Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы расширения адаптивных возможностей организма в экстремальных условиях с помощью эндогенных нейропептидов

- од

I 1 ил да

На правах рукописи

Ш /Чъие-иЛ

ЛЛЬПЕРОВИЧ ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

МЕХАНИЗМЫ РАСШИРЕНИЯ АДАПТИВНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ОРГАНИЗМА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ С ПОМОЩЬЮ ЭНДОГЕННЫХ НЕЙРОПЕПТИДОВ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

14. 00.16.- патологическая физиология

Москва -1999

Работа выполнена в отделе экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии Ростовского областного патологоанатомического бюро

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор

А.М. Менджерицкий

доктор медицинских наук

А. Э. Мационис

Официальные оппоненты:

1. Глебов Р.Н., доктор биологических наук, профессор.

2. Панченко Л.Ф., доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, академик Российской АМН, профессор.

3. Гуляева Н.В., доктор биологических наук, профессор.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт Мозга Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится "40 " 1999 года в_часов на

заседании Диссертационного Совета Д. 001.03.01. при НИИ общей патологии и патофизиологии Российской АМН (Москва, 125315, Балтийская ул., д.8)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан "_ 1999 года

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность п роблемы. Проблема адаптации организма к экстремальным воздействиям, изучение общих и специфических механизмов развития ответных реакций на действие раздражителей различной силы и длительности, разработка принципов профилактики истощения адаптационных резервов и терапия развившихся на этой основе патологических состояний продолжает быть актуальной как для теоретической биологии, так и для практической медицины, которой приходится сталкиваться с так называемыми «болезнями адаптации» во все большем объеме (Vincenzo, 1990; Судаков, 1994).

В процессе эволюции живых систем развивались различные пути и способы приспособления организмов к меняющимся условиям среды. Увеличение резистентности (сопротивляемости) и повышение толерантности (переносимости, выносливости) относится к двум качественно различным стратегиям адаптации (Слоним, 1986; Меерсон, Пшенникова, 1988). Есть достаточно доказательств, что наряду с резистентной толерантная стратегия адаптации часто встречается у незимоспяших млекопитающих, включая человека, а выбор стратегии определяется биологической целесообразностью, зависящей от характера действующего фактора, его силы и длительности (LeBlanc, 1978; Линденбратен, 1986; Ольховский, 1987).

Зависимость качественно различных приспособительных реакций от количества (силы) действующих раздражителей является основой дальнейшей разработки эффективных способов управления адаптацией, поскольку незначительные по силе и продолжительности воздействия активируют защитные механизмы, а интенсивные или повторяющиеся вызывают повреждения отдельных органов и их систем, привода к развитию патологических процессов (Меерсон, 1995; Herman and Cullinan, 1997). Наиболее распространены стрессогенные нарушения функций желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистой и центральной нервной систем (Тигранян, 1990; Ашмарин, 1997). Нарушение функций нервной системы в ходе трансформации адаптивного эффекта стресса в повреждающий происходит за счет возникновения в результате воздействия чрезвычайных раздражителей генераторов патологически усиленного возбуждения, структурных альтераций нейронов, изменений секреции медиаторов, межнейрональных и системных отношений (Панченко и др., 1995; Represa, 1995; Глебов, Крыжановский, 1995).

Наиболее перспективным путем в плане управления адаптационной деятельностью организма представляется установленный факт замены в естественных условиях одной стратегии на другую, когда первичная стратегия оказывается неэффективной (Кулинский, Ольховский, 1992). Такие переключения стратегий возможны за счет участия в адаптационных процессах различных типов

рецепторов путем взаимодействия реактивности и пластичности - двух основополагающих свойств нервных клеток, которые обеспечивают все разнообразие регуляторно -приспособительных реакций организма на изменения внутренней и внешней среды (Конорский, 1970; Гайнутдинов, Штарк, 1986; Батуев, 1991).

При поиске инструментов воздействия на молекулярный уровень процессов нейрональной пластичности с целью управления адаптационными реакциями организма особый интерес представляет изучение механизмов действия эндогенных регуляторных пептидов, которые выполняя функции нейромедиаторов и/или нейромодуляторов способны за счет образования пептидного континиума длительно влиять на метаболизм мозга, тем самым занимая одно из ведущих мест в общей картине регуляции и коррекции пластических перестроек в органах и тканях при изменении условий окружающей среды (Громов, 1992; Ашмарин, 1996; Но1 й. а1., 1994). Особое внимание привлекает дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП), доминирующим свойством которого является адаптогенный эффект, показанный в условиях различных по этиологии стрессирующих воздействий (Иванов, 1984; Меерсон, 1986; Менджерицкий и др., 1996; Альперович и др., 1997). Индуцируемая при введении данного пептида Д-активность, характерная для медленноволновой фазы сна (Судаков, 1992; Ковальзон, 1994), является показателем протекания адаптационных изменений, обеспечивающих защиту и надежность работы нервной системы (Бехтерева, 1994). Перечисленные факты (наряду с полифункциональностью н отсутствием специфических рецепторов) и послужили основанием выбора ДСИП в качестве объекта для исследования возможностей управления развитием адаптационных реакций в организме и их переключением с одного типа на другой, более эффективный.

Цель исследования состояла в изучении триггерных механизмов управления эффективностью адаптивных реакций организма с помощью экзогенного введения регуляторного нейропептида эндогенного происхождения (дельта-сон индуцирующего) и использования раздражителей различной силы и этиологии: гипоксия, повышенная (плавание) физическая нагрузка, гипокинезия, аудиостимуляция и аудиостимуляция на фоне гипокинезии.

Основные задачи исследования состояли в следующем: 1. Изучить длительное (в течение 1-5 суток) влияние пептида на состояние некоторых регуляторных систем, изменения в которых могут приводить к морфо-функциональным перестройкам нейрональных структур. Для этого исследовать функциональное состояние различных типов мембран в отделах головного мозга, участвующих в развитии адаптационных реакций (кора, ги-

поталамус, таламус, гшшокамп) по изменениям в системе перекисного окисления липидов.

2. В отделах мозга (кора, таламус, гипоталамус, гиппокамп) изучить влияние пептида на соотношение ионоаминов для оценки степени сдвигов в системах центрального контроля активности пшоталамо-гштофизарно-адренокортикаль-ной оси в процессе развития ответной реакции на экстремальные воздействия.

3. Исследовать влияние ДСИП на некоторые физиологические показатели и состояние системы перекисного окисления липидов, уровень моноаминов в крови и кислотную резистентность эритроцитов для интегративной оценки степени адаптивных/дезадаптивных изменений в организме в условиях экстремальных воздействий.

4. Определить тип адаптационной реакции при различных видах воздействий на фоне введения дельта-сон индуцирующего пептида и без него по анализу лейкоцитарной формулы.

Научная новизна

1. Впервые показано, что введение ДСИП интактньш животным способствует повышению резистентности организма благодаря развитию состояния «преадаптации» путем фазной смены в течение первых суток после инъекции различных стадий реакции тренировки и активации. Это становится возможным в результате развития следующих процессов.

■ Во-первых, в связи с длительными (в течение трех суток) изменениями электроэнцефалографических характеристик цикла бодрствование-сон в сторону уменьшения доли бодрствования (особенно активного бодрствования) и увеличения представленности медленноволновой активности Д-диапазона за счет пролонгированного влияния ДСИП на суточную динамику катехоламинов и серогонина в коре и подкорковых структурах;

■ Во-вторых, введение пептида индуцировало фазные изменения в равновесии про- и антиоксидантных систем мозга и крови, в результате чего наблюдался выраженный мембраностабилизирующий эффект пептида в отношении не только нейрональных (синаптические, митохондриальные и миелинизированные) мембран, но и эритроцитарных и лейкоцитарных. Одновременно были зарегистрированы длительные изменения в системе кроветворения, что выражалось в выбросе в кровяное русло повышенного количества стойких к гемолизу молодых эритроцитов;

■ В-третьих, пептид продуцировал наблюдавшиеся в течение 5 суток после

инъекции изменения уровня серотонина и гнстамина крови - важнейших

вазоакгивных веществ, относящихся к системе регуляции микроциркуляции;

2. Впервые показано, что одним из важнейших молекулярных механизмов создания состояния преадаптации к различным по этиологии, силе и длительности стрессорным воздействиям является модулирующее влияние ДСИП на моноаминергические системы и интенсивность перекисного окисления липидов в различных отделах головного мозга, обеспечивающее функциональные перестройки в активности гапоталамо-гапофизарно-наддочечниковой системы.

3. Проведен сравнительный анализ степени и скорости наступления изменений в системах биогенных аминов и перекисного окисления липидов в мозге и крови при различных стрессорных воздействиях, отличающихся своими патогенетическими механизмами, на фоне предварительной инъекции пептида и без него и показана большая подверженность нейрональных мембран коры и гиппокампа окислительной деструкции при стрессе.

