Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Органоспецифические особенности нарушений биосинтеза эйкозаноидов, активности ферментов клеточной защиты и перекисного окисления липидов в динамике эндотоксинового шока

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ГК СЭН РФ

ПОМОЙНЕЦКИЙ Валерий Дмитриевич

ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НАРУШЕНИЙ БИОСИНТЕЗА ЭЙКОЗАНОИДОВ, АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ ЗАЩИТЫ И ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ДИНАМИКЕ ЭНДОТОКСИНОВОГО ШОКА

14.00.10 — инфекционные болезни 14.00.16 — патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

На правах рукописи

Москва — 1992

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии и в Центральном институте усовершенствования врачей Л13 Российской Федерации

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

академик РАМН, доктор медицинских паук, профессор В. И. Покровский

лауреат Государственной премии Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор А. А. Кубатиев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Ф. А. Туманов доктор медицинских паук, профессор М. X. Турьянов доктор биологических наук, профессор О. А. Гомазков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ — Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита диссертации состоится « ^X » 1993 г. в

» час. на заседании специализированного Совета Д 074.19.01 в Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии (Москва, 111123, Новогиреевская ул., д. За)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦНИИЭ

Автореферат разослан «

6 »

199 С> г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат медицинских паук

М. Н. Пименова

5ИБЛИ<Л££А - I -

ОНШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблеск.Выяснение механизмов развития токсико-икфекциокнсго иока и его ослс~ненп:: является одной из наиболее актуальных. задач.современной иедипдш (Б.3.Кулагин, 1979; З.В.Малеев и ссавт.. 1983; В.'И.Покровскгй г соаэг., 1973, 1979, I9S3; Г.Рвккер и ссант.. 1987; 5.3.Булычев, IS87; Н.Б.Шалнгнна н соавт., I9S7;

tyg&tilJzt aß., IS69, I99G; l.M. /¿ук. 7 £ ' fäti/ii, 1989).

При анализе сушествушЕХ представлений.о патогенезе экдоток-сгноэого пека обращают втканге две ведущие, на.наш взгляд, концепции. По одной из .та:, эндотоксины первоначально, взаимодействуя с ке.мбрана'.п: клеток-мишеней тканей или органов, актнвиругзг ключевой фермент метаболического каскада арахидоновой кислота, фосзо липазу а2 и запускаю? синтез всех типов эйкозакопдов (ИГ, Т)^, ПП^, лейко-триены н др.) (В.И.Покровский л созет., 1983; В.3.Фалеев и соавт.., 1983; З.Д.Помойнецкий и соавт,, IS34, 1983, 1989; ^ /Ц. I9S5; СTty/w, . 1985; ^.M.Jfcctt UtU, 1983, 1986, 1989;

М.М.. dz^tA., 1989, I9S0). По"другой версии предпочтение отдается активации езебоднорадикальннх реакций, накоплению токсических радикалов кислорода п. как следствие этого, стимуляции синтеза эйкозаноидов ( Л. ^¿опл. ? И-G-itn,t£t 1967; С. At heft ¿to I9C7; E.Ä. bLtKttt^ 1985).

На над взгляд, подобное противопоставление инициальной роли метаболитов арахидоновогэ каскада продуктам окислительной деградации лилидов в разЕИпш эндотоксинового пока вряд.ли удачно, поскольку з последнее время подчеркивалось неоднократно, что синтеза эйкозаноидов и свободнорадикальное окисление лшшдов составляет единый биорадикалькый процесс,участвующий в регуляции клеточной активности.

Биорадикальный характер инициации синтеза лейкотрненов и дру-

vzx соединений был установлен в реакциях липэксигеназного пути ме- • таболизма арахидоновой кислоты и других тепое цолиненаскшенкых мирных кислот ( Р. С- fac&ttL С. ¿e/iedrtto _ Is37 ). Ь указанных реакциях, кроме лейкотриенов и радикальных продуктов, образуется пироний спектр биологически активных гидроперокси- и гддроксиэйкозатетраеяовых кислот (НР2ГЕ к НЕГЕ), которые, с одной стороны, обладают сеойстеом активировать иле ингибнроЕать ферменты .метаболического каскада арахидоновой кислоты, с другой же - инициировать процессы ПОЛ {^.B-Jotiíoivf 1934. W.£, JcLñJs, 1985;

1987;/; Я MB&eL¡L9Bñбольшое значение в регуляции выхода конечных продуктов лилоксигеназного дуги играют антиокспданты (природные плл синтетические), восстановленный глутатион и глутатион-£'-транс-фераза {Balie^, 1985; A.LejeZ> 1989 ). Складывается, на первый взгляд, парадоксальная ситуация: с одной стороны, СЕОбодкорадккаль-ше реакции необходимы для регуляции многих метаболических процессов Е клетке, а с другой - их чрезмерная актИЕе-д.м приводит к необратимым повреждениям (С. Benedetio, 1967;G-гееп )• Анализ этих и других фактов приводит к предположению о сушест-вовании в клетке окисяителъно-аЕтиокЕслителъного пула, т.е. физиологического баланса мегду этими системами фактороЕ, который не допускает; избыточного образования активных метаболитов кислорода, а следовательно, и чрезмерной стимуляции ПОЛ ( 7¿arte., IS32;ЛМ. Mi, 1980 * ). К антиокислительной системе могно отнести как вешестЕа, поступавшие с нишей (с£-токо-ферол и др.), так и синтезируемые в самой клетке: белковые и небелковые соединения, содеркалше ^Н-гругшы, главным из которых является восстановленный глутатион, а такие большую группу ферментов, кесушх защитные функции (глутатионпероксидаза, зпоксндгидратаза, COZ,, глутатионредуктаза, цитохром Р-450, глутатион-^-трансферазы, циклоокснгеназа и др.).

Такш образом, становится понятным то, что физиологическое равновесие данных систем является условием нормального функлионирова- ■ кия клетки. Это, в своп очередь, дает основание как выдвинуть гипотезу, в соответствии с которой всглс.'ютзгя на организм экзогенко.1 или эндогенной природ!:,'включая и ЛПО ^рк-^пи-Ъо*-!*., могут привести к сдвигу сувестаутего равновесия путем повреждения рехуяяппп синтеза факторов затдиты и привести к резкой активации .метаболического каскада арэхидоковой кислоты и свободнорадикальшх реакций, увелзгяевагяпя: пул токсических метаболитов кислорода и лппоперекзсей пирных кислот.

3 предлагаемой нами гипотезе впервые сделана попытка связать в единое целое разрозненные з литературе данные о возмогшие взаимосвязях системы синтеза эйкозаксидов, иропессов ПОЛ, защитных и ре-гуляторн^с Факторов и их расбалансировке при действии эндотоксинов.

Ваг.ненпп:м аргументом для выдвигаемой наш: версии является реальное существование в клетке компенсаторно-гомеостатической рогуля-торной системы, предназначенной для сохранения физиологического уровня активных радикалов кислорода, сбалансированного антвокскдантной системой факторов ( £. ^о О , 1584 ).

Исходя из выдвигаемой'концепции становятся понятными и основные подходы к изучению механизмов повреядаккего действия эндотоксина на организм: во-первых, выяснение еозмэеных корреляций между сво-боднорадикальными реакциями, активностью ферментов метаболического каскада арахидоновой кислоты и системой защитных факторов клетки; во-вторых, исследование характера блеяния Ж1С на баланс защитных :: поврекдаших факторов в органах и тканях в динамике эндотоксинов:.: _ пока; в-третьих, выявление органо- и тка не специфичных сссбекпостс.' в действии ЛПС на активность метаболического каскада арахидоксво' кислоты в организме кивоткых с экспериментальным эндотоксинов!"': -ком. Необходимо отметить, что удельная активность тех -^т и:-::'

ферментов, синтезирующих эйкозаноиды в разных органах и тканях, неодинакова. Так, например, максимальной тромбоксансинтегазной активностью обладавт тромбоциты; существенно меньше в этих клетках синте-зирувтся другие типы цросгакоидов и совсем отсутствует образование простацпклина и лейкотриенов ( ¿f. М- ßzlieg., 1925 > С. ßeäßdef-"60; I9S7 ). В разной степени представлена активность синтеза тром-боксана и других типов эйкозаноидов в легких, почках, селезенке и др. ( М. Л, Cßhefb^ 1985 )• Tai:, например, наибольшее количество простациклина образуется в эндотелии сосудов и в меньшей степени - в клетках других органов и тканей ( O.F. Сой

Я. И. С-гсе/г. ¿¿Л, 1983 ).

В связи с вышаизлокенкыи становится пошлю, что выяснение ор-гано- и гканеспецифических' особенностей в действии ЛПС на образования разных тшзов эйкозаноидов имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, поскольку подводят реальную научную базу под разработку эффективных патогенетическ:. обоснованных методов фармакологической коррекции септических состояний и шока.

В целом, основываясь на данных литературы, мокко предположить,

*

что современные противошоковые средства долкш удовлетворять трем основным требованиям: во-первых, эффективно модулировать активность ферментов гак циклоокси-, так и липоксигеназного путей метаболизма арахидоновок кислоты в органах и клетках-мишенях; во-вторых, подавлять активность ПОЛ как в мембранах клеточных, так и субклеточных образований; и, в-третьих, поддергивать высокий уровень природных антиоксидантных систем в клетке.

Разумеется, подобные требования не могут быть удовлетворены при помощи применения селективных блокаторов синтеза простаноидов или лейкотриенов. Многообразие патофизиологических механизмов развития токсикоинфекционного шока и его клинических проявлений требу-

ет безусловно комплексного воздействия на ключевые этапы биосинтеза продуктов циклоокси- и липоксигеказногэ путей метаболизма ара-хидоновой кислоты, а хакге анпфадакальную систему клеточной зашиты.

Поэтому в настоящей работе бил использован весь основной арсенал фармакологических средств в профилактике и лечении экспериментального эндотоксинового шока.

диссертационная работа является исследованием, выполнении.".! в рамках государственных тем ШИИЭ \!.Ъ СССР "Токснкоинфекционный иск как основная- причина смерти инфекционных большее: клиника, патогенез, лечение" и "Изыскание эффективных методов п средств совершенствования патогенетической герапго при ряде инфекционных заболеваний", входящих э план научно-технического сотрудничества стран-членов СЗВ в области медицинской науки, техники и здравоохранения (см. отчеты гос. per. Is 1516008624 за I9B5 г. п гос. per. й 0I8900II043 за IS90 г. соответственно).

Цель исследования - изучить органоспецифические особенности нарушений биосинтеза и метаболизма эйкозаноидоЕ, активность ферментов клеточной зашиты и ПОЛ в органах и тканях -квотных с экспериментальный эндотоксиновым шоком, а такие разработать на этой основе новые методы и прикпипы противошоковой терапии.

Задачи исследования.

