Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Антидепрессивная активность новых рядов фосфорилированных карбоновых кислот с ноотропными свойствами

На правах рукописи Для служебного пользования Экз. № ЮО'Ь

ШИЛОВСКАЯ ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

АНТИДЕПРЕССИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ РЯДОВ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ С НООТРОПНЫМИ

СВОЙСТВАМИ

14.00.25-фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань, 2000

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском университете

Научный руководитель: кандидат медицинских наук

И.И. Семина

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Р.С.Гараев Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор А.М.Карпов доктор медицинских наук С.М.Горбунов

Ведущая организация: НИИ фармакологии РАМН

Защита состоится

в _ час. на заседании диссертационного Совета КР 084.29.37 Казанскс

государственного медицинского университета по адресу: 420012, г. Каза: ул. Бутлерова, д. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанскс государственного медицинского университета (420012. г. Казань, ул. Бутлеро д.49, корп. Б).

Автореферат разослан

" МьОЬСгМ 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор А.У.Зиганшин

Актуальность проблемы. В последние годы во многих странах отмечается начительный спрос на ноотропные препараты, обусловленный увеличением гасла пожилых людей, трудностью лечения нейродегенеративных заболеваний, i таюке возможностью применения ноотропных средств для лечения целого ря-ш других заболеваний и симптомокомплексов (Ковалев Г.В., 1990; Jellinger K.F. :t al., 1994; McDowell I., 1995). Актуальным является не только создание новых гоотропных препаратов, но и изучение спектра их психотропного действия, что >бусловлено частым сочетанием когнитивных и мнестических нарушений с ¡сихическими заболеваниями, преимущественно, депрессиями (Caine E.D., 981; Haggerty J.J.,1988; Яковлева О.Б.,1995). Существенным преимуществом ¡удут пользоваться препараты, способные улучшать память, мыслительные функции и одновременно обладающие антидепрессивной активностью.

Перспективным направлением является создание средств, сочетающих ноо-ропные и антидепрессивные свойства, среди производных фосфорилирован-гых карбоновых кислот, одним из которых является фосфабензид, внедренный I практическую медицин)' в качестве транквилизатора (Ржевская Г.Ф., 1973; ¡аиконникова И.В. и соавт., 1980), и проявивший в клинике ноотропное и анти-1,епрессивное действие (Блюхерова H.A., 1981; Щелкунова М.С. и соавт., 1995).

В результате дальнейшего изучения психотропной активности гидразидов ^сформированных карбоновых кислот было обнаружено новое соединение -:-хлорэтокси-пара-К- диметиламинофенилфосфорилацетогидразид - КАПАХ, |бладающее выраженной ноотропной и антидепрессивной активностью Семина И.И.,1988).

Цель работы.Изучение антидепрессивного действия и некоторых сторон го механизма фосфорилацетогидразидов (аналогов КАПАХ), а также выявле-гие ноотропных свойств и исследование антидепрессивной активности в новых вдах фосфорилированных карбоновых кислот.

В связи с этим предусмотрено решение следующих задач:

1. Изучить антидепрессивную активность в рядах соединений с ноотропны-ш свойствами - хлорэтоксиарил- и дифенилфосфорилацетогидразидов на экс-[ериментальной модели депрессии и выявить зависимость "структура-ктивность".

2. Исследовать некоторые аспекты механизма антидепрессивного действия лорэтоксиарил- и дифенилфосфорилацетогидразидов.

3. Провести углубленное изучение антидепрессивных свойств КАПАХ в равнении с эталонными препаратами.

4. Исследовать вероятность возникновения депрессивно-подобного состояли у потомства крыс, подвергнутого воздействию перинатальной гипоксии, ыяснить некоторые стороны механизма его развития и возможность коррекции [репаратом КАПАХ.

5. Осуществить поиск веществ с ноотропными свойствами в новых рядах юсфорилацетогидразидов - N-замещенных фосфорилацетатов аммония и гид-азиниевых солях фосфорилацетогидразидов, исследовать антидепрессивное ;ействие этих соединений и установить зависимость "структура-активность".

б. Изучить некоторые стороны механизма антидепрессивного действия га разиниевых солей фосфорилацетогидразидов и N-замещенных фосфорилацеп тов аммония.

Научная новшна работы,Впервые установлено антидепрессивное действиг некоторые аспекты механизма его реализации фосфорилацетогидразвдов в доз; составляющих 1/100 и 1/1000 от ЛДзо, выявлена зависимость активности соедш ний от химической структуры.

Показано, что воздействие перинатальной гипоксии у крыс вызывает в г ловозрелом возрасте развитие депрессивно-подобного состояния, одной из пр чин которого является повышение активности МАО Б в коре головного моз] Применение КАПАХ в раннем поетнатальном периоде предупреждает развит этого состояния.

Впервые выявлены ноотропные свойства в новых рядах фосфорилацетога разидов - их щдразиниевых солях и N - замещенных фосфорилацетатах аммош изучено антидепрессизное действие, некоторые стороны механизма его реашт ции, установлена зависимость активности соединений от химической структуры

Научно-нрактическая значимость работы. На основании анализа завис мости действия фосфорилацегогидразидов от химической структуры были сшг. зированы новые ряды соединений - гидразиниевые соли фосфорилацстогидраг дов и N-замещенные фосфорилацетаты аммония, которые в эксперименте пр явили ноотропную и антидепрессивную активность.

На поведенческих моделях доказано, что КАПАХ является эффективнь средством коррекции депрессивно-подобных состояний у животных.

Показано, что в реализации механизма антидепрессивного действия фосф рилацетогидразидов, их гидразиниевых солей и N-замещенных фосфорилацеп тов аммония играют роль серотонинопозитивные, МАО-ингибирующие, а тиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства.

Результаты исследования антидепрессивных свойств КАПАХ, изложенньк диссертации, вошли в USA Patent (Лг? 5,679,663, 1997), а также войдут в ochobhj материалы доклинического изучения препарата.