4. Впервые проведена оценка типа адаптационной реакции по формуле «белой крови» при гипоксии, гипокинезии различной продолжительности, физической нагрузке (плавание) и аудиогенной эпилепсии и установлен факт изменения типа адаптационной реакции организма на более эффективный и экономичный при предварительном введении ДСИП.

5. Впервые показана эффективность применения ДСИП в условиях физической нагрузки с целью повышения работоспособности. Установлена способность пептида увеличивать латентный период возникновения генерализованной судорожной активности в группе «чувствительных» к звуковому эпилептическому раздражителю крыс и полностью предотвращать появление в ЭКоГ признаков эпилептической активности в группе крыс, «нечувствительных» к звуковому эпилептическому раздражителю.

6. Результаты выполненных исследований позволили впервые провести сравнительный анализ особенностей влияния дельта-сон индуцирующего пептида на функционально-биохимические характеристики мозга и организма в целом в условиях различных по этиологии и патогенезу экстремальных состояний, что позволило разделить адаптивные перестройки, происходящие под влиянием ДСИП на универсальные и специфические.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработан ряд теоретических положений, которые в совокупности позволяют определить роль нейропепгидов в механизмах выбора адаптационной стратегии организма и обосновать возможность

повышения эффективности адаптивного ответа при переключении с помощью пептидов с одного типа адаптационной стратегии на другой. Полученные результаты являются крупным вкладом в такие науки как биология и медицина экстремальных состояний, физиология и биохимия адаптационных процессов, физиология и биохимия регулягорных пептидов.

Полученные в данной работе новые факты о неспецифических и специфических (в зависимости от конкретного вида действующего на организм экстремального или патологического фактора) составляющих механизма реализации стресспротекторных свойств ДСИП (выпускаемого рядом фармацевтических фирм в качестве лекарственного препарата) открывают новые перспективы его практического применения в медицине с целью управления адаптационными реакциями организма.

Результаты исследования последствий влияния на организм повышенной физической нагрузки, гипоксии, гипокинезии и звукового эпилептического раздражителя могут быть использованы в соответствующих отраслях клинической и спортивной медицины как для уточнения патогенеза каждого из этих состояний, так и для предотвращения связанных с их воздействием осложнений путем применения ДСИП в качестве специфического защитного препарата.

Материалы работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий по курсам общей и спортивной физиологии, а также спортивной морфологии в Ростовском государственном педагогическом университете и Институте физкультуры.

Положения, выносимые на защиту.

1. Искусственное повышение адаптивных возможностей организма к различным патологическим воздействиям с помощью введения эндогенного адаптогена пептидной природы (дельта-сон индуцирующего пептида), сопровождается перестройками, на фоне которых универсальные естественные адаптивные реакции приобретают определенную специфичность в зависимости от характера взаимодействия пептида и патогенного фактора.

2. Универсальными составляющими адаптогенного действия ДСИП являются регуляция баланса моноаминов и интенсивности ПОЛ в различных регионах мозга, активация эритропоэза и выброс в кровяное русло повышенного количества стойких к гемолизу молодых эритроцитов, а также контроль со стороны пептида уровня в крови таких вазоакгивных веществ как гистамин и серотонин.

3. Специфическим фактором повышения адаптивных возможностей организма к воздействию гипоксии является предупреждение развития стресс-реакции путем введения ДСИП, в результате чего повышение резистентности организма в условиях

гипоксии достигается путем развития первой стадии реакции тренировки -ориентировки, переводя данный раздражитель из ряда чрезвычайных в разряд слабых.

4. Повышение адаптивных возможностей организма и удлинение периода, в течение которого не развивается утомление, в условиях вынужденного плавания на фоне введения ДСИП достигается предупреждением развития стресс-реакции и ее заменой на реакцию активации

5. Повышение адаптивных возможностей организма к воздействию гипокинезии различной продолжительности путем введения ДСИП достигается предупреждением развития стресс-реакции и ее трансформацией:

■ при 1-часовой гипокинезии на реакцию ориентировки;

■ при 6-часовой гипокинезии на реакцию первичной активации;

■ при 24-часовой гипокинезии на толерантную стратегию адаптации.

6. Введение ДСИП повышало адаптивные возможности организма и предупреждало развитие стресс-реакции путем ее замены в случае аудиостимуляции на реакцию ориентировки, а при адиостимуляции на фоне гипокинезии на реакцию спокойной активации, что достоверно удлиняло латентный период возникновения генерализованной судорожной активности в группе «высокочувствительных» крыс и препятствовало ее развитию в группе животных, «слабочувствительных» к звуковому эпилептическому раздражителю.

Апробация работы. Основные положения работы изложены на 12 Российских и Международных конференциях: 1. Международная конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 1997; 2. Международная конференция «Медицина и охрана здоровья», Тюмень, 1997; 3. Всероссийская конференция «Образование и здоровье», Калуга, 1998; 4. Третья международная конференция «Гипоксия в медицине», Москва. 1998; 5. Пятая международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 1998; 6. XII конгресс Европейского Нейрохимического общества (ESN), Санкт-Петербург, 1998; 7. Третий конгресс Европейской ассоциации по нейронаукам (ENA), Германия, Берлин, 1998; 8. Международная конференция «Адаптация организма к природным и экосоциальным условиям среды», Киргизстан, Бишкек, 1998; 9. VII Конгресс Югославского Общества токсикологов с международным участием, Югославия, Игало, 1998; 10. XVII Съезд Физиологов России, Ростов-на-Дону. 1998; 11. Коференция «Проблемы валеологии», Ростов-на-Дону, 1998; 12. IV Югославско-Российский симпозиум «Основные и клинические аспекты теории функциональных систем», Нови Сад, Югославия, 1998.

Работа прошла апробацию на совместном заседании кафедры анатомии и физиологии человека Ростовского государственного педагогического университета, лаборатории Физиологии и биохимии нейропептидов Ростовского Научно-исследовательского института нейрокибернетшш и отдела экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии Ростовского областного патологоанатомического бюро.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 28 печатных работах. Из них 1 монография, 23 работы опубликовано в центральной печати и в Российских и Международных изданиях, 5 - в материалах Всероссийских конференций.

Структура диссертации. Работа состоит из введения, трех основных глав, общей заключительной части, выводов и списка литературы. В первой главе приводится литературная справка, состоящая из двух частей; во второй главе изложены методические приемы и описание экспериментальных моделей; в третьей излагаются результаты собственных исследований с их обсуждением. Разделы третьей главы, содержащие результаты исследований гипоксии, плавания, гипокинезии и аудиогенной эпилепсии предваряются краткими литературными справками о современном состоянии вопроса. Работа изложена на 337 страницах машинописи, содержит 55 таблиц и 33 рисунка, проиллюстрирована фрагментами элекгрокортикограмм и диаграммами. Библиография включает 296 отечественных и 216 зарубежных источников литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 398 половозрелых белых крысах обоего пола массой 120-180 г, содержавшихся в условиях вивария при температуре 18 - 20 °С на полном пищевом рационе. Был использован ДСИП, синтезированный в лаборатории Химии пептидов Института Биоорганической химии им. ММ. Шемякина, РАН, Москва и любезно предоставленный нам в.н.с. И.И. Михалевой. Пептид вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 120 мкг/кг массы животного, эта доза как наиболее эффективная и временной интервал до начала воздействия (1 час) отработаны ранее (Бондаренко и др, 1985; Менджерицкий и др., 1987, 1996). Контрольные животные во всех сериях получали соответствующий объем физиологического раствора. Проведены следующие серии экспериментов:

1. Влияние ДСИП на некоторые физиолого-биохимические параметры организма через 1, 3 часа и 1, 3 и 5 суток после введения интактным животным.

2. Действие 3-х часовой гипоксии и гипоксии на фоне предварительного введения ДСИП на некоторые метаболические параметры мозга и крови.

3. Действие физической нагрузки (плавание с грузом и без него) и физической нагрузки на фоне введения ДСИП на некоторые физиолого-биохимические параметры организма.

4. Действие 1, 6 и 24-часового гипокинетического стресса и гипокинезии на фоне предварительного введения ДСИП на некоторые физиолого-метаболические параметры организма.

5. Действие аудиостимуляции (ежедневно в течение 5 суток до появления в ЭКоГ первых признаков эпилептической активности) и аудиостимуляции на фоне предварительного введения ДСИП (за 1 час до начала 5-го акустического воздействия) на некоторые физиолого-биохимические параметры.

6. Действие аудиостимуляции на фоне гипокинезии (до появления признаков генерализованной судорожной активности) с предварительным введением ДСИП и без него на некоторые физиолого-биохимические параметры.

После декаяитации собирали кровь, а мозг извлекали на холоду и выделяли следующие отделы: кора, гипоталамус, таламус и гиппокамп. Во всех сериях эксперимента параллельно в сыворотке крови и отделах мозга определяли содержание биогенных аминов и концентрации молекулярных продуктов перекисного окисления липидов: диеновых коньюгатов (ДК), оснований Шиффа (ШО), малонового диальдешда (МДА). Дополнительно в крови исследовали суммарную пероксидазную активность (СПА), оксид аз ную активность церулоплазмина (ЦП), уровень внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ), кислотную резистентность эритроцитов и формулу "белой крови".

