Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Коррекция окислительного стресса при транслюминальной коронарной ангиопластике и терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

□03053336

Каминный Александр Иванович

КОРРЕКЦИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ ТРАНСЛЮМИНАЛЬНОЙ КОРОНАРНОЙ АНГИОПЛАСТИКЕ И ТЕРАПИИ ИНГИБИТОРАМИ ГМГ-КоА-РЕДУКТАЗЫ (клинико-экспериментальпое исследование).

14.00.06 - Кардиология 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2007

003053936

Работа выполнена в НИИ кардиологии им.А.Л.Мясиикова ФГУ Российский кардиологический научно-проюводственпый комплекс

Росздрава

Научные руководители: Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валерий Владимирович Кухарчук Доктор биологических наук, профессор Вадим Зиновьевич Ланкин

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Виктор Алексеевич Люсов Доктор медицинских наук, профессор Анатолий Николаевич Бритов Доктор биологических наук, профессор Александр Александрович Болдырев

Ведущая организация:

ГОУ Московский Государственный медико-стоматологический Университет Росздрава

Защита состоится « » марта 2007 г. в 13 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета К 208.073.02 по присуждению ученой степени доктора медицинских наук в ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава (121552, г.Москва, 3-я Черепковская ул., дом 15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК

Росздрава

Автореферат разослан « » февраля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Сшпщын Валентин Евгеньевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время патология сердечнососудистой системы занимает ведущее место среди неинфекционных заболеваний, в связи с чем весьма важен поиск рациональных подходов к ее терапии. В литературе имеется большое количество данных, указывающих на важную роль интенсификации свободнорадикальных процессов в этиологии и патогенезе ишемической болезни сердца (ИБС) и атеросклероза (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Панкин В.З, Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000-2004; Steinberg D., Witztum J.L., 2002; Lankin V., Tikhaze A., 2003; Madamanchi N.R. et al., 2005). Свободнорадикальное окисление липопротеидов низкой плотности (ЛНП) при атеросклерозе сопровождается модификацией апопротеина В в окисленных ЛНП (окси-ЛНП), причем окислительная модификация ЛНП способствует увеличению их атерогенности и активному захвату моноцитами-макрофагами в межэндотелиальном пространстве стенки сосуда с последующим образованием пенистых клеток (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Ланкин В.З, Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000-2004; Steinberg D., Witztum J.L., 2002; Madamanchi N.R. et al., 2005). Кластеризация пенистых клеток приводит к возникновению первичных липоидозных поражений стенки сосуда (липидные пятна), причем интенсивное накопление липидов в пенистых клетках вызывает их апоптоз с освобождением факторов, стимулирующих миграцию гладкомышечных клеток из медии в интиму и их последующую пролиферацию, что способствует созданию клеточной основы атеросклеротических бляшек, стенозированию артерий и появлению симптомов ИБС (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Ланкин В.З, Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000-

2004). В настоящее время для реваскуляризации коронарного русла наряду с аортокоронарным шунтированием широко применяется транслюминальная коронарная ангиопластика (ТКА). Тем не менее, одной из проблем, ограничивающих эффективность этого метода, является последующее рестенозирование (Watanabe К. et al., 1996; Беленков Ю.Н. и др., 2002). Важную роль в процессе рестенозирования играют тромбообразование и воспаление, причем продукты свободно-радикального окисления являются медиаторами и тромбообразования, и воспаления (Watanabe К. et al., 1996; Lankin V., Tikhaze A., 2003). Несмотря на отсутствие видимых успехов при попытках клинического использования витаминов-антиоксидантов, что может быть связано с объективными просчетами в проведении этих исследований (Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2003-2004; Madamanchi N.R. et al., 2005), целесообразность включения антиоксидантов в комплексную терапшо ИБС и атеросклероза обсуждается многими авторами (Ланкин В.З., Тихазе

