В. Л. Виноградов, к. м. н.

Т. А. Ермакова, к. м. н. М.Н. Кулагин, к. м. н., Г. Н. Курбанова, к. м. н. 3. М. Лиховецкая (ГНЦ РАМЩ, к. м. н., Е Ю. Громыхина, д. м. н. проф., В. И. Козлов, д. м. н., проф. R А. Труфакин ( ИКИ СО РАМН) к. м. н., В. И. Карасева, д. м. н. А. Д. Черноусов (Институт Иммунологии РАМН) , к. м. н.. И. Н. Шойхет, к. м. н. , К С. Трейвиш,

д. м. н. проф., Н. М. Новиков, к. м. н., Н. М. Самойлова (АГМВД.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы проведена на 1350 белых крысах линии Вистар массой 180-220 г, 590 мышах линий СБА, Balb/C, (СВАхВб)F1, породы Swiss массой 12-15 г, 38 кроликах массой 1,5-1,8 кг, 18 беспородных собаках массой 3-5 кг, полученных из питомника "Столбовая", находящихся на стандартной диете без ограничения в условиях вивария. В клинике обследованы 78 человек в том числе 19 здоровых и 59 больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на лрограмном гемодиализе.

Применены следующие основные экспериментальные процедуры: двусторонняя, односторонняя нефрзктомии, двусторонняя адреналзк-томия, перевязка мочеточников, перфузия почек, печени на крысах, мышах.

Воспроизведены следующие экспериментальные модели:

-эндокринная почка" по Selye;

-острая массивная (30-40 % ОЦК) не во з меде иная кровопотери на собаках, кроликах, крысах, мышах;

-краш-синдром - наложением зажимов на задние конечности крыс, бинтованием задних конечностей собак.

Методики определения физико-химических свойств эритроцитов, крови

Кислотная резистентность эритроцитов определялась по И. А. Тер-скову, И. И. Гительзону (1957) в модификации Г. IL Григорьева, (1986).

Микрометод определения биотермической ксилотной резистентности эритроцитов по Л. И. Ершовой с соавт. (1992).

Определение электрофоретической подвижности эритроцитов производили по методу Abramson в модификации Г. А. Дворкина (1958).

Определение активности глисозо- 6-фосфат-дегидрогеназы (Г-6-ФДГ) производили по Beutler (1977) количественным методом в эритроцитах при 30 С без измерения активности 6-фосфоглюконатде-

- 11 -

гидрогеназы спектрофотометрически (340 нм).

Определение скорости промводства НАД®! в эритроцитах проводили по Б. С. Балыуханову, Ф. И, Аттауллаханову, С. R Замуло (1980) количественно при использовании 50 % суспензии эритроцитов и регистрации редокс-потенциала на диаграмной ленте по скорости восстановления феррицианида калия.

Ыорфологко эритроцитов определяли с. помощью сканнирующей микроскопии.

Индекс ригидности эритроцитов определяли по М. Hanss (1983) в модификации И. Л. Лисовской с соавторами (1992) после пропускания 2 % взвеси эритроцитов через фильтры (3 мкм) с автоматической регистрацией времени выхода определенного количества эритроцитов.

Определение объема циркулирующей крови производили колориметрически при помощи синего Эванса (Т-1824).

Определение гемолитической активности сыворотки крови (ГС)

проводили после инкубации в ней эталонных эритроцитов, в качестве которых использовали донорские эритроциты 0(1) группы (резу-сотрицательные) или пул сингенных эритроцитов (авт. свидетельство N 1770001 от 25.12. 90). ГС оценивали в единицах активности (БА) в пробах в пересчете на единицу белка.

Иммунологические методы

АнтителообразуЕггге клетки (АСК) определяли по Cunningham, Szenberg (1968) в полужидкой среде счетом зон локального гемолиза на 4 день после внутривенной иммунизации мышей эритроцитами барана (5Z взвесь, 0,2 мл). Расчет АОК производили на 10~6 ядро-содержащих клеток селезенки (относительные АОК) и на селезенку (абсолютные АОК).

Аутобдодоообразухззе клетки (АБОЗД считали по ЕЕ Клемпарской в модификации а И. Пуховой (1984). Определение АВОК проводили в крови и селезенке в пересчете на Ю'б ядросодержащих клеток на 4 сутки после иммунизации мышей эритроцитами барана (0,2 мл 5% взвеси эритроцитов; внутривенно).

Т-сулрссоряуга активность лимфоцитов определяли по В. М. Писареву, Л. А. Певиицкому (1977) при адоптивном (сингенном) переносе спленоцитов иммунизированных мышей, взятых на 4 сутки после иммунизации и инфузированных внутривенно (10"4 ядросодержащих кле-'/- /у/у

ток) реципиентам в продуктивную стадию иммунного ответа (3 сутки) по числу зон локального гемолиза (относительные и абсолютные величины).

Активность моноиуклеарной фагоцитирующей системы (ШС) оценивали по тесту элиминации из крови культуры листерий (штамм 1458) после внутривенного введения микроорганизмов. Тест оценивали количественно по числу колоний, высеваемых из крови, селезенки через 15,30,60,180 минут после заражения.

Влияние на активность состояния системы М<1С осуществляли внутривенным введением туши (одно-, двукратно) 0,5 мл 33 % раствор/ 100 г массы, продигиозэна.

Экспрессия 1а-антигенов (1а-а) проводили после разделения спленоцитов и других клеточных суспензий в чашках Петри на адгезивную и неадгезивную фракции. Интенсивность флуореценции учитывали количественно после обработки клеток мышиными 1а-аллоанти-сывороточными флуоресцеиновыми конъюгатами (Mouse la alloantiserum fluorescein conjúgate, Canada,Cedarlane Laborator i es.).

Индукцию эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) проводили (Eshar et al. ,1979) после культивирования (5 суток, С0£-инкубатор, среда RPMI-1640 +10% сыворотки эмбрионов коров, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ HEPES, 5х10"-5 М 2-меркаптоэтано-ла, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина) лимфоцитов (10"7/мл) с макрофагами, предварительно инкубированных (20х10"6/мл) с антигеном (овальбумин. Serva, 25 мкг/мл) в течение 1,5 часов. Миф-продукцию учитывали в прямом капиллярном тесте по зоне миграции клеток перитонеального экссудата (КПЗ) ин-тактных мышей той if линии.

НСГ-тест лейкоцитов определяли по Park в модификации С. М. Гор-диенко (1983) с использованием в качестве стимулятора функции нейтрофилов продигиозана при количественном учете спонтанного и стимулированного показателей фагоцитоза и индекса стимуляции.

Циркулирунщие иммунные комплексы определяли по Chascova (1977) методом преципитации в 3,2 % растворе полиэтилеигликоля (ЮГ) (М. масса -6000) с последующим спектрофотометрированием (450 нм).

Реакцию гиперчувствигельностк замедленного типа in vivo учи-

тывали на б сутки после внутривенной иммунизации мьшей ГНЮ в полном адъюванте Фрейнда и субплантарного введения разрешающей дозы антигена измерением инфильтрации задних конечностей окуляр-микрометром ОМ-51 в сравнении с контролем (парным контролем) по методике А. Д. Черноусова с соавторами (1983).

Гистологические исследования

Определение гемосидерина в тканях проводили по методике Перл-са в модификации Лилли (Р. Лиллн, 1969) в соответствии с которой количественно учитывали интенсивность гемосодероза тканей.

Морфометрическое исследование клубочкового аппарата почек проводили на модели "эндокринной почки", с учетом количества гранулированности эпителиоидных клеток югстагломерулярного аппарата, диаметра клубочков, капсулы.

Хрокатографическке методы

!.'йтод згаалыгого электрофореза в полишсриламидном геле в присутствии диссоциирующего агента -додецисульфата натрия ( Г. Ма-уэр, 1971; Г. Ларе кий, 1971) использовали дм исследования сыворотки и стремы эритроцитов на содержание белков.

Строму эритроцитов для электрофоретического исследования получали путем добавления к 0,5 мл раствора стромы (50-100 мкг белка) 0,1 г сахарозы и 0,025 г додецилсульфата натрия при нагревании взвеси в кипящей водяной бане в течение 1 мин. Анализ денеитограмм производили после фотографирования по площади выделенных пиков, характеризующих соотношение белковых фракций.

Метод гель-хроггзтогрз&ии на сефздексе применяли для определения веществ средней молекулярной массы с использованием колонок размером 90x0,9 см, заполненных сефадексом G-15 фирмы "Pharmacia" (Швеция).В качестве элюента использовали 0,5 мл нейтрализованного супернатанта; элюцию вели со скоростью 15 мл/час. Детекция элюируемых компонентов осуществлялась методом УФ-спект-рофотометрии (206 нм).Для подготовки пробы пользовались методикой В. К. Осиповича. С помощью самописца осуществлялась запись кривых фракционирования образца. .

Идентификация элюируемых веществ в зоне пиков проводилась с помощью калибровочных маркеров известной молекулярной массой; аденозинтрифосфат (507 Д) и витамин Р>12 (1300 Д). йэличестЕеннаа

их оценка проводилась подсчетом площади под кривой злюатограммы и выражением в условных единицах (у. е.).

Жидкостная хроматография еысокого давления применялась для исследования состава образцов постгеморрагической сыворотки с целью идентификации гуморальных гемолитических факторов. Препаративная ионообменная хроматография осуществлялась на ТЭЕАЕ-Тоуореаг1 е (7,5x75 мм) при элюировании 0,04 М Тпб-НСЬ буфером, рН 7,8, содержащим 0,1 % ЫаМЗ в градиенте ИаСЬ 0-1 М, время элюции - 40 мин.