Для физиологического контроля состояния животных эксперименты проводились на крысах, которым вживлялись электроды для регистрации суммарной биоэлектрической активности сенсомоторной коры больших полушарий (ЭКоГ) и электроды для регистрации электромиограммы шейных мышц (ЭМГ). Кроме того проводилась регистрация электрокардиограммы (ЭКГ). Визуальную оценку элекгрофизиологических показателей осуществляли с помощью восьмиканального индикатора ИМ - 789. Биоэлектрическая активность усиливалась усилителями биопотенциалов УБФ 4-03. Запись биоэлектрической активности проводилась на восьмиканальном самописце H - 339 8П и на семиканальном магнитографе НО - 68. К опытам приступали спустя 5-7 дней после операции.

Гипоксическую гипоксию вызывали в барокамере проточного типа, конструкция которой позволяет вести наблюдение за состоянием животных в течение эксперимента. Опыты проводили при атмосферном давлении в барокамере 0,029 МПа, что соответствует подъему на высоту 9000 м над уровнем моря. Скорость компрессии и декомпрессии составляла 0,005 МПа в минуту. Животные

находились в барокамере в условиях свободного поведения под постоянным наблюдением.

Гипокинезию моделировали, помещая животных в камеры из оргстекла, резко ограничивающие подвижность (Федоров, 1984).

Моделирование физической нагрузки проводили с помощью 30-минутного вынужденного плавания крыс без груза в сосуде большого объема с величиной слоя воды 70 см и температурой, которая на протяжении всего эксперимента поддерживалась на уровне 30°С, а для оценки влияния ДСИП на скорость развития утомления изучали длительность плавания крыс до предела с грузом, составляющим 8% от массы тела (Усик, Ленкова, 1981).

При моделировании аудиогенной эпилепсии животных в течение 5 дней подвергали аудиостимулящш 8-12 кГц, 110 ДБ ежедневно на фоне 6-часовой гипокинезии (до появления генерализованной судорожной активности) или без нее (до появления на ЭКоГ первых признаков эпилептической активности: пики, острые волны, комплексы пик-волна). Шестичасовое ограничение подвижности использовали на основании известного факта о том, что длительная гипокинезия сокращает период возникновения аудиогенной судорожной активности (Буреш, 1989).

Для выделения субклеточных фракций (синалтосомы, миелин, митохондрии) использовали метод дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (de Robertis, 1971). Фракции на границах раздела слоев сахарозы отбирали шприцем, отмывали от сахарозы и концентрировали центрифугированием в Tris-HCl буфере, pH 7,4.

Для определения содержания моноаминов в отделах мозга и крови препараты анализировали, применяя обращенно-фазный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) на установке Liquochrom 312/1 (Венгрия) с колонкой Nucleosil С 18 фирмы "SERVA" (Krstulovic and Powell, 1979). В качестве детектора использовали флюоресцентный спектрофотометр "Hitachi F-4010" со встроенным процессором, с помощью которого производили расчет концентраций моноаминов в образцах, используя стандартные растворы фирмы "SERVA" с 3.4 -дигидро-бензиламином гидрохлоридом в качестве внутреннего стандарта.

Содержание общих липидов определяли в хлороформном липидном экстракте (Bligh and Dyer, 1959) методом, основанном на взаимодействии фосфорно-ванилинового реактива с продуктами окисления жирных кислот (Колб, Камышников, 1982). Для определения количества ДК в пробе липидный экстракт выпаривали на роторном испарителе, затем растворяли сухой осадок липидов смесью метанол-гексан в соотношении 5:1 (Костюк и др., 1983). Содержание ШО

измеряли на спекгрофлуориметре Hitachi-F-4010 (Япония) и выражали в относительных единицах флуоресценции на 1 мг общих липидов. Содержание малонового диальдещда (точнее ТБК-активных продуктов) определяли в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТЕК) и выражали в нмоль МДА/г влажной ткани мозга (Placer et al., 1966).

Количество гисгамина в крови определяли спекгрофлуориметрическим методом после реакции с орто-фталевым альдегидом (Endo, 1978). Суммарную пероксидазную активность сыворотки крови определяли в реакции окисления бензидина перекисью водорода с образованием окрашенных продуктов (Покровский, 1977). Содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) в сыворотке крови определяли гемоглобинцианидным методом (приказ МЗ СССР N 960, 1974). Оксидазную активность церулоплазмина определяли методом, в основе которого лежит катализируемая церулоплазмином реакция окисления пара-фенилендиамина кислородом с образованием окрашенных продуктов (Колб, Камышников, 1982). Кислотную резистентность эритроцитов определяли методом фотоэлектрической регистрации кинетики гемолиза в 0,002 N растворе HCl (Гительзон, Терсков, 1967).

Фиксацию и окраску мазков крови проводили унифицированным методом: окраску - по Романовскому - Гимзе, фиксацию - раствором эозинметиленового синего по Маю - Грюнвальду (Меньшиков, 1987). Количество форменных элементов в лейкоцитарной формуле подсчитывали при помощи светового микроскопа и выражали в процентах от общего количества лейкоцитов.

Статистическую обработку данных проводили на ШМ РС/АТ-486 по t-критерию Стьюдента, резко отклоняющиеся варианты отбрасывали с использованием критерия Шовене (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Структура цикла бодрствование-сон и метаболические показатели мозга и крови через различные сроки после введения ДСИП

В среднем по времени в цикле бодрствование-сон у контрольных животных активное бодрствование занимало - 15%, спокойное - 23%, дремота - 16%, медленноволновой сон - 42%, парадоксальный сон - 4%.

Введение ДСИП крысам в условиях свободного поведения приводило к некоторому изменению структуры цикла бодрствование-сон: за счет уменьшения времени активного бодрствования до 10% увеличивалась стадия спокойного бодрствования (до 24%). Доля дремоты и парадоксального сна не изменилась, тогда как медленноволновой сон занимал уже 46%. Описанное изменение характеристик цикла бодрстовование-сон сохранялось на протяжении первых 3 суток после

введения пептида, а возвращение к контрольным показателям наблюдалось только к концу 5-х суток эксперимента, что совпадает с результатами, опубликованными ранее другими авторами (Ковальзон, 1994).

Однократная инъекция ДСИП приводила к длительному (до 5 суток) изменению содержания моноаминов в коре и подкорковых структурах головного мозга (Рис. 1, А-Г). Через 1 час после введения ДСИП уровень моноаминов в гиппокампе и содержание норадреналина во всех исследованных отделах мозга достоверно не изменялись. В то же время происходило преимущественное накопление адреналина в гипоталамусе и таламусе и интенсификация образования дофамина в коре, таламусе и гипоталамусе (судя по увеличению соотношения дофамин/ДОФА параллельно с увеличением уровня дофамина и снижением содержания ДОФА), несколько уравновешенное накоплением серотонина в коре, гипоталамусе и таламусе. Описанные результаты согласуются с активацией в течение первого часа после инъекции ДСИП двигательной и исследовательской активности, сменявшейся к окончанию 3-го часа наличием практически единственных форм поведения у крыс - сна и релаксированного бодрствования, преобладавших над другими поведенческими функциями и в течение последующих 3-х суток (МепскегНБку е1 а1., 1998).

Такое изменение поведенческих функций через 3 часа после введения ДСИП было возможно благодаря увеличению содержания серотонина и норадреналина в коре головного мозга, выполняющих в этом отделе функции тормозных нейромедиаторов (Каменская, 1996) и за счет снижения в гипоталамусе уровня норадреналина (выполняющего функцию возбуждающего нейромедиатора в данном отделе) и дофамина по сравнению с 1-часовой временной точкой. Снижение уровня адреналина в данный промежуток времени (во всех за исключением гиппокампа отделах мозга) согласуется с обнаруженной при электронномикроскопическом исследовании активацией тормозных аксосоматических синапсов в структурах мозга после введения ДСИП и подавлением центральных механизмов быстрого реагирования (Павлов, 1998).

Колебания уровня моноаминов в таламусе и гиппокампе несмотря на продолжающуюся в них интенсификацию образования дофамина и накопление норадреналина в гиппокампе (на 96% и 70% по сравнению с 1-часовым промежутком времени и контролем, соответственно, р<0,01) соответствовали описанным поведенческим эффектам ДСИП, так как накопление серотонина через 3 часа после введения ДСИП было максимальным в этих двух отделах в течение всего периода эксперимента. Одной из причин снижения двигательной активности животных, которым вводили ДСИП, на фоне возросшего уровня дофамина в подкорковых структурах может явиться описанная многими авторами активация

пептидом ГАМК-ергической тормозной системы (Менджерицкий и др., 1994), осуществляющей тормозный контроль активности дофаминергических путей (Пикок, 1982).