I. Изучить в условиях ин зитро действие ЛПС на:

- биосинтез, метаболизм и соотношения пиклооксигеназных продуктов арахидановой кислоты (IHEj, ПГЕ^, ПП^. 6-кет.&~-ПГРи, 15-кето-ПГ?2^);

- биосинтез и метаболизм липоксигеназных продуктов арахидоновс: кислоты (лейкотриены В4, С4, 5-, 12- и 15-РЗГГ);

- биосинтез разных фракций фосфолипидов;

- интенсивность перекисного окисления липидое;

- активность антиокислительных ферментов (СОД, эпоксидгидрата-зц, глутатионпероксидазн, глутатион-,?-трансферазы и др.);

- содерканзе циклических нуклеотидов (цАМФ и цШФ).

П. Сопоставить полученные данные с особенностями нарушения би осингеза продуктов метаболического каскада арахидоновой кислоты, интенсивностью ПОЛ, активностью антиокислительных ферментов и содер-нанием цитохрома Р-450 в разных органах и тканях, -кивотных с экспериментальны эндотоксиновым шоком в условиях ен bebo.

Ш. Выявить наиболее специфические клетки-мишени поврекдавдего действия ЛПС в условиях ин витро и пн еиво.

1У. Разработать на основе сравнительных исследований ин витро и ин виво оптимальные подхода к профилактике и терапии экспериментального эвдотоксинового шока.

Научная новизна. Работа носит приоритетный характер, так как в ней впервые:

- прослекены сдвиги в активности синтеза, .метаболизма и содержания разных типов эйкозаноидов (ПГ, ТХ!^, 6-кето-ПГР-г^, лейкотрие-нов Б^, С^, Д^; 5-, 12- и 15-НЕГЕ) и их соотношениях в органах и тканях зиеотных в динамике экспериментального эндотоксинового шока. Установлено, что в первой фазе шока преобладает образование циклэ-оксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты, а во второй - липо-ксигеназных;

- выявлены сдеиги в соотношениях ключевых факторов защиты (е сэдеркании цитохрома Р-450, восстановленного глутатиона, 6-кето-KiTj^, nrSj, ШДз» Я^-®, активности глутатионзаЕисимых ферментов, СОД и эпоксидгидратазы) и повреждения (активность ПОЛ, уррвни окисленного глутатиона, лейкотриенов, свободных нуклеотидов, ТХВ2) в клетках е сторону последних в динамике экспериментального эндотоксинового шока;

- установлены ключевые механизмы .итС-индуцпроваккоД агрегат:? тромбоцитов л нейтрофидов:

а) преобладаше активации цвклооксвгеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в тромбоцитах (подъем уроЕне;; ТХЗ? и снижение ПГЕТ и ПГд9) и липоксигеназного в нейтрофилах (особенно ЛТВЛ); б) значительные сдвиги величин соотношений цА:.1$/цГ.'й, ПГЕТ/?ХВ2 в сторону последних; з) значительное сникение активности глутатискза-впспмых ферментов и СОД; г) резкое падение чувствительности тромбоцитов к повышению концентраций простациклина в среде инкубации; д) нарушение баланса реакций ациллроэания и деащлкрованкя ванней-ших фракций фосфолгсшдоЕ. сопровождаемого ростом активности ПСЛ, концентраций лизоформ фосфагшшлпвозптола и фосфатпдилхолина в мембранах клет о::;

- вскрыты механизмы протективкого действия и тормскения ЛПС-индупированной агрегации тромбоцитов и некрофилов новыми кекбра-ноактивкымп соединениями 3-оксипиридинового (АСК-^) и гидрохлорид. 3-(//,//-диметилгарбамоилокси)-2-этнл-Р-метил~1Л1рндинэЕого (ГБ-212) рядов в условиях ин еиво, обусловленные подавлением реакций СЕобод-норадикального окисления лшшпов. модуляцией активности метаболического каскада арахидоновой кислоты и повксением уровне" защитных тороЕ е клетке;

- показана высокая противошоковая активность АСХ-6 п. ссс&с ГБ-212 з условия?: ин визе;

- доказано, что в качестве критерия тянести эндотоксиноеого-пока могут выступать количественные изменения в содержании липоперск-сидоз крови, свободных нуклеотидов, активности СОД и резнстентксст:. тромбоцитов к еысоким концентрациям простациклина. Выяснено, чп эти факторы тесно связаны с функционально-метаболическим состоянием органов и тканей;

- установлено, что повреядапвее воздействие эндотоксина иа печень (вероятно, и на другие органы) коррелирует с уровнем Л.-токо-ферола е мембранных структурах клеток и активностью антиоксидантных ферментов. Выявлено, что ЛПС обладает'свойством снижать содернание природного антиоксиданта в мембранах субклеточных структур печени и повышать его в плазме крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Диссертация является фунда;.]ентальны;л теоретическим исследованием, посвященным выяснению механизмов поЕрездашего действия эндотоксина на ключевые ферменты метаболизма в органах и тканях при шоке. Представленные е работе результаты имеют научно-теоретическое значение, поскольку значительно расширяют■сушествунпие представления об органо-и клеточноспецифических особенностях сдвигов в активности процессов ПОЛ, синтеза эйкозаноидов и ферментов клеточной зашиты в динамике эндотоксинового шока. Показана тесная корреляционная связь менду исследуемыми показателя:™ и летальностью животных при шоке.

Полученные результаты и данные литературы послукили основой для разработки и обоснования гипотетической схемы патогенеза эндотоксинового шока и его патогенетической фармакокоррекции.

Выполненное исследование имеет и прикладное значение, так как открывает новые перспективы для целенаправленного поиска эффективных противошоковых средств на основе мембраноактивных соединений 3-0ксипиридин0Е0Г0 (АСК-6) и гидрохлорид,3-(//,4^-дшлетилкарбамои-докси)-2-этМ-6-мегил-гшридиноЕого (ГБ-212) рядов. Материалы клинической апробации производных 3-оксипиридиноЕого ряда в качестве противошоковых средств переданы в Фармакологический комитет МЗ ССР.

Внедрение результатов исследования в практику. По результатам работы подготовлены, утверздены и внедрены . на Союзном и республиканском уровнях 4 методические рекомендации, издано одно учебное по-

собие (в соавторстве) и монография (е соавторстве). Модификации методов отбора биологического материала, экстракции эйкозаноидов, их тонкослойной и колоночной хроматографии и основные рекомендации по работе внедрены во Всесоюзном научном Центре хирургии А.\3 СССР, сгитуте биохимии АН 7зСС?, Военно-медицинской Академии и:.:. С.".Кирова, Токсикологическом Центре Г.13 АзССР, научно-медициЕских ЦеЕтрах г.г. Иркутска, Ашхабада, Владивостока.

Материалы диссертации и методические рекомендации гключены в программ усовершенствования врачей на кафедрах ЦОЗПЗГВ :,53 СССР (патофизиологии, спохп-'.сип, нефрологии и медицинской радиологии)'.

Разработан и апробирован в клинике (Токсикологический Центр АзСС?) простой и информативный критерий для диагностики степени гипоксии и аноксии органов и тканей в динамике зндотоксинового шока (определение уровнен свободных нуклеотидов в цельной кроЕи). Предлагаемый тест затптен авторским свидетельством (1983 г.). В целом, по материалам диссертации зашишено два авторских свидетельства.

По результатам работы предложен интегральный тест для: а) оценки степени поЕрендаюших воздействий эндотоксина и б) эффективности подбираемой фармакотерапии. Тест проводится на богатой тромбоцитами плазме животного или человека. После обработки клеток ЛЕС или другими агрегирунБИМп агентами измеряется резистентность тромбоцитов к агрегации на фоне возраста-кгаих концентраций простациклина. Методика апробирована в клинике при изучении моделируемого стресса у больных с ишемической болезнью сердца (кафедра факультетской терапии МЛСИ им. Н.А.Семашко, 1990 г.).

Положения, выносимые на защиту.

I. Нарушение биосинтеза продуктов метаболического каскада ага-хидоноеой кислоты и интенсификация свободнорадикального окисления липидов при эндотоксемии возникает практически одновременно и ха-

рактерпзирует ранние стада заболевания.

2. Несмотря на тотальный характер выявленных в ходе исследования изменении, есть все основания утверждать о существовании не только клеток-мишеней, но и органов-мишеней по отношении к эндотоксину. К ним в периую очередь относятся: тромбоциты, нейтрофилы, почки и слизистая желудочно-кишечного тракта.

3. Параллельное нарушение биосинтеза никло- и липоксигеназных продуктов метаболического каскада арахидоновой кислоты с интенсификацией ПОЛ и падением активности антиокислительных ферментов защиты свидетельствует о необходимости комплексного патогенетического подхода к фармакотерапии эндотоксиноеого шона на основе ингибиторов циклооксигеназ, тромбоксансинтетазы, а также мембранопротекторов З-оксипиридинового ряда.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: УП Всесоюзной конференции по химии органических пероксидоЕ (Волгоград,1980); Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Фагоцитоз и иммунитет" (Москва, 1983); П Всесоюзной конференции "Поражение сосудистой стенки и гемостаз" (Минск, 1983); 1У Всесоюзном синпозиуме по биохимии липидов (Киев, 1983); научно-практической конференции ЦНИИ эпидемиологии МЗ СССР и клиники инфекционных болезней МмСИ им. H.A. Семашко (Москва, 1983, 1992); П Всесоюзном совещании "Синтетические и прикладные исследования простагландинов" (Уфа, 1984); Всесоюзном симпозиуме "Синтез ж исследование простагландинов" (Таллин, 1986); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике" (Москва, 1988); Ш Международной конференции (Монте-Карло, 1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 37 работ в журналах, сборниках научных трудов, материалах Международных конгрессов. Всесоюзных и республиканских конференций и симпозиумов. Издано 4

методические рекомендации, одно учебное пособие и монография в соавторстве. Получено 2 авторских свидетельства.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 352 страницах .машинописного текста и состоит из введения, 13 глзе, заключения, выводов, приложения, указателя литературы, включавшего 43 отечественных и 395 иностранных источников литературы. Работа иллюстрирована 44 рисунками и 64 таблицами.

П. С0ДРР1АИЗ РАБОТЫ Диссертация состоит из трех разделов: первый носЕятен механизма!.; нарушения структурнофункциональксГ: организации биосинтеза продуктов арахидонового каскада, ПОЛ и активности ферментов зашиты в нативных клетках крови, обработанных бактериальным липополисахари-дом е условиях ин витро; второй - особенностям этих нарушений в клетках кров::, ткани почек, сердца, легких, селезенки и других органов в динамике эндотоксинового шока; и третий - поиску новых фармакологических подходов к регуляции ключевых метаболических систем, определявших развитие эндотоксинового пока и созданию на этой основе эффективных средств протиЕошоковой терапии.

I. Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 894 беспородных белых крысах, 678 нелинейных лабораторных мышах г 1с" кроликах-самцах породы "Шиншилла".

