Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Липоксигеназный метаболизм арахидоновой кислоты в нейтрофилах у онкологических больных

шум ВАК. России

■JL- iL^Äi^f

'судил ученую степень ДOKTÖFÄ4- *

шажке от

• 12.льник упраялеиш: PJP" России

тУУУ - 3/J2 - ^

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. академика H.H. Блохина

На правах рукописи УДК 612.015.32: 616.008.93

ШЕВЧЕНКО Валерий Евгеньевич

ЛИПОКСИГЕНАЗНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В НЕЙТРОФИЛАХ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

14.00.14 - онкология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность; АК - арахидоновая кислота;

БСТФА - 1Ч,0-бис(триметилсил)трифторацетомид;

ВК - "волосатые" клетки;

ВКЛ - волосатоклеточный лейкоз;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ГГТК - 12Ь-гидрокси-5,8,10-гептадекатриеновая кислота;

Г- КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;

ГМ-КСФ - гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор;

Г(П)ЭТК - гидро(пер)оксиэйкозатетраеновая кислота;

ЕР - система естественной резистентности организма;

ИЛ - интерлейкин;

ИНФ - интерферон;

КСМ - костномозговые саркомы;

КС - костные саркомы;

ЛГМ - лимфогранулематоз;

ЛО - липоксигеназа;

ЛТ - лейкотриены;

ЛТБ4 - лейкотриен Б4, 58,12Я-дигидрокси-6,14-цис,-8,10-транс-эйкозатетра-еновая кислота;

ЛИ - вариант лимфогранулематоза - лимфоидное истощение; ЛП - вариант лимфогранулематоза - лимфоидное преобладание; ЛХЛ - люминолусиленная хемилюминесценция; ЛЦХЛ - люцигенинусиленная хемилюминесценция; МК - меланома кожи;

МТ - мягкие ткани;

НЛ - нейтрофильный лейкоцит;

НС - вариант лимфогранулематоза - нодулярный склероз;

ОЗ - опсонизированный зимозан;

ОПК - опухолеподобные поражения костей;

ОС - остеосаркома;

ПА - полиамины;

ПГ - простагландины;

ПК - протеинкиназа;

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты;

ПХТ - противоопухолевая химиотерапия;

РА - рецепторы андрогенов;

РВ - респираторный взрыв;

РГ - рак гортани;

РЭ - рецепторы эстрогенов;

РЯ - рак языка;

РДПР - рак дна полости рта;

РМЖ - рак молочной железы;

СК - смешанно-клеточный вариант лимфогранулематоза;

СМТ - саркома мягких тканей;

СС - синовиальная саркома;

СЮ - саркома Юинга;

УФ - ультрафиолетовый диапазон спектра;

ФБ - фосфатный буфер;

ФЛ- фосфолипаза;

ФМЛФ - Ы-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; ФНО - фактор некроза опухоли; ХЛ - хемилюминесценция; ХМЛ - хронический миелолейкоз;

ХС - хондросаркома; ХТ - химиотерапия;

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; ЦО - циклооксигеназа;

ЦПО - ферментный комплекс, содержащий цитохром Р-450-подобную оксигеназу;

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат; ВН - внутренний стандарт;

Три-ГЭТК - тригидроксиэйкозатетраеновые кислоты; ТхБ2- тромбоксан Б2;

5-ГЭТК - 58-гидроксиэйкозатетраеновая кислота; 5,12-ди-ГЭТК - 58,128-дигидроксиэйкозатетраеновая кислота;

6-транс-ЛТБ4 - 6-транс-лейкотриен Б4, 58,12Я-дигидрокси-6,8,10-транс,-14-цис-эйкозатетраеновая кислота; 6-транс-12-эпи- ЛТБ4 - 58,128-дигидрокси-6,8,10-транс,-14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

20-ОН- ЛТБ4 - 20-гидрокси-лейкотриен Б4; 20-СООН- ЛТБ4 - 20-карбокси-лейкотриен Б4;

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................6-13

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................14-37

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................3 8-42

Глава III. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В НЕЙТРОФИЛАХ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ И ЗДОРОВЫХ