Через 1 сутки после введения пептида в коре головного мозга наблюдается достоверное увеличение относительной интенсивности образования норадреналина и адреналина по сравнению со всеми предшествующими промежутками времени, а в гипоталамусе отмечено достоверное увеличение дофамина и серотонина при одновременном снижении содержания норадреналина и неизменном уровне адреналина и ДОФА. В данный интервал времени в таламусе зарегистрировано снижение ДОФА при возвращении концентраций других моноаминов на уровень контроля, а в гаппокампе наблюдается увеличение дофамина (на 218%, р<0,001), норадреналина (на 86%, р<0,05), серотонина (на 35%, р<0,05) и ДОФА (на 29%, р<0,05) при уровне адреналина, не отличающемся от контрольного.

Через 3 суток влияние ДСИП на содержание моноаминов изменяется: в коре головного мозга происходит увеличение содержания серотонина (39%, р<0,05) при сохранении повышенного уровня адреналина (на 56%, р<0,02) и норадреналина (на 29%, р<0,05); в гипоталамусе существенно увеличивается концентрация дофамина и ДОФА (на 161% и 64%, р<0,05) при снижении уровня норадреналина (на 32%, р<0,05) и адреналина (на 20%, р<0,05) и дальнейшем накоплении серотонина (164%, р<0,001). В этот же промежуток времени в гигаюкампе достигает максимума концентрация норадреналина (на 130% выше контроля, р<0,01), содержание ДОФА, дофамина и серотонтина превышает контрольные значения на 47%, 172%, и 46%, р<0,05; в таламусе содержание дофамина, ДОФА и серотонина превышает уровень контроля на 98%, 78% и 30%, р<0,05.

Через 5 суток после введения ДСИП в коре и гиппокампе наблюдается полная нормализация уровня и баланса моноаминов, а в гипоталамусе и таламусе отмечается довольно четкая тенденция к возвращению всех исследованных показателей к контрольному уровню.

Таким образом, введение ДСИП интактным животным создает в структурах мозга уровень моноаминов, свойственный состоянию преадаптации (Павлов, 1998). Это выражалось в преимущественной активации серотонинергической системы мозга (особенно в гипоталамусе) с максимумом эффекта на 3-й сутки после инъекции и согласовывалось с описанным нами ранее увеличением доли сна и релаксированного бодрствования на фоне снижения представленности всех форм двигательной активности в структуре поведения (УегЬйгку е! а1., 1998) и данными о корреляции преимущественной интенсификации деятельности норадренергической системы с более высоким, а серотонинергической -с более низким уровнем всех поведенческих показателей активности ЦНС (Исмайлова и др., 1992).

Преимущественное увеличение активности серотонин-ергической системы (судя по снижению в большинстве случаев соотношения НА/Сер) можно рассматривать как один из молекулярных механизмов развития состояния преадаптации в результате введения ДСИП, поскольку этой медиаторной системе принадлежит ведущая роль в регуляции медленно-волновой активности (.Гиуе!, 1969). Именно медленноволновая активность является показателем протекания адаптационных изменений, обеспечивающих защиту и надежность работы нервной системы (Бехтерева, 1994).

А:

ИНА ША ОДОФА ПДА ШСер

Б:

а на на одофа пда «сер

160-, Г 140 120 100 80 60 40 20 О -20 -40

В:

Г:

100 80 60 40 20 О -20

Рис.1. Влияние ДСИП на уровень моноаминов (в % к уровню контроля) в коре (А), гипоталамусе (Б), таламусе (В), гиппокампе (Г) через 1 час (1), 3 часа (2), 1 сутки (3), 3 суток (4), 5 суток (5).

Поскольку адаптационные возможности организма во многом определяются структурной целостностью и надежностью функционирования различных типов биомембран (адекватное изменяющимся условиям среды метаболическое обеспечение информационных - высвобождение нейромедиаторов и связанное с ним распространение нервного импульса-, и энергетических процессов), мы изучали влияние ДСИП на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в синаптических, митохондриальных и миелнновых мембранах головного мозга.

При оценке влияния ДСИП на интенсивность ПОЛ в отделах мозга по такому интегративному показателю как уровень малонового диальдегида, установлено достоверное накопление МДА в гипоталамусе через 1 час после инъекции, тогда как в других отделах изменений не наблюдалось (Рис. 2, А). Через 3 часа после введения ДСИП содержание МДА уменьшается в коре и гиппокампе, через сутки снижение МДА становится достоверным во всех изученных отделах мозга, а через 3 суток возвращается к контрольному уровню. Учитывая, что наибольший ингибирующий эффект ДСИП в отношении образования МДА наблюдался в коре и гиппокампе, более подробное изучение влияния пептида на интенсивность ПОЛ в различных типах нейрональных мембран было решено провести именно в этих двух отделах головного мозга, в которых даже короткое, но интенсивное действие экстремальных факторов производит значительные и длительные по своим последствиям функциональные и структурные изменения (Кариг, Мас(1опа1<1, 1995).

Инъекция ДСИП интакгаым животным приводила к снижению содержания начальных (коньюгированные диены) и конечных (основания Шиффа) молекулярных продуктов ПОЛ во всех типах нейрональных мембран гшшокампа, за исключением случаев, когда их уровень оставался в пределах контрольных значений (Рис.2, Б, В). В коре головного мозга влияние ДСИП на содержание ДК и ШО не было столь однозначным и в отдельных случаях (в основном в митохондриальной фракции) было зарегистрировано накопление молекулярных продуктов ПОЛ (свидетельствующее об ускоренном обновлении липидных компонентов данных мембран), однако в синаптосомах и миелине было отмечено снижение их содержания.

Эффект ДСИП был более выражен в отношении оснований Шиффа. Вероятно, механизм такого влияния пептида на содержание исследованных продуктов ПОЛ наряду с описанной в литературе способностью активировать супероксиддисмутазу мозга состоит в активации глутатионпероксидазной системы защиты, находящейся между первичными (ДК) и конечными (ШО) продуктами липопероксидации. Это согласуется с данными других авторов о том, что ДСИП, не являясь антиоксидантом, оказывает модулирующее влияние на активность антиокс идантных систем (Рихирева и др., 1994).

А:

Б:

Рис.2. Влияние ДСИП (в % к контролю) на содержание МДА (А: 1-кора, 2-гипоталамус, 3-таламус, 4-гиппокамп), ДК и ШО (Б, В: 1-3-кора, 4-6-гиппокашт, 1,4-синаптосомы; 2,5-миелин; 3,6-шггохондрии) и интенсивность ПОЛ в крови (Г)

Влияние ДСИП на интенсивность перекисного окисления в крови зависело от промежутка времени, прошедшего с момента инъекции (Рис.2, Г). Через 1 час после введения ДСИП наблюдается достоверное снижение в сыворотке крови уровня оснований Шиффа при неизменном уровне внеэритроцитарного гемоглобина и оксидазной активности церулоплазмина по сравнению со значениями, определенными у контрольных животных. Несмотря на снижение содержания ДК в

сыворотке крови в промежутке с 3 до 24 часов после инъекции пептида, кратковременный подъем уровня конъюгированных диенов в течение 1-го часа явился причиной накопления оснований Шиффа через 3 часа после введения ДСИП. Однако, наблюдаемая интенсификация образования молекулярных продуктов ПОЛ является отражением ускоренного обновления липидов биомембран и не ведет к каким-либо нарушениям их структуры и проницаемости. Действительно, обнаруженное снижение содержания внеэритроцитарного гемоглобина через 3 часа после инъекции ДСИП согласуется с данными других авторов о способности изучаемого пептида оказывать стабилизирующее воздействие на эритроцитарные и лизосомальные мембраны (Бондаренко и др., 1985; Лысенко и др., 1994).

Мембраностабилизирующий эффект ДСИП (несмотря на некоторую интенсификацию процессов перекисного окисиления липидов в сыворотке крови) возможен благодаря увеличению концентрации церулоплазмина, которое начинается с 3-го часа после инъекции пептида и сохраняется в течение суток. Внеклеточный антиоксидант церулоплазмин обладает СОД-акгивностью, окисляет Рег+ и взаимодействует с предшественником супероксид-анион-радикала (гидратированным электроном), поэтому повышение его концентрации в крови приводит к росту антиокислительной активности (Бобырев и др., 1994).

В изменение равновесия про- и ангиоксидантных систем крови после введения ДСИП вносит вклад и волнообразное изменение суммарной пероксидазной активности: повышение через 1 час и 3 суток (отражающее интенсификацию процессов ПОЛ) и снижение через 3 и 24 часа, отражающее стабилизацию не только эритроцитарных, но и лейкоцитарных мембран, поскольку главный вклад в С ПА вносят свободный гемоглобин и миелолероксидаза лейкоцитов, высвобождающиеся в плазму при повреждении соответствующих мембран (Милютина и др., 1994).