A.К., Беленков Ю.Н., 2003-2004; (Грацианский H.A.,2002; Kuller L.H., 2001; Howes R.M., 2006). Широкое использование гиполипидемических препаратов из класса ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы (статины) выявило определенные трудности, возникающие при необходимости применения высоких доз этих препаратов, что связано с возможностью увеличения уровня печеночных трансаминаз в крови пациентов и повышением опасности развития миопатий, рабдомиолиза и почечной недостаточности (Alsheikh-Ali A.A. et al.,2005; Grundy S.M., 2005). Эти побочные эффекты статинов связаны с тем, что ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы подавляют не только синтез холестерина (ХС), но и синтез таких важнейших природных антиоксидантов, как восстановленный коэнзим Q и антиоксидантный фермент Бе-содержащая GSH-пероксидаза (Bliznakov E.G., Wilkins D.J., 1998; Moosmann В., Behl С., 2004; Ланкин

B.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н.,2004). Не вызывает сомнений, что любые попытки повысить эффективность терапии ИБС и атеросклероза

являются весьма актуальными. Исходя из этого, в настоящей работе мы изучали возможность применения низких доз синтетического фенольного антиоксиданта пробукола для уменьшения степени рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики, а также исследовали возможность увеличения антиоксидантной защиты ЛНП при холестеринснижающей терапии больных ИБС путем дополнительного применения коэнзима Q.

Цель исследования: Разработка подходов к рациональной коррекции окислительного стресса при ТКА и гиполипидемической терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы (статинами)

Задачи исследования:

1. Исследовать окисляемость ЛНП при введении высоких доз витамина Е и действие синтетического антиоксиданта пробукола в дозе 250 мг/сут на содержание продуктов свободнорадикального окисления и активность утилизирующего липопероксиды фермента GSH-пероксидазы в крови больных ИБС.

2. Изучить действие синтетического антиоксиданта пробукола в низкой суточной дозе (250 мг) на степень рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики.

3. Исследовать эффективность антиоксидантного действия коэнзима Q на модели индуцированного окисления биомембран печени.

4. Изучить влияние ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (симвастатина и аторвастатина) на окисляемость биомембран печени у интактных крыс и крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией.

5. Исследовать влияние ингибитора ГМГ-КоА редуктазы симвастатина на синтез макроэгических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) в миокарде крыс и на модели изолированного сердца изучить влияние

аторвастатина на сократительную функцию миокарда в норме и при моделировании окислительного стресса.

6. Исследовать влияние окислительного стресса на активность миокардиальных антиоксидантных ферментов супероксид-дисмутазы (СОД) и GSH-пероксидазы у интактных крыс, а также крыс, предварительно получавших коэнзим Q.

7. Изучить влияние факторов риска развития атеросклероза -гиперхолестеринемии и сахарного диабета 2 типа на уровень окси-ЛНП в плазме крови больных.

8. Изучить влияние ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (правастатина, симвастатина и церивастатина) на уровень окси-ЛНП и активность GSH-пероксидазы в крови больных ИБС.

9. Исследовать уровень окси-ЛНП в плазме крови и активность эритроцитарной GSH-пероксидазы у больных ИБС при введении комбинации коэнзима Q с правастатином и пробукола с церивастатином.

Научная новизна исследования: Проведен критический анализ недостатков, отмеченных при проведении клинических исследований с использованием природных антиоксидантов, дана углубленная научно-обоснованная оценка результатов этих исследований и намечены основные пути преодоления существующих трудностей. В клинических исследованиях нами подтверждено, что высокие дозы витамина Е (400 МЕ/сут) не оказывают достоверного влияния fia окисляемость ЛНП в плазме крови больных ИБС и, следовательно, не могут быть использованы для эффективного подавления окислительного стресса при атеросклерозе. При проведении модельных экспериментов с использованием ЭПР-спектроскопии, а также в результате клинических исследований установлено, что синтетический антиоксидант пробукол в низкой суточной дозе (250 мг) не обладает гиполипидемическим