Полученные результаты обосновывают перепек гивноеть дальнейшего р< вития нового направления разработки оригинальных психотропных препарат на основе фосфорилацетогидразидов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гидразиды хлорэтоксиарипфосфорилуксусной кислоты в дозах, соотв^ ствующих 1/100 от ЛДзо.обладают антидепрессивной активностью.

2. Хлорэтоксиарипфосфоргшацетогидразиды проявляют серотонинопоз тивные, антиокевдантные и МАО-ингибирующие свойства, которые участвуют реализации механизма их анпщепрессивного действия.

3. Воздействие перинатальной гипоксии вызывает у крыс развитие депр< сивно-подобного состояния, сопровождающегося повышением активности МЛ Б в коре головного мозга. Раннее постнатальное применение КАПАХ прс упреждает развитие депрессии и мнестических нарушений, нормализует а

явность фермента МАО.

4. Гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов обладают более выра-кенной ноотропной и антидеирессивной активностью по сравнению с N-амещенными фосфорилацетатами аммония.

5. В рядах N-замещенных фосфорилацетатов аммония и гидразиниевых со-<ей фосфорилацетогидразидов обнаружены перспективные соединения с МАО-шгибирующими, антиоксидантными, мембраностабилизирующими и серото-шнопозитивными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XIV меж-(ународном конгрессе "Phosphorus Chemistry", (Cincinnati, 1998); V и VI Все-юссийских школах молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии", Казань, 1998, 1999); на 17th JSN/13th EST Neurochemistry Meeting (Berlin, jermany, 1S99).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах гашинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания ма-ериалов и методов исследования, трех глав собственных исследований и их об-уждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 36 таблицами i 12 рисунками. Указатель литературы включает 238 источников.

Материал и методы исследования.

В работе использовано 2109 белых мышей и 252 белых крысы.

Объектом исследований явились фосфорорггничсскиа соединения, синте-ированные на кафедре органической химии КГТУ под руководством вед. науч. отр., к. х. н. Р.И.Тарасовой.

Определение острой токсичности исследуемых фосфорилацетогидразидов [ их производных проведено И.И.Семиной, соединений XIII, XIX и XX -'.Ф.Ржевской.

Изучение антидепрессивной активности проводили на моделях поведенческое отчаяние" (Porsolt R.D.,1977; Русаков Д.Ю., Вальдман А.В., 983) и "выученная беспомощность'ХАшзтап H. et. al., 1979).

Ноотропные свойства соединений оценивали по их способности улучшать роцессы обучения и памяти в условиях модели УРПИ и проявлять антигипок-ическое действие на модели гипобарической гипоксии у мышей (Ковалев Г.В., 990).

Влияние соединений на активность МАО Б изучали in vitro (Ю'МО"4 M) и i vivo (1/100 от ЛД;о в течение 7 дней) в коре головного мозга крыс и мышей БалаклеевскийИ.А., 1976).

Действие на центральные серотонинергичесхие структуры оценивали по зменению числа "кивков" головой у мышей, вызванных введением 5-кситриптофана (300 мг/кг; Corne, 1963).

О степени перекисного окисления липидов (ПОЛ) в ткани коры головного юзга крыс судили по реакции образования диеновых конъюгатов (Стальная ¡.Д., 1977) и по накоплению малонового диальдегида (МДА) в реакции с тио-арбитуровой кислотой (Стальная И.Д., 1977) в опытах in vitro. Соединения ис-ледовали в концентрациях 10'4 - 10"7М.

Мембраностабилизирующее действие соединений (10 -10"8 М) изучали i vitro на модели осмотического гемолиза эритроцитов, вызванного гипотоничнс стью среды (Inglot A.D., 1968).

Острую перинатальную гипобарическую гипоксию у крыс осуществлял согласно методике, описанной Майзелисом М.Я.(1983). КАПАХ в дозе 10 мг/к (п/'к) вводили в раннем постнатальном периоде с 8-го по 20-й день жизни, В 2-месячном возрасте у потомства изучали исследовательскую активность "открытом поле", процессы обучения и памяти в условиях модели УРПИ, aim депрессивную активность на модели "поведенческое отчаяние", а также актш ность МАО Б в коре головного мозга крыс.

В качестве препаратов сравнения применяли пирацетам (100 и 200 м/кг мелипрамин (10 мг/кг) и ниаламид (20 мг/кг).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с испол1 зыванием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Антндепрессивная активность н некоторые аспекты механизма действия хлорэтоксиарил- и дифепилфоефорилацетогидразндов

По химической структуре гидразиды можно разделить на 3 группы: 1) незамещенные гидразиды: I, 11, Ш, XII, XIII, XIX, XXI, XXII; 2) замещеннь: гидразиды: IV, V, VI, Vil; 3) гидразоны : VIII, IX, X, XI, XVI, XVII

Для выявления функционально-активных групп среди хлорэтоксиарил-дифенилфосфорилацетогидразидов использованы соединения: XVIII - в кок ром отсутствует гидразидная группа; ХХ-гидразидная группа заменена на амщ кую; XIX - фенильные радикалы у атома фосфора заменены на этилыше; XXI XXII- в химической структуре отсутствует атом фосфора.

Химические формулы изучаемых соединений представлены в табл. 1.

Обнаруженная ранее антндепрессивная активность КАПАХ в дозе 1С мг/кг - 1/10 от ЛДо (Семина И.И. и соавт., 1996) - послужила основанием д; изучения антидепрессивного действия аналогов КАПАХ, а также его выявлен!-у соединений в меньших дозах, в которых они проявляют ноотропную акти! ность (Семина И.PL, 1998).