Зцдогоксиноеыи шок на кроликах массой 2-3 кг воспроизводили путем однократного введения (в краевую вену уха) раствора .МТС ркл, и-т- . фирмы " 3)с/со « (США) в дозе 5-10 мг/кг массы

животного, а крыса;.' и мышам (160+20 г и 2042 г соответственно) однократной инъекцией раствора эндотоксина в хвостовую гену из расчета 20 мг и 30 мг на I кг массы соответственно. Контроль за развитием эндотоксиноеого шока на кроликах осуществляли исследованием центральной гемодинамики методом терморазведения ( /""<?/ -бе2., 1954). Крн-

вую терморааредешя оинхронно с НЮ?, ФКГ и кривой давления в аорте• регпетр'дрзЕат! на Жг^о^г^ук—ЗА фир.-.ш^/А'б . Забор крови осуще-бТВйяли в фиксированное время суток (10 часов утра) из краевой Еены уха кролика методом веносекции. Богатую тромбоцитами плазму получали по методу (1975), суспензии отмытых клеток - по Н. й.мс( JtG^ ¡{¿грггип- (1972). Нейтрофилы из крови выделяли обшепринятым методом дифференциального центрифугирования суммарной фракции клеток в градиенте 60$ Перколла (Швеция), макрофаги перитонеального эксудата получали по методике ei.iL, (1985). Подсчет клеток, выделяемых, разными методам, осуществляли на целоскопе (ФРГ). У животных с эндотоксиноеым шоком (крысы) 1фоеь отбирали в разные временные интервалы после введения ЛПС из брюшного отдела аорты (через 5, 15, 30, 60, 120, 240 минут и 12, 18, 24, 48, 72 часа) после предварительной анестезии животных тиопенталом-уУс. (40-60 мг/кг). В те не временные интервалы осушестЕляли и отбор органон животных. Среза коркового и ыедуллярно-пгпилдлрного отделов почки получали после предварительного быстрого замораживания органа. Субклеточные фракции из гомогенатов органов и тканей выделяли методом дифференциального ультрацентрифугирования 1981).

Активность синтеза и метаболизма разных типов эйкозаноидов (ПГЕ1, П1Т2<д, ПГД2, ТХВ2, б-кето-ПГР^ и др.) в гомогенатах органов и тканей анализировали по методу ( Наггг^ а, 1982; Помойнецкий В.Д. и др., 1986), вводя в среду инкубации 14С-арахидо-ноиую кислоту (удельная активность 60 мКи/шэль - Лмгг ¡А , Англия) .с последующей хроматографией продуктов реакции на тонком слое силикат едя £ ФРГ) в системе органической фазы растворителей этилацетат : изооктан : уксусная кислота : вода (110 : 50 : 20 : 100, объем/объем).

Разделение ИТ на группы на микроколокках с кремниевой кислотой 100-200 меш ( feíO-fla-tL La6c¿á-tozj, СО), А2, Е2, ^^осуществляли-по методу F-jt¿<--¿¿ it О- и др. (1974) в модификации Псмойнецко-го Б.1. и др. (1979) с последушнм их количественным определением стандартными наборам реагентов ( C¿¿/u.t^i Ascaj, СО).

Определение тромбоксана 2>>, б-кето-Ш?'-^ (.стабильный метаболит простациклика). лейкотриензв B¿, Сд, Х,.^; 5-. 12- и I5-K3TE, цА'.3 и цГ.й проводили с помощью специальных наборов реактиЕОЕ фирм Англии, СО, Венгрии, Чехословакии согласно инструкций, прилагаемых к. ним.

Анализ синтеза разных фракций фоссолипидов (фосфатпдилхолзша,

лизофосфатидилхолика. сфингомиелика и др.) в .срезах почек е динамит/

ке иока определяли после инкубации их с * ■С-метилхолином, а в нейт-

т *

рофилах и тромбоцитах - после экспозиции клеток с "^С-арахидоновой . кислотой с последующим разделением продуктов двумерной хроматографией нз тонком слое силикагеля С- {^Делк. ФРГ) по методу Ра О & tú. H.G-. (1986). Скачала в I системе растноретелей (Хлороформ : метанол-уксусная кислота : Еода, объем/объем) , затем ео П (хлороформ : метанол : 40JS еодный метиламин : Еода, объем/объем). Подсчет радиоактивности идентифицированных фракпий осуществляли е сцинтилляцион-ном счетчике МаИс 2: ( tfucSzasi. Chícalo f CEA).

Активность перекисиого окисления липидов (содержание липопе-роксидоз Е мембранных структурах клетки - тест по "ДНА). уроЕни окисленной и восстановленной форм глутатиона измеряли на спектрофлуо-риметре ( Je, . 1982; R С. Hl^in. ; Я. у 197=)- Щ-

пентрации питохромз F-450 анализировали на двухеолновом спектрофотометре Jensen, £.£fa"Sen(iggi), белка - по D.M. leu-г* £¿a¿ (1951).

Динамику уровней свободных нуклеотидов в плазме крови анализировали по методу Помойнецкого З.Д. и др. (авторское сЕидетельсг-

во 1983 г.). Активность глутатионзависимых ферментов: тлутатионпе-• роксидазы, глутатионредуктазы, глутатион-^-трансферазы, а.такке супероксидди смутазы определяли спектрофяуорометрическими методами.

Агрегация тромбоцитов и нейтрофилов оценивали по методу (1962) в модификации 0' г/¿£ (19В2) при помощи агрегометра

фирмы Ск опо£с£ ¿¿>у>г>2а£е>л((Ш.), В качестве индукторов агрегации тромбоцитов использовали Ж1С X (^ со *> США) в ко-

нечных концентрациях от .100 до 1000 ккг/мл; АДФ (" ", США);

кальциевый ионофор А 23187 США) (1-10-3 и 4,5-Ю"3 мМ);

е случае же нейтрофилов - ЖС и А 23187.

Регуляция ЛПС-индуцмрованной агрегации тромбоцитов осушестЕля-лась при помощи: имидазола ("л&^м.", США) в конечной концентрации 0,028, 5 и 10 мМ; индометацина (" ^а?а. СИА) - 0,028 м!,1; трента-ла (Хехст АГ, ФРГ) - 0,028 мМ; ацетилсалициловой кислоты (АСК) {^Оиске. МО- , Чехословакия) - 2 и 5 мМ; АСК-6к (водорастворимое производное 3-гидроксипиридинового ряда) и ГБ-Р123"5 (гидрохлорид, 3-(Л/',Л/-ДЕ!летилкарбамоилокси)-2-этил-6-метил-11иридин) в конечной концентрации 2,5 и 10 мМ.

Для регуляции агрегации нейтрофилов, вызываемой ЖС или кальциевым ионофором (А 23187), применяли АСК-6 и 1Б-212, а е качестве сравнения - уже известное соединение З-оксшшридкноЕого ряда (эмо-ксипин).

Анализ агрегатограмм проводили расчетным методом. Определяли максимальный цроцент падения оптической плотности (ст %), скорость агрегации {% сек), время латентного периода (Тпл сек) 50% от максимального падения оптической плотности (Твт/2 сек) и процент тори-

н - препарат АСК-6 любезно предоставлен д.х.н. проф. Л.Д.Смирновым -ш - ГБ-212 академиком А?Ш СССР Р.Г.Глушковым и д.м.н. Т.А.Руськовой

мсгенпя агрегации (ICC - С v).

Расчет л статистическую обработку получении:-: данных проводили на сБ!.' " 'bi^i'tcL-E VI ЮС", а такге методами вариационной статистики с использованием критерия Стыздекта (Кекуй !.".Г., ISS2).

2. Влияние SIC на синтез и содержание циклоок-сигеназных метаболитов арахидононой кислоты и циклических нуклеотидоЕ в органах и клетках-мишенях у ".КВОТНЫХ с ЭНДОТОКСИНОБЫ.М ' шоком

Сведения с дисбалансе в системе эйкозаноидов в организме' -.квотных с эндотокспкозым шоком носят разрозненный и противоречивы;: характер. Из поля зрения исследователей практически выпал аспект изучения соотношений концентраций метаболитов арахидоновой кислоты в кровотоке в динамике эндотоксинового шока и, особенно, специфика их сдвигов е разных органах и тканях. Поэтому данная работа предпринята с целы: восполнить этот пробел. Так, на рис.1 показано, что уге через 15 минут после введения эндотоксина происходит резкий выброс в кровоток TXBg. В последующие временные интервалы наблюдается рост концентраций 6-кето-ПГ?-^, ПГБ^ и ПГ?2о(;

Анализ полученных данных свидетельствует о существенных различиях в динамике изменений уровней разных метаболитов арахидоновой кислоты в кровотоке кивотных после введения ЛИС.

Исследование активности образования метаболитов арахидоновой кислоты в тканях сердца показывает, что пик синтеза тромбоксана Г.-,, простацнклпна (по стабильному метаболиту - б-кето-ШГЗ--^) и Ш/^"отмечается через час после разЕития шока, в то время, как мак си:-/:.':: для ИГЕ? и ПШ,^- через 2 часа после введения ЛИС (рис. 2А). близкая картина наблюдается и в ткани легких (рис. 2Б). Но в отличие от сердечной мышцы, в них резко активирован и синтсз TTZ,-,. кстср;:" даг.е на поздних стадиях шока остается ете значетелько выше. в. группе контроле (р<-0,СТ).

1 - О—© - ПГЕ1

2 - А—А - ПГЕг

3 - а—в - пгтгл

4 — V—V — 6—кешо-

5 - «-О - ТХВг

0.000 1.000 2X00 3.000 4.000

Т, ЧАСЫ

Рис.1. Содержание эйкозаноидов в плазме крови крыс в динамике эцдотоксинового шока

С некоторыми отличиями аналогичный характер сдвигов в системе эйкозаноидов отмечается в тимусе, желудке, 12-перстной кишке, везикулярных железах, тканях мозга, надпочечника, селезенки, почек и др. Особый интерес представляет анализ сдвигов в активности ферментов циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в печени (рис 2В). В тканях этого органа, в отличие от других, уже с первых минут после введения ЛИС наблюдается резкое снижение всех груш эйкозанондов.

Патогенез осложнений эндотоксинового шока чрезвычайно сложен и не ясен. Так как в основе синтеза циклических эндоперекисей (общие предшественники простаноидов) лежат свободнорадикальные реакции, то в результате этих процессов происходит образование широкого спектра токсичных соединений с перекисными радикалами, ингиби-руишах те или иные ферменты синтеза ПГ (например, Ь,, З^, ТХА2).

1 - О—О - ПГЕо

2 - Д-А - ПГГ2

3 - Я—Я - ПГДг

4 _ _ 5-кгто-

5 _

Рис. 2 А. Сердце

0.000 0.5с0 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000

Т, ЧАСЫ

1 - О—о - ПГс2

2 _ Л-А - пгг2

3 - п—п - ПГД2

4 _ V—г - 6-кегт)!