Для определения молекулярной массы использовали колонку ТЗК-б-ЗООО ЗУ (7,5x300 мм) и 0,1 М фосфатный буфер, рН -6,5, содержащий 0,02 X ИаИЗ и 0,1 % детергента 7Х Детектирование проводили при £80 нм. Процентное содержание фракций с различной молекулярной массой определяли с использованием интегратора 2220 фирмы Ш5. Фракции объемом 1 мл отбирали с помощью коллектора фракций ЗирегПа): 2211 фирмы ЬКВ.

Результаты исследования подвергались статистической обработке по расчетам, приведенным в статье И. А. Ойвина (1960), Е. В. Монцевичюте-Эрингене (1964). Определялась степень достоверности различий между показателями с помощью таблиц Р.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Ранее нами (Л. И. Ершова с соавт. ,1970 - 1990) было показано снижение гемолитического эффекта фенилгидразина у животных с двусторонней нефрэктомией. В связи с этим нами проведены исследования по выяснению почечно-зависимого компонента постгеморрагического эритродиереза (ЭД) (Я. Г. Ужанский, Е А. Федоров, Е А. Горбунова и др.).

Результаты, представленные в таблице 1 свидетельствуют об уменьшении количества плазмы (ОЦП) на 16,6 %, ОЦК - на 38,6£.объема циркулирующих эритроцитов (ОЦЭ) - на 61,3 % у животных с ложной нефрэктомией через 1 сутки после острой невозмещенной кро вопотери (2 % от массы ). Относительное количество эритроцитов, характеризующее степень постгеморрагической анемии, снижалось на 43,4 % . Абсолютное количество эритроцитов у животных этой группы снижалось на 65,1 % ( Р < 0,001), в то время как относительное количество эритроцитов не достаточно точно отражает изменения периферической крови, занижая степень анемии в среднем на

Таблица 1.

Изменение гематологических показателей у животных с острой массивной (40% ОЩ) невозмещенной кровопотерей (1 сутки) и

нефрэктомией (М+ш)

Показатели Контроль Нефрзктомия+ Ложная нефрэктомия+

кровопотеря кровопотеря

ОЦК мл/ЮОг 8,43 ± 0.244 7,32 + 0,305* 5,18 + 0,208*

ОЦЭ мл/ЮОг 4,00 + О; 171 2,53 + 0,184* 1,55 + 0,101*

Эх10"12/л 7,09 ± 0,184 5,27 + 0,160* 4,01 ± 0,116*

Эх10~9/100г 59,56 + 1,762 38,56 + 1,614* 20,76 + 1,003*

СР %мин 552,4 + 15,44 544,7 + 15,27 783,0 + 8,01 *

Процент эритроцитов:

низкостойких 0 0 2,4 ± 1,03 *

среднестойких 91,2 + 9,51 91,7 i 2,10 50,4 + 11,80*

высокостойких 8,8 + 0,41 7,9 ± 2,25 47,2 + 11,41*

L мин 10,0 + 0,81 9,8 ± 1,16 16,5 ± 1,25 *

Гемосидерин

у. е. /ед S - 9,1 ± 4,4 21,4 ± 5,2

Своб. Нв г/лх10~-2 3,8 ± 0,24 21,5 + 0,85 * 46,5 ± 5,61 *

С. 0. Э. мк~3 68,9 ± 2,43 54,9 t 2,27 74,6 ± 2,67

ЭФПЭ мк/с/в/см 1,32 ± 0,051 1,38 + 0,067 1,58 ± 0,034*

* - достоверные различия в сравнении с контролем.

Таблица 2.

Изменение физико-химических свойств эритроцитов до и после перфузии почек предварительно (1 сутки) анемизированных массивной кровопотерей крыс Вистар (М ± т)

N Условия опыта Г-б-ФДГ СР ИР ЭФПЭ Калий Нв г/л

МЕ/г Нв % мин сек мк/с/в/см ммоль/л х10л-2

Опыт 1

1. До перфузии

2. После перфузии анемизированных почек

3. После перфузии почек интактных животных

Опыт 2

4. До перфузии

5. После перфузии анемизированных почек

Р 1-2 Р 1-3 Р 4-5

6,ü 0,51

9,5± 1,08

8Л± О', 81

5,9t 0,74 <0,05

<0,05

485,3t -8,72

566,3± -11,82

502,1+ -12,41

1,52± 0,02

1,64t 0,04

1,59± 0,03

584,3± 132,1+ 1,62±

10,21 9,72 0,03

479,3± 110,0+ 1,35± 11,44 5,66 0.04

<0,01 - <0,05

>0,05 - >0,05 <0,001 <0,05 <0,01

5,2± 0,46

10,2± 0,31

5,4± 0,31

5,6± 0,32

8,5± 0,62 <0,001 >0,05 <0,05

5,8± 0,38

14,7± 0,95

6,1t 0,42

6,3+ 0,21

7,3± 0,71 <0,001 >0,05 >0,05

21.7 X. Кровопотеря у животных с билатеральной нефрэктомией способствует уменьшению ОЦК лишь на 13,2 % , за счет снижения ОЦЭ на 36,8 ОЦП имеет тенденцию к увеличению за счет естествен-нойпостгеморрагической гидремии и специфической почечно-зависимой гемодилюции. Степень уменьшения количества эритроцитов в единице объема составляет 25,7

Анализ вышеуказанных показателей 2 и 3 групп животных свидетельствует о снижении степени постгеморрагической анемии у животных с двусторонней нефрэктомией, что подтверждается менее выраженными показателями снижения относительного и абсолютного количества эритроцитов и ОЦЭ /100 г массы соответственно на 17,7%,

29.8 %, 24,5 X в сравнении с ложнонефрэктомированными животными после кровопотери.

Известные в литературе данные о наличии эритродиереза после кровопотери (А. А. Богомолец, Я. Г. Ужанский, К А. Горбунова, В. К Левин) - пост геморрагического эритродиереза - подтверждены нами и дополнены сведениями о ренопривном компоненте ЭД. Так, у животных с сохраненными почками через 1 сутки после кровопотери наблюдается увеличение суммарной кислотной резистентности эритроцитов (CP) до 783,0 + 8,01 Z мин ( контроль - 552,4 ± 15,44 %мин) при увеличении процента высокостойких фракций эритроцитов в 5,3 раза и соответственном снижении ( на 44,7 X) их среднестойких форм. Графически отмечен сдвиг кислотных эритрограмм вправо (рис. 1).

Усиление разрушения эритроцитов у животных этой группы подт-верадаетея увеличением плазменного гемоглобина в 4,7 раза, гемо-сидероза селезенки - в 2,3 раза в сравнении с эффектом нефрэкто-мии и последующей кровопотери, элиминацией эритроцитов пониженной стойкости из кровотока, что регистрируется увеличением CP преимущественно фракции старых эритроцитов до 539,4 ± 21,93 %мин (контроль - 446,4 ± 13,23 %мин) при удлинении ленты гемолиза. Вторичные изменения,наблюдаемые во фракции молодых эритроцитов, характеризуют процессы, с одной стороны, поступления клеток эритроидного ряда из костного мозга, а также перехода эритроцитов низкостойких фракций в популяцию старых эритроцитов с последующим их разрушением и элиминацией ( И. А. Терсков.И. И. Гитель-зон, 1981; Г. П. Григорьев, 1986).

Билатеральная нефрэктомия уменьшает проявления раннего постгеморрагического ЭД. Через 1 сутки после острой кровопотери во фракции старых эритроцитов незначительно ( на 13,6 X) увеличивается СР, в то время как у животных с сохраненными почками СР повышается на 20,9 % , сопровождающаяся тенденцией к увеличению процента среднестойких форм эритроцитов с эритродиерезом низкоустойчивых форм, повышением свободного гемоглобина плазмы до 21,5 ± 0,85 ыг£ ( контроль - 3,8 t 0,25 мг%) и количества гранул гемосидерина (ГОД) до 9,1 t 4,4 у.е. ГСД/ед площади. Во фракции молодых эритроцитов достоверно не изменяются параметры кислотных зритрограмм ( 544,7 t 15,27 % мин; контроль - 552,4 ± 15,44 %мин).

Повышенный гемолиз у животных с сохраненными почками и крово-потерей в сравнении с нефрэктомированными сопровождается более выраженными изменениями физико-химических свойств эритроцитов: увеличением их среднего об.ема в среднем на 15 %, ЗФПЭ- на 15,5 %, индекса суммарной кислотной резистентности молодой фракции эритроцитов на 40 £ вследствие разрушения и элиминации из кровотока низкостойких фракций эритроцитов при уменьшении белков стромы с молекулярной массой 180-250 кД на 39 % (в т.ч. белок полосы 3) при преобладании стромальных белков с молекулярной массой 38-75 кД, что свидетельствует о преобладании в периферической крови эритроцитов с увеличенным содержанием рецепторных белков типа гликофоринов.

Изучение динамики постгеморрагическогс ЭД свидетельствует о волновом процессе циркуляции в периферической крови эритроцитов с пониженной стойкостью и их последующей элиминации системой МФО. Так, после невозмещенной кровопотери падение СР наблюдается через 15,30,45 минут раннего постгеморрагического периода; повышение СР оставшихся в периферической крови эритроцитов после их элиминации органами !ЙС наблюдается через 1час, 1,3,5 сутки .после кровопотери. Обращается внимание на сдвиг кислотных эритрог-рамм вправо до 14,4; 15,4 мин времени полного гемолиза (конт-роль-6,6±0,24 мин ) к 3 и 5 суткам постгеморрагического периода, что связано не только с повреждением низкостойких популяций "постгеморрагических" эритроцитов, но и с поступлением из костного мозга эритроцитов с повышенной стойкостью: интегрально это

характеризуется увеличением индекса резистентности до 603-607 %мин (Р ■■• 0,001).