Через 7 часов после инъекции пептида отмечается сдвиг пика кислотной эритрограммы влево от контрольного, свидетельствующий о понижении гемолитической стойкости эритроцитов (Рис.3,А). Снижение гемолитической стойкости эритроцитов совпадает по времени с увеличением количества внеэритроцитарного гемоглобина, максимальным накоплением оснований Шиффа в сыворотке крови и происходит за счет увеличения доли стареющих эритроцитов с пониженной стойкостью при перераспределении их из 1- ой и 4-ой группы (Рис.3, Б). Напротив, через 1 сутки после введения ДСИП происходит смещение эритрограммы вправо от контрольного уровня, сохраняющееся н через 3 суток после инъекции, но менее выраженное. Такое повышение кислотной резистентности было обусловлено увеличением эритроцитов в 4-ой группе за счет уменьшения их в группе 1.

"•♦—контроль —■—24 ч —*—7 ч —*—72 ч

s? L-

40 30 20 10 0

120 150 180 210 240 270 300

время, сек

Б:

31 И2 ПЗ D4

.О""

контроль ДСИП 1 сутки

Рис. 3. Влияние ДСИП на кислотную резистентность эритроцитов (А) и распределение по группам стойкости (Б, в % от общего количества): эритроциты низкой стойкости -сферуляционные изменения (гемолиз до 120 секунд, 1-я группа), пониженной стойкости -стареющие (гемолиз от 120 до 180 секунд, 2-я группа), средней стойкости - зрелые (гемолиз от 180 до 270 секунд, 3-я группа), повышенной стойкости - молодые (гемолиз свыше 270 секунд, 4-я группа).

С процессами перекисного окисления липидов и механизмами развития состояния преадаптации при действии ДСИП тесно связана и система биогенных аминов крови. Через 1 час после инъекции содержание норадреналина и адреналина достоверно повышалось, причем снижение соотношения НА/А указывало на некоторое преобладание гормонального звена регуляции симпато-адреналовой системы в этот промежуток времени (Тигранян, 1990). Несмотря на отсутствие достоверных изменений уровня дофамина в крови в этот период времени, увеличение соотношения ДА/ДОФА позволяет говорить об увеличении относительной интенсивности образования дофамина из его предшественника, что служит молекулярным обеспечением интенсификации образования норадреналина и адреналина в единой метаболической цепи. Заслуживает внимания накопление в первый час после введения пептида гистамина, которому принадлежит важное место в механизмах организации приспособительных реакций организма, поскольку одной из функций этого биогенного амина является участие в регуляции тонуса сосудов, проницаемости стенок капилляров и клеточных мембран (Сергеев и др., 1982). Повышение концентрации гистамина в крови связано с высвобождением из депо. Вещество, способное высвобождать гистамин из депо реализует свой эффект посредством одного из механизмов (Вайсфельд, Кассиль, 1981): сенсибилизация организма; повышение проницаемости плазматических мембран; активация трипсиноподобных протеолитических ферментов; взаимодействие с поверхностно-активными веществами для разрушения комплексов гистамина с белками и пептидами.

Учитывая способность ДСИП модулировать активность протеолитических ферментов (Менджерицкий и др., 1994) и собственные результаты о накоплении коньюгированных диенов в сыворотке крови через 1 час после введения пептида, можно предположить, что именно эти два механизма являются причиной повышения уровня гистамина в крови в данный период времени.

Начиная с 3-го часа после введения ДСИП накапливается серотонин и баланс моноаминов в крови смещается в сторону преимущественной активации стресс-лимитирующей системы (Меерсон, 1981) что, наряду с активацией антиоксидантных механизмов вносит значительный вклад в развитие состояния преадаптации в результате введения ДСИП. Одновременно наблюдается падение уровня основных медиаторов стресс-реализующей системы (норадреналина, адреналина, дофамина) и снижение содержания гистамина. Такой эффект ДСИП в сыворотке крови сохраняется и в последующие 3 суток. К концу 5-х суток после введения ДСИП сохраняются довольно значительные отклонения в содержании моноаминов в крови со сдвигом баланса в сторону преимущественного накопления серотонина при возвращении уровня адреналина и гистамина до исходного (Рис.4).

H1

□ 3

□ 4

06

40 0 -40 -80

mi. ■* •„

»« u i

4 "fi »Г '

A l Л'« "У

*!•••:-I i.". » г ;

1 час

3 часа

1 сутки 3 суток 5 суток

Рис.4. Влияние ДСИП на уровень биогенных аминов в крови в % к контролю (1-гистамин, 2- норадреналин, 3- адреналин, 4- ДОФА, 5- дофамин, 6- серотонин).

При изучении типа адаптационных реакций по формуле «белой крови» и весу селезенки установлено, что инъекция ДСИП повышает резистентность организма, способствуя развитию состояния «преадаптации» путем фазной смены в течение первых суток различных стадий реакций тренировки и активации (Рис.5). В первый час организм, отвечая на введение ДСИП реакцией повышенной активации, воспринимает данный раздражитель как средней силы. В течение 2-го и 3-го часа ответ угасает, сменяясь на первую стадию реакции тренировки, возникающей при действии слабых раздражителей. Вторая, но более слабая, волна активации наблюдается в конце 1-х суток после инъекции ДСИП, когда регистрируются изменения, характерные для первой стадии реакции активации - первичной активации и к 3-5 суткам эксперимента ответ угасает совсем. Изменения в лейкоцитарной формуле происходили на фоне отсутствия достоверных изменений в весе селезенки.

Оценивая полученные результаты можно отнести ДСИП по классификации Herman and Cullinan (1997) к «процессивным» стимулам, не содержащим в себе немедленной угрозы физиологическому гомеостазу и требующим перед началом ответа организма предварительного сбора и обработки сигналов от большого количества сенсорных модальностей с участием таких лимбических структур как префронтальная кора, гишюкамп и амигдала. Молекулярным механизмом повышения резистентности организма при развитии описанных адаптационных реакций на фоне введения ДСИП интактным животным является активация антиоксидантных систем и влияние на процессы центральной регуляции гипоталамо-гипофизарно-адрено-кортикальной оси через поддержание такого баланса моноаминов, которое обеспечивает преимущественную активацию «стресс-лимитирующей» серотонин-ергической системы в мозге и крови.

контроль

70,9

ДСИП 1 час

88,2

ДСИП 2 часа

48,2

43,3

ДСИП 1 сутки

78,2

2,7 0 9 15,3

ДСИП 3 часа

.63,2

3,5

29,8

ДСИП 3 суток

0,9 23,9

ДСИП 5 суток

66,8

■пя шея пэ пм ал

Рис. 5. Влияние ДСИП на формулу белой крови крыс ( в % от общего количества лейкоцитов); ПЯ палочкоядерные нейтрофилы; СЯ -сегментоядерные, Э- эозинофилы, М-моноциты. Л- лимфоциты

2. Физиолого-биохимические показатели мозга и крови при экстремальных воздействиях и адаптивном влиянии ДСИП

Для выяснения механизмов реализации стресс-протекторных эффектов ДСИП мы выбирали модели стрессорного воздействия, стараясь, чтобы в них были представлены разнокачественные стимулы: «системные» и «процессивные», действие которых на организм представляет (в первом случае) или не представляет собой (во втором) прямую угрозу выживанию (Sawchenko et al., 1996). Эти стимулы различаются использованием пути, по которому информация о физиологическом значении стрессора передается в паравентрикулярные ядра. При действии на организм «системных» стрессоров возбуждающие стимулы немедленно передаются в паравентрикулярные ядра через ствол мозга, минуя познавательную переработку информации; при действии «процессивных» используется «окольный» путь через структуры лимбической системы, где происходит последовательная переработка информации для получения данных о физиологическом значении стимула, а тип и интенсивность ответа на него вырабатывается только после сравнения с предшествующим опытом (Herman and Cullman, 1997). Среди отобранных экспериментальных моделей к «системным» стимулам относят гипоксию, остальные воздействия - к «процессивньш» (Cullinan et al., 1995). Для различных процессивных стрессоров (таких как акустический, плавательный и ограничение подвижности) установлено использование совершенно разных сенсорных и ассоциативных путей до взаимодействия со структурами лимбической системы (Sapolsky et al., 1996); этим и был обусловлен более широкий набор «процессивных» стимулов в наших исследованиях. Наибольшие изменения уровня моноаминов при гипоксии в таламусе, при плавании в коре и гипоталамусе, при 1-часовой гипокинезии и 5-кратной аудиостимуляции в коре и гиппокампе, при 24- часовой гипокинезии в коре и гипоталамусе, при аудиостимуляции на фоне гипокинезии в гиппокампе подтверждают отнесение гипоксии к «системным» стимулам, а остальных - к «процессивньш» (Рис.6).

Большая подверженность коры и особенно гигаюкампа повреждающему действию продуктов ПОЛ (Рис.7,8) согласуется с эволюционным принципом исследования патологических состояний Л.А. Орбели, согласно которому патологический процесс поражает в первую очередь структуры, возникшие в эволюции в более поздние сроки и потому более ранимые. Результаты по изменению уровня моноаминов и интенсивности ПОЛ согласуются с данными других авторов о том, что основными патогенетическими механизмами развития экстремальных состояний являются ослабление реактивности и функциональных резервов нейроэндокринной системы, активация процессов ПОЛ и истощение отенциала антиоксидантной системы с лабилизацией клеточных мембран (Владимиров и др., 1991).