В дозах 1/100 от ЛДзо антидепрессивная активность обнаружена у незам-щенных хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразидов: КАПАХ (I) и его хлорист< водородной соли (XIV), а также соединений II, III и VI, которые уменьшал время неподвижности ("замирания") соответственно на 31, 33,2, 27,5, 41,6 19,5% (р<0,05; рис. 1). КАПАХ и его соль (XIV) проявили активность и в до: 1/1000 от ЛД50, сокращая период неподвижности мышей соответственно на 34 25,4% (р<0,05).Соединепия, не содержащие фенильных радикалов у атома фо фора (XIX), гидразндной группы (XX), а также атома фосфора (XXI и XXI] были неэффективны, а дифенилфосфорилуксусная кислота (ДФУК, XVIII),

Таблица 1

Химические формулы гидразидов фосфорилированных карбоновых кислот и их ЛД50

для мышей при внутрибрюшнннои введении

Соед1тнение Химическая формула ЛД,„ (мг'кг)*

I CICH; СН:0 ^Р(О) CH2C(0)NHNH2 (CH^NCja, 960 г 35

II С1СИ2 сн2о ^Р(О) CH2C(0)NHNH2 СНзСбНц 910 + 76

III С1СН, CH¡0 ^Р(О) Ch"2C(0)NHNH2 ClCjH, 900 + 79

IV CICH2 сн2о NP(0) CH2C(0)NJINHC(0)CHj (CH,)2NC¿{/ 3120+ 160

V С1СН2 сн2о ; p(O) CH2C(0)NHNHCH(0HX:C1i (СН,)2КСеН, 2980+ 134

VI ClCHjCH20 P(O) CI^CÍOjMINUCHiCsII, (CH,);NC6H; 5100 -26,4

Vit CICH, CHjO^ / P(01CH2C(0JNHNI!CH(CHj> (CH,)2KC6H4 4950 2.13,6

VIII CICHaCHjO * P(O) CH, C(0)NHN=CHC6IÍ4 COOH (СН^ХСЛ 5110 + 190

IX CICH; CH;0 4P(0) CH2 C(0)XHN=CHC6H, COOHNTI2CH;CeH3 (CH;);NC4H,/' 5180^36,0

X C1CH2 CH20 4 P(O) CHíCÍOjNHN-CHCcH, (СН,),КС,Л/ 4960 + 210

XI C1CII2CH20 ^P(O) C^CfOjNHN-CÍCH^iCOOH (CH^NCíH, 5250 + 286

XII C2H50 ) P(O) CH¡C(0)NHKH2 (CHjVNCsHj 1040; 64

XIII CSH, >(0) C¡I2C(0)NHNH2 СЛ, 315 ; 24.s

XIV C1CH2 CH20 ^P(0 ) CH2C(0)NHNH2 • HCl (CH,),NCSH. 945 ±24

XV C„ir4 ) P(O) CH2C(0)NHN'H2 ■ HC¡ CSH, 300 + 28

XVI C.H, / P(O) CH2C(0)NIIN--CIIC6H3 c6H, 5200 + 310

XVII СбН, P(O) CH2C(0)N'ÍIN--=CIÍCH=CHC6H¡ ctH, > 5000

XVIII c6Hj ) P(O) C'HjCOOH CfH, 2650 +215

XIX C2K5 ,4F(0) CH2C(0)MHNH¡ C;H,' 5400 + 235

XX QH, ,P(0) CH,C(0)KH2 C;Hj 51S0 + 325

XXI C,Hs-CH2C(0)NHNH2 714+18

XX.'I C41,-CIIjC(0)NHNHj 243 + 24

* - по данным И.И.Семиной I! Г.Ф.РжевсксЛ

напротив, увеличивала время неподвижности мышей на 24,6% (р<0,05). Эффек тивность наиболее активных гидразидов (I, III, XIV) сопоставима с таковой пре паратов сравнения пиал амида н мелипрамина; пирацетам в обеих исследован ных дозах не проявил антидепрессивной активности.Таким образом, антиде прессивное действие проявили хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразиды с не замещенной гидразидной группой. Дифенилфосфорилацетогидразиды антиде

прессивного действия на данной модели не показали. £

ж 110 *

о

3 ь ах

Соединение 3 s i

.......-- - ...... 1 ё I

■ 1лс0лд50 и1/1000 лд50

Рис. 1 Антидепрессивная активность фосфорилацетогидразидов на модели "поведенческое отчаяние" у мышей s дозах 1/100 и 1/1 ООО от ГДи. Контрольные значения приняты за 100%; * - разница достоверна (р<0,С5)

Известно, что гидразиды обладают антимоноаминооксидазной активность!-(Колла В.Э.,1976), что является одним из механизмов их антидепрессивног действия. Влияние на активность МАО, особенно МАО Б, в значительной сте пени зависит от мембранолипотропных свойств препаратов (Авдуло Н.А.,1990). Учитывая, что КАПАХ и аналоги взаимодействуют с мембранным липидами (Семина И.Г. и соавт., 1998), изучено их влияние на активность МА( Б in vitro и in vivo. .

Все исследованные нами фосфорилацетогидразиды проявляют ингиби рующую активность в отношении МАО типа Б в опытах in vitro (табл.2). Прове денные эксперименты подтвердили значение гидразидного фрагмента в реали зации антимоноаминооксидазной активности: замещенные гидразиды (IV) ме нее активны, чем незамещенные (XIII, XI, XVI, I) и гидразоны, а замена гидра зидной группы на амидную (XX) приводит, напротив, к повышению активност фермента.

Исключение из молекулы фосфорилацетогидразидов атома фосфора н способствует уменьшению МАО-ингибирующей активности: в этом отношени бесфосфорные гидразиды (XXI и XXII) сопоставимы с КАПАХ (I). Активност фосфорсодержащих гидразидов в значительной степени зависит от радикалов фосфорильном фрагменте. Например, соединение, содержащее два фенильны

щикала и незамещенную гидразидную группу (XIII), оказывает наиболее вы-1женное МАО-ингибирующее действие in vitro, которое отсутствует при заме; фенильных радикалов на этильные (XIX). В то же время, наличие фенильных щикалов без гидразидного фрагмента (XVIII) способствует появлению тен-:нции к угнетению МАО Б. В экспериментах in vivo МАО-ингибирующая ак-шность в большей степени характерна для хлорэтоксиарилфосфорилацетогид-13идов, в частности, КАПАХ (табл. 2). Более подробное изучение этого дейст-1я показало, что в дозе 100 мг/кг КАПАХ ингибирует МАО мозга и печени оответственно на 15,4 и 34,4%; р<0,05), а в дозе 10 мг/кг - только МАО мозга ia 32,1%; р<0,05).