О цель» выяснения механизма снижения постгеморрагического эритродиереаа у нефрэктомированных животных, несмотря на ретен-ционную гиперазотемию, нами проведены специальные эксперименты с перфузии почек анемизированных жиеотных сингенной кровью. В литературе имеются некоторые сведения об участии патологически измененных почек в механизме фрагментации эритроцитов ( Вгат, 0ас1в, НоигтаЫе, 1962 ), в связи с чем проведены соответстую-щие эксперименты с определением вероятной способности почек участвовать в повреждении клеток эритроидного ряда в различные периоды посгеморрагического периода. Так, уже через 15 минут после эксфузии крови СР увеличена на 38 %мин при повышении высокостойких форм эритроцитов в перфузате е среднем на 22 X. Максимальный локально почечный механизм постгеморрагического эритро-диереза развивается в период 1 -24 часа, что коррелирует с динамикой показателей эритродиереза после кровопотери.

В таблице 2 показано влияние анемизированных кровопотерей почек (1 сутки) на активность ферментов гликолиза, электрофорети-ческую подвижность эритроцитов, содержание калия, гемоглобина в супернатанте перфузата. Проведено изучение двух пулов эритроцитов: с высокой резистентностью - "молодая" фракция, содержащая до 20 % полихроматофильных, оксифильных нормобластов, ретикуло-цитов; и с пониженной стойкостью - фракция "старых" эритроцитов - содержащая единичные ретикулоциты . Эти эксперименты проведены с целью последующего изучения в перспективе управления интенсивностью постгеморрагического ренопривного эритродиереза, поскольку. как известно, продукты распада молодых и старых эритроцитов неоднозначно влияют на регенерацию красной крови. Итак, после перфузии эритроцитов "старой" фракции через почки анемизированных животных (1 группа) происходит их разрушение , регистрируемое по выходу калия (в 2 раза), гемоглобина из эритроцитов , характеризуемое как классический , наиболее часто встречающийся путь эритродиереза - коллоидно-осмотический, проходящий стадии изменений работы К-Ма каналов, изменения объема эритроцитов с последующим строматолизом (А. 0. Иванов, А. А. Мольнар,Э. П. Козловская, М. М. Монастырская, 1987) и выходом гемоглобина ( увеличение в 6- /у/у

2,5 раза). Оставшиеся неразрушенные циркулирующие популяции эритроцитов имеют повышенную резистентность (СР увеличена на 20,8 % (Р <0,01),электрофоретическую подвижность - на 7,8 % , а количество глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы повышалось в 1,6 раза.

Это характеризует способность анемизированных почек повреждать с последующа элиминацией низкостойких популяций эритроцитов, что способствует очищению крови от дефектных эритроцитов, продукты распада которых стимулируют эритропоэз при "цене" адаптации в виде нарастающей анемии.

Во втором опыте для исследования взяты эритроциты "молодой" фракции, которые после перфузии через анемизированные почки качественно изменяются: уменьшается содержание Г-б-ФДГ, фермента пентозо-фосфатного пути окисления глюкозы, активирующего скорость потребления глюкозы при действии окислительной нагрузки (активация симпато-адреналовой и стресс-реакции ) на эритроциты, уменьшение количества которого характеризует укорочение продолжи тельности жизни, старение эритроцитов (0. И. Моисеева, А. К Вайшу-курова, К М. Алексеев, 1980; Ш. Мива, 1981). Кроме того, уменьшена суммарная кислотная резистентность эритроцитов ( +24 С ) на 23,4 % (Р< 0,001), ИР (+37 С) - на 16,7 % (Р< 0,05); характерно и снижение электрофоретической подвижности эритроцитов до 1,35 мк/сек/в/см при увеличении калия в супернатанте в 1,6 раза при достоверно не измененным свободном гемоглобине супернатанта, что свидетельствует о переходе эритроцитов в состояние предгемолиза - "молодой" фракции и служит лимитирующим фактором кроветворения в отношении зритроидного ростка ( Я.Г. Ужанский с соавт. ,1974; Е М. Новиков, Л. И. Елюм с соавт. ,1976).

При детальном изучении локального ранее неизвестного почечного механизма разрушения эритроцитов в постгеморрагическом периоде нами показано влияние стабилизаторов мембраны , ингибиторов простатландинов, эндогенно освобождающихся в звездчатых клетках мозгового слоя почек на интенсивность повреждения эритроцитов в момент прохождения их по почечным микрососудам. Добавление в перфузируемую сингенную кровь индометацина (0,2 мг/мл) приводит лишь к снижению суммарной кислотной резистентности на 20,6 %мин уменьшении процента высокоустойчивых форм и укорочению вследствие этого ленты гемолиза , т. е. о переходе эритроцитов в предге-

молитическое остояние. В то время как перфузия крови без индо-метацина через почки животных с кровопотерей, как уже было показано выше, вела к разрушению низкостойких популяций эритроцитов при относительном преобладании высокоустойчивых форм и соответственному увеличению суммарной резистентности на 47,2 %мин ( Р < 0,001 ).

С целью определения возможного влияния спазма резистивных со ■ судов почек при кровопотере на локальный механизм ЭД проведены эксперименты с добавлением вазодилятаторов в перфузируемую син-генную кровь. Результаты свидетельствуют о том, что эуфиллин не изменяет достоверно процесс повреждения эритроцитов , перфорируемых через почки крыс с кровопотерей ( 1 час). Эритроциты также как и без эуфиллина уменьшали суммарную резистентность., теряли калий, происходило снижение их электрофоретической подвижности.

Данные кислотных эритрограмм и электронограмм крови, взятой из вен различных регионов в момент максимально выраженного пост ■ геморрагического ЭД (1 сутки) свидетельствуют о активации разрушения эритроцитов, проходящих сосудистые регионы селезенки -в 4,3 раза, почек- в 2,3 раза, легких-1,7 раза в постгеморрагическом периоде.

Многочисленные данные по изучению патогенеза постгеморрагического эритродиереэа свидетельствуют о экзоэритроцитарном механизме гемолиза, связанном с повышением гемолитической активности сыворотки крови (Я. Г. Ужанский, 1956-1981, С. Г. Качанова с соавт., 1962, R А. Федоров, 1976; Горбунова, 1985; А. И. Шашкин, И. А. Терс -ков,1986; Yawata, 1988 и др.), что подтверждено в опытах на парабиоз ированных партнерах, в экспериментах in vitro в тестах инкубации с меченными 59 Fe , 51 Сг.

По нашим данным гемолитическая активность сыворотки крови, определяемая в динамике постгеморрагического периода в отношении клеток -мишеней эритроцитов разных фракций по степени зрелости : " молодой" и "старой" оказывается неодинакова. Так, ГС в отноше■ нии "старой" фракции эритроцитов максимально проявляется в раннем постгеморрагическом периоде ( 1 час - 1 сутки ) и равна соответственно 22,7 ЕА и 47,2 ЕА ( контроль - 5,5 + 0,26 ЕА ); Гемолитическая активность, в отношении "молодой" фракции эритроцитов увеличивается преимущественно к 3-5 суткам постгеморрагичес-

кого периода и составляет 19,2 ЕА и 26,7 ЕА. Выявленную дифференцированную активность ГС сыворотки в отношении различных популяций эритроцитов можно рассматривать как специфический, механизм адаптации эритрона, процессов регенерации красной крови в ответ ка различные побуждения в виде продуктов распада эритроцитов, обладающих неодинаковым механизмом действия в зависимости от степени зрелости эритроцитов на эритропоэз. В ранний постге-морагический период ГС реализуется преимущественно на эритроциты старой фракции, что тем самым расширяет плацдарм кроветворения детерминированных в отношении эритропоэза клеток; повышенная эритродиеретическая активность сыворотки крови в более поздние периоды после кровопотери способствует образованию продуктов разрушения эритроцитов молодой популяции., являющихся фактором рестрикции в последующем процессе гиперрегенерации эритрона

Поскольку нами выявлен почечнозависимый компонент постгеморрагического эритродиереза, последующие эксперименты с определением ГС поетгеморрагической сыворотки на фоне двусторонней нефрэк-томии показали участие почек в активации (образовании) гуморальных гемолитических факторов. Показано снижение ГС постгеморрагической сыворотки нефрэктомированных крыс как в отношении молодой , так и старой популяции эритроцитов. Так ГС в отношении молодой фракции эритроцитов уменьшена у нефрэктомированных животных через 1 час после кровопотери в 2, 1 раза; через сутки ГС снижается в 3,3 раза при исследовании в качестве клеток-мишеней эритроцитов старой фракции.

Представлялось целесообразным установить отличия во фракционном составе сывороток, различных по ГС и выделить фракцию, ответственную за реализацию гемолитического эффекта в постгеморрагическом периоде. Методами жидкостной хроматографии высокого давления (ВЖХ) проведены исследования образцов постгеморрагической сыворотки крови экспериментальных животных. Препаративная ионообменная хроматография осуществлялась на 0ЕАЕ-Тоуреаг1е (7,5 х 75 мм) при элыироваяии 0,04 М Тг1з-НС2, рН- 7,8, содержащим 0,1 % №аМЗ в градиенте ИаС1 0 - 1 М, время элюции 40 мин. На рис.2 (1.1.)представлен профиль элюции образцов сыворотки в линейном градиенте НаС1. Специфическая гемолитическая активность была установлена во фракциях 14-15 с максимальным значением 2,33

М N801

1.1

■ ниятти' гТ|шнииж [фракции^

¡о л 1а гг 36

83

ТВ ■ ■ Ю ■ ■

к ■.

40 ■ ■

я ■ • аа 10 а

Профили элюции образцов постгеморрагической сыворотки крови, полученные на колонках:

1.ПЕЛЕ-Тоуреаг1е (7,5x75 мм) в 0,04 М Тг1э-НСЬ буфере рН 7,3 в гралиенте концентрации 0-1 М ГТаСЬ при скорости элюции 1,0 мл/мин;

1.1.Об'ем образца 0,5 мл; количество белка в образце 8,30 мг.