Гипоксия

ДСИП + гипоксия

ОНА МА ОДОФА ПДА Я Сер

В НА ЯА ОДОФА ПДА «Сер

плавание

юо

ДСИП + плавание

100-

гипокинезия

ДСИП + гипокинезия

150-

100- ■ 50 0 -50

¡ттш

Цг| \\

Щ \5

аудиостимуляция

ДСИП + аудиостимуляция

юо

Рис.6. Влияние ДСИП на динамику моноаминов при действии различных стрессорных стимулов в % к контролю: 1,5 -кора, 2,6-гипоталамус, 3,7-таламус, 4,8-гиппокамп (первая цифра для гипоксии, плавания, гипокинезии 1 час и аудиостимуляции, вторая - для гипокинезии 24 часа и аудиостимуляции на фоне ггпокинезии).

I гипоксия РДСИП+гипоксия

Нплавание ПДСИП+плавание

гипокинезия

91 ч

■ 6 ч

□ 24 ч

ДСИП + гипокинезия

01 ч

16 ч Ш24 ч

2 3 4

аудиостимуляция

Аудиостимуляция на фоне Гипокинезии

О стимуляция ПДСИП+стимуляция Н стимуляция ПДСИП+стимуляция

Рис.7. Влияние ДСИП на содержание малонового диальдегида в структурах мозга при воздействии различных стрессорных стимулов в : 1- коре, 2-гипоталамусе, 3- таламусе, 4- гиппокампе (в % к уровню контроля)

ДК

О гипоксия ПДСИП+гипоксия

200<1 - - ! 1501~Й I, д I

100 <1 В ва^ГТИ

■50

I ■ Я II

I плавание □ ДСИП+плавание

ШО

В гипоксия □ДСИП+гипоксия

20 0 -за

-40 -60 -80

I плавание □ ДСИП+плавание

гипокинезия

гипокинезия

1 2 3 4 5 6

Аудиостимуляция

■ 1 ч

□ 6ч

□ 24 ч

■Д' □ £<

п£

СИП+1 ч ,СИП+6 ч СИП+24 ч

аудиостимуляция

■ стимуляция

□ ДСИП+стимупяция

□ симуляция 2

□ ДСИП+стимуляция 2

Я стимуляция ■ ДСИП+стимуляция

□ стимуляциям

□ ДСИП+стимуляция2

Рис.8. Влияние ДСИП на уровень конъюгированных диенов и оснований Шиффа при различных стрессорных воздействиях: 1,4-синаптосомы, 2, 5- миелин, 3, 6-митохондрии; в коре (1-3) и гиппокампе (4-6) в % к контролю.

Нарушения в структуре гиплокампа, играющего ингибиторную роль в регуляции гшюталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси, приводят к потенциированию стрессорного ответа (Herman et al., 1995), поэтому более выраженное по сравнению с корой больших полушарий накопление оснований Шиффа (признак необратимых структурных изменений мембран) в субклеточных фракциях гиплокампа при всех видах воздействий (Рис.8) позволяет отнести факт преимущественной окислительной деструкции гиплокампа к молекулярным механизмам перехода адаптивного эффекта стресса в повреждающий.

Значительное накопление дофамина в коре и гиппокампе при гипоксии, в коре при плавании, в гипоталамусе при 1- и 24-часовой гипокинезии, в гиппокампе при 5-кратной аудиостимуляции и гипоталамусе, таламусе и гиппокампе при аудиогенной эпилепсии может усиливать нейротоксичность глутамата при стрессе, поскольку источником свободных радикалов при глутамат-индуцированной гибели нейронов является избыток дофамина и образующихся при окислении моноаминов таких метаболитов как 6-гидроксидофамин, 4-гидроксидофамин, 2-гидрокси-дофамин или 5-5-цистеинилдофамин (Mäher and Davis, 1996).

По силе стрессорного ответа 3-часовая гипоксия, 1-часовая гипокинезия и 30-минутное плавание соответствовали стадии тревоги острого стресса, что подтверждалось характерным соотношением форменных элементов «белой» крови, достоверным снижением веса селезенки, балансом моноаминов, активацией перекисного окисления липидов в крови, сдвигами кислотной резистентности и перераспределением эритроцитов по группам стойкости (Рис. 9-13).

Сходные изменения в лейкоцитарной формуле при использованных режимах гипоксии, плавании и 1-часовой гипокинезии, вероятно, объясняются наличием компонента гипоксии при выполнении интенсивных физических нагрузок (Бобков и др., 1987) и ограничении подвижности (Коваленко, Гуровский, 1987). При данных воздействиях зарегистрировано и усиление активности симпато-адреналовой системы с преимущественной активацией ее гормонального звена, что выражалось в увеличении содержания норадреналина, адреналина и дофамина в сыворотке крови и в снижении соотношения норадреналин/адреналин с 5,86 в контроле до 4,52 при плавании, 3,83 при гипоксии и 3,68 при 1-часовой гипокинезии.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов о том, что снижение устойчивости к гипоксической гипоксии, физической нагрузке и гипокинезии сопряжено с ростом концентрации молекулярных продуктов ПОЛ, снижением кислотной резистентности эритроцитов и нарушением проницаемости различных типов мембран, уменьшением выраженности лейкоцитотоза и лимфопешш, т.е. уменьшением реактивности системы крови (Горанчук, 1998).

гипоксия О 4,7

49,1

1-часовая гипокинезия

48,8

ДСИП +• гипоксия

43,1

44,6

45,8 -— 3>9

Гипокинезия 6 часов

51,7

аудиосгимуляция

41,5

56,5

ДСИП + 1-часовая гипокинезия ^^^^ 52,3

2,3 41,5

ДСИП + плавание 68,6

ДСИП + гипокинезия 6 часов 75,5

2,8 0,9 19

ДСИП + аудиосгимуляция

32,8

Рис.9. Влияние ДСИП на лейкоцитарную формулу при различных стрессорных воздействиях в % от общего количества: 1-палочкоядерные, 2-сегментоядерные, 3-эозинофилы, 4-моноциты, 5-лейкоциты

Гипоксия

Плавание

□ гипоксия ПДСИП+гипоксия

1 2 3 4 5 6

1- часовая гипокинезия

□ гипокинезия □ ДСИП+гипокинезия

Гипокинезия 24 часа

□ гипокинезия □ДСИП+гипокинезия

□ плавание ПДСИП+плавание

5-кратная аудиостимуляция □стимуляция ПДСИП+стимуляция

Аудиостимуляция на фоне Гипокинезии

□ стимуляция ПДСИП+стимуляция

Рис. 10. Влияние ДСИП на содержание биогенных аминов в сыворотке крови при различных стрессорных воздействиях (в % к контрольному уровню): 1-норадреналин, 2-адреналин, 3-ДОФА, 4-дофамин, 5-серотонин, 6-гистамин

Гипоксия

I гипоксия ШДСИП+гипоксия

300т'

1-часовая гипокинезия

В гипокинезия ОДСИП+гипокинезия

плавание

В плавание □ ДСИП+плавание

6-часовая гипокинезия

¡гипокинезия ПДСИП+гипокинезия

5-кратная аудиостимуляция

I стимуляция □ДСИП+стимуляция

24-часовая гипокинезия

Ш гипокинезия □ ДСИП+гипокинезия

200-1' 150 100

т

I ш шш

Аудиостимуляция на фоне гипокинезии

Рис. 11. Интенсивность ПОЛ в сыворотке крови: 1-ВЭГ, 2- СПА, 3- оксидазная активность церулоплазмина, 4- уровень ДК, 5- уровень ШО (в % к контролю).

ДСИП+тапокинезия гипокинезия 1ч контроль

90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Рис.12. Влияние ДСИП на кислотную резистентностьэритроцитов при стрессорных воздействиях (по оси X - время гемолиза в минутах, по оси У -количество гемолизированных эритроцитов в % от общего количества).

Гипоксия

55,2

13,3

54

10,4

1-часовая гипокинезия 66,9

22,5

7,4 3,2

Гипокинезия 6 часов 59,8

16,2

18,9

Аудиостимуляция

52,1

22,6 3,8

21,5

ДСИП + гипоксия 59,7

19,8

16,2 3'4

ДСИП + плавание 53,8

37,6

6 2,6

ДСИП + 1-часовая гипокинезия 70,5

6,5 3

ДСИП + гипокинезия 6 часов 60,3

22,9

л

12,8

ДСИП + аудиостимуляция 6,4 2,7

■ 1 Я2 ПЗ П4

Рис. 13.Распределение эритроцитов по группам стойкости в количества (1 — низкой стойкости, 2 -пониженной, 3 — повышенной стойкости).