ДОНОРОВ.........................................................................................43-80

Глава IV. ИЗУЧЕНИЕ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ И ДОНОРОВ МЕТОДОМ

ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ...........................................................81-91

Глава V. ВЛИЯНИЕ РЯДА ФАКТОРОВ НА МЕТАБОЛИЗМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В НЕЙТРОФИЛАХ У

ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ..................................................92-103

Глава VI. ДЕЙСТВИЕ ИНТЕРФЕРОНА - АЛЬФА НА МЕТАБОЛИЗМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В НЕЙТРОФИЛАХ ДОНОРОВ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ.........................................104-135

Глава VII. МЕТАБОЛИЗМ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМАХ ДЕЙСТВИЯ Г-КСФ НА НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЛЕЙКОЦИТЫ ПРИ ВЫСОКОДОЗНОЙ ПРОТИВООРУХОЛЕВОЙ

ХИМИОТЕРАПИИ.......................................................................136-153

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................154-170

ВЫВОДЫ.........................................................................................................171-173

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................. 174-206

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время нейтрофильные лейкоциты (НЛ) рассматриваются как важное звено в единой структурно-функциональной системе противоопухолевой защиты организма [1,2]. Экспериментальные и клинические исследования указывают на их тесную взаимосвязь с патогенезом злокачественного роста [3]. НЛ могут принимать непосредственное участие в элиминировании трансформированных клеток посредством цитотоксического и цитолитического эффекта [4,5]. Опосредованное их действие проявляется через синтез различных медиаторов, регулирующих ряд клеточных и гуморальных реакций [6]. Эффективность самостоятельного или кооперативного действия НЛ определяется гомеостазом организма.

Развитие опухолевого процесса оказывает непосредственное модифицирующее действие на гранулоцитопоэз [ 7 ]. У онкологических больных часто наблюдается нейтрофильный лейкоцитоз, снижение фагоцитоза и хемотаксиса по-линуклеаров [ 8 ]. Механизмы развития этих дисфункций и их физиологическая роль в настоящее время недостаточно ясны. Полученные данные устанавливают не всегда однозначные изменения реактивности НЛ и тем самым вносят элементы противоречия.

Исследования состояния НЛ при злокачественном росте выявляют изменения активности различных ферментов [ 9 ]. До настоящего времени изучались ферменты, ответственные за конкретные функции НЛ, что часто не давало возможность до конца интерпретировать полученные факты, часто противоречивые. Из результатов данной работы становится понятным, что анализу должны подвергаться и регуляторные системы НЛ. Нарушение в передаче сигнальной информации НЛ является важным ключом в понимании механизмов их дисфункции. Одной из таких систем является группа метаболитов арахидоновой кислоты (АК)- эйкозаноидов. Доказано, что эйкозаноиды выполняют как внут-

риклеточные регуляторные функции, так и регулируют межклеточные взаимодействия. Их особая роль еще объясняется и тем, что на них замыкаются многие медиаторные системы и вторичные мессенджеры. Так ряд эффектов цито-киновой и других систем объясняется участием эйкозаноидов.

Как известно существует два пути метаболизма АК - циклооксигеназный (ЦО) и липоксигеназный (ЛО). Первый является источником тромбоксанов, простациклина, простагландинов, второй - лейкотриенов, липоксинов и других соединений. В то время как ЦО метаболиты вовлечены во все этапы этиологии рака, роль ЛО метаболитов до конца не установлена. Взаимоотношение этих двух метаболических систем еще предстоит выяснить, однако уже сейчас становится ясным, что эффекты их метаболитов на процессы опухолевого роста часто не совпадают, а находятся скорее в антагонизме.

В нейтрофилах метаболизм АК представлен в основном 5-ЛО каскадом, поэтому, являясь мощным генератором липоксигеназных метаболитов, НЛ могут влиять на общий фон эйкозаноидов в организме онкологического больного и, тем самым, на механизмы ЕР и опухолевого роста. Любые изменения в обмене АК в НЛ могут автоматически затрагивать и другие клеточные системы.