1.2.Об'ем образца 0,6 мл; количество белкз в образце 10,55 мг.

г.тБК-о зооо зу

|(7,5x300 им) в 0,1 М фосфатном буфере рН 6,5 при скорости элюции 0,5 мл/мин; об'ем образца (концентрат фракций

18,191-0,024 мл;количес-тво белка в образце 0,38 мг; ГС(ЕА)/мкг бел-ках10~2;

В В 7 В 9

ЕА/мкг белка, определяемого с использованием красителя Coomassie Blue G (Read, Norchlote, 1981). Изменение профиля градиента ионной силы позволило выделить компонент, обладающий ГС, максимальное значение которой достигло величины 6,86 ЕА/мкг белка во фракции 18, причем 80,3 X от общей активности ГС содержалось во фракциях 18 и 19 (рис. 1.2). Потери активности при фракционировании составили 5-7 %. Для установления молекулярно-массового состава эти фракции подвергали концентрированию и последующему злю-ированию на колонке TSK-G 3000- SW с параллельным измерением ГС. Полученный профиль элюции и распределение по ГС представлены на рис.2 (2) из которого следует, что наибольшей активностью обладает компонент с молекулярной массой в интервале 80-100 кД. При электрофорезе белковых фракций постгеморрагической сывортки в ПААГ установлено увеличение количества альфа-1-глобулинов (на 24,9 X) в сравнении с контролем.

В опытах in vivo определено наличие доаозависимого гемолитического эффекта выделенного с помощью ионообменной хроматографии компонента постгеморрагической сыворотки. Увеличение дозы инфу-зируемого гемолитического компонента сопровождается нарастанием концентрации свободного гемоглобина плазмы, причем показатели суммарной резистентности эритроцитов изменяется в зависимости от дозы в разные сроки наблюдения, достигая максимальных значений при дозе 19,5 ЕА/мкг белка

Таким образом, нам удалось установить и выделить хроматогра-фическими методами в эксперименте почечнозависимый гемолитический компонент постгеморрагической сыворотки крови, молекулярная масса которого составляет 80-100 тыс Д . Введение этого компонента в кровеносное русло животных показало наличие дозозависи-мого гемолитического эффекта. Предполагаемый механизм действия гуморальных гемолитических факторов связан с дерестрикцией альтернативного пути активации комплемента через рекластеризацию CR1 ингибитора СЗЬ компонента комплемента(Chevalier ,Kasatschírie,1989) ; декомплементизация эритродиеретически активной сыворотки.крови (1 час,+56 С) снижает ГС на 58 %. Зрктро-диерез, связанный с воздействием гемолитических факторов почечного происхождения, реализуется по пути действия таких детерген-тных веществ, как 1сапалофориаров, способствующих деструкции мзм-

браны эритроцитов с выходом гемоглобина без предварительных стадий коллоидно-осмотического лизиса CH. И. Ермишкин, В. Н. Зильберш-тейн, 1982).

В условиях искусственной гемодилюции ГС снижается на 27,8 Z через сутки после инфузии, но практически не изменяется общий потенциал ЭД, реализуемый по локально-почечному механизму: перфузия аутокрови через почки анемизированных собак с адекватной гемодилюцией (1 сутки) собак спсобствует уменьшению стойкости эритроцитов (СР и ИР) соответственно на 11,9-15 %%.

Кроме того, установлено, что после инфузии эритроцитной массы с индексом резистентности 470,3 %мин в период после кровопотери 1 сутки при высокой ГО (26,4 ЕА) при математически расчитанном показателе ДЭ - устойчивости донорских эритроцитов к диеретичес-кому вздействию сыворотки- равном 2,3 наблюдается через 24 часа после инфузии эритромассы: уменьшение количества эритроцитов в среднем на 37,1 % в сравнении с ранним (1 час) постинфузионным количеством эритроцитов , повышение плазменного гемоглобина в 7,2 раза, веса селезенки на 59,3 % при изменении качества эритроцитов, проявляющемся в увеличении индекса ригидности эритроци-тиов на 34,9 %, СР - на 26 %, ИР - на 19 %. В то время как инфу-зия эритромассы свежезаготовленной (СР - 577 %мин) способствует снижению эритроцитов лишь на 25,7 ( при этом ДЭ - 0,77), увеличению- плазменного гемоглобина в 3,5 раза меньше предыдущей серии экспериментов, увеличению веса селезенки -на 17,8 %, при снижении индекса ригидности эритроцитов на 11Z, СР - на 19 %.

Ряд исследователей, предполагая участие иммунной системы в деструкции и элиминации клеток зритроидного ряда,считают, что эритродиерез связан не с гуморальными, а с клеточными факторами аутоиммунитета и осуществляется по типу реакций взаимодействия клеток- киллеров и клеток-мишеней (Я. И. Пухова, 1979; Halbhube г, Zimmermann, Ochring, Stibenz, Linss, 1987). Используя метод выявления клеток-эффекторов Т-, В- системы иммунитета, образующих зоны гемолиза с аутологичными эритроцитами (H. а Клемпарс-кая,1971) автором показано, что уже через 3 часа после острого кровопускания у кроликов происходило статистически достоверное увеличение численности аутобляшкообразующих клеток (АБОК) с постепенным нарастанием к 3 суткам после кровопотери, что совпадает

Таблица 3.

Влияние билатеральной нефрзктомии (24 чае) и кровопотери(20 час) на количество АОК, АЕОК крови, селезенки мышей Swiss (Mi ш)

Воздействие п Спленоциты АОК/10^6 АОК/селезенку АБ0К/10~6

х10~6 я. с.к. я. с. к.

Иммунизация 16 186t 144± 227421 180301

(4 сутки) 13,4 21,1 3300 1520

Лапаротомия 14 137± * 1851 25508+ 191501

(24 час) 11,2 20,2 з;оо 6608

Кровопотеря 18 152± 2351 * ЗЗГ,51± 22365± *

(20 час) 9,3 34,1 7620 1321

Нефрэктомия 22 129± 851 * 104501 * 121201 *

(24 час) 136,1 7,1 1640 2353

Нефрэктомия+22 173± 831 * 109071 * 12751 *

кровопотеря 17,2 18,6 1800 205

* - различия достоверны в сравнении с эффектом иммунизации.

• Таблица 4.

Изменение некоторых свойств эритроцитов после перфузии почек крыс (п=10) с краш-синдромом (1 сутки) после снятия зажимов (Mim)

Показатели До перфузии После перфузии Р

(высокостойкий пул)

СР, Хит 583,2 ± 23,14 449,0 1 10,13 <0,001

Процент эритроцитов:

среднестойких 72,8 1 8,14 97,2 1 1,13 <0,05

высокостойких 28,0 + 3,92 2,8 1 1,13 <0,001

Максимум гемолиза,мин 5,0 1 0,13 4,4 1 0,24 <0,05

Длит, гемолиза, мин 9,5 1 0,72 7,0 + 0,32 <0,05

ИР (+37 С),с 115,0 1 4,82 84,2 1 8,12 <0,05

АТФ, мкмоль/г Нв 1,75 t 0,079 1,40 t 0,044 <0,01

2,3 ДФГ,мкмоль/г Нв 17,3 1 0,58 15,2 1 1,18 >0,05

НАДФН мкм/мл эр. час 3,27 1 0,15 2,80 1 0,09 <0,05

ИД, мкл/сек 62,5 1 1,15 51,4 1 1,37 <0,001

Нв г/л х10~-2 8,7 + 0,35 12,4 ± 1,12 <0,01

Примечание: ИД -индекс деформируемости эритроцитов.

со временем максимального эритродиереза в постгеморрагическом периоде ( Я. Г. Уланский, 1968; Е А. Федоров, Е А. Горбунова, 1976).

Нами выявлено в условиях билатеральной нефрэктомии уменьшение количества антителооброазующих клеток (АОК) до 85 * 7,2 АОК/10"6 ядросодержащих клеток (контроль - 144± 21 А0К/10 6 ). Более выраженное снижение количества АОК наблюдается в пересчете на абсолютные величины: 10466 ± 1640 АОК/селезенку, контроль - 22742 ± 3300 АОК/селегенку. Острая массивная невозмещенная кровопотеря у животных с сохраненными почками способствует стимуляции иммунного ответа в 1,5 раза, что не реализуется у животных с билатеральной нефрэктомией (табл.3). Механизм выявленной ингибиции иммунного ответа у нефрэктомированных животных связан с повышением активности Т-супрессоров, что подтверждено в экспериментах с адоптивным переносом спленоцитов ( В. М. Писарев, Л. А. Певницкий, 1977). Спленоциты мышей с двусторонней нефрэктомией и последующим кровопусканием, введенные животным в продуктивную стадию иммунного ответа, способствовали снижению количества АОК в среднем на 52 X в сравнении с эффектом иммунизации и в 2,1 раза - по отношению к воздействию клеток-модуляторов животных с ложной нефрэктомией. Острая кровопотеря у животных с сохраненными почками способствовала активации иммуноцитов селезенки, аргументацией чего служит увеличение количества антителообразующих клеток у мышей -реципиентов в 2,5 раза. Сыворотка животных с удаленными почками не оказывала стимулирующего влияния на количество АОК в сравнении с контролем.

В последующих экспериментах нами изучено влияние почек на процесс аутоиммунного клеточного механизма постгеморрагического эритродиереза. Выявлено значительное (в 15 раз) уменьшение ау-тобляшкообразования у предварительно иммунизированных мышей с двусторонней нефрэктомией и кровопотерей. У животных с сохраненными почками кровопотеря способствовала повышению количества АБОК крови яри уменьшении этого показателя в селезенке. В опытах с перевязкой мочеточников (ретенционная гиперазотемия) показано сохранение стимулирующего эффекта кровопотери на аутоиммунный клеточный зритродиерез: количество АБОК крови возрастает на 48

АБОК селезенки - на 66 X.