Способность соединений угнетать МАО Б может иметь значение для реа-хзации их антидепрессивного действия, вероятно, при многократном примене-т, поскольку однократное введение КАПАХ не вызывало ингибирования [АО ни в одной из исследованных доз.

Таблица 2

Антимоноаминооксндазная активность фосфорилацетогндразидов

в коре головного мозга крыс (in vitro) и мышей (in vivo)

Торможение активности МАО (%)

Соединение in vitro (10'4 М) М + m in vivo

доза (мк/кт) М + m

Контроль 0 0

I 14,0 +2,0 * 10 32,1 х 4,6 *

II 7,0 ±2,0

III 3,0 + 0,7

IV 0 30 5,0+ 1.2*

IX 0

XI 22,2 + 0.3 * 50 9,0 + 3,5*

XII 7,6+ 1,9 *t 10 24,6 ± 0,3 *

XIII 30,4 + 2,1 * 3 17,7 + 4,0"

XIV 19,8 + 0.2* 10 4,1 + 0,6

XV 11,4 + 3,0*

XVI 9,9 ± 0 *

XVIII 9,0 + 4,9 25 4,4 - 0,4

XIX 0 50 12,6 + 2.4 *

XX 45,7+ 1,7 * t 50 14,6 + 3,0*1

XXI 2,4 + 0,4

XXII 8,610,8*

пимечание: 100% контроль активности МАО в опытах in vitro составляет 192,4 мкМ/кг/час; in vivo -4,2 мкМ/кг/час. Í - повышение активности МАО; * - разница достоверна по отношению к контролю ;и р<0,05

В последние годы патогенез депрессивных состояний тесно связывают с ¡рушениями в серотонинергической передаче (Nagayama Н.,1991; Андреева .И., 1996). О роли серотонинопозитивного компонента в действии фосфорил-детогидразидов свидетельствуют результаты изучения их влияния на эффекты ■ОТФ у мышей (рис. 2). Изучение зависимости "структура-действие" показало, го замена фенильных радикалов на этильные (соединение XIX), а также гидра-гдной группы на амидную (соединение XX), приводит к потере серотонинопо-1тивного действия.

iv xi xii х; и xviii xix хх

Соединение

Рас.2 Влияние производных фосфорияаиэтогидразидоо в дозах, составляющих 1/100 от ЛДю на эффекты 5-ОТФ. Контрольные значения приняты за 1СС% * - разница достоверна (р<0,С5)

Большую роль в развитии многих психических заболеваний, в том 4iicj депрессий, играет перекисное окисление липидов, при этом отмечается усил ние процессов ПОЛ (Прилипко Л.Л., 1987; Ковалева Е.С.,1988; Zeiman F.F 1989; Деев М.Н.,1994), что сопровождается изменением активности мембра; ных рецепторов, ферментов, каналов (Бурлакова Е.Б. и соавт.,1975). Учитыв« мембранолипотропность исследуемых соединений (Семина И.Г. и соавт., 1998 было исследовано их влияние на процессы ПОЛ: образование диеновых к,онъ;< гатов и содержание малонового диальдегида (МДА) в гомогенате корыголовн го мозга крыс в экспериментах in vitro.

Установлено, что большинство фосфорилацетогидразидов обладают ант; оксидантными свойствами, снижая концентрацию МДА (рис.3), но не влияя i начальный этап ПОЛ - диеновую конъюгацию.

Изучение зависимости структура - активность показало, что для проявлен! антиоксидантных свойств фосфорилацетогидразидов необходимо присутств! гидразидной группы, так как замещенные гидразиды (IV) менее активны, че незамещенные (I, И) и гидразоны (VIII, IX, X, XI), а отсутствие гидразиднс группы в молекуле ДФУК приводит к исчезновению способности снижать ко: центрацию МДА.

Сравнение фосфорилированных ацетогндразидов с их аналогами, не с держащими фосфора (XXI, XXII), показало на необходимость присутствия ат ма фосфора для реализации антиоксидантных свойств.

Таким образом, установлено, что хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразид обладают антидепрессивной активностью и в дозах, в которых они проявляв ноотропные свойства (1/100 и 1/1000 от ЛД50). Для более выраженного антид прессивного действия необходимо присутствие незамещенной гидразиднс группы. Фосфорилацетогидразиды обладают серотонинопозитивными, антио

идантными и МАО-ингибирующими свойствами, для проявления которых [меет значение как замещение в гидразидной группе, так и окружение в фосфо-ильном фрагменте.

д

ж

2

к

т,

vii viii

I

Е:

г:

!х____x________xi xii

' ГЭ-4 И-5 П-6 а-7 иод(М)

Рис. 3 Влияние фосфориладетогидразидов на содержание МДА в гомотенате хоры голсзкого эзга крыс. Контрольное значение принято за 100%; 100% МДЛ соответствует 85,2 мкМ/кг; * - разни-1 достоверна (р<0,05).

Результаты проведенных экспериментов показали перспективность даль-ейшего изучения КАПАХ как наиболее активного среди исследованных рядов эединений.

1g

Углубленное изучение антидепрессивного действия 2 - хлорэтокси-4 - N, N - днметилашшофеннлфосфорнлацетогндразнда (КАПАХ)

Антидепрессивную активность КАПАХ изучали и на других моделях д прессивных состояний. На модели "поведенческое отчаяние" у крыс время н подвижности составило в контроле 253,8 +12,4с, КАПАХ в дозах 10 и 1 мг/: сокращал время "зависания" соответственно до 188,5 + 15,6 и 181,3 + 24,9 (р<0,05 ).

На модели "выученная беспомощность"КАПАХ уже после 3-х дневно: применения проявил выраженный антидепрессивный эффект, уменьшая латен ный период избеганий и % неизбеганий мышей, подвергнутых стрес воздействию (табл. 3). Пирацетам проявил эффект на данной модели лишь на е, а мелипрамин - на 10 сутки. Способность корригировать поведение стресс рованных животных обнаружена у КАПАХ и при его введении per os в эквито сических дозах (4 и 40 мг/кг).