5 - -О - тхв2

Легкое

Т. ЧАСЫ

15--

1 - о—о - пгЕг

2 - А—А - ПГГ2

3 - П- П - ПГД2

4 - V-V - б-келпо-

ГИТ}

5 _ «—о - ТХВ2

Рис. 2 В. Печень

Зная это, моено предполагать о том, что эндотоксины опосредованно, через другие механизмы, будут нарушать функцию отдельных ферментов' метаболизма арахидоновой кислоты и тем самым приводить к изменению соотношений и количества образующихся эйкозаноидов. А так как они обладают широким спектором биологического действия, то избыток или недостаток каких-либо активных метаболитов арахидоновой кислоты монет существенно нарушить метаболизм и функции органов или тканей в ту или иную сторону. Известно, что, например, повышение концентраций ПГЕ^ и ПИзд значительно повышающие юс физиологические уровни, вызывают диарею и ряд других сдвигов ( С. &емг(еио , ив?). Недостаток же этих эйкозаноидов монет привести к некрозу слизистой при действии различных поврездаших агентов ( Р. £ , 1986).

Влияние ЛПС на активность синтеза щщдооксигеназных метаболитов арахидоновой якояоты в клетках крови и перитонеаяьного смыва ис-■слодобйяв после предварительной инкубации их с ^С-арахидоновой 1ШП0Той. В отдельных ке опытах богатую тромбоцитами плазму или отмытые клетки содержали в среде ЛПС, но без добавления ^С-арахидо-новой кислоты, для измерения ПГЕ1 и циклических нуклеотидов (цАМФ и цШФ).

Рис.3. Синтез и содержание эйкозаноидов в тромЗщмтах в динамике их экспозиции с ЛПС

О 5

-О-

10

I .....

15 20

30

Та?:, на рис.З представлены результаты определений активности синтеза и содержания цнклэоксигеказных (ПГБТ, ПГД?, ТХ^) к лкпок-оигеназннх метаболитов ^С-арахвдоновоЛ кислоты (1~С-НЕГЕ) в тромбоцитах кр:вн.

Из анализа данных следует, что в первые минуты инкубации клеток с эндотоксином происходит резкая активация синтеза ТХВ9, многократное снижение образования ПЦ^ к концу наблюдения (Р <¿0,001) и достовершя тенденция активации синтеза липоксигеназкых продуктов (•^С-оксикислот).

Таким образом. увеличение времени контакта тромбоцитов 'с эндотоксином приводит к значительному увеличению .синтеза прсагрегантов (Т)32 и х4С-оксикислот) и снижению образования факторов дезагрегации (1ЩЕ2, ПГЕт)-

3 связи с полученными результатами представляло большой интерес исследовать динамику содержания ПГЕТ, а также Ееличин соотношений концентраций цА!.Э/цШФ и ТХЕ^/ПЩ^ _ биологических регуляторов, основные функционально-метаболические характеристики тромбоцитов. Как следует из рис.3, уровни Щ'^ прогрессивно снижаются в зависимости от времени инкубации тромбоцитов с ЛПС. Одновременно с этим наблюдаются и значительные изменения величин соотношений пАЖ/пЕЛ и ТХЬ9/ПГметаболитов '.рис.4).

Существенное значение для характеристики функционально-метаболического состояния тромбоцитов имеет и тест на их резистентность к натиЕкому ПГ1о при ШС-индуцированной агрегации. Тест позволяет; оценить состояние рецепторов к эндогенному автиагрегалпонкому ха::то-ру - простациклину при действии бактериальных эндотоксинов.

На рис.5 представлены результаты проведенных исследований, "й-анализа полученных данных следует, что длительная пккубапия ?г.-мог>-цитое с ЛПС ведет к резкому снижение чувствительности тромйоптпог к натЕВКОлсу ПЛ.- .

Рис. 4. Влияние ЛПС на величины соотношений пДМФ/цШФ и ТХВ2/ПГД2 в тромбоцитах

т

1 - О—О - опыт

2 - Д.—А - КОНТРОЛЬ

-4-

— 24

—+— 27

30

О 3 6 9 12 15 18 21

Рис. 5. Резистентность тр мбоцитов к дезагрегирукгаему действию простациклина в зависимости от времени их инкубации с ЛПС

I

о

Е» б О.

ы т х о

Рис. б. Активность синтеза эйкозэеопдое в нейтрофплах крови е динамике экспозиции их с ШС

Радиохроматографаческле и радиоиммункые .методы исследования были выполнены на нейтрофилах крови (рис.6) и макрофагах перитоне-ального с?,ива крыс (рис.7).

Рис. 7. Влияние ЛПС на активность синтеза эйкозанокдов е перитонеалышх макрофагах

Анализ результатов, представленных на рис. 6 и 7, свидетельствует о том, что в первые Ее минуты экспозиции клеток с эндотоксином происходит значительная стимуляция образования HTEj, б-кето-ПГБ^ сменяющаяся через 2 минуты многократны.! увеличением активности синтеза TXBg и НЕГЕ. На 30-й нинуте экспозиции клеток с ЛПС происходит многократное снижение образования всех типов эйкозаноидов. Аналогичные данные с некоторыми различиями были получены при инкубации ЛИС с нейтрофилами и лимфоцитами веритонеазгьного смыга.

3. Активность синтеза и содержание липоксигеназ-ных метаболитов арахидоновой кислоты у животных с эндотоксиновым шоком

В последнее времл продуктам липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты (лейкотриены - В4, С4, Д4, Е4 и оксикис-лоты - 5-, 12- и 15-НЕГЕ), особенно лейкотриенам, стали придавать Еедушее значение в патогенезе осложнений эндотоксинового шока {C.B. TefiipÔLÎcn, eir.ai) 1987; Уси.^, Ч. Рак/п cïê., 1987 ; ÂJS. Âefez, 1939; Л. kyitLÎie^/¡.l^z^ieâeftt, 1990). Связано это с тем, что, б отличие от.циклооксигеназных продуктов, метаболиты 5-, 12-и 15-липоксигеназ, включая и некоторые лейкотриены, обладают более мощным модулируншм действием на иммунитет, проходимость бронхиального дерева и систему кровообращения. Однако для корректного заключения о роли лидоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты в механизмах развития шока не хватало исследований об активности их синтеза в форменных элементах крови и тканях органов в динамике эндотоксиноеого шока. В данной серии' экспериментов сделана попытка восполнить существующий пробел. Так, на рис.8 представлены результаты по изменению уровней продуктов липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в плазме крови крыс е динамике экспериментального эндотоксинового шока.

0

¿5

а 140 +

1 - о—о - лтэ4

2 - д-а - лтс4

3 - в—п - лтд4

4 - 7-V - 5-неге

5 - ❖-О - 15-нете

0.000 1.000 2.000 3.000 4.000

т. часу

Рис. 8. Содержание липоксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты в плазме кроЕИ крыс е динамике эндотоксинозого шока

Из анализа данных видно, что содержание ЛТВ4 резко увеличивается через 2 часа и достигает своего максимума к 3 часу наблюдения. В то же время, незначительный прирост концентраций ЛТСд и ЛТД4 отмечается е первые 30 минут, после чего начинается их существенное снижение. Этот феномен долго оставался непонятным, пока не появились экспериментальные работы, раскрывающие его суть {J.M,

1989). В этих исследованиях была установлена быстрая элиминация лейкотриенов С^ и Д4 из кровотока и последушее увеличение их метаболитов в содержимом нелчного пузыря.

Интересные результаты были получены при длительной инкубации нейтрофилов крови и перитонеального смыва у крыс с агрегирующими концентрациями ЛПС (рис. 9 А,Б).

Рис.-9 А, Б. Содержание шгаоксигеназных метаболитов ара-хидоновой кислоты в нейтрофилах крови (рис.А} и перитонеального смыва (рис.Б) при длительной инкубации с ШС Установлено, что уке с первых минут инкубации клеток с ЛПС концентрация ЛТВ4 сушественно меняется. Так, на третьей минуте происходит резкий подъем содержания данного метаболита (р< 0,001). Одновременно с этим возрастают и уров-

ни и других типов лейкотриенов (С^ и Д^). Надо отметить, что на фоне активации синтеза лейкотриенов отмечается и значительный подъем различных оксикислот арахидоновой кислоты (5-НЕГЕ и 15-НЕГЕ). Кнг-логичная картина стимуляции липоксигеназного пути метаболизма ара-хидсноеой кислоты наблюдается также е перитонеальных макрофагах и лимфоцитах. При сравнительном анализе этих процессов максимальная активность отмечается у нейтрофилов крови и перитонеального смнЕа.

Анализ активности липоксигеназ (по уровню их продуктов) в органах и тканях крыс с.эндотоксемией свидетельствует о том, что степень их стимуляции, как и последующего ингибирования в разных тканях, неодинакова. Вероятно, этим, скорее всего, и определяется характер тяжести различных патологических синдромов в динамике эн-дотоксинового шока. Обобшая полученные в данной серии экспериментов данные, хочется обратить особое внимание на деэ ключевых положения. Во-первых, совершенно очевидно, что после введения эндотоксина г органах и тканях экспериментальных ~двотных происходит резкая активация ферментов как цикло-, так и липоксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислоты. При этом максимум образования лейкотриенов и оксикислот приходится на П фазу эндотоксинового шока, при которой и наблюдается существенный сдвиг баланса цпкяоок-сигеназных и липоксигеназных метаболитов в сторону.последних. Во-вторых, характер изменения концентраций как цикло-, так и липоксигеназных продуктов в различных органах и тканях отнюдь не одинаков. Повышенный уровень активности синтеза этих метаболитов в так:::-: .органах как сердце, легкие, селезенка, почки, в.слизистой оболочке желудка, 12-персгкой кишки, тонкого кишечника, а.такие клетках крови (тромбоциты, нейтрофияы, макрофаги) проливают, на наш взгляд, свет на роль указанных систем в организме в развитии эндотоксин-: -еого шока.

4. Влияние ЛПС на активность ПОЛ, ферментов клеточкой задпты, фосфокипидного обмена и содеркание цктохрома Р-450 в органах и тканях кивотных в динамке эндотоксинового шока

Многочисленные публикации последних лет свидетельствуют, что чрезмерная интенсификация СЕободнорадикаяьных реакций с последующей активацией процессов ПОЛ вызывает образование переписных радикалоЕ и гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот, а такве широкого спектра токсических метаболитов типа альдегидоЕ, нетонов и др., которые.приводят к повреждению клетки за счет: набухания митохондрий, разобщения окислительного фосфорилироЕания, повышения активности гоосфодиэстераз, падения уровня цАЫФ, повышения содержания цитодлазматического Са2т; повреждения ^Н-групп.и инактивации глутатионзавпсимых ферментов и цитохрома Р-450; окисления и полимеризации внутриклеточных компонентов.и макромолекул до сульфокоЕ, не способных реактивироваться; дезинтеграции мембраны вплоть до ее разрыва и гибели клетки {Е.С. Ив^ея ^ 1983; £пи ¿i 19Э0). По нашим данным, наиболее значительное повышение активности ПОЛ происходит в печени (в 17,05 раза, р< 0,001), в легких - в 10,5 раза (р < 0,001); в мозговом веществе почки

- в 8,02 раза (р< 0,001); в слизистой, оболочке тонкой кишки

- в 2,4 раза (р<0,01) и др.