Исходя из вышеуказанного, в реализации постгеморрагического

иммунного ответа и эритродиереза участвуют ренопривные механизмы, осуществляющие Т-эависимые эффекты деструкции эритроцитов в постгеморрагическом периоде.

О возможности раздельного эритроцитолитического влияния клеток ШС и лимфоцитов- эффекторов при кровопотере судили по эрит-ролизу после инкубации соответствующих выделенных популяций яд-росодержащих клеток с пулом сингенных "эталонных" эритроцитов. После инкубации лимфоцитов интактных животных с эритроцитами эритродиеретический эффект выше в 2,1 раза в сравнении с эритро-лизом, вызываемым интактными макрофагами; кровопотеря у животных с сохраненными почками способствовала увеличению эритродиерети-ческой активности лимфоцитов в 2,4 раза и макрофагов - в 1,9 раза. При односторонней нефрэктомии происходит снижение цитолити-ческой способности лимфоцитов на 64 X. , гемолитическая активность макрофагов достоверно не изменяется. Острая невозмещенная кровопотеря не влияет на интенсивность эритродиеретической способности изучаемых популяций клеток животных с односторонней нефрэктомией. Двустороннее удаление почек способствует повышению эритродиеретической активности лимфоцитов (количество гемоглобина супернатанта увеличивается с 35,5 ±2,9 иrZ до 117., О ± 13,4 мгХ) при супрессии гемоглобинолитической способности макрофагов. Эффекты стимуляции и подавления клеточного ЗД при билатеральной нефрэктомии не снимаются ранее стимулирующим воздействием острой кровопотеря. Выявленный эффект возрастания цитолитической активности слленоцитов возможно связан с подавлением супрессирующих клонов макрофагов, определяющих действие лимфоцитов-эффекторов.

Выше наш указывалось о реноприеных механизмах усиления постгеморрагического ЭД за счет активации гуморальных гемолитических факторов и локально, т. е. при прохождении крови через почечный сосуды при кровопотере. Учитывая возможность участия в процессах деструкции эритроцитов почечных популяций АЕОК, проведены соответствующие эксперименты. Так,количество спонтанных АБОК почек мышей СБА в постгеморрагическом периоде возрастало в 1,4 раза в сравнении с контрольными исследованиями ( АБОК интактных почек).

Одним из важнейших механизмов уменьшения ЭД в постгеморрагическом периоде у животных с удаленными почками может быть влияние активности клеток МФО на элиминацию эритроцитов из сосудис-

того русла. С целью получения фактического материала по этому вопросу нами проведены эксперименты по изучению фагоцитарной активности спленоцитов с помощью культуры листерий (штамм И-1457). Показано, что высеваемость тест микробов из крови повышена у нефрэктомированных животных, особенно через 30 минут после заражения (20,6 ± 5,2 %) в сравнении с контролем (0,2+ 0,05 %). Показатели завершенности фагоцитоза у животных с удаленными почками через 20 и 30 минут после заражения соответственно равны 3,0 1 0,3 и 63,5 ± 3.8 %), у ложнонефрэктомированных животных эти показатели значительно выше: 90±6,5 % и 99±8,2%. При кровопотере происходит активация клеток М£С, участвующих в элиминации листерий: уже через 10, 15 минут после введения культуры процент высеваемости из крови снижен соответственно в 3,4-4,2 раза (Р с0,05),чем при лапаротомии. Завершенность фагоцитоза увеличена в постгеморрагическом периоде (1 сутки), особенно черз 10, 15 минут после инфузии штамма: 458 и 120 колоний ( контроль -940 и 325 колоний, Р <0,01; 0,001). Кровопотеря в объеме 2 >Т. от массы нефрэктомированных мышей не стимулировала изучаемые функции клеток МФО; т. е. количество колоний, высеваемых из крови, селезенки достоверно не отличаются от группы с • нефрэктомией без кровопускания.

Учитывая возможность гиперфункции инкреторного аппарата почек при односторонней нефрэктомии ( Ю. Е. Вельтищев, 1974; С. И. Рябов, И. А. Ракитянская, А. Н. Шутко, 1989), проведены соответствующие опыты: у повышение иммунного ответа (ИО) у мышей этой группы до 159 ± 18,5 АОК / 10 б ядросодержащих клеток (я. с. к.), что в 1,7 раза больше показателя в контроле (иммунизация). Кровопотеря у животных с односторонней нефрэктомией,как и при двусторонней, не вызывает стимуляции ИО (количество АОК составляет 89 ± 5,9 А0К/10 б ядросодержащих клеток, при иммунизации - 89 ± 14,1 /10 6 я. с. к.). В то же время у животных с сохраненными почками кровопускание вызывает увеличение количества АОК и РОК соответственно на 44 и 130 %. В этой же серии экспериментов для определения влияния первичных звеньев патогенеза симпато-адреналовой системы и стресс-реакций на ИО при нефрэктомии проведены сравнительные опыты с двусторонней адреналэктомией и односторонней нефрэктомией. Достоверных изменений содержания АОК, РОК в группах с адре-

налзктомией и без удаления надпочечников не выявлено, хотя имеется тенденция к повышению показателей при адреналэктомии, что соответствует данным других авторов (Priyma, Fiad, Mutar, Ernst, 1989).

С целью выяснения конкретного участия почек в реакциях ИО и ЭД in vit.ro проведены опыты с последовательным выделением и инку бированием прикрепившихся к пластику клеток почек ( 20 х 10 6/мл, 2 часа , СО 2 инкубатор ) после обработки их антигеном с лимфоцитами и тестированием медиатров гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Результаты свидетельствуют об увеличении процента миграции клеток перитонеального экссудата до 156 + 8,7. в контроле (инкубация лимфоцитов с антигенстимулированными макрофагами селезенки ) формирование МИФ-продуцентов способствует снижению эффекта миграции макрофагов на 45 - 50 %. Эксперименты с исследованием экспрессии 1а - антигенов нефроцитов свидетельствуют о наличии в прикрепившихся к пластику клетках почек, обработанных анти-1а-антителами флюоресцирующих клеток 1,3 степени - 1,8 %, 2 степени -7,2 %. В контроле отмечена экспрессия антигенов 2 класса макрофагов селезенки мыши -80-90 %, и внутрибрю-шинного экссудата - 8-15 Z. Неприкрепившиеся клетки не экспрес-сируиг 1а-антигены. Данные об экспресиии 1а-а почечных клеток получены и другими авторами (Р. Hall oran et al. ,1980; P. Natali et al., 1981; E. Hielm,1982; A. Worlok,1989; V. Sowsa et al. ,1989).

При кровопотере наблюдается активация экспрессии антигенов 2 класса во фракции адгезированных нефроцитов до 75,6 + 9,67 % при уменьшении экспрессии 1а- антигенов селезенки.

Полученные сведения позволяют рассматривать такой экстремальный раздражитель, как кровопотерю, тригерным фактором экспрессии 1а-а для последующей рестрикции генов иммунного ответа пограничных органов и тканей при действии стрессоров.

Возможность участия фагоцитирующих элементов почек в постгеморрагическом ЭД проверена в сериях экспериментолв с локальной блокадой клеток ШС почек тушью на модели перфузии сингенной кровью. Результаты свидетельствуют о снижении эффекта стромато-лиза эритроцитов на 25,9 % , регистрируемого по содержанию гемоглобина в супернатанте перфузата после острой кровопотери в сравнении с аффектом выхода гемоглобина после перфузии анемизи-

- 31 -

рованных кровопотерей почек крыс без инфузии туши.

Таким образом, интенсивность иммунного ответа и эритродиереза изменяется в зависимости от наличия функционирующих почек, определяющих активность В-системы иммунитета (стадия "зрелых" анти-телопродуцентов, АОЮ, особенно в экстремальных условиях (острая кровопотеря) , зависимой от реализации кооперации Т-супрессоров, клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы, гуморальных имму-номодулирующих факторов, генерацию которых существенно определяют условия моно-и билатеральной нефрэктомии. Эффект ренопривной элиминации аутологичных эритроцитов усиливается за счет А-кле-точно-зависимой активации иммуноцитов селезенки, возрастания комплементнезависимых популяций АБОК крови, селезенки, почек, осуществляющих функции клеточной деструкции и лизиса чужеродных агентов, вт.ч. и клеток эритроидного ряда, подвергшихся диере-тическому воздействию.

Как известно, в посттравматическом периоде наблюдается аналогично постгеморрагической реакции стереотипное усиление эритродиереза (Везз^,1973; Богтапс)у, 1980; И. А. Брагин с соавт. , 1980; К К Есина, 1980; ТакаЪазМ еЪ а1. .1983; Кисега еЬ а1. ,1984; ЕН. Дерябин,0.С.Насонкин. 1987 и др.), обусловленный по мнению авторов токсогенными свойствами сыворотки крови, печеночного, селезеночного, почечного, легочного происхождения, воздействием продуктов распада аутобелков, эндотоксинов (липополисахаридов) бактериального происхождения, пептидов средних молекул, полиаминов, веществ липидной природы, обусловливающих генерацию ПОЛ.

На модели краш-синдрома (крысы, собаки) установлено развитие гемолитической анемии , интенсивность которой снижена на 27 % у крыс с двусторонней нефрэктомией по показателям абсолютного количества эритроцитов, ОЦЭ/ЮО г массы при повышении плазменного гемоглобина на 30 %, массы селезенки на 26 X,сдвиге кислотных эритрограмм вправо до 8,4 мин при увеличении процента высокостойких эритроцитов при максимальных изменениях показателей кислотных эритрограмм через 1 сутки после снятия зажимов (2 сутки посттравматического периода.; свободный гемоглобин увеличен в 6,6 раза).

При исследования механизма посттравматической анемии и ее эритродиеретического компонента проведены специальные опыты по

изучению свойств эритроцитов при перфузии сингенной кровью почек животных с травмой (24 час).