% от общего средней и 4-

При 6-часовой гипокинезии и аудиостимуляции (Рис. 9) количество эозинофилов, моноцитов и палочкоядерных нейтрофилов было на уровне контроля, число лимфоцитов снижалось на 27% и 29%, а сегментоядерных нейтрофилов повышалось на 87% и 89% по сравнению с контрольными показателями, что характерно для стадии резистентности острого стресса и согласуется с данными литературы о развитии на данной стадии вследствие запредельного торможения реакции тренировки или активации (Гаркави и др., 1990). Отнесение к стадии резистентности подтверждалось и результатами исследования содержания биогенных аминов и интенсивности перекисного окисления липидов в сыворотке крови (Рис. 10-13).

24-часовая гипокинезия и аудиогенная эпилепсия соответствовали хроническому стрессу (Рис. 14): наряду с повышенным количеством нейтрофилов и моноцитов отмечается нормальный уровень лимфоцитов и некоторая эозинофилия. Эозинофилия в сочетании с лимфопенией является плохим прогностическим признаком, так как указывает на истощение глкжокортикоидной функции коры надпочечников (Мацанов, 1971), в связи с чем данные «рессорные воздействия можно рассматривать как стадию, при которой есть предпосылки перехода стресс-реакции в фазу истощения.

При 24-часовой гипокинезии в ЭКоГ появлялись признаки локальной, а при аудиостимуляциии на фоне гипокинезии - генерализованной судорожной активности. На протяжении 24-часовой гипокинезии на ЭКоГ крыс других состояний, кроме бодрствования не наблюдалось (активное бодрствование составляло 95% времени, остальное - эпизоды спокойного бодрствования), что подтверждалось поведением животных: несмотря на резкое ограничение локомоции, двигательная активность была повышена, что согласуется с имеющимися в литературе описаниями у животных моторной и эмоциональной гиперреактивности (по типу панической реакции) в условиях интенсивного стресса при отсутствии информации о способе избавления и только спустя несколько суток после начала обездвиживания наступает период уменьшения активности (Коваленко, Гуровский, 1980).

О развитии стресс-реакции и о наличии эмоционального напряжения при данных воздействиях свидетельствует и выраженная активация симпатико-адреналовой системы, особенно ее гормонального звена: соотношение НА/А в крови снижалось с 5,86 в контроле до 3,31 после 24-часовой гипокинезии и 2,89 при аудиогенной эпилепсия (Рис.10). Кроме того, отмечена активация перекисного окисления липидов в сыворотке крови, сопровождавшаяся нарушением проницаемости эритроыитарных мембран, нарастанием уровня внеэритроцитарного гемоглобина (Рис.11), снижением гемолитической стойкости эритроцитов за счет их перераспределения по группам стойкости (Рис. 15, 16).

Гипокинезия 24 часа

вп ос пз пм вл

68,1

22,3

ДСИП + гипокинезия 24 часа

ВП ПС ПЭ ПМ ВЛ

2.6 1

18,5

Аудиогенная эпилепсия

ВП ПС ПЭ ОМ ВЛ

65,3

ДСИП + аудиогенная эпилепсия

вп ас пэ пм вл

71,6

3,4 1,1

20,1 3,8

Рис.14. Влияние ДСИП на лейкоцитарную формулу крыс: П-палочкоядерные нейтрофилы, С-сегментоядеркые нейтрофилы, Э- эозинофилы, М- моноциты, Л-лимфоциты ( в % от общего числа форменных элементов)

Инъекция ДСИП за 1 час до начала всех использованных экстремальных воздействий способствовала активации стресс-лимитирующей серотонинер-гической системы и ограничению активации таламуса при поддержании тонуса коры и гиппокампа, что позволяет путем инъекции пептида ослаблять силу ответа гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной оси (Рис.6) и переводить гипоксию из разряда «системных» стимулов в процессивные.

При всех стрессорных воздействиях ДСИП регулировал интенсивность ПОЛ в регионах мозга и сыворотке крови и оказывал стабилизирующее влияние на нейрональные, эритроцитарные и лейкоцитарные мембраны. Под влиянием пептида снижалось стресс-индуцировашюе накопление ДК и ШО в мембранах коры и гиппокампа, уменьшался уровень ВЭГ и повышалась кислотная резистентность эритроцитов за счет выброса в кровяное русло повышенного количества стойких к гемолизу молодых эритроцитов (Рис.7, 8, 11). Необходимо отметить и роль церулоплазмина в реализации адапто генного эффекта ДСИП и контроль пептидом уровня в крови таких вазоактивных веществ как серотонин и гистамин.

9 контроль ■ гипокинезия □ ДСИП+гипокинезия

20

О

ДСИП+гипокинезия

90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Аудиостимуляция на фоне гипокинезии

а контроль ■ стимуляция □ ДСИП+стимуляция

л

' / ДСИП+стимуляция Г стимуляция контроль

90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Рис.15. Влияние ДСИП на кислотную резистентность эритроцитов (по оси X -время гемолиза в минутах, по оси У - количество гемолизированных эритроцитов в % от общего количества)

Специфическим фактором повышения адаптивных возможностей организма к воздействию гипоксии при замене стресс-реакции на первую стадию реакции тренировки - ориентировки в результате введения ДСИП является ингибирование образования ДК в мозге, нарастание С ПА и активности церулоплазмина. Повышение адаптивных возможностей организма в условиях вынужденного плавания на фоне введения ДСИП достигается заменой стресс-реакции реакцию активации, за счет чего более экономично происходит энергоснабжение организма и удлиняется период, в течение которого не развивается утомление (с 6,11 минут в контроле до 15,97 минут при плавании с грузом 8% от массы тела). Особенностью эффекта ДСИП при плавании является преимущественное ингибирование образования МДА в мозге и интенсификация образования дофамина в коре.

Повышение адаптивных возможностей организма к воздействию гипокинезии путем введения ДСИП достигается предупреждением развития стресс-реакции и ее трансформацией при 1-часовой гипокинезии в реакцию ориентировки, в результате чего раздражитель данной длительности, вызывающий в норме реакцию тревоги, воспринимался как слабый и не сопровождался резкими метаболическими сдвигами и нарушениями в цикле бодрствоание-сон; при 6-часовой гипокинезии на реакцию первичной активации, а при 24-часовой гипокинезии на толерантную стратегию

адаптации, что выражалось минимизацией метаболизма и засыпанием животных (сон подтверждался на ЭЭГ).

12,4

ДСИП + гипокинезия 67,5

23,7

21,6

6,4 2,4

Аудиостимуляция на фоне гипокинезии

60,1

ДСИП + аудиостимуляция на фоне гипокинезии

23,3

15,9

Рис. 16. Влияние ДСИП на распределение эритроцитов по группам стойкости в % от общего количества (1 - низкой стойкости, 2 -пониженной, 3 - средней и 4- повышенной стойкости).

Повышение адаптивных возможностей организма в условиях аудиостимуляции путем введения ДСИП достигается заменой стресс-реакции на реакцию ориентировки, в результате чего восстанавливается соотношение представленности в ЭкоГ синхронизированного и десинхронизированного типов активности, достоверно увеличивается латентный период появления в ЭКоГ животных отдельных элементов судорожной активности и раздражитель средней силы воспринимается как слабый. Введение ДСИП в случае пятикратной аудиостимуляции на фоне гипокинезии приводит к замене стресс-реакции на реакцию спокойной активации, что способствовало восприятию чрезвычайного раздражителя в качестве фактора средней силы, достоверно удлиняло латентный

период возникновения генерализованной судорожной активности в группе

«высокочувствительных» крыс и препятствовало ее развитию в группе животных,

«слабочувствительных» к звуковому эпилептическому раздражителю.

ВЫВОДЫ

1. Важнейшим молекулярным механизмом создания состояния преадапташш к различным по этиологии, силе и длительности стрессорным воздействиям является модуляторное действие ДСИП на моноаминергические системы и интенсивность перекисного окисления липидов в различных отделах головного мозга, что приводит к функциональным перестройкам в активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы.

2. Введение ДСИП изменяет тип адаптационной реакции на более эффективный и экономичный, о чем свидетельствует формула «белой» крови при гипоксии, гипокинезии различной продолжительности, физической нагрузке (плавание) и аудиогенной эпилепсии

3. Универсальными составляющими адаптогенного действия ДСИП являются регуляция баланса моноаминов и интенсивности ПОЛ в различных регионах мозга, активация эритропоэза и выброс в кровяное русло повышенного количества стойких к гемолизу молодых эритроцитов, а также контроль со стороны пептида уровня в крови таких вазоактивных веществ как гистамин и серотонин

4. Специфическим фактором повышения адаптивных возможностей организма к воздействию гипоксии является предупреждение развития стресс-реакции путем введения ДСИП, в результате чего повышение резистентности организма в условиях гипоксии достигается путем развития первой стадии реакции тренировки - ориентировки, тем самым переводя данный раздражитель из ряда чрезвычайных в разряд слабых.