Таблиц;

Влияние КАПАХ на показатели реакции избегания у мышей на модели "выученная

беспомощность" при внутрибрюшинном и пероралыюм введении

Группы животннх % неизбеганий 1 Латентный период от общего числа | избеганий проб | М + ш (с) % нгизбегашш от общего числа проб Латентный период избеганий M + rn (с)

3-х кратное введение 5- кратное введение

Контроль Цинтактные 36.7 14.0 +0,7 28,1 11,7+ 1,1

Контроль 2 (сгрессиро-ванные мыши) 68,8 * 17,2 ± 1,1 * 62,0 * 15,7 ±1,2*

КАПАХ 10 мг/кг в/б 30,0 ** 12,9 т- 1,1 ** 31,0 11,8 + 2,1

КАПАХ 1 мг/кг ь/б 20,0 ** 9,6+ 1.5 ** 7 5** 7,6 + 0,94 **

Пирацетам 100 мг/кг 47,0 15,0 х 2,0 20,0 ** 10,2 + 1,8**

Мелипрамин 10 мг/кг 43,0 13,5 ± 1,8 29,0 11,8+1.5

КАПАХ 40 мг/кг per os 26,0"* 8,4 + 1,2 ** 8.3** 8,8 + 0,9 **

КАПАХ 4 мг/кг per os 21,4** 9,8 + 0,7 ** 8,2 8,1 ±0,3 **

* - разница достоверна (р < 0,05) относительно контроля 1; ** - разница достовериа(р < 0,05) отно< тельно контроля 2

Наличие в спектре психотропного действия КАПАХ ноотропных сеойс послужило основанием для изучения его способности корригировать депре сивно-подобное состояние, а также мнестические нарушения и ухудшение с магического статуса, возникающие у крыс после воздействия перинатальн! гипоксии.

Воздействие перинатальной гипоксии у крыс вызывает у половозрелого п томства нарушения процессов обучения и памяти (рис. 4), а также соматическ го статуса, что согласуется с данными литературы (Трофимов С.С. и соав 1993). Кроме того, нами установлено, что "гипоксические" животные в больш степени подвержены развитию депрессивно-подобного состояния. Так, на мог ли "поведенческое отчаяние" длительность периодов неподвижности животнь перенесших перинатальную гипоксию, увеличивалась на 58% (р<0,05) по отн шеншо к контролю (рис.5). Постнатальное введение КАПАХ (10 мг/кг, п/к) пр дупреждало дефицит обучения и памяти при тестировании половозрелых крыс

и

условиях модели УРПИ на 2, 7 и 30 дни после обучения, сокращало длительность периодов неподвижности до уровня контрольных животных (рис. 4, 5), а также предупреждало изменения соматического статуса животных.

Известно, что в коре головного мозга крыс, перенесших перинатальную гипоксию, снижается содержание катехоламинов, в частности, дофамина (Семенова Т.П. и соавт., 1998), что обуславливает развитие депрессивного синдрома. Для изучения возможной причины снижения уровня катехоламинов, а также выяснения некоторых сторон механизма действия КАПАХ на данной модели, мы изучили активность МАО Б в коре головного мозга.

**

£ 20

I ю '. - [■'■.;■• •'- .|

га ~ % '

2 день _____ 7 день 30 день Группа жиаотных

Ш^троль ямпоталя С гипо/атч - КАПАХ

Рис.4 Влияние КАПАХ на воспроизводство УРПИ у потомства, подвергнутого перинатальной

гипоксии

* - разница достоверна по отношению к группе контрольных животных при р <0,05 " - разница достоверна по отношению к группе "гипокеических" животных при р <0,05

Нами установлено, что в коре головного мозга потомства, испытавшего внутриутробную гипоксию, повышена активность МАО Б (контроль 498,1 + 9,1 мкМ/кг/час; "гипоксия" 553,0 + 3,5 мкМУкг/час, р <0,05). Постнатальиое введение КАПАХ оказывало нормализующее влияние на активность моноаминоокси-дазы, которая составила 487,0 + 13,8 мкМ/кг/час.

Таким образом, КАПАХ, примененный в раннем постнатальном периоде развития у крыс, испытавших перинатальную гипобарическую гипоксию, предупреждает возникновение нарушений памяти и обучения, развитие депрессивно-подобного состояния и нормализует измененный соматический статус. Эффективность препарата при депрессивно-подобном состоянии может быть обусловлена его способностью ингибировать МАО типа Б и тем самым предупреждать снижение содержания катехоламинов в коре головного мозга, одной из причин которого является активация этого фермента. Важное значение могут иметь серотонинопозитивные свойства КАПАХ, а также его способность снижать концентрацию продуктов ПОЛ.

Интактные Гипоксия Гипоксия+КАПАХ Группа животных

Рис.5 Влияние КАПАХ на время "зависании" на модели "поведенческое отчаяние" у крыс,

испытавших перинатальную гипоксию, * - разница достоверна (р<0,05) относительно контрольных крыс ;" - разница достоверна (р<0,05) относительно "гилоксических" крыс

Поиск и изучение ноотрошюн и антндепрсссивнон активности в новы> рядах гидразидов фосфорилнрованиых карбоновых кислот

Исследование антидепрессивного действия и некоторых сторон его механизма фосфорилацетогидразидов, а также изучение зависимости "структура-действие" исследуемых соединений позволили установить, что в проявлении и> активности важное значение имеет как структура фосфорильного фрагмента, таь и наличие гидразвдной группы. Для выявления функционального значения каждого из этих фрагментов в реализации антидепрессивного действия б исследуемых рядах производных фосфорилированных карбоновых кислот, по нашим ре комендациям, были синтезированы два новых ряда соединений:

1) гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов - имеющие фосфориль ный фрагмент, гидразидную и гидразиниевую группы;

2) N-замегценные фосфорилацетаты аммония - имеющие фосфорильньп фрагмент, но не имеющие гидразидной группы.

Нами проведено изучение ноотрогшых свойств этих соединений и исследование их антидепрессивного действия.

Структурные формулы гидразинневых солей фосфорилацетогидразидо] представлены в таблице 4.