Метаболиты АК модулируют многие важнейшие функции НЛ - хемотаксис, адгезию, агрегацию, реализацию лизосомальных энзимов [133,138,124]. Для реактивности НЛ может оказаться критичным изменение баланса этих медиаторов. В этой связи наибольший интерес представляет изучение активности отдельных ферментов, входящих в ЛО каскад НЛ при патогенетических изменениях в организме, связанных с опухолевым процессом. Становится актуальным сопоставление метаболических нарушений обмена АК в НЛ при различных неоплазиях с другими изменениями в их реактивности, а также изучения способов их коррекции.

Система кроветворения онкологических больных является объектом интенсивных воздействий противоопухолевой терапии, что неизбежно приводит к нарушениям в звене НЛ, повышая тем самым вероятность возникновения у па-

циентов вторичных инфекций. В то же время депрессия функции НЛ является фактором, благоприятствующим распространению опухоли. Для уменьшения воздействия противоопухолевой ХТ на гемопоэз в настоящее время все чаще применяются колониестимулирующие факторы (КСФ), усиливающие как кроветворение так и эффекторный потенциал иммунокомпетентных клеток [13 ]. Сказанное обуславливает актуальность изучения функциональных изменений НЛ при различных видах противоопухолевой химиотерапии (ПХТ) и исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе возникновения вторичных иммунодифицитных состояний. В этой связи анализ изменения метаболизма АК в НЛ может дать важную информацию для коррекции проводимых схем лечения.

Наконец, важным аспектом исследования является изучение влияния им-муномодуляторов на обмен АК в НЛ, что дает возможность раскрыть молекулярные механизмы их действия и проводить селективный отбор препаратов. Выявленная взаимосвязь метаболитов АК с другими медиаторами иммуногенеза - интерлейкинами, интерферонами (ИНФ) и др., а также использование рекомбинантных цитокинов в клинической практике дает оригинальную возможность контролировать и усиливать их действие.

В этой связи исследование состояния НЛ в процессе злокачественного роста и в процессе противоопухолевой иммунохимиотерапии даст возможность оценить степень и глубину изменения их функции и может способствовать разработке мероприятий, направленных на повышение противоинфекционной и противоопухолевой резистентности организма.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является изучение 5-липоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты и его роли в изменении функциональной активности нейтрофилов у онкологических больных.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач: 1. Разработать методические приемы, позволяющие количественно оценить

уровень продуктов метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах человека.

2. Провести сравнительное исследование метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах здоровых доноров и онкологических больных с различными видами неоплазии.

3. Сопоставить нарушения обмена арахидоновой кислоты в нейтрофилах с патофизиологическими особенностями изучаемых заболеваний.

4. Выявить некоторые предполагаемые причины изменения обмена арахидоновой кислоты в нейтрофилах при онкопатологии.

5. Провести корреляцию и оценить взаимосвязь нарушений метаболизма арахидоновой кислоты с изменениями реактивности нейтрофилов у онкологических больных.

6. В опытах in vitro изучить влияние ряда цитокинов (интерферонов, Г-КСФ) на метаболизм арахидоновой кислоты в нейтрофилах.

7. Изучить в динамике показатели метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах при противоопухолевой терапии с применением интерферона-альфа.

8. Оценить изменение метаболизма арахидоновой кислоты при использовании Г-КСФ в противоопухолевой химиотерапии.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в практику отделений опухолей молочных желез и опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей ОНЦ РАМН.

Научная новизна

В работе впервые представлено и научно обосновано новое перспективное направление клинико-лабораторных исследований - определение состояния метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах в норме и при злокачественных новообразованиях. Установлена универсальность, высокая объектив-

ность и достоверность показателей 5-липоксигеназного пути обмена арахидо-новой кислоты для оценки патофизиологических изменений в нейтрофилах.

Впервые на клиническом материале от 267 пациентов получены количественные данные по 5-липоксигеназному метаболизму арахидоновой кислоты в нейтрофилах человека при онкологической патологии и разработаны статистически-достоверные нормы для уровней метаболитов арахидоновой кислоты у доноров. Показано, что при опухолевом процессе наблюдается достоверное изменение 5-липоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах.