Сопоставление уровней липопероксидов е разных органах в тканях свидетельствует о том, что имеются определенные различия как по-наступлению максимума актиЕности ПОЛ, так и по характеру ее динамики при эндотоксемии. Исходя из этого, можно говорить, что процессы повреждения в органах и тканях наступают не одновременно..

Для выяснения широты спектра псврендаюшего действия эндотоксинов на клетки-мишени была исследована активность ПСЛ в суспензиях отмытых тромбоцитов и нейтрофилов крови при инкубации их с агрегирупдпми дозами ЛПС. Результаты исследования показали, что интенсивность ПОЛ. ео всех изучаемых клетках во иного:.: зависит от времени экспозиции их с эндотоксином.

Особый интерес представляет данные о содержании лкпоперок-спдое в клетках из перитонеального смыЕа крыс. Полученные нами результаты со все:: очевидностью свидетельствует о том, что в первые минуты самый высокий уровень яипопероксидов регистрируется в макрофагах и в меньшей степени - в лимфоцитах. К концу наблюдения уровень активности ПОЛ практически ЕыравниЕается ео Есех клетках. Выявленная дина:гака колебаний в содержании липопероксидов, по все." вероятности, отражает состояние систем затп-ты клеток.

Одним из малоизученных вопросов является действие ЛПС на фосфолнпиднкй обмен в клетке. 3 этой связи мы инкубировали последние с различными концентрация!«! эндотоксина, а затем проводили экстракцию фосфолипидов и анализ их фракций методами тонкослойной радиохроматографии.

тл

В первые минуты инкубации с токсином и "С-арахидоновой

кислотой отмечается обная для всех исследуемых клеток тент £

летая - рост включения х ^-арахидонсвой кислоты ео все фракции фсофолипидов, включая и триглнцеридщ. В дальнейшем пропс-_ ходит значительный подъем синтеза лизоформ фосфолипидов. Самыми показательны;.® в этом отношении клетка™ оказались кейт-рофилы крсЕИ, и в меньшей степени - макрофаги перитонеального смыва.

Исследуя обратное явление, т.е. Елиянзе ЛПС на процессы деацилнровакия .разных фракций фосфолипидоЕ в тех не клетках, предварительно помеченных 14С-арахидоноЕой кислотой, было ус-таноЕленно, что во всех клетках с разной активностью идет де-ацилпрование важнейших фракций фосфолипидов, играю'дих ключевую роль б их функционально-метаболическом статусе (фосфатидк-

Т А

линозитол и фосфатидилхолин) и выход С-арахидоновой кислоты из триглицеридного пула.

Кратко обобщая полученные данные этой серии экспериментов, моано сказать, что при воздействии эндотоксина обнаружены существенные сдвиги в обмене фосфолипидов исследуемых клеток. Были установлены более ранние и значительные изменения в образовании лизоформ вакне;ншх фосфолипидов в медуллярном слое ■почек к изучаемых популяциях клеток (тромбоциты, нейтрофияы, перптонеапъные макрофаги). Рост синтеза этих .ракцпй моч:ет косвенно свидетельствовать и об активации фосфолппаз клетки, обуславливающих дальнейшее поЕрендение их мембран.

Анализ полученных результатов приводит к предиолонению, что нарушение обмена фосфолипидоЕ является одним из существенных механизмов токсического действия эндотоксина.

Для уточнения механизмов шеренватего действия ЛПС был:: проведены исследования по влиянию их на уровни и активность защитных факторов клетки. С этой целью проанализировано содержание цигохрома Р-450 и активность эпоксидгидратазы в основных органах детоксикации (печень, пошей). Анализ получек— кых результатов свидетельствует, что максимумы снижения концентраций цигохрома Р-450 в печени и почках происходя? в одни л те не временные интервалы наблюдения. Боли содержание щ:то-

хрома Р-450 е исследуемых органах начинает падать уже в пер-Еые часы (через 3 часа) после введения эндотоксина, то активность цитозольной эпокспдгидратазы как в печени, так и почках достоверно снижается только через 6 часов. Этот факт свидетельствует о том, что система цитохрома Р-450 является одной из главных точек приложения поЕрендашего действия ЛИС.

Особое место в характеристике систем залиты клеток занимает фермент суперокскддисмутаза (СОД). Результаты измерений активности СОД в гомогенатах печени, коркового и медуллярно- • папиллярного слоен почек, надпочечника, легких, сердца, стенки сосудов, слизистой желудка, 12-перстной и -тонкой кишки, селезенки и тимуса у крыс в динамике экдотоксикового шока свидетельствуют о том, что.активность ее от органа к органу колеблется. Быстрее всего происходит снижение активности СОД в печени, затем в медуллярно-папиллярном слое почек. Практически нет достоверного снижения активности фермента в структурах мозга. Падение активности СОД в органах колеблется от 2,46 до 8,9 раза (р<0,01 и Р <0,001) относительно контрольной группы жиеотных. Выявляется высокая степень обратной корреляции между активностью ПОД и СОД. Достоверная прямая корреляция наблюдается и между содержанием цитохрома Р-450. активностью эпоксидгидрагазы и СОД (р<С,0и1).

Для более полной характеристики сдвигов в уроЕНях защитных факторов клетки были проведены измерения содержания глу-татиона и активности глутатионзависимкх сЬерментоЕ в тех же тканях е динамике эндотоксиноеого шока. Анализ полученных результатов свидетельствует, что наиболее резкие сдвиги и в более ранние сроки развития шока наолюпаются в печени и кг-:-

колько поз>:;е - в других органах п тканях. Измерения активности глутатпонзависпмых ферментов выявляют два, на наг; взгляд, момента: во-первых, наиболее значительное падение активности ферментов в дикарке шона е почек:; во-Еторых, на::-большую резистентность к действию эндотоксина со стороны глу-татпонпероксидазы. Аналогичные результаты ранее на друп:::

объектах были получены ¿'. ^fi^aJW^kJ. aJL (1381).

й * $ í.jeHee стойки:.: оказался уермент глутатион-А-трансуераза {L.6e/i¿.

387). Сопоставительный анализ активности СОД с системой глутатиона выявляет высокую степень прямой корреляции с глу-татпонпероксидазой (2= 0,8S, р < 0,001), глутатпон-^-трако-йеразой (£.= 0,68, р <0,001), глутатпоиредуктазой (t=G,77, р < 0,001) и концентрацией восстановленного глутатиона ÍZ = 0,83, р <Т 0,001) и обратную корреляционную связь с содергани-ем оделенного глутатиона (Z = 0,65, р < 0,01).

Такп:.: образом, полученные результаты дают основание считать, что е качестве ктптерня состояния систем защиты и пов-регдения тканей и клеток моею использовать определение активности супероксиддис:.!утазы.

Намерение активности "СОД и глутатионзавпеимн:: ферментов (глутатионпероксидазы, глутатпон-^-трансперазы) было проведено в тромбохртах-и нейтрооплах крови-кроликов, подвергнуты:: воздействию эндотоксина. Анализ полученный данный свидетельствует, что активность ферментов для большинства исследованных клеток начинает суиественно изменяться к 18-24 часа:.: после введения эндотоксина. Причем характер эти:: сдвигов близок к тем, которые .ваблндались в органах.

Большой интерес представляет серия экспериментов, выполненная на клетках перптовеального смыва в дина—ке эндстокси-

нового пока (нейтрофилы, лимфоциты, макрофаги). Результат!: исследований на здороЕой группе :^:еотньт: свидетельствуют о над больней активности Есех трех ферментов в макрофагах относительно дцутях клеток. Эти данные позволяют думать об основной роли макрофагов в детоксикацни различных интермедкатсв, в том числе и эндотоксинов бактерий'. Tai-:, в макрофагах получек-нне результаты свидетельствуют о значительном поЕЫшекпг активности глутатпокпероксидазы, особенно через 6 часов после введения токсина (в 8,7? раза выпе исходного уроЕня, р£ С,CCI). Параллельно с измерением д::намнкн активности глутдт::онперок-сидазы определяли и активность СОД. ПроЕеденгый анализ свидетельствует о резком повышении активности фермента через 3 часа после введения ШС (в 14,3 раза выше исходных уровней, р <C,GGI). Однако через. 18 часов наблюдается более чем двухкратное ыппг-екпе активности фермента относительно группы контрольны:: гдвотнн::.

Измерение активности глутатпок- ^-трансйеразн показывает значительный подьем ее в макрофага:; через 12 часов после введения эндотоксина (в 11,3 раза относительно контрольны:-: значений, р С С,CCI). Высокий уровень активности фермента отмечается к на 36 часу наблюдения (в 1,9 раза выпе, чем в контрольной группе, р С 0,01).

Taj;:M обрлзом, при анализе дикампт активностей тре:: ферментов е пе_лтонеалыш;: макроуага:: в первые сутки после ïiHbejxtrii; детальны: доз эндотоксина Еыявлено значительное повышение активности глутатпокпероксидазы, СОД л глутатпок-^ -траксферезп. Интересно отмстить, что наблюдается прямая корреляция (Z = 0,76) метду ростом акпшностн псследуеж: фер-

ментов в макрофагах и изменением количества лейкоцитов в сторону ех повышения на шпсе активности 3-х ферментов (р<0,С1). 5т:: факты дают основание предполагать, что при стимуляции данный ферментов, по-видимому, повышается и способность макрофагов обезвреживать бактериальные эндотоксины, а, следовательно, снижается вероятность дальнейшей агрегации лейкоцитоз, циркулирующая эндотоксинами пли их "обломками".

Анализ данных активности изучаемы:; ферментов е течение первых и последуюсрхх суток наблюдения говорит о то:,:, что до-еольно значительное снижение их фунгодгс одновременно (до 1С часов) отмечается у СОД п глутатион-,?-трансферазы и существенно позяе - у глутатпонлероксидазы (после 18 часов). Максимумы падения активности изучает: Ферментов, но е разной степени, отмечаются через 48 часоь после введения летальных доз эндотоксина. Этот факт могво лредполозлттельно объяснить накоплением токсических интермедиатоЕ в клетках, обусловленным активацией свободнорадпкальных процессов.

для подтверждения этого предположения был проведен сравнительный анализ содержания лгшоперокспдоЕ в перитонеальны;: макрофагах в динамике ендотокспноеого coica и активности данной группы ферментов. Из этого сопоставления следует, что максимум концентрации: липопереклсей происходит е период супе-ственного снижения актпЕностп Ферментов детокспкации, особенно глутатионперокспдазы. Отмечается таю:;е i: высокая степень корреляции ыеаду ростом липоперекисей и активностью этого фермента (2 = 0,88, р < 0,001).

Аналогичные корреляции были установлены мезду ростом ли-поиероксидов, скпг.екпем активности глутатионзависпмы:: фермен-

тов и повышением уровней окисленного глутатиона ( Г5£Г). Ьти факты свидетельствуют о разной степени чувствительности активности ферментов к возрастгпцлк концентрация;™' липспер^сисей в клетке. Наряду с ростом содержания Г55 Г било усталовдеко и падение уровней восстановленного глутатиона (Г,? II).