действием, однако, проявляет такую же антиоксидантную активность in vivo как и при использовании его в дозе 1000 мг/сут. Впервые показано, что использование пробукола в дозе 250 мг/сут сопровождается значительным снижением параметров, характеризующих окислительный стресс in vivo (уровень окси-ЛНП и МДА в ЛНП), повышает активность GSH-пероксидазы и существенно снижает степень рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики. Установлено, что основные факторы риска развития атеросклероза - гиперхолестеринемия и сахарный диабет одновременно индуцируют образование окисленных ЛНП плазмы крови. В экспериментах на животных продемонстрировано, что восстановленная форма коэнзима Q является значительно более эффективным антиоксидантом, подавляющим свободнорадикальные процессы в биомембранах, чем комплекс витаминов-антиоксидантов и селена. Впервые обнаружено, что введение животным ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы, подавляющих биосинтез промежуточного переносчика электронов в митохондриальной цепи окисления - коэнзима Q, сопровождается достоверным снижением синтеза макроэргических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) в миокарде экспериментальных животных, при одновременном снижении сократимости сердечной мышцы, причем в условиях окислительного стресса введение статинов приводит к более выраженному снижению сократимости миокарда. Впервые обнаружено, что при введении ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы окисляемость биомембран печени как у интактных животных, так и у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией резко увеличивается, причем введение антиоксидантов способствует нормализации этих процессов. При проведении двойных слепых плацебо-контролируемых исследований впервые было установлено, что ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы способны резко снижать активность зритроцитарной GSH-пероксидазы и провоцировать экстремальное

накопление окси-ЛНП в плазме крови больных ИБС, причем одновременное введение препарата коэнзима Q полностью подавляет процессы свободнорадикального окисления в ЛНП и в значительной степени способствуют сохранению исходной GSH-пероксидазной активности. Показано, что прооксидантное действие ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы возрастает в ряду: правастатин, симвастатин и церивастатин, что сопоставимо с увеличением гиполипидемической активности этих препаратов. Полученные данные подтверждают высказанные нами ранее предположения о целесообразности применения низких доз пробукола для снижения степени рестенозирования при ТКА, а также свидетельствуют о целесообразности введения коэнзима Q в комплексную холестеринснижающую терапию больных ИБС при условии биохимического тестирования основных параметров окислительного стресса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Синтетический фенольный антиоксидант пробукол при применении в суточной дозе 250 мг эффективно подавляет свободнорадикальное окисление липидов в крови больных ИБС (снижает накопление окси-ЛНП и МДА в ЛНП) и увеличивает активность утилизирующей липопероксиды эритроцитарной GSH-пероксидазы, не влияя на показатели липидного обмена.

2. Снижение интенсивности свободнорадикальных процессов путем предварительного введения пробукола в дозе 250 мг/сутки за 7 дней до проведения TICA и в течение 6 месяцев после ТКА сопровождается снижением степени рестенозирования коронарных артерий.

3. Введение ингибиторов ГМГ-КоА-редукгазы экспериментальным животным (крысы) вызывает интенсификацию свободнорадикального окисления мембранных фосфолипидов печени, снижает

энергообеспечение миокарда и интенсивность сократительной функции изолированного сердца.

4. Применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы сопровождается накоплением окси-ЛНП и снижением активности утилизирующей липопероксиды GSH-пероксидазы, причем добавление к гиполипидемической терапии коэнзима Q подавляет прооксидантное действие статинов.

Практическая значимость работы:

1. Показано, что синтетический антиоксидант пробукол в дозе 250 мг/сут не оказывает достоверного влияния на липидный обмен, но полностью сохраняет антиоксидантные свойства, характерные для высоких доз (1000 мг/сут) этого препарата, что позволяет использовать его в качестве антиоксидантного препарата в клинике для комплексной терапии заболеваний, сопровождающихся интенсификацией свободнорадикальных процессов.

2. Установлено, что использование пробукола в дозе 250 мг/сут существенно снижает степень рестенозирования сосудов после транслюминальной коронарной ангиопластики, что повышает эффективность данного метода при минимальных дополнительных затратах.

3. Обоснована целесообразность добавления коэнзима Q к стандартной и, особенно, интенсивной терапии ингибиторами ГМГ-КоА редуктазы для снижения атерогенной окислительной модификации ЛНП.