В ряду гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов наибольшей cao собностью улучшать обучение и память на модели УРПИ обладают соединенна с незамещенным фенильным радикалом (Г-I), а также метальной (Г-Ш) и меток сильной (Г-IV) группами в составе арильного радикала (рис. 6). Соединения, i молекуле которых присутствует атом хлора в пара-положении арильного ради кала (Г-Н) или отсутствует гидразидная группа в фосфорильном фрагменте (Г VI), не улучшают процессы памяти и обучения.

п

Таблица 4.

Химические формулы и ЛД50 для мышей при внугрибрюшиниом введении

гидразнниевых солен фосфорилацетогидразидов

эединение Химическая формула ЛД,-0 (мг/КГ)*

Г-1 /,0"NHjNHj СбН5 - Р(О) 4CH2C(0)NHNH2 655,0 + 24,3

Г-Н ^Ö'NHjNHj 4-С1СЛ14-Р(0) nCH2C(0)NHNH, 666,0 ±27,1

Г- Ш ^o*nh3nh2 4-CHjC6H4- P(0) xCH2C(0)NHNH; 646,0 ±40.2

r-IV ^ ölMHjNHz 4-CH3O C6H4-P(0) 4 CH,C(0)NHNH, 631,0 ±39,2

r-v ^Ö'NHjNH; 4- FCiRi - P(O) 4 CH,C(0)NHNH, 531,0 + 39.3

Г-VI (C6Hj)., - P(0) CH:COO NHj NH, 735.0±23,8

Г-VI! ,Ö'NH3NH2 (CIIj)21nC(,H4 - P(OÍ rH2C(0)NHNH2 712,0+13,5

* - по данным И.И.Семиной

Рис.б Влияние тдразиниевкх солсй фосфоридацетогидразндов на процессы памяти и обучения у мышеи на модели УРПИ; Контрольные значения приняты за 100%; *- разница достоверна (р<0,05).

Рис. 7 Власшс гидраз!шиевых солей на время зкгани мышей в барокамере на модели гипобари' ческой гипохспи при контроле, принятом за 100%; * - разница достоверна (р<0,05).

Антигипоксической активностью на модели гипобарической гипоксии > мышей обладают соединения Г-ПТ и Г- VI, имеющие метальную группу илк атом фтора в пара-положении арильного радикала фосфорильного фрагменте; (рис.7).

Г-1 Г-11 Г-Ш Г-1У Г-У Г-VI Г-№ КАПАХ Соединен!

01/100ЛД50 И1/100СЛД50

Рис. 8 Антидепрессивная активность тидразиниевых солей фосфорилацетотидразидов на модем "поведенческое" отчаяние-у мышей. Контрольные значения припягы за 100%; * - разница достовернг (р<0,05)

Аналогичная зависимость от химической структуры обнаружена и при изу-ении антидепрессивной активности: эффективными на моделях поведенческое отчаяние" и "выученная беспомощность" были соединения, меющие метильнуго группу или атом фтора в структуре арильного радикала юсфорильного фрагмента - Г-Ш и Г-У (рис. 8). На модели "поведенческое от-аяние" активность проявило и соединение Г-У, в структуре которого отсутст-ует гидразидная группа.

Так же как фосфорилацетогидразиды, их гидразиниевые соли обладают -1АО Б - ингибирующими свойствами. По степени уменьшения МАО-нгибирующей активности гидразиниевые соли можно расставить в следующем орядке: Г-1 >Г-Ш и Г-У >Г-И. Установлено, что способность угнетать МАО ависит от замещения в арильном радикале фссфорильного фрагмента, в резуль-ате чего происходит изменение злектронодонорных свойств соединений. Наи-олее выраженной МАО-ингибирующей активностью обладает Г-1, не имеющее аместителей в фенильном радикале и обладающее электронодонорными свой-гвами. Отсутствует способность угнетать МАО у Г-П, имеющего в арильном адикале акцепторный атом хлора. Следует отметить, что наличие метоксиль-ой группы в пара-положении арильного радикала фосфорильного фрагмента ГЧУ) приводит, напротив, к повышению активности фермента.

Антиоксидантные и мембраностабияизирующие свойства гидразиниевых олей фосфорилацетогидразидов (табл. 5) сопоставимы с таковыми исходных идразидов.

Таблица 5

Антиоксидантные и мембраностабшшзиругощие свойства

Соединение Снижение содержания МДА (ЮЛКГМ) Снижение интенсивности гемолиза эритроцитов (105 - 10"М)

Г-1 + +

Г-П + -1-

г-пт -Н-+ -1-4.

Г-1У -1- ■м-

Г-У ++ +

Г-У1 +++ 4-

Г-VII ++ ++Т+

рпчечанпе: + - наличие активности соединений в одной из концентраций; ++ - в двух; - в 1рех; - в четырех; 0 - отсутствие эффекта во всех концентрациях.

На основании проведенных исследований в ряду гидразиниевых солей гид-азидов арилфосфорилуксуспой кислоты выделены наиболее активные соеди-ения - Г-Ш и Г-У, которые проявляют антигипоксические свойства, способст-угот улучшению процессов памяти и обучения, обладают антидепрессивным ействием и по некоторым тестам превосходят КАПАХ.

Эти соединения проявляют серотонинопозитивные, МАО - ингибирующие, нтиоксидантные и мембраностабилизирующие свойства, которые, как и у ис-одных гидразидов, могут участвовать в реализации механизма их психотроп-о1о действия.