Анализ получению: результатов дает основание считать, что введение эндотоксина глвотнкм приводит к глубокому карзг-пению липидного обмена через интенсификацию свободнорадикаль-шг.: реакций и активности ферментов метаболического каскада арахидоновоп кислоты. Следствием эти:-: процессов является сдвиг баланса зацптных и поврегдашп: факторов в клетке в сторону последних.

Б свете вкпеизлог.енного особую актуальность приобретает поиск новых методов лечения экдотоксинового пока.

5. НоЕые подходы к фармакотерапии

экспериментального эндотоксинового псг.с

Современные подходы к фармакотерапии эндотоксинового сока базируются на широком использовании препаратов, регулирующих синтез продуктов араиидонового каскада.

Так е^е в начале 80-х годов было показано, что введение лЗвотеым ингибитора цпклоокспгеназы пбупрофека приводит к значительному снижению летальности их от эндотоксинового 'иска, вызванного внутрибрюшинной инъекцией эндотоксина

574). Аналогичные данные были получены и в отношении специфичесзспх блокаторов тромбоксанспктетазк (:::и> дазол, 7-1НА, дазоксибен, 0КУ-1581 и др.) (1М- ал^.Л. 1984).

К сожалению, указанные препараты не всегда дает ожидаемые результаты., поскольку они, во-первн>:, тормозят, наряде с тромбоксансинтетазои, и синтез простациклипа, необходимого для поддержания сосудисто-тромбоцнтаряого гемостаза,на стационарном уровне, во-вторых, способствуют интенсивно:.— накоплению цпююоксигеназккх экдоперекисеп, усиливался;: агзегсциог-нуэ способность тромбоцитов ц вазоконстрикцию; в-третьих, не влияют на активность образования липоксигеназныи метаболитов аранндоноЕого каскада и, наконец, в-четвертых, не предотвраса-ют накопления в органах-гяшекях продуктов СЕободно-ргдп^сль-кого окисления лшщдов. .

Поиск более вадеглш; средств Фармакотерапии эндотокенно-еого пока побзтепл нас использовать новые подходы, основанные на преимущественной блокаде синтеза продуктов 5-лнпоксгтеказы и свободнорадюкалъного окисления ллпидое при сохранении активности циклоокситеназц клеток эндотелия сосудов.

С этой целью наие внимание привлекли 2 группы препаратов - 3-гпдроксиппрпдпнового и гндронлорид.ЗЦ/К, /И )-дцметил-1сарбамоилоксп)-2-эт1:л-6-метпдьш;рпдц:кового рядоЕ, показавшие в предварительных исследованиях (А.А.Кубатиев, Б.Д.Помойнец-кий и др., 1586-1991) гг.) внрекевнн^ протпвоагрегационнып эффект на тромбодптах и псо!иморГюную:еарЕы:: лейкоцита::.

Опыты, проведенные нами в условия:: ин витро, СЕидеталь-стЕуют, что большинство испытываемых препаратов (ГБ-212, АСК-6, СКА-4) в исследованных популяция?: клеток значительно подазляпт синтез а^, лсй:итриеков (В^, С4, Дд), поеыпвот содержание простациклина, ПГЗр и ГЗ Н, существенно еос-станавЕГЕаэт активкость СОД, глутатиокзавп&хмкх ферментов и

др., а также ингпбируют образование продуктов ПОЛ (лшоперок-сидов и ТЕХ-активных соединений).

Интересные результаты были получены и по действии АС1С-3 и ГБ-212 на фосболшицщый обмен в тех г.е популяциям клеток. Так, било установлено, что ГБ-212 в большей степени, че:.: АСК-6, Елпяет на нормализацию баланса активностей дерментов азд:-лирования и деацилирования арахлдоновои кислоты в разню: фракциях фосфолипидов тромбоцитов, нейтройилов, макрофагов и лимфоцитов. '

Применяя указанные препараты на модели эндотоксикового' пока пн впво установили, что данные соединения, в отличие от ранее используемы,: при терапии экспериментального эядоток-синоеого пока, способны предотвращать летальность квотных

(табл.1, рис.10).

Наиболее эффективны:.;:: из них оказались ГБ-212 (55^), затем АСК-6 (75^) и С1СА—4 (54£). Результаты действия изучаемы:: препаратов на АД свидетельствуют, что наиболее эффективно нормализует систолическое АД в динамике сока ГБ-212.

Б связи с полученными данными закономерно Естает вопрос о механизмах действия ново': группы лекарственных соединений (АСК-6, ГЕ-212) е условиях ин виво. Анализ полученных результатов свидетельствует, что оба препарата, особенно ГБ-212, значительно сникает содержание ТХ^, лейкотрпенов (В^, С^, сеободних нуклеотидов и липопероксидов в щювотоке, повышают а!:тивность СОД, глутатпонзавпсимых ферментов, уровшг проста-цпклпка, ПГSJ, Г£К и цАШ в органах и тканях. Необходит:о отметить и существенную нормализацию содержания цитохрома

Таблица I

Влияние природных и синтетических антиоксидантов на детальность мышей в динамике экдотокспнового пока

: Летальность zziвотиых (число з'ме-оших/числс Используем. : взятых в опыт. наблюдение в час.)

* " : 6 : 12 : 24 : 4б : 72

Контрольная :22/50 тоушха : 442 :31/50 :: 622 -.48/50 : S82 : 50/5С : 1002 : :

«¿-токоперол 21/50 (100 мг/кг) (422) + I час 27/50 (542) . 43/50 (862) 48/50 (S62) -

СКА-4 (50 ыг/ 5/50 ' кг)+ I час (102) 8/5С (162) IS/5C (382) 23/50 (462) 24/5С (4S2)

+ 3 часа IC/50 (203) 16/50 ' (322) 23/50 (462) 30/50 (602) 30/50 (602)

+ 5 часов 12/50 (252) 20/50 (422) 30/50 (602) 34/50 (682) 39/5С (782)

АСК-6 (50 мг/ 3/50 кг)+ I час (52) 4/50 (82) 5,/ оО (Ю2) 5/50 U02) 6/5С ' (122)

+ 3 часа 5/50 (105) 8/50 (152) 12/50 (25S) 13/50 (262) 13/50 (262)

+ 5 часов 8/50' (162) 12/50 (242) 20/50 (402) 25/50 (5G2) 26/50 (522)

ГБ-212 (30 мг/ 0/50 кг) + I час (GS) 1/50 (22) 2/50 (42) 3/50 (62) 3/5G (62)

+ 3 часа 3/50 (62) .4/50 (82) 5/50 (102) 5/50 (102) 5/50 (102)

+ 5 часоЕ 4/50 (82) 8/50 (162) 10/50 ' (202) 15/50 (302) 17/50 (342)

Р-450 и активности эпокспдгидратазы в печени и почках - основ нын органах детоксикацип различны:: ксенобиотиков в организме человека и глвотны;: (Арчаков А.И., IS75).

Сравнительный анализ полученных результатов исследований Z условиях ин витро и ин виво свидетельствует, что новая труппа препаратов влияет на ваглеишие механизмы регуляции метабо-

лических реакщгй в клетке.

Рис.10. Влияние препаратов с разными .мехавнзи&ми

действия на процент летальности гзйотных'

в динамике эндотокснноеого пока

Рис.II. действие АСК-6 и ГБ-212 на систолическое АД на фоне ЛПС

Интересные данные были получены на фоне введения вксоккх доз витамина 3 (50-10С иг/кг массы ¡юпзотного). В настоящее время считается, что основная роль -токоферола сводится к антпоглслнтельной защите селена п акцептирования синглетного кислорода. Для проверки этого полоаекпя ливогным вводели ссче-

такие меченого «¿-токоферола и ГБ-212 через 5 часоЕ после инъекции эндотоксина.

Анализ полученный результатов свидетельствует, что динамика изменения общего содер-.:алпя cl-токоферола в субклеточных фракциях печени экспериментальной группы миле:'; существен-ко отличается от таковой, наблюдаемой у интактннх жпеотнып. Так, общее содержание %-сС-токоферола е печени мышей с экдо-токсикоеым шоком резко снижается и через 18 часов составляет 17,63 от уровня контрольны:: значение (р £ О,CCI). Отмечается выраженная тенденция повышения его содержания у животных, оставшийся е живых через 48 часов после введения ЛИС. В плазме кроЕи происходит значительное снижение ¿¡(.-токоферола в первые же часы после введения МС, особенно резко через 15 мин. после инъекции эндотоксина. Через 20 часов наблюдается значи-

о

тельный подъем Н-Д.-токоферола в плазме кров:: (в 2,46 раза, р ¿0,01). В последующие сроки наблюдения вновь отмечается снижение концентрации <L -токоферола (к 48 часам) значительно ниже, чем у контрольной группы. Особенности изменений уровней о1-токоферола у жпеотных с эндотоксемпей, вероятно, связаны с мобилизацией его из других тканей и выбросом в кровоток.

Сравнительный анализ кинетик выведения ^Н-оС-токоферола из субклеточны:: фракций с динамикой его содержания в плазме крови приводит к предположен:®, что ГБ-212 каким-то образом задерживает процессы мобилизации «¿.-токоферола из мембран клеток печеш: и кровотока. Полученные данные, вероятно, можно объяснить стабилизирующим действие:.: ГБ-212 на клеточную мембрану как за счет ингибирования цекло- и лппоксигеназного путей метаболизм аразищоновой кислоты, Taie и существенного по-

поареждение мемБРАН

повреждение ■ лизосом

ингиБирозлние сьевиентов

[ГСН-Злвисимые"] аюрментыидр]

МеТАБОЛИЗМ

токсичность

| пнжк о;

2

чПНЩН

СООССООЛИПИДЬ! мемБРАН

\|азоса)ОлипАЗы(А,ф

пнжк

\ АРАХИДОЮйАЯ К-ТА| | И ДР 1

ПРОницАемэсть КАПИЛЛЯРОВ

цистеиновье

ОСТАТКИ . 16

глутешон^

}липоксигендзы

Л

&ПНЖК(Ж

циклооксигендзА

V

циклические энлоперекиси

' 5-пнжк а^н

лейксгриены

ПГН,

т4(дтс4/лтд4/тЕ,

'и К 1 \ ^

*/ I 1\\

МеТАБОАИЗМ / I V V / а 1 >

ингиБирозАние

' тей^есть----" » ' •...............