Перфузия (1 сутки,табл. 2) сопровождается уменьшением процента высокостойких форм эритроцитов в среднем в 10 раз (Р < 0,01) при соответственном увеличении количества среднеустойчивых форм клеток, укорочении ленты гемолиза на 26 %, что способствует снижению СР на 23 % (Р <0,001), индекса резистентности (+37 С) до 84,2 Л 8,12 с ( исх. - 115,0 4,82 с; Р <0,05). Повреждение, разрушение эритроцитов, перфузируемых через сосуды почек крыс с травмой, сопровождается также биохимическими изменениями. : уменьшением содержания АТФ до 1,4 ± 0,04 мкмоль/г Нв ( до перфузии -1,75 ± 0,079 мкмоль/г Нв), обусловленным перегрузкой мембранных АТФ-аз с последующим перерасходом АТФ, дефицит которого уменьшает продолжительность жизни эритроцитов при снижении антиоксидан-тных резервов эритроцита в виде НАДФН на 14 % (Р <0,05), тенденции к уменьшению 2,3 ДФГ, изменяющего сродство гемоглобина к кислороду, что способствует уменьшению специфической адаптации эритроцитов к действию экстремальных факторов и ускоренному их эритродиерезу, естественно пролонгирующему развивающуюся геми-ческую гипоксию.

Перфузия старой фракцией эритроцитов сопровождается их гемолизом после прохождения через микрососуды почек при сдвиге кислотных эритрограмм вправо и морфологически показано процента необратимых форм эритроцитов (сфероцитов-10-12 %).

В постравматическом периоде фрагмент почечно-зависимого ЭД (по показателям СР, сооношению низко,средне-высокостойких фракций эритроцитов, электронограмм) занимает 40-41 %, при активации ЭД селезенкой (33 %), легких (21%).

Выраженный эритродиерез локального характера при высокой ГС крови до 60,0 л 3,14 ЕА к 4 часу посттравматического'периода (исход- 5,6 ± 0,30 ЕА) проявляется накоплением продуктов распада эритроцитов, регистрируемых по увеличению свободного гемоглобина крови до 32.7 ± 4,12 X к 24 часам после снятия зажимов.

В литературе имеются сведения, что в некоторых экспериментальных и клинических ситуациях, в частности,сужении брюшной аорты или почечной артерии, происходит активация инкреторной функции почек, вследствие чего усиливается образование некоторых

биологически активных веществ (ренина, эритропоэтина) ( Н. Seiуе, 1947-, R. Murrary et al. ,1980; М. Heyes et al. ,1982); в связи с этим Н. Selye разработана модель изучения эндокринной функции ночек. С целью выяснения конкретных морфологических структур почек в реализации гемолитических процессов при типовых патологических процессах, сопровождающихся гипоксией (кровопоте-ря, травма), проведены соответствующие исследования на крысах, кроликах с "эндокринной почкой".

Установлено увеличении количества свободного гемоглобина в

3.2 раза сыворотки крови , взятой из вены эндокринной почки. СР увеличивалась на 20,9 % (Р --0,05) при повышении процента высокостойких популяций эритроцитов в 7,0 раза (Р <0,05) и сдвиге кислотных эритрограмм вправо до 6,1 ± 0,30 мин и удлинении ленты гемолиза до 7,2 ± 0,31 мин ( исходные величины соответственно:

5.3 ± 0,15 мин; 6,2 ± 0,15 мин) при увеличенном количестве ги-пергранулированных ¡теток в области сосудистого полюса корковых клубочков, в стенке крупных артериол наружной части коры через 7 суток после наложения лигатуры с сохранением редуцированного кро?отока (на 40,5 Z; Р <0,05) при соответствующем увеличении ин-п; гГW:ГОР 'ЛННООТИ На 50,8 %.

В cwiax с лерфузкей сингеняой кровью почек эндокринных животных с последующей кровопотерей показан более выраженный эффект деструкция эритроцитов при прохождении крови через почки эндокринные, чем контрлатеральные: кислотные эритрограммы имеют сдвиг вправо до 8,0 + 0,21 мин (до перфузии - 7,5 ±.0,5 мин) при увеличении процента высокостойких фракций эритроцитов на 30,1 %. при соотвественнном уменьшении процента среднеустойчивых клеток до 16,1 1 3,21 X. ( до перфузии - 33,5 ± 8,7 %), что обусловлено разрушением низкостойких фракций эритроцитов; № составлял после перфузии 120,3 ± 2,5 сек (исх. - 111 ± 2,9 сек), количество свободного гемоглобина увеличиывалось в 2,7 раза (Р <0,001). После перфузии контрлатеральной почки, по данным гистологического исследования находящейся в меньшей степени гиперфункции (гранули-рованность ЮГА), происходит лишь снижение суммарной резистентности : эритроцитов на 13,3 % (Р <0,05) при относительном увеличении процента ереднестойких форм эритроцитов в 2,4 раза, снижении ИР на 13,5 % и тенденции к увеличению плазменного гемоглоби-

на в 1,5 раза.

Острая массивная (35-40 X ОЦК) невозмещенная кровопотеря, произведенная у животных с "эндокринной почкой", способствовала более выраженной степени гранулированности эпителиоидных клеток ЮГА в 2,3 раза больше контроля и в 1,6 раза - в сравнении с животными с "эндокринной почкой" без кровопускания; индекс грану-лировапнности равен 0,49 + 0,031 (контроль - 0,17 + 0,03) Контр-ла^ерапьная почка в условиях кровопотери достоверно не отличается по критериям гранулированности ЮГА от аналогичных показателей кроликов с "эндокринной почкой" без кровопотери. При исследовании кислотной резистентности эритроцитов, взятых из вены "эндокринной" почки" спустя сутки после кровопускания наблюдается увеличение суммарной резистентности на 52,4 % при сравнении с исходными показателями и на 62,5 % в сравнении с показателями артериальной крови. В исследуемых образцах крови эндокринной вены наблюдается также относительное преобладание клеток эритроидного ряда высокоустойчивых на 44,9 % вследствие повышенного разрушения низкостойких форм эритроцитов и их элиминации из кровотока, что сопровождается повышением сывороточного гемоглобина на 24,6 % в сравнении с показателями до кровопотери и на 43,8 X по сравнению с содержанием гемоглобина в аорте.

В опытах с перфузией почек "эндокринных" и контрлатеральных при определении возможности влияния на процесс локального ЭД с помощью теофиллина, как известно, являющегося ингибитором фосфо-диэстеразы. катализирующей процесс синтеза ЦАМФ, показано, что после инфузии теофиллина (0,2 мг/мл) перфузия "эндокринных, почек" аутокровыо способствует увеличению эритродиеретического эффекта, что подтверждается снижением СР и ИР соотвественно на 28,3 X и на 29,6 %.Теофиллин также усиливает ЭД и при прохождении крови через контрлатеральные почки, что подтверждено соответствующими экспериментами.

Изучение гемолитической активности сыворотки в постгеморрагическом периоде у животных с "эндокринной почкой" свидетельствует о повышении ГС в случае исследования сыворотки крови, взятой из вены эндокриннных почек" до 11,4 ± 0,23 ЕА в сравнении аналогичными показателями крови вены контрлатеральной почки (3,3 ± 1,29 особенно после кроволотере с максимальным эффектом к 30 суткам

функционирования модели в условиях невозмещенной кровопотери соответственно в 3,6 -4.7 раза в сравнении с ГС животных без кровопотери.

Таким образом, интенсивность постгеморрагического эритродие-реза у животных с моделированным усилением инкреторной -функции почек зависит в определенной степени от ЦАМФ-определяемого повреждения эритроцитов при прохождении крови через почечные сосуды при участии эритродиеретической активности сыворотки крови, максимально проявляющейся через 30 суток функционирования "эндокринной почки".

В связи с выявленным нами почечнозависимым компонентом эрит-родиереза при действии экстремальных факторов, данными исследователей по поводу наличия фрагментации эритроцитов при почечной патологии и значении патологически измененных микрососудов почек (Brain et aJ. , 1962) в гемолизе эритроцитов, а также установлении зависимости степени анемии, эритродиереза с локальным и дистантным (гуморалыго-почечным) механизмами разрушения эритроцитов (Л. И. Ершова, 1979) в эксперименте (Б. В. Полушкин, Н. М. Новиков, Л. И. Ершова, 1983) и клинике при сохранении азотвыделительной функцией почек (Л. И. Ершова, 1985) нами проведены исследования интенсивности специфических механизмов эритродиереза и его гуморального компонента у больных ХПН, находящихся на програмном гемодиализе.

Показано,что у больных ХПН перед сеансом гемодиализа (ГД) количество эритроцитов и гемоглобина на 61,8 % и 54,1 % меньше соответствующего показателя в контрольной группе. Сеанс гемодиализа способствует увеличению концентрационных величин, в том числе и количества эритроцитов, гемоглобина; их содержание возрастает в единице объема соотвественно на 36,5 % - 52,6 % при увеличении плазменного гемоглобина на 41,2 X (Р <0,01), как одного из показателей строматолиза эритроцитов.

Выявленная анемия сопровождается увеличением максимальной резистентности эритроцитов до 0,25 % НаС1 (контроль - 0,31 % NaCl; Р <0,05), удлинением ленты химических эритрограмм до 9-12 мин (контроль - 7-9 мин) при максимуме гемолиза до 8 - 8,4 мин (контроль - 5,2 мин; Р <0,01).Суммарная резистентность возрастала на 47-64 ZZ при увеличении свободного гемоглобина в среднем в 2,1

Рис 3.

1.Гель-хроматограммы супернатанта, получен-

1.1 ного обработкой НСЬ04 сыворотки крови б-ной Е; ГС(ЕАх10-1).