Апробация работы и публикации: Основные положения и материалы диссертации были доложены или представлены на: 2-ом съезде биохимического общества РАН (Пущино, 1997); 10-ой международной конференции по химии органических и элементоорганических пероксидов

(Москва, 1998); 1-ой региональной конференции по медицинским наукам «Роль свободных радикалов в норме и при патологии» (Jerusalem, Israel& Amman, Jordan, 1998); международной конференции «Регуляция биологических процессов свободными радикалами» (Москва-Ярославль,

1998); 7-ом конгрессе европейского общества по исследованию атеросклероза (Geneva, Switzerland, 1998); 10-ой международной конференции по сосудистой биологии (Cairns, Australia, 1998), 5-ой международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 1998); 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова (Москва, 1999); международной конференции «Антиоксиданты, адаптация и старение» (Dresden,Germany,

1999); национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999); международном симпозиуме «Окислительный стресс и атеросклероз» (Oslo, Norway, 2000); 10-ой конференции международного общества по исследованию свободных радикалов (Kyoto, Japan, 2000); 6-ой международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002); 17-ом международном конгрессе по тромбозам (Bologna, Itali, 2002); 11-ой конференции международного общества по исследованию свободных радикалов (Paris, France, 2002); 1-ом Российский съезде интервенционых кардиоангиологов (Москва, 2002); 73-ем конгрессе европейского общества по исследованию атеросклероза (Austria, Zalzburg, 2002); международной конференции «Активные формы кислорода и азота, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2003); Российском национальном конгрессе кардиологов (Томск, 2004); 74-ом конгрессе европейского общества по исследованию атеросклероза (Seville, Spain, 2004); 12-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005); международном междисциплинарном конгрессе «Достижения современной медицины», (Судак, Крым, Украина, 2005); 75-ом

конгрессе европейского общества по исследованию атеросклероза (Prague, Czech Republic, 2005); 14-ой международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Гурзуф, Крым, Украина, 2006); 14-ом международном симпозиуме по атеросклерозу (Rome, Italy, 2006).

Апробация диссертации была проведена 14 ноября 2006 г. на заседании Ученого Совета НИИ кардиологии им.А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК Росздрава. По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, включая 16 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 8 публикаций в зарубежных научных журналах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 250 стр., состоит из 8 глав, разделов «Введение» и «Заключение», содержит 26 таблиц, 38 рисунков. Список литературы содержит 415 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинические исследования. В клинические исследования было включено 277 пациентов (98% мужчины) в возрасте от 40 до 65 лет с гиперлипидемией 2А типа и семейной гиперхолестеринемией у которых исследовали основные параметры липидного обмена (общий ХС, ХС ЛНП, ХС ЛВП) и свободнорадикального окисления липидов (уровни окси-ЛНП и МДА в ЛНП, активности эритроцитарных СОД и GSH-пероксидазы). В различных сериях клинических исследований больные ИБС в течение 3-6 месяцев получали природный антиоксидант витамин Е (а-токоферилацетат, 400 мг/сут) или разные дозы (1000 мг/сут или 250 мг/сут) синтетического антиоксиданта пробукола («фенбутол» АО Акрихин).

Больные с гемодинамически значимыми стенозами коронарных артерий были рандомизированы на 2 группы, после чего им была проведена транслюминальная коронарная ангиопластика (в 92% случаев

со стентированием). Пациенты первой группы за 7 дней до проведения транслюминалыюй коронарной ангиопластики (ТКА) и в течение 6 месяцев после ТКА получали 250 мг/сут пробукола («алколекс» фирмы ICN Hungary) на фоне стандартной терапии, больные второй (контрольной) группы не получали каких-либо антиоксидантных препаратов как до, так и после проведения ТКА. До проведения ТКА и через 6 месяцев после ТКА всем больным проводили коронароангиографию (КАТ) и производили количественный коронарный анализ с определением минимального диаметра и степени сужения артерии на аппарате фирмы Siemens (Германия).

В первом двойном слепом плацебо контролируемом исследовании больным ИБС в течение 6 месяцев проводили терапию с включением ингибитора ГМГ-КоА-редуктазы правастатина («липостат» фирмы BristolMayers Squibb, 40 мг/сут), либо правастатина совместно с коэнзимом Q («биохинон» фирмы Pharma Nord, 60 мг/сут). Во втором двойном слепом плацебо контролируемом исследовании больным ИБС в течение 6 месяцев проводили терапию с включением ингибитора ГМГ-КоА-редуктазы церивастатина («липобай» фирмы Bayer, 0,4 мг/сут), либо церивастатина (исследование было проведено до запрета применения препарата) совместно с пробуколом («алколекс» фирмы ICN Hungary, 250 мг/сут). Кроме того, было проведено клиническое исследование в котором больные ИБС в течение 2 месяцев получали ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы симвастатин («вазилип» фирмы KRKA, 20 мг/сут).