I ф \Л'£«БРАНЫ

ссер/лентов ( рЛ,, \

Гглут-Злвисимые] / ГПК \

<рермекты ] I ' *

ДНК

АТР ЦГМР

\

-V

ТУБ1.ЛИН

регуляция аэерментов

регуляция соерментов

--¡г

клеточное деление

амзиалогические эазсоекты

Рис. 12. Механизмы иоврекдаших действий ЛПС на ключевые реакции метаболизма в клетке и пути их фармако-коррекции (гипотеза)

давления сЕободЕорадхкальных реак^и;: и, по-видимому, такме и активности C0C;:0.~:na3i: ¿2- '-зьестнс, что данный фермент запускает iscкад p££;-™.и, Еедуспх к дестабилизации лип::дкого слоя мембранк и высвобождению ¿l-токоферола {И.^. Yah (id, 1£:7; /lL-£h. I*'"-, I9SG).

На основании обобщения собственного с ко перхм е :-:т ел; ног о материала и данных мировой литературы, на рис.12 приводим гипотетическую схе::у механизмов noEper^cicrn: ЕогдейстЕий .'ПС на метаболизм глет:с; и пути их фармакокорре;пдп.

Теки:.: образо:.:, анализ всех фа;~0Е приводит к за1".пче:-п.-:, что для коррекции дунхпхонЕЛько-метгбсдхческхх нарушений в органах и тканях, а также проф::ла1'.тп:с: и лечение основных ос-ломкенпй в динамике экспериментального зядото::с::ноьсго пока необходимо использовать новые группы препаратов 3-о::с:пг:р::.г:-нового (ЛСК-6) и. гидро>1Лорнд,3-(Л/,Л/--д::мг;?::л^.арб£.,.:о:1.-скс::;-2-эт;:л-6-мет1:л-пкрид:-:кового (ГБ-212) рядои, облсдазх.-::: поливалентным механизмом действия.

выводи

I. Экспериментальный гидотоксиновый сок, вызванный внутривенной инъекцией exbotkum (хролшгам, ::рысам, мытам) сублетальных доз ШС X характеризуется существенными сдв:;га:.з; в соотношении синтеза метаболитов арахидско-еого каскада одновременно с изменением интенсивности СЕобод-норадпкального окисления липидое и нарушеш:ем активности ан-тнокислптельных ферментов е клетках крови (тромбоцита::, пол::-морфонуг-леарнкх лейкоцита::, макрофагах п лимфоцитах), а также в тканях головного мозга, тимуса, сердца, легких, печени, почек, i-исечника, селезенки, стенки сосудов, надпочечников :: половых желез.

¡¿тачеЕой особенностью нарушения синтеза продуктов арг::::-доноеого каскада является уЕелпче;п;е уровней метаболитоЕ с

поърезд&з&и характером действия (ТХВ?, 1Ш?2<<. . ле1д:отр::епог Зд. Сл, и оксикислот).

2. Развитие экспериментального гндстокскновсго пока сопровождается выраженной органо- и тканевой специфичностью влияния ШС на исследуемые показатели. При этом наблюдается:

- е печек:, в отличие от других органов, в первые п;ут:: и часы после введекия эндотоксина резкое снижение синтеза все:: типов циклооксигеназных метаболитов и более позднее -запттис: факторов (содержание гдто::рома Р-450, Г^Н, сС-токоферола, активности глутатионзавпси.мис ферментов, эпокспдгидра-тазы :: СОД);

- в тромбоцита::, по сргвксппг: с другими клетками, значительное увеличение содержания ТХЗд, снинение ШЗ^» восстановленного глутатиона, пА1Л0, активности СОД, глутатионзаЕпс-:;-;:: Ферментов и псдьем скорости включения 14С-ара:и:доко2ой кислоты во уракцпп лдзоГозг фосфолипидов;

- в кейтрофилах, относительно других клеток, мкогскрет-ное повышение концентраций лейкотриенов, особенно Зл, а тайме 5-, 12- и 15-НЗГЗ, увеличение синтеза фракций лизофосфат::-дидкнозытола и лпзсфосфатидылколнна.

3. Динамика п характер биохимических сдеьтое в органа::

:: тканях тесно коррелирует с фазами течения экспериментального эндотоксинового пока. Так, е I фазе пока Е кровотоке :: большинстве исследуемы:: органов и тканей преобладает образование цпклоокспгеиазных метаболитов арагпщоковой 1":слот:: (ПГВо, ШТр^ . ТСЗ2 и ДР.) над лппокскгеназгаг.г (лейкстриек/ Вд, Сл, Д4; 5-, 12- и 15-НЕТЕ), а во П - сдвиг в сторож последки::. Исключение составляет печень, где в первые г.:е ::::;:у1ы погл происходит резкое угнетение синтеза все:: типог иг::"0с:-сигеназкы:: метаболитов арагпхдоновой кислоты и повышение урс?-пей лппокскгеиазны:: (окспкиелоты). П Саза экдото::с:::-:оеого гг-ка характеризуется более Еыраженной активацией ПОД во 2С€.:: органа:: и тканях, корраллрукгф: с падением уровней акт::::::ост:: заштныг. факторов в клетке (содержание цктсдрома Р—15С, Г¿> ~:1, оС-токоферола в субклеточюп: структура:: клетки, ахтмркост:: глутатионзависк.'.-ыи ферментов, ССД, эпоксидгпдрстгзз*}.

4. Результата проведении: ксследог-снп!; свидетельств:":-:1,

что гемодинамическпе сдают у животных с экспериментальным экдотокскновш шоком прямо коррелирует с изменением уровней простацпклпиа и степень}: резистентности тромбоцитов к дезагрегирующее действию еысоких концентрации этого метаболита в , плазме крови в динамике шока.

5. Для коррекции функционально-метаболически: нарушений е органа:-: и тканях, а также профилактики и лечения основных осложнен:::; в динамике экспериментального эндотоксинового пока необходимо использовать новые группы препаратов 2-оксигсфидп-нового (АСК-6) к гидрохлорид,3-(/У,// -дпметплкарбамоилоксн )-2-эт:-л-6-мет1Ш-пир:дпнового рядов (ГБ-212), обладающих поливалентным .механизмом действия, поскольку они:

- нормализуют активность ферментов метаболического таскала арахддоновон кислоты ::н виво и нн Еитро;

- снижают резистентность тромбоцитов, обработанных агрегирующая до за',с эндотоксина, к простацнгаину;

- значительно подавляют активность ПОЛ г. образованию лизоформ фосфолипидоЕ в мембранных структурам: клетки;

- повышают уровень защитны:: факторов е органах и таетка::-мипенях;

- существенно предотвращают нгсод «I -токоферола из .мембран субклеточны:: образований печен:: (гпалоплазма, митохондр::::, микросомы) и подъем его уровней в плазме крови;

- данная груша лекарственны:: соединений, в отличие от всех известных противошоковых средств, нормализует артериальное давление п резко снижает процент летальности хсшотши: даже через несколько часов после развития экспериментального эндо-токсиноеого шока (черзз I, 3 и 5 часов). -

практические ржоиенеац:ш*

I. Для предупреждения артефактов при анализе продуктов метаболического каскада аргхидоновой кислоты и ПОЛ в биологп-ческом материале необходимо строго соблюдать следующие условия:

- отбор крови осуществлять не только с добавлением антн-коагулянтов, но и ингибиторов активности цнклоокспгеназы и 5-липоксигеназн; •

- плазму крови фиксировать двумя объемами абсолютного

этанола, что позволяет длительно хранить про Си при менее пискни температура::;

- образцы тканей у мивотныи в условиях эксперимента еле-дует отбирать при глубокой анестезии с последующе:: Скисание:: их з жидком азоте и :граненпе.\: при -4С°С, идеально :::е - б дъ варе с зцдкпк азотом;- для хорошего разделения продуктов циклооксигеказнсго пути метаболизма арахидоковой кислоты :.:етода-дх тонкослойной рад:о::ро:.:атограуии необходимо предварительное насыщение иро-матограОической камера парами элпируюцей с:.:еси растворителе::.

2. Для получения объективной картины сдвигов в концентрация:-: и соотношения:: метаболитов аранидоновой кислоты , о-кето-niTj . , лейкотрпенов и др.) , циклических нуклеотидог-(цА-"-;3, цП_з) :: активности изучаемых ферментов при действии ОС ин витро необходимо отбирать бисобразцы, начиная с секундный интервалов, ин впео не - с первый :и:нут после введения эндотоксина.

3. При оценке степени тяжести течения эндотоксинового шока :: эффективности патогенетической терапии как в клинике, та:-: и в эксперименте, необход:::.: анализ содержания свободный нуг-хеотидов в цельной крови.' Предлагаемый критерий дает объективное представление о гипоксии и гсшоксегпп: органов и тканей, вызываемый нарушением :,и::-фоцир:-уляци::.

4. для диагностики функционально-метаболического состоя-нпя тромбоцитов при шоке, а также оценки эффективности подбираемой Сармата терапии ДВС-синдрома в клинике и эксперименте, можно использовать тест, характеризующий пзмене:п:е резистентности тромбссттов в богатой тромбоцитами плазме к дезагреги-рующп- концентрациям простациклика.

5. Полученные результаты дают основание рекомендовать новые группы препаратов с поливалентным .механизмом действия (ACK-S и ГБ-212) для широкого клинического испытания при лечении септически:: состояний и токспкоинОекцнснкого шока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TSffi ДИССЕРТАЦИИ

1. Оп Ни cx>tttlcJ:iO(^ bl j>tcitaglü.nííihS om¿ сус-кс mtitokdex иг tía. cUmtmUí bfíhx ufított ifiU -Upd

/ JS. JtnJuvM, Л. tyiidM, lí. pcwWÜKy ¿

¿XVJ. Ci'^Jolí^U tyU*: JW en. P?cda¿&*-

2. CWa-гоб E.I. ?otnoptU^ íí.2>.,

§encus pc£Ía¡jknilm CU-A a¡Lfta.t¿on, to fZezüuit Weiéoad. ¡ÍMh

vm HfcM CcntMsi t:f ъг-чо- mi - p. m.

3. HetüiX aÁi-pi^tLon, i,с adíe ¡>2USuM. O^cU-.a m

ttiih inóolMut d -en¿o§epcus poítaieaJicLm./EJ.ttwoir,

tr.b. rmoytíisy, kíhty lt*¿//tec. JL. - P.Jor-ЛЯ.

4. НоЕие аспекты в развитии i: стандартизации метода определения простагландинов в биологически; гздкостях и тканях/ Б.Д.Помойнецкий, А.А.Некрасова, В.А.Косых, Г.А.Гачаряк // Бопр. мед.химии. - 1979. - Г; 5. - С.636-642.

5. Молекулярные основк сократимости миокарда к ее регуляции / и. К.Алиев, Д.0.Левицкий, В.А.Сакс, Б.Д.ПомойнецЕпй // Балл. БГОЩ AI.H СССР. - IS7S. - .0 2. - С.7-21.

6. Особенности биосинтеза и метаболизма иростагландггноЕ в тонкой летке крыс при действии холерного антеротокенна /

С.В.Золотухин, К.Б.Павельский, Б.Д.Помойнецкий и др. // Балл, эксп.биол. и мед. - 1979. - И 8. - С.37-39. -

7. Простагландины и циклические нуклеотцды как возможные регуляторы адаптивных реакций сердца к острой и хронической перех^узке давлением / В.Д.Помойнецкий, Н.Г.Гелинг, А.А.Некрасова и др. // Метаболизм миокарда. Материалы Советско-Американского симп. - М. - 1981. - С.198-210.