N-замещенные фосфорилацетаты аммония по химической структуре upe; ставлены 3 группами веществ (табл. 6): 1) дифенилфосфорилацетаты (A-I, A-I A-III); 2) аммонийфосфинаты (A-V); 3) двойные соли (A-IV, А-VI)

Таблица

Химические формулы и их ЛДзд для мышей при внутрибрюшинном введении __Гч'-замещеииых фосфорилацетатов аммония_

Соединение Химическая формула ЛД50 (мг/кг)*

A-I А-П A-III [(СеН5)2Р(0)СН2СОб][К'НзСНСН(СНз)2СООС2Н5] [(С6Н;),Р(0)С1ЬС0а ] ['ШзСН(СНз) СООС;Н5] [(С«Н5)2Р(0)СН2С00Г ] ['NH3CH(CH3)C6H5] о" 4500,0 ±213,0 5136.0+ 154,0 687,0 + 28,0

A-IV 1 . ч [С1С6Н.,Р(0)СН2ССЮ] 2[ ХНзСН(СНз) COOC2H3J О" 5327,0 ±215,0

A-V 1 - ♦ [С6Н5Р(0)СН2С00 ] [ ЫНзСН(СНз) СООС2Н5] О" 5118,0 ±254,0

A-VI 1 [С6Н3Р(0)СН2С00] 2Ха 5289,0 ± 189,0

* - по данньш И.И.Сеыиной

В ряду N-замещенных фосфорилацетатов аммония способностью улучшат процессы памяти и обучения в условиях модели УРПИ обладало лишь соедиш ние A-I, которое в дозах 50, 5 и 0,5 мг/кг удлиняло латентный период захода темный отсек камеры соответственно на 125, 68 и 75% (р<0,05; рис.9). Актш ность этого соединения не превосходила таковую КАПАХ.

330

A-I A-II A-JI! A-IV A-V A-VI ДФУК КАПАХ Фосфаб. соединение

в1/1с0лд5!) в1/1000лд50 п1/10000лд50

Рис.9, Влияние N-замещенных фосфорилацетатов аммония на процессы памяти и обучения у мыте на модели УРПИ; Контроль принят за 100%; * - разница достоверна (р<0,05).

Рис. 10 Ачтиделрессивная актизиость N-замещенных фосфорнлацетатов на модели "поведенче-сое отчаяние" у мышей; Контроль принят за 100%; * - разница достоверна (р<0,05),

Ни одно из производных N-замещенных фосфорнлацетатов, в отличие от ;1дразиниевых солей фосфорилацетогидразидов, не проявило антигипоксиче-кой активности на модели гипобарической гипоксии.

Антидепрессивкую активность на моделях "поведенческое отчаяние" и выученная беспомощность" проявили соединения А-Т и A-III (рис.10). При роническом и однократном введении наиболее активное соединение (A-I) уси-ивало действие 5-ОТФ соответственно на 205 и 165% (р<0,05).

Большинство N-замещенных фосфорнлацетатов аммония угнетают МАО Б коре головного мозга крыс в условиях in vitro (табл.7). Причем в отличие от юсфорилацетогидразидов, МАО-ингибирующая активность которых в большей гепени определяется присутствием гидразидной группы, активность аммоние-ых солей зависит от природы катионной части молекулы и от структуры фос-юрилыгого фрагмента.

Таблица 7

МАО-лнгнэпрующие, мембраностабилнзиругощне и антноксидантные свойства

N-замещенных фосфорнлацетатов аммонии

Соединение МАО-ингибиругощие Снижение содержания МДА Снижение интенсив-

свойства (10"4.10"М) вности гемолиза эрит

(10 3- Ю\М> рощпов (10°- 10"8М)

A-I 0 ++

A-II + -г

А-Ш -Н- 0 ++

A-IV ++ + 0

A-V ++ 4- 0

A-VI + +4++ 0

римечаиие: ^ - наличие активности соединений в одной из концентраций; - в дя\л; - в трех; +++ - в четырех; 0 - отсутствие эффекта во всех концентрациях.

Отсутствие гидразидной группы, по-видимому, определяет и меньшую спс собность N-замещенных фосфорилацетатов аммония по сравнению с гидрази ниевыми солями (табл.5), снижать содержание малонового диальдегида в гомс генате коры головного мозга крыс. Антиоксидантную активность проявил только дифенилфосфорилацетаты (А-1 и A-II; табл.7), содержащие карбэток сильный радикал в катионной части молекулы. Присутствие отрицательно заря женного кислорода у атома фосфора в анионной части молекулы солей фосф!-натов (A-IV - А-VI) приводит к повышению концентрации малонового диальдс гида.

Мембраностабилизирующее действие на модели осмотического гемолиз эритроцитов выявлено у дифенилфосфорилацетатов (A-I - А-Ш; табл.7).

Таким образом, N-замещенные фосфорилацетаты аммония в исследоваг ных дозах не проявляют антигипоксической активности, некоторые из них ок; зывают антидепрессивное действие (A-I, A-III), улучшают память и обучени (А-1) у мышей. Дифенилфосфорилацетаты (A-I, А-Н, А-Ш), подобно гидразида; фосфорилированных карбоновых кислот и их гидразиниевым солям, ингибир) ют МАО Б, проявляют серотонинопозитивные и антиоксидантные свойства обладают мембраностабилизирующим действием, но по выраженности этих э4 фектов уступают им.

Анализ зависимости структура - активность показал, что в ряду гидрат ниевых солей фосфорилацетогидразидов существенное значение имеет замени ние в арильном радикале фосфорильного фрагмента. Для проявления активно сти N-замещенных фосфорилацетатов аммония активными фрагментами в фос форильной части молекулы является группа АгР(0)(0"), в ацильной - С(0 'NHjR.

Обобщая результаты настоящей работы по изучению антидепрессивной a¡ тивности в рядах соединений с ноотропными свойствами, можно сделать з< ключение о том, что по степени выраженности антидепрессивного действия эт ряды располагаются следующим образом: хлорэтоксиарилфосфорилацетогидрг зиды s гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов > N-замещенные фосфс рилацетаты аммония > дифенилфосфорилацетогидразиды.

^ О" О" О"

АгРч = АгР '' > АгР^ > Ph2P- X ¡! X ¡|SX II СНзСОО' II

О 0 0 О где X=CHjC(0)NHNH2

Примерно одинаковая выраженность антидепрессивного действия в ряда хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразидов и гидразиниевых солей фосфори; ацетогидразидов определяется аналогией их конечных продуктов гидролитич< ских превращений. Являясь лабильным радикалом (Мастркжова Т.Э. и соавт 1988), хлорэтоксигруппа при введении в организм легко гидролизуется по РОС связи, в результате чего образуется анионный фосфорильный фрагмент, анал< гичный таковому гидразиниевых солей.