1.1.ло гемодиализа

1.2.после гемодиализа

2. Профили злнции образцов пула сыворот-

1.2 ки крови больных ХПН II стадии, полученные на колонке ТБК-в 3000 БЫ (7,5x300 мм) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,5) при скорости злю-ции 0, 5 мл/мин; об ' ем

2.1 образца 4, мкл; ГС (ЕА/мкг белка);

2.1. до гемодиализа; количество белка в образце 0,27 мг;

2.2.после гемодиа-

2.2 лиза; количество белка в образце-0,29 мг.

ГО

во ■ ■ во

4Л

30 Е0

га о

РИС. 4. ИНТЕГРАЛЬНАЯ СХЕМА РЕГУЛЯЦИИ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА

раза. Повышешюрезистентный пул эритроцитов больных ХПН после гемодиализа снижает свою резистентность на 57,1 % мин (Р <0,05) при nobtííibhKn количества низкоустойчивых форм эритроцитов и укорочении ленты гемолиза до 8,0 + 0,47 мин (до гемодиализа - 12,2 + 0,52 мин; Р <. 0,001).

Активация эритродиереза при ХПН связана с воздействием гуморальных гемолитических факторов. Показано, что после сеанса гемодиализа наблюдается снижение количества СМ на 40,2 %. Тем не менее, гемолитическая активность сыворотки крови возрастает после гемодиализа на 69,7 Z до 20,2 ЕА (рис. 3). Исследование на ге-молити ческую активность фракций сыворотки, полученных с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ) при использовании колонки TSK-G-3000 SW показало, что специфическая гемолитическая активность установлена во 2 фракции (время элю-ции13-51 мин) с максимальным значением ГС 17,9 ЕА/мкг белка. Профиль элюции образца сывороток больных ХПН после гемодиализа, свидетельствует о максимальной- ГС 2 фракции со значением 25,8 ЕА/мкг белка, что на 44,1 % больше специфической гемолитической активности выявленного ГС-компонента сыворотки больных, взятой до гемодиализа. Полученные хроматограммы сывороток больных ХПН и определение распределения фракций по ГС свидетельствуют о том, что наибольшей специфической активностью обладает компонент с молекулярной массой 80-100 кД. Биологическая активность выделенного с помощью ВЖХ гемолитического компонента сыворотки больных ХПН, находящихся на програмном гемодиализе, подтверждена в экспериментах in vivo.

Таким образом, ГС выделенного компонента сыворотки больных ХПН после гемодиализа более активна в отношении разрушения эритроцитов, чем до гемодиализа, как показано в экспериментах с изучением ГС in vitro и in vivo, и трансфузии эритроцитной массы в период повышенного риска гемолиза нецелесообразна Показано, что уже через 24 часа после инфузии количество эритроцитов не только не оставалось на прогнозируемо повышенном уровне, а даже имело тенденциА) к снижению: 2,08 ± 0,08х10л12/л; исход - 2,36 ± О,14x10" 12/л. Следовательно, эффективность инфузий эритромассы значительно снижена у больных ХПН в связи с повышенной гемолитической актив ностью сыворотки крови и реализуемой на пул доноре-

ких эритроцитов, обладающих низкой резистентностью. В связи с этим нами разработан ( авт. свид. N 1770001) и внедрен (метод. рекомендации, МЗ РФ, 1992) способ прогнозирования эффективности инфузий эритромассы, основанный на количественном определении в предтрансфузионном периоде у больного показателя гемолитической активности сыворотки крови и коэффициента устойчивости донорских эритроцитов к гемолизирующему воздействию сыворотки реципиента Показатели рассчитываются по интегральным параметрам кислотных эритрограмм,адекватно отражающим качество клеток эрит-роидного ряда По соотношению этих показателей: при гемолитической активности сыворотки крови <5,5 X, коэффициента устойчивости донорских эритроцитов < 1 прогнозируется эффективность инфузий эритромассы.

Таким образом,проведенные исследования по изучению механизмов экстремального эритродиереза, в частности, при кровопотере, травме, свидетельствуют (рис.4) о наличии общих стандартных звеньев почечно-зависимого эритродиереза, реализующегося в ранние сроки через гемолиз клеток красной крови, проходящих через почечные сосуды, измененным основным патологическим процессом при участии Т-супрессорно регулируемых аутоиммунных клеточных механизмов ЭД, СМФ в том числе и почечных адгезивных Га-положительных популяций клеток, способных к антигенпрезентации с продукцией лимфокинов. Эритродиерез дополняется воздействием гуморальных гемолитических факторов молекулярной массы 80-100 кД, ц-АШ>-зависимо образующихся эпителиоидными клетками ЮГА, дифференцированно специфически воздействующих на эритроциты различных популяций по степени зрелости с последующей адекватной адаптацией процессов регенерации эритрона.

ВЫВОДЫ

1.При действии экстремальных факторов (острая кровопотеря, травма) наблюдается стереотипная реакция системы красной крови - эритродиерез, интенсивность которого снижена при двусторонней нефрэкто-мии, что играет важную роль в развитии постгеморрагической, посттравматической анемий.

2. Механизм гемолиза эритроцитов в ранний период (1-24 час)после острой, массивной (30-40 X ОЦК) невозмещенной кровопотери, травмы связан с почечнозависимыми гуморальным, аутоиммунным и локаль-

- 40 -

но-почечным процессами разрушения эритроцитов.

3. После острой кровопотери, действия механических факторов наблюдается повышение гемолитической активности сыворотки крови, величина которой снижена при билатеральной нефрэктомии, с максимальным эффектом через 1 сутки после воздействия стрессоров, при кровопотере 35-40% от объема циркулирующей крови. Эритродиерети-ческое. действие пост геморрагической сыворотки зависит от времени пгсле кровопотери: в раннем (до 1 суток) периоде мишенью для нее являются эритроциты старой фракции, на 3-7 сутки - преимущественно эритроциты молодой фракции.

4. Хроматографич^екими и электрофоретическими методами выделен и идентифицирован специфический почечнозаьиеимый гемолитический компонент постгеморрагической сыворотки крови, имеющий молекулярную массу 80-100 кД, относящийся к фракции альфа-1-глобулинов с евспшшлтк) 07- E/i/MrT Исследование in vivo доказало наличие дозозависимого эффекта. Механизм действия гуморальных эритродиеретических факторов при кровопотере связан с активацией системы комплемента по альтернативному пути, не зависит от действия ингибиторов протеаз.

5. На модели эндокринной почки показано специфическое усиление эритродиереза, реализующегося за счет гипергранулированных эпи-телиоидных клеток югстагломерулярного аппарата почек, обусловливающих ц-AM1-зависимое образование гуморальных гемолитических факторов, количество которых возрастает при кровопотере.

6. Усиленный эритродиерез в раннем (1-24 час) постгеморрагическом, посттравматическом периоде определяется повреждением эритроцитов, проходящих через почечные сосуды животных. Процесс локального почечного механизма разрушения эритроцитов зависит от освобождения простагландинов, не связан с вазоконстрикцией, осуществляется с участием аутоиммунных механизмов: реактивных популяций аутобляшкообразующих клеток почек, фагоцитирующих почечных элементов, адгезивные 1а-а+ -фракции которых способны к антиген-презентации с образованием лимфюкшюв, активирующих миграцию макрофагов in vit.ro.

7. Электронномикроскопические исследования и данные кислотных эритрограмм показали что в первые сутки после кровопотери, краш-синдрома в крови, проходящей через сосуды почек, легких,

селезенки значительно увеличено содержание эритроцитов в стадии предгемолиза.

8. Иммунный процесс разрушения эритроцитов после острой кро-вопотери, травматического повреждения заключается в почечнозави-симом аутоиммунном клеточном механизме эритродиереза, реализация которого связана с активностью Т-супрессоров, системы мононукле-арных фагоцитов.

9. Сравнительный анализ интенсивности эритродиереза при кро-вопотере и травме свидетельствует о более выраженном локально-почечном механизме разрушения эритроцитов при краш-синдроме и повышенной гемолитической активности сыворотки крови, определяемой в постгеморрагическом периоде.

10. Возмещение острой смертельной кровопотери кровезаменителями гемодинамического действия способствует снижению гемолитической активности сыворотки крови, но не уменьшает интенсивности локального почечного механизма эритродиереза.

11. У больных хронической почечной недостаточностью, терминальной фазы, второй стадии развивается анемия, механизм которой связан с повышенным разрушением эритроцитов вследствие увеличения гемолитической активности сыворотки крови, зависящей от среднемолекулярных пептидов, количество которых снижается в процессе гемодиализа, и гемолитических факторов молекулярной массы 80-100 кД, концентрация которых увеличивается к концу сеанса ге-мод диализ а.

12. Инфузии зритромассы больным с терминальной уремией в период увеличения гемолитической активности сыворотки крови неэффективны в связи с гемолизом низкорезистентных донорских эритроцитов, что сопровождается понижением количества эритроцитов и повышением свободного гемоглобина плазмы уже через сутки после трансфузии.

13. С целью повышения эффективности инфузий зритромассы при кровопотере, травме и почечной патологии рекомендуется in vitro определять показатели гемолитической активности сыворотки крови и устойчивости донорских эритроцитов к диеретическому воздействию сыворотки крови реципиента: инфузии более устойчивых эритроцитов способствуют более выраженному эффекту антианемического, -гипоксического действия инфузируемых эритроцитов (авторское

свидетельство N 1770001 от 25.12.90, методические рекомендации, МЗ РФ, 1992).

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Горбунова Н. А. , Балакина Т. А., Пригожина Т. А. , Ершова JI. И. и др. Системные нарушения при краш-синдроме, принципы трансузион-ной коррекции в эксперименте. Тез. докл. 3-го Всесоюзного с'езда гематологов и трансфузиологов. Москва. 1991, т. 2, с. 471-472.