8. Помойнецкий В.Д. Простагландины к сердце // Тер.Архив. - 1930. - 6. - C.I4I-I46.

S. Помойнецкий В.Д., Кретв В.А., Кладухнна Л.С. Перекис-ное оп-.сленпе липидое л состояшге ферментных систем детоксп-кгции перекисей в слизистой тонкого кипечнпка при воздействии.

холерного л салкганеллезЕого токсинов // Л1 Всесопзк.конО. по химии органически: пероксидоз. Тез .докл. - Волгоград. - 1980.

- С.179.

10. Использование 4-{Ьо:.;1еткл-7-:ле?оксйп^?:арина для количественного снастза простаглапдтпгов / СЛ.Ллепсеев, В.Д.По-мойнецгс:::, П.К.Сарычеиа-, Р.П.Евстигнеева // Хим.-Сарм. ::урнал.

- 1931. - II. - C.II5-IIE.

11. Влияние гиперокслп на акпзность супероксиддпсмутазы, глутатпонперскспдазы в тканяи :.г«пэй / В.Е.Ханппн, Д.В.Вавдаг.вв, А.К.Тихадзе, В.Д.Помойнецкий :: др. // ;,АН СССР. - 1981. 1.295. -.0 1.- С. 229-231.

12. Помойнецкий В.Д., IIcr-cpoEciciíi В.П., ¡.'алеев В.В. Влияние некоторых препаратов на активность ферментный_систем в органа:: и тглнях при эндотокскновом шоке // Сб. Тез. докл. П Всероссийского съезда пгОекционлстов. - Кемерово, 1983.-С.97-93.

13. Синтез и метаболизм простагландинов в подвздопнои кпоке кркс в дннаг.гике развития опдотоксппового пока / В.Д.По-мойкещ::::, С.В.Золоту::::;-, Л.С.Кладунина, С.А.Д^авадов.// Сб. Тез. докл. П Всероссийского сьезда инфекционистов. - Кемерово, 1983. - С.98-99.

14. Покровский В.!!., Помойнецкий В. д., ¡.'алеев В.В. Роль простаглапдиков, простациклина, тромбоксапа А^ и ферментных систем зсдотн клетки в механизмах развития экдотоксиноиого сока // Тез. докл. П Всероссийского сьезда пнфеквронпстов. -Кемерово, 1983. - с.99-100.

15. Помойнецкий В.д., Золотухин C.B., Кладупнна JLC. Влияние сублеташшх доз токсина Енгеллн Сшексвера и различны:: фармпрепаратов на активность тргхспортвк: АТЗаз слизистой подвздошной larcas: крыс // Тез. докл. П Всероссийского съезда тгОепдгонистоз. - Кемерово, 1983. - C.I0C-IGI.

16. Злуорометрическнй метод анализа простаглслдпнов и яирш:: кпслот в биологически:: объекта:: / В.Д.Помопнецклй,

С..'.i. Алексеев, C.B.Золотухин :: др. // Тез. докл. 17 Всесоes п. симп. по биохимии липидов. - ib:ев, 1983. - С.88-89.

17. 4-броммет:1Л-7,8-бензокумарпн - реагент .для количественного Олуоромзтрического анализа :пгрных кислот и простагл-п-динов / С.;.:.Алексеев, C.B.Золотухин, В.Д.Помойнецкий и др. // :й:м.-уарм.мурнал. - 1933. - Jî 5. - С.619-623.

18. Способ диагностики скрытых некротических ослопзеш:;; у больных с травмакгаескцмя повреждениями / И.й.Бквк, IC.II. Наумов, 3.1Л.Девэт:енскп£, В.Д.Домойнецкий и др. // Лвт.свпд.

1038483 от 10 дня 1983 г.

IS. Зйендпев A.Î.Î.O., ПокоЕнецквй В.Д. '."етодкчесп:е ука-заш:я к количественному анализу лростагландпков, тромбоксана, простацпклпка и апккгееоипс нуаяеогцдов в биологических «пакостях п.тканях // Шгод.рекомендаыгл:. - Bai"/, lio АзССР. -1984. - 42 с.

20. Применение высокоэООектгвно!: ггдаос?ноЛ хромлтогрг-йпи мвтхлбензкумаринови:; эфпров простагландпнов для in: количественного йдуоролетрггческого анализа / C.B.Золотухин, С..'Л. Алексеев, Н.Е.Кучеренко, В.Д.Помойкецюш и др. // Укр.бнохим. щурн. - 1984. - Т.56. - 2. - C.I7I-I75.

21. Помойнецзагй В.Д., Титов В.В., Эйендиев А.1.1.0. Особенности синтеза :: метаболизма лростагландпнов, простацнкдлна, тромбоксака п других .метаболитов арахпдоновой кислоты в тканях кроликов при эндотоко:шоеом поке // Тез. доил. П Все-сопзн. Совещания "Синтетические :: прзкладкде исследования простагландпнов". - Упа, 1934. - С.12-1.

22. Помопнецкй В.Д., Клздухнна Д.С. pj.-i ьростаглацд::-ков в регулам транспорта здекгролзтоэ :: eoâlî при остри:: ::;-печных пвОекцвях (обзор) // мед.реф.г.урн. - ISS4. - Ьп.З. -.. о» С я оЗО-оЗо •

23. Зйекдиев A.LI.0., Пс&юйкецггй; В.Д. Егопдпческхе .метода исследована активности уерментоЕ, осуществляйте защиту клетки при повреядазцЕХ воздействия:: // Летодгческие рекомендации. - Баку, I.Î3 АзССР, 1285. - 29 с.

24. Титов В.В., ПомоШецкнй В.Д. Роль нарупекдй синтеза пррсуадкклпна, тромбоксака ^ к метаболизма простагландпков в Патогенезе тро-мбогеморрашческг::-: осложнений при т.=г.елом течении спльмоиедезов // Тез.докл. "Актуальные вопросы профилактики остры;: ютечш: заболеваний". - Таллин, 1985. - C.I5I-I52.

25. ЗЛкозаноИДУ н шок. Роль антпокспдантов в механизмах защиты и повреждения при токспкопнОекцпонном поке / В.Д.Помой-;:спс:й, А.А.Кубатиев, А.С.Турглев, Л.Д.Смирнов // Сб. тез. докл. "Синтез и псследование простагландпнов". - Таллин, IS36. - C.GS.

26. Тромбоз мезентериатьнып сосудов как осложнение пиже-выи токсикопнфе1:цпй / В.В.Титов, 1.3.Бродов, В.3.Фалеев, К.Д. Киук, В.Д.По:лэ1Ьещс:1: // Тер.Ариив. - 1506.- 5 2.- С.127-2С1.

27. Роль эйкозалоидов в меиа:ж:змап зажиты к повреждения желудочно-кппечного тракта. Радис::::мукЕце к радиоиром.ато-графические методы исследования активности :и: синтеза, содержания и метаболизма в тканяи: Метод. рекомендации: / Т.У.Табу-цадзе, С.А.Моренкова, З.М.Масенко, В.Д.Помойнецкий и др. -Тбилиси, 1533. - 20 с.

2с. Влияние антиокеидактсв на активность синтеза проста-гланднкоЕ, простациклина и тромбоксака в разню-: слоя:: почек старин: крыс / А.М.О.Эфекдиев, Д.Д..Смирнов, В.Д.ПомойЕецкий, А.А.Кубатиев // Уармакология :: токсикология. - 1286. - Д. 3. -С.23С-233.

22. С::ислнтелыгая и ант::о:г:сл::телькая с::сте:.:а ферментов и пи роль в патологии, Методы ни определения в тканяи: Метод, рекомендации / Т.У.Табуцадзе, С.А.Моренксва, В.П.Масекко, В.Д. Помойнеикий и др. - Тбилиси, 1986. - 23 с.

30. Оерменты клеточной зациты и методы ил определения: Учебное пособие / А.А.Кубатиев, В.Д.Помойнецкий, В.П.Масекко и др. - 1.1.: ДОШУВ МЗ СССР, 1286. - 46 с.

31. Титов В.В., Малеев В.В., Помой!ецкий Б.Д. Молекулярные механизмы агрегации клеток крови при тсксикопкОекционном соке // Тез . докл. кону. "Актуальные проблемы гемостаза в клинической прш'.тике". - М., 1287. - 0.86.

32. Етсцур1п (ЕМ) ки d;Lf>of>0¿jSactk&>z¿c(¿(¿P$)-trl-[1ие1(и>£а 'по1с[(Е1) ргс^ксйон. ^ 2вЦ[Ь // .

/ ¿. ЗтИпоб, и. Ротодп&ху, к. %м&ей.//Л№г.

/77ипотс^СцЬог!.-Моч(г-СллА>, Ш9. ~ Р- №4. ' ^ '

33. Титов В.З., Кудрявцев А.Е., Помойнецюш В.Д. Роль простагландинов в патолоттги системной г.пцтоциркуляцпп у больны:-: с менпнгохокковой инфекцией и Еторпчнкмп гнойными менингитам пневмог.окковой этнологии // Тер.Ариив. - 1282. -.'} II. -С.15-18.

34. Системная зндотоксемия в генезе диссемшгированного Енутрисосудистого тромбообразования / А.А.Кубатиев, С.В.ГрачеЕ,

Б.Т.Ядигарова, В.Д.Помойнецкий // Тез. докл. 17 Всесоюзного съезда патофизиологов. - Кишинев, 1289. - С.1237.

35. Простагландины к их аналоги в репродукции лсиеотнкх и человека / Г .А. Толстяков, М.С.Мифтахов, Д.К.Лазарева, З.Д. Помойнецкий, Н.Н.Сидоров. - Уфа, IS89. - 40С с.

36. Гидроздорид,3-(д11:.5етЕлкарба'.:о1локс11)-2-эт:и-6-:.:ет:1"-пхридика, обладающий способностью пкгпбировать агрегацию ней-трофилов / Р.Г.Глупков, Л.Н.Дронова, Н.А.НиколаеЕа, 0.Б.Козлова, А.А.Кубатиев, А.С.Тургиев, В.Д.По:.:ойнецктгй, Т.А.Тусъ-кова и др. // Авт. сеид. !'г 1587866 от 22 апреля ISSC г.

37. ittJuSlticti- ^Mpzpoijsa.cc/ttL&.di-/л-

ciuCXLet ¿L^^yte^il^ioii. d-nil f>ZcSicl/U>ltl

on. -fiy J, /^/¿¿.-¿ут J, ¿.¿Mi^Mtf

if. pomojjneteKy/ /,'. %uMaet.r. //Inf&it-. t e^У/^ие Рыс£. buJ.C&tb. ac/xtfe, - mo.-if. M.-tff. -

-Р. 2.И-ЛЛ8.

Зап. bZJtp Tup. J 2D T«n. Мин-ва культуры