На схеме это можно представить следующим образом: ^ ОСН2 СН2 CI ^ О'

АгР^ -> АгР^

I! CH2C(0)NHNH2 II CH2C(0)NHNH2

о о

Хлорэтоксиарилфосфорил- Гидразиниевые соли фосфорил-

ацетогидразнды ацетогидразцдов

Дифеиилфосфорилацетогидразиды, имеющие стабильные фенильные ради-алы, не обладают способностью к образованию солевых структур по фосфо-ильному фрагменту.

Таким образом, для создания средств, сочетающих ноотропные и антиде-рессивные свойства, перспективным является целенаправленный синтез новых ядов фосфорорганических соединений, имеющих лабильные радикалы и спо-обных к образованию солевых структур с отрицательно заряженным фосфо-ильным фрагментом.

Выводы

1. Производные хлорэтоксиарилфосфорилацетогидразидов в дозах, соответ-гвующих 1/100 от ЛД50, проявляют антидепрессивную активность на модели поведенческое отчаяние" у мышей, более выраженную у соединений с незаме-кнной гидразидной ¡ рунной.

2. Дифеннл- и хлорэтоксиарилфосфорилацегогидразиды обладают серото-инопозитивными, МАО Б-ингибирующими и антиоксидантными свойствами.

3. Антидепрессивное действие 2-хлорэтокси-4-М,М- диметиламинофенил-юсфорилацетогидразида (КАПАХ) при внутрибрюшинном (1 и 10 мг/кг) и пе-оральном (4 и 40 мг/кг) применении на модели "выученная беспомощность" азвивается после 3-дневного применения, раньше, чем у мелипрамина (10 г/кг) и пирацетама (100 мг/кг).

4. Острая перинатальная гипобарическая гипоксия у крыс вызывает у по-эмства в половозрелом возрасте развитие депрессивно-подобного состояния и овышение активности МАО Б в коре головного мозга. Раннее постнатальное рименение КАПАХ (10 мг/кг) предупреждает развитие депрессивно-подобного эстояния, когнитивных нарушений, изменений соматического статуса и повы-1ение активности МАО типа Б.

5. Гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов обладают более выра-:енной ноотропной и антидепрессивнон активностью, чем N-замещенные фос-орилацетаты аммония. Подобно исходным гидразидам, N-замещенные фосфо-илацетаты аммония и гидразиниевые соли фосфорилацетогидразидов облада-iT МАО-ингибирующими, антиоксидантными, мембраностабилизирующимп и ;ротоиинопозитивными свойствами.

6. В рядах гидразиниевых солей фосфорилацетогидрагидразидов и N-1мешенных фосфорилацетатов аммония выделены альфа-карбэтокси-зобутиламмониевая соль дифенилфосфорилуксусной кислоты (A-I) и гидрази-иевые соли метил- и фторфенилфосфорилацстогидразида (Г-Ш и Г-V), кото-

рые в дозах, проявляющих ноотропные свойства (1/100 от ЛД50), обладают антидепрессивным действием.

Практические рекомендации.

1. Перспективен синтез новых соединений - солей фосфорилацетогидраз дов, как потенциальных средств с психотропной активностью.

2. Целесообразно дальнейшее фармакологическое изучение фосфорилац тогидразидов, гидразиниевых солей фосфорилацетогидразидов и N-замещеннь фосфорилацегатов аммония как потенциальных препаратов с ноотропной и а тидепрессивной активностью.

3. Рекомендуется продолжить доклиническое изучение КАПАХ с цель внедрения его в медицинскую практику.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Семина И.И., Байчурина А.З., Салахутдинова Л.Р., Гараев Р.С., Тарасо; Р.И., Шиловская Е.В., Ванеева И.Х. Антидепрессивное действие гидразида (гидрокси)хлорэтил-пара-К-диметиламинофенилфосфинилуксусной кислоты КАПАХ (Capah) // Материалы Рос. научной конф., посвященной 75-летию < дня рождения проф. Й.В.Заиконниковой "Фармакология и токсикология фосф рорганических и других биологически активных веществ", Выпуск 3. - Казан 1996.-С. 121.

2. Semina I., Sehilovskaya Е., Tarasova R., Baychourina A., Pavlov \ TikhonovaN., Garaev R. Mechanism of Action of Phosphorylacetic Acid Hydrazid as Memoryenharcers and Neuroprotectors // XIV International Conference < Phosphorus Chemistry. - Ju'ii 1998.- Cincinnati, Ohio.- LF-4-6.

3. Шиловская E.B., Семина И.И., Гараев P.C. Нарушения функций моз при воздействии перинатальной гипоксии у крыс и их коррекция препарате КАПАХ // Актуальные проблемы нейробиологии.-V Всероссийская школа м лодых ученых. - 11-12 ноября 1998 г. Казань. - С. 72-73.

4. Семина И.И., Тихонова Н.А., Байчурина А.З., Тарасова Р.И., Павлов В./ Шиловская Е.В., Гараев Р.С. Нейропротекторное действие КАПАХ, представ теля нобого класса ноотропов - неантихолинэстеразных фосфорорганическ] соединений // Вестник РАМН. - 1999. - № 3. - С.32-36.

5. Semina I., Baichourina A., Bukharaeva Е., Sehilovskaya Е„ Nikolsky Е. Т Mechanism of Action of САРАН on cholinergic neurotransmission. Effects similar substance P ? // 17th Isn/13 th Esn Meeting, Berlin, Germany //Journal Neurochemistry. - 1999. - Vol. 73. - P.31.

6. Шиловская E.B., Семина И.И., Байчурина А.З. Изучение эффектов 1С, ПАХ и субстанции Р при их совместном применении в экспериментах in vivo Актуальные проблемы нейробиологии. - VI Всероссийская школа молодых уч ных. - 24-27 октября 1999 г. Казань. - С. 124.

7. Semina I., Shilovskaya Е., Baychourina A., Tarasova R., Pavlov л Tikhonova N., Garaev R. Mechanism of Action of Phosphorylacetic Acid Hydrazid as Memory Enhancers and Neuroprotectors // Phosphorus, Sulfur et Silicon. - 1999

V.144-146.-P. 373-376.