2. Ершова Л. И. Влияние почек на некоторые физико-химичесие свойства эритроцитов. -Тез. докл. научн. конф. молодых ученых. Барнаул, 1975, с. 132-133.

3. Ершова Л. И. О почечных гуморальных факторах эритродиереза. -В кн.: Биологически активные вещества и процессы адаптации. Барнаул, 1978, с. 9-10.

4. Ершова Л. И. Почечнозависимый эритродиерез при гипоксическом стрессе. В кн.: Механизмы регуляции в системе крови. Тез. докл. 4 Всесоюзной конференции. Красноярск. 1. 1978, с. 170-171.

5. Ершова JL И. К механизму эритродиереза при патологии почек. В кн.: Кислородный режим организма и механизмы его обеспечения. Тез. докл. Всесоюзной конференции. Барнаул. 1978, с. 170.

6. Ершова Л. И. Состояние постгеморрагического эритродиереза у животных после нефрэктомии или поражения почек уранил-глицерино-вой смесью. В кн.: Сердечно-сосудистые заболевания и гомеостаз. Барнаул, 1979, с. 63-67.

7. Ершова JL И. К патогенезу анемий при нефритах. Тезисы докл. Всесоюзного с'езда нефрологов. Москва, 1980, с. 184.

8. Ершова Л. И. Почечнозависимый эритродиерез при экстремальных воздействиях. - В кн.: Патология экстремальных состояний. Уфа, 1982. с. 1.34.

9. Ершова Л. И. Эритродиретическая активность сыворотки крови как показатель возможности гемотрансфузионной терапии при патологии почек. В кн.: Молодые ученые и специалисты Алтая народному хозяйству. Барнаул, 1983, с. 82-84.

10. Ершова Л. И. Иммуномодулнруюшая роль почек. - В кн.: Проблемы ангиологии и патологии гемостаза. Тез. докл. краевой конференции, Барнаул, 1986, с. 125-126.

И.Ершова JL И. О роли почек в иммунном ответе. В кн.: Регуляция почек и водно-солевого обмена. Барнаул, 1987, с. 8-15.

12. Ершова Л. И. Методика оценки эритродиеретической активности

сыворотки крови и степени повреждения эритроцитов у больных. В кн.: Ангиология и гемостаз. Барнаул, 198S. с. £8.

13. Ершова Л. И. Об участии лимфоцитов и макрофагов в механизме почечнозавксимого эритродиереза. В кн.: Механизмы патологических реакций. Томск, 1988, с. 68-71.

14. Ершова Л. И. К механизму постгеморрагического аутоиммуного эритродиереза. В кн.: Механизмы повреждения регуляции восстановительных процессов. Новосибирск, 1988, с. 112-113.

15. Ершова Л. И. Экспрессия Иа-антигенов и антигенпрезентирующая функция почечных макрофагов. - В кн.: Механизмы патологических реакций. - Новокузнецк, 1991, с. 43-44.

16. Ершова Л. И. К патогенезу анемий при травке и 'фовопотере. Тез. докл. 3 Всес. с'езда гематологов и трансфузиологов. Москва. 1991, т. 2, с. 336- 337.

17. Ершова Л. Л. Первичный иммунный отЕет в условиях моно-и билатеральной нефрэктомии. Иммунология, 1991, 2, с.44-46

18. Ершова Л. И. Почечкозависимый механизм постгеморрагического -эритродиереза. Патол. физиол. и экспер. тер. 1991. N. 3, с. 27-29.

! 9. Ершова Л. И. , Горбунова H.A. Механизмы гемолиза при действии экстремальных факторов. Бюлл. экспер. биол. .1991, N. 4, с. 363-365.

20. Ершова Л. И. , Горбунова Н. А. Способ прогнозирования эффективности инфузий эритромассы. - Тез. докл. 3-го Всесоюзного с'езда гематологов и трансфузиологов. Москва. 1991, т. 2, с. 446-447.

21. Ершова Л. И. , Горбунова H.A. О механизмах постравматическо-го гемолиза. Патол. физиол. и экспер. тер. 1992, N 3, с.54 -56

22. Ершова Л. И. , Горбунова Н. А. Методика прогнозирования эффективности инфузий эритромассы. Методические рекомендации МЗ РФ. Москва. 1992.

2?. Ершова Л. И. , Громыхина Н. М. О влиянии почек на активность Т-супрессороЕ при острой кроЕопотере. В кн.: Механизмы патологических реакций. Томск 1983. т. 3 с. 162-164.

24. Ершова Л. И. , Зейналов А. 11 , Ажигирова М. А. , Дереза Т. А. и др. Исследование гуморальных гемолитических факторов при крово-потере хроштографическими методами. Билл, экспер. биол., 1992, N.2,0.122-127. '

25. Ершова Л. И. , Козлов В. А.', Труфакин В. А. , Громыхина ЕЮ. и др. О роли почек в механизме иммунной стимуляции, вызванной острой кровопотерей. В кн.: Механизмы патологических реакций. Томск, 1981, с. 64-66.

26. Ершова Л. И. , Полушкин Б. В. Почечнозависимый эритродирез как одно из важных проявлений адаптации при экстремальных воздействиях. В кн.: Адаптация человека в различных климато-геогра-фических производственных условиях. Тез. докладов Всесоюзной конференции по адаптации. Ашхабад,1981. с. 136.

27. Ершова Л. И. , Полушкин Н. М. Участие почек в эритродиерезе. -В кн.: Регуляция функции почек и водно-солевого обмена. Барнаул, 1983, с. 26-34.

28. Ершова Л. И. , Полушкин Б. В., Новиков ЕМ. О гуморальных, иммунных и сосудистых механизмах почечнозависимого эритродиере-за. В кн.: Механизмы патологических реакций. Томск. 1981. , с. 67-69.

29. Ершова Л. И., Самойлова Е М. Иммунологические механизмы почечнозависимого постгеморрагического эритродиереза. - В кн.: Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Тез. докл. 4-го Всесоюзного с'езда патофизиологов. Москва, 1989. 2, 667.

30. Ершова Л. И. , Самойлова Н. М. К ренопривному механизму раннего постгеморрагического эритродиереза. В кн.: Экспериментальная и клиническая патофизиология экстремальных и терминальных состояний. Новокузнецк, 1990, с. 78-80.

31. Ершова Л. И., Самойлова Н. М. К почечно-сосудистому механизму элиминации иммунных комплексов при острой кровопотере. В кн.: Актуальные вопросы клинической ангиологии. Барнаул, 1990, с. 78-80.

32. Новиков Н. М. , Л. И. Ершова. О роли почек в механизме эритродиереза. -В кн.: Вопросы частной патологической анатомии. Барнаул, 1973, с. 180-182.

33. Новиков Н. М. , Ершова Л. И. Особенности развития гемолитической анемии у нефрэктомированных животных. В кн.: Актуальные вопросы гематологии. Томск. 1976,с. 139-142.

34. Новиков Н. М. , Ершова Л. И. , Михайлова С. Е Продукты распада эритроцитов как стимуляторы образования эритропоэзстимулирующего микроокружения. - В кн.: Повреждение и регуляторные процессы организма. Москва, 1982, с. 291.

35. Новиков H. M. , Ершова Л. И. , Ромендик Л. Я , Григорьев Г. П. и др. О роли эритродиереза и продуктов распада эритроцитов вмеханиз-мах регуляции эритропоэза. - В кн.: Механизмы повреждения, резистентности, адаптации и компенсации. !.Материалы 2-го Всесоюзного с'езда патофизиологов. Ташкент, 1976, с. 383-384.

36. Новиков Е М., Ершова Л. И. , Стагис А. Е О роли почек в механизме эритродиереза при гемолитической (фенилгидразиновой) и острой постгеморрагической анемии. - Вюлл. зксп. биол. и мед. ,1976, N 11, с. 1311-1313.

37. Новиков H. М. , Ершова JL И. , Черкашин Г. В. О взаимосвязи почечного эритродиереза с функцией макрофагов. - В кн. : Иммунологические механизмы в патогенезе, диагностике, лечении заболеваний сосудов и внутренних органов. Барнаул. 1980, с. 24-26.

38. Новиков H. М. , Полушкин Б. В., Ершова Л. И. О роли макрофагов в механизме эритродиереза в обеспечении эритропоэзстимулирующего действия эритроцитарных факторов. - В кн. Фагоцитоз и иммунитет" Тез. докл. Всесоюзного симпозиума, посвященного 100-летию создания И. И. Мечниковым теории создания иммунитета. Москва, 1983,123-124.

39. Полушкин Б. В., Новиков H M., Ершова Л. И. Патогенез нефроген-ных анемий. Тез. докл. 4 Всесоюзной конференции. Красноярск. 1978,1, с. 147-148.

40. Полушкин Б. В. , Новиков H M Ершова Л. И Шойхет И. H и др. Роль почек• в гомеостазе форменных элементов крови. В кн. : Кислородный режим организма и механизмы его обеспечения. Тез. докладов Всесоюзной конференции. Барнаул. 1978, с. 170.

41. Erschova L. I. Mechanisms of hemolysis in extreme conditions. Constituent Congress international Society for Pathophysiology, Moskow, 1991, P. 128-129.

Изобретения и рационализаторские предложения по теме диссертации

1. Ерщова Л. И., Горбунова НА., Шойхет И. Н. Авторское свидетельство N 1770001 на изобретение "Способ прогнозирования эффективности инфузий эритромассы".

2. Ершова Л И. Удостоверения NN 656, 702, 36 на рационализаторские пред ложения. Приняты к использованию в Алтайском медицинском институте.

Подп. к печати f/xl-9Аг ф. (,Cf9û/,i

Буи. тип. № Д Физ. П. л. ZK Уч.-нзд. л. 2., V

Заказ /У/4 Тираж /00

Типография ордена «Знак Почета» нзл-ва МГУ. Москва. Ленинские горы