Установлено, что качественный состав метаболитов арахидоновой кислоты в нейтрофилах первичных онкологических больных не отличается от показателей для здоровых доноров, что указывает на идентичный состав ферментов каскада арахидоновой кислоты у онкологических больных.

Впервые установлено, что количественный состав метаболитов арахидоновой кислоты в нейтрофилах при всех изученных патологиях изменен и характер изменения имеет как общие, так и специфические черты, определяемые нозологической формой, морфологическим вариантом и клинической стадией заболевания.

Впервые установлено, что для всех изученных патологий характерна супрессия 5- липоксигеназнои активности по сравнению с нормой и ее зависимость от вида заболевания, что коррелирует с уменьшением фагоцитарной активности нейтрофилов у онкологических больных.

Впервые показано, что активность цитохром Р-450-подобной оксигеназы и лейкотриен А^гидролазы в нейтрофилах у онкологических больных зависит от нозологии заболевания.

Показано, что прогрессия опухолевого процесса и наличие метастазов снижает катаболизм лейкотриена Б4 в нейтрофилах у онкологических больных.

Установлено, что Г-КСФ, простагландины, полиамины, макро- и микроэлементы, связанные с опухолевой патологией, дозозависимо модулируют функ-

циональную активность и обмен арахидоновой кислоты в нейтрофилах и могут рассматриваться как возможные факторы изменения реактивности нейтрофи-лов у онкологических больных.

Впервые показано, что терапия интерфероном-альфа у всех больных воло-сатоклеточным лейкозом и раком почки вызывает схожие изменения в метаболизме арахидоновой кислоты, которое выражается во временной супрессии 5-липоксигеназы и цитохром Р-450 - подобной оксигеназы нейтрофилов при суммарной дозе интерферона-альфа 20-24 млн МЕ.

На основании полученных данных высказана гипотеза, что процессы метаболизма арахидоновой кислоты участвуют в молекулярных механизмах реактивности нейтрофилов и противоопухолевой резистентности в целом и их направленная модуляция может быть использована в терапии некоторых видов злокачественных новообразований.

Практическая значимость

Изучение обмена арахидоновой кислоты в нейтрофилах носит фундаментальный характер, имеет важное теоретическое и практическое значение. Впервые с помощью широкого комплекса методов доказывается особая роль липид-ных медиаторов в патофизиологии нейтрофилов. Обнаружение метаболических изменений в нейтрофилах позволяет раскрыть новые звенья молекулярных механизмов нарушения реактивности нейтрофилов при опухолевом росте.

Стандартизованы методы определения уровней метаболитов арахидоновой кислоты, подтверждена их стабильность, хорошая воспроизводимость. Получены статистически достоверные нормы показателей для доноров и ряда онкологических патологий, что свидетельствует об универсальности и большой практической ценности параметров метаболизма арахидоновой кислоты в нейтрофилах. Предложены математические критерии для оценки состояния ферментов 5-липоксигеназного каскада. Показатели обмена арахидоновой кислоты у доноров могут служить критерием для обнаружения патологических сдвигов в

реактивности нейтрофилов у онкологических больных. Могут быть составлены и периодически дополняться типологические таблицы нарушений метаболизма арахидоновой кислоты и других параметров функциональной активности нейтрофилов, что послужит фундаментом для исследования состояния нейтрофилов в процессе терапии злокачественных новообразований. Вводится дополнительный критерий для оценки изменения функциональной активности нейтрофилов при онкологических заболеваниях, который поможет понять механизмы и степень влияния опухоли на их функциональную активность. Знание метаболизма арахидоновой кислоты даст возможность более достоверно оценивать состояние нейтрофилов больного до и во время терапии, корректировать и оценивать эффективность схемы проводимого лечения, разрабатывать ее новые варианты.

Расширение представлений об универсальной роли 5-липоксигеназного метаболизма арахидоновой кислоты в механизмах изменения реактивности нейтрофилов на фоне роста, развития и метастазирования опухолевого процесса позволит рекомендовать использование в клинике препаратов, влияющих на этот путь обмена. Применение таких препаратов наряду с известными методами комплексной терапии злокачественных новообразований позволит улучшить эффективность