5. Повышение адаптивных возможностей организма в условиях вынужденного плавания на фоне введения ДСИП достигается предупреждением развития стресс-реакции и ее заменой на реакцию активации, за счет чего удлиняется период, в течение которого не развивается утомление

6. Повышение адаптивных возможностей организма к воздействию гипокинезии путем введения ДСИП достигается предупреждением развития стресс-реакции и ее трансформацией при 1-часовой гипокинезии на реакцию ориентировки, в результате чего раздражитель данной длительности, вызывающий в норме развитие реакции тревоги острого эмоционального стресса, воспринимался как слабый и не сопровождался резкими метаболическими сдвигами и нарушениями в

цикле бодрствоание-сон, при 6-часовой гипокинезии на реакцию первичной активации, а при 24-часовой гипокинезии на толерантную стратегию адаптации, что выражалось минимизацией метаболизма и засыпанием животных

7. Введение ДСИП способствует замене стресс-реакции в случае пятикратной аудиостимуляции на реакцию ориентировки за счет регулирования представленности в ЭКоГ синхронизированного н десинхронизированного типов активности, увеличивает латентный период возникновения генерализованной судорожной активности в группе «чувствительных» крыс и предотвращает появление на ЭкоГ признаков эпилептической активности в группе крыс, «нечувствительных» к звуковому эпилептическому раздражителю.

8. Регуляторные пептиды, на примере ДСИП, являются факторами, определяющими стратегию функционально-метаболических сдвигов в организме, зависящих от типа и мощности повреждающего фактора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бактерицидная система прооксидантных и ангиоксидантных ферментов // 4 Всесоюзная конференция «Биоантиоксидант», Тез. Докл.- М, 1992.- Т 1,- С. 61 (Соавт.: Шепелев А.П., Чернявская Л.Н.)

2. Свободно-радикальный механизм антимикробного действия ксантиноксидазы и лактопероксидазы // Бюлл эксперим биол и мед.- 1992.- № 9,- С. 272-274 (Соавт.: Шепелев А.П., Чернавская Л.Н.)

3. Мембраноспецифичный механизм протекторного действия ДСИП и пирацегама при гипоксии // Конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», М, 1997,- С. 5 (Соавт.: Лысенко А.В., Менджерицкий A.M.)

4. Влияние гипоксии на содержание в мозге крыс гомокарнозина и ГАМК и включение в них радиоактивной метки при интрацистернальном введении 14С-путресцина и 14С-глутаминовой кислоты Там же, С. 123-124 (Соавт.:УсковаН.И.)

5. Некоторые биохимические механизмы нейропротекторного эффекта ДСИП при гипоксии // Hypoxia Medical J.- 1997,- № 4,- С. 3 - 7 (Соавт.: Лысенко А.В., Мационис А.Э., Менджерицкий AM.)

6. Перспективы использования ДСИП для коррекции сдвигов в системе перекисного окисления липидов при гипокинезии И Биоантиоксидант: материалы международного симпозиума Медицина и охрана здоровья,- Тюмень, 1997,- С.181-183. (Соавт.:Лысенко АВ., Михалева И.И)

7. Пирацетам - психофармакологические свойства и механизмы проявления антигипоксических эффектов // Hypoxia Medical J.- 1998,-№ 1,- С. 2 -7 (Соавт.: Лысенко А.В., Менджерицкий А.М)

8. Biochemical peculiarities of DSEP and putrescine anticonvulsive properties// Нейрохимия - 1998,- №2,- С. 163-170. (Соавт.: Lysenko A., Uskova N., Mendzeritskaya L., Mendzeritsky A)

9. Особенности адаптогенного действия ДСИП и неокиоторфина при пшотермии // «Адаптация организма к природным и экосоциальным условиям среды», Магадан, 1998,Ч. 2,- С. 5-6. (Соавт.: Лысенко А.В., Пашаева Д.Э., Менджерицкий А.М)

10. DSIP and neokiotorphin neuroprotective effect under hypothermia// 3d European Neuroscience Assotiation Meeting, Berlin.- European J of Neuroscience.- 1998 - V.10 - P.232 (Соавт.: Lysenko A., Pavlov I., Uzdensky A., Mendzeritsky A.)

11. A comparative investigation of behavioral effects of DSIP and neokiotorphin // 3d European Neuroscience Assotiation Meeting, Berlin.- European J of Neuroscience.- 1998,-V.10.- P. 424 (Соавт.: Verbitzky E., Topchiy I., Kolpakova N., Lysenko A)

12. Оценка степени функционально-метаболических сдвигов в организме спортсменов-пловцов по показателям кислотно-щелочного равновесия слюны // Валеология,- 1998,- № г.- С. 28-31 (Соавт.: Бондин В.И., Лысенко А.В., УсковаН.И.)

13. The correction of exercise-induced metabolic disorders with DSIP in rats // J of Neurochemistry.- 1998- V. 71, Suppl. 1,- P. S 46 (Соавт.: Lysenko A., Mendzeritsky A., Uskova N)

14. DSIP and neokiotorphin influence on body temperature and rat brain monoaminergic system under hypothermia and autowarming // J of Neurochemistry.- 1998,- V. 71, Suppl. 1.- P. S 47 (Соавт.: Lysenko A., Pavlov I., Mendzeritsky A.)

15. The neurophysiological aspects of relationships beetween behaviour and the peptide influence on sleep-wakefulness cycle // «Basic and clinical aspects of the theory of functional systems».- Eds. Lazetic and Sudakov.- Novi Sad, 1998,- P. 133-139 (Соавт..Mendzeritsky A., Verbitsky E., Kolpakova N., Topchiy I., Lysenko A., Uskova N)

16. The neuropeptidal influence on structural-functional changes in rat brain cortex under hypothermia // Там же - P.287-295 (Соавт.: Lysenko A., Pavlov I., Povilaitite P., Matsionis A., Uskova N., Mendzeritsky A.)

17. Пирацетам усиливает нейропротекторное действие ДСИП при гипоксии // Hypoxia Medical J.- 1998,- V. 6 - № 2,- P. 26 (Соавт.: Лысенко А.В., Менджерицкий А.М)

18. Оценка функционального состояния организма человека при физической нагрузке (плавание) различной продолжительности и интенсивности по показателям кислотно-щелочного равновесия слюны // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Образование и здоровье», Калуга, 1998,- С.13-14 (Соавт.: Бондин В.И., Бородин С.Н., Лысенко А.В., Менджерицкий А.М.)

19. The behavioral effects of DSIP under acoustic stimulation // The 14th Congress of European Sleep Research Societies, Madrid, 1998,- P.431 (Соавт.: Pavlov I., Verbitzky E., Lysenko A., Mendzeritsky A)

20. Коррекция дельта-сон индуцирующим пептидом интенсивности перекисного окисления липидов в тканях крыс при плавании // Биоантиоксидант, М, 1998,- С. 105-106 (Соавт.: Бондин В.И., Лысенко А.В., Менджерицкий А.М.)

21. Нейрохимические механизмы поведенческих эффектов ДСИП // Тез. Докладов XVII съезда Всероссийского Физиологического общества им. Павлова, Ростов - на - Дону, 1998.- С. 271-272 (Соавт.: Вербицкий Е.В., Ускова Н.И., Лысенко А.В., Менджерицкий A.M.)

22. Пластичность нейрональных структур при действии пирацетама и ДСИП в условиях гипероксии // Там же .- С.352-353 (Соавт.: Лысенко А.В., Павлов И.Ю., Мационис А.Э., Менджерицкая Л.Г.)

23. Genetical and biochemical peculiarities of mammalian preadaptation to oxidative stress// VH Yugoslav Congress of Toxicology, Igalo, 1998,- P. 22-24 (Соавт.: Bren A., Guskov E., Lysenko A., Mendzeritsky A.)

24. Особенности метаболического обеспечения адаптогенных эффектов ДСИП и пирацетама при гипероксии // Биохимия.- 1998,- № 6. - С. 48-52 (Соавт. Лысенко А.В., Ускова Н.И., Менджерицкий А.М

25. Сравнительное изучение эффективности применения ДСИП для коррекции функционально-метаболических сдвигов в условиях гипоксии и физической нагрузки // Нейрохимия. - 1999,- Т.16, №1,- С. 53-60 (Соавт.: Лысенко А.В., Ускова Н.И., Михалева И.И., Менджерицкая Л.Г.)

26. Преадаптация организма к действию неблагоприятных факторов путем введения эндогенного адаптогена - дельта-сон индуцирующего пептида// Нейрохимия,- 1999,- Т.16, № 1.- С. 44 - 52 (Соавт.: Лысенко А.В., Михалева И.И., Менджерицкий A.M.)

27. Оценка интенсивности перекисного окисления липидов как метод диагностики уровня физической работоспособности и степени утомления // Конференция «Образование и здоровье», С-Пб, 1999,- С. 5-6 (Соавт. Баршай В.М., Бондин В.И., Лысенко А.В., Менджерицкий А.М.)

28. Нейропептиды в механизмах адаптации к экстремальным состояниям. - Ростов-на-Дону: Изд-во РГПУ, 1999 - 350 с. (Соавт.: Лысенко А.В., Мационис А.Э., Менджерицкий A.M., Повилайгите П.Е.)