Транслюминальная коронарная ангиопластика. Коронарную ангиопластику проводили по стандартной методике. Выполняли предилятацию баллонном, диаметр которого подбирали согласно среднему диаметру участков артерии проксимальнее и дистальнее стеноза. Далее в пораженном сегменте либо позиционировался стент без лекарственного покрытия с его последующим расширением, либо

проводилась дальнейшая дилатация сегмента до достижения оптимального ангиографического результата. Номинальный диаметр стента соответствовал должному диаметру артерии в стенозированном участке. После проведения последней дилятации и удаления из коронарной артерии баллонного катетера и коронарного проводника выполнялось контрастирование дилятированного участка со съемкой минимум в 2-х ортогональных проекциях. При проведении контрольной КАГ, съемка выполнялась в тех же проекциях. Остаточный стеноз после стентирования составлял не более 10 %, после баллонной ангиопластики - не более 20%. Контрольная КАГ выполнялась всем пациентам через 6 мес после проведения ТКА. Исследование проводилось на аппарате «Goroscop 33» (Simens, Германия); съемка каждого стеноза проводилась как минимум в 2-х ортогональных проекциях для его лучшей визуализации. Последующий анализ полученных ангиограмм проводился с помощью системы компьютерного анализа Axiom Artis (Simens, Германия). Ангиографический рестеноз определялся как сужение артерии >50% в диаметре в месте дилятации или стентирования через 6 месяцев после проведения ТКА.

Экспериментальные животные. В экспериментальной части работы было использовано 207 половозрелых самцов крыс линии Wistar и линии WKY. Интактным крысам Wistar и крысам с алиментарной гиперхолестеринемией в течение 1 месяца через пищеводный зонд вводили симвастатин («вазилип» фирмы KRKA) или ловастатин («мевакор» фирмы MSD) соответственно, после чего в гомогенате печени исследовали кинетику аскорбат-зависимого свободнорадикального окисления мембранных фосфолипидов.

В другой серии экспериментов животным перорально в течение 1 месяца вводили симвастатин («зокор» фирмы MSD) и в миокарде определяли уровень макроэргических фосфатов. После предварительного

перорального введения аторвастатина («аторис» фирмы KRKA) в течение 1 мес на изолированном сердце крысы исследовали интенсивность сократительной функции миокарда до и после моделирования окислительного стресса путем введения в перфузат пероксида водорода. Активность миокардиальных антиоксидантных ферментов определяли до и после моделирования окислительного стресса в сердечной мышце интактных крыс линии WKY и животных той же линии, получавших в течение 6 недель 10 мг/кг солюбилизированной формы коэнзима Q («кудесан» АО Аквион).

Физиологические методы исследования. Изолированные сердца крыс перфузировали при 37° через аорту раствором Кребса-Хензелейта рН 7,4 , содержащим 11 мМ глюкозы и насыщенным карбогеном (5%С02+95%02). Перфузию осуществляли со скоростью, близко соответствующей величине 10 мл/мин/г. Через левое предсердие в левый желудочек (ЛЖ) сердца вводили латексный баллончик, заполненный физиологическим раствором. Объём баллончика устанавливали на уровне, при котором диастолическое давление в ЛЖ составляло 12-14 мм рт.ст. и поддерживали его на постоянном уровне. Давление в аорте и ЛЖ, а также dP/dt регистрировали при помощи электроманометров Gould Statham Р23 Db (США) на полиграфе Gould Brush 2400 (США). В условиях изоволюмического режима основными критериями силы сокращений миокарда и его энергорасхода были развиваемое давление и показатель интенсивности сократительной функции (ИСФ, произведение развиваемого давления и частоты сердечных сокращений), который прямо пропорционален величине потребления кислорода сердечной мышцей. Схема опыта включала определение максимальной ИСФ при градуальном повышении скорости перфузии в 2 раза, после чего не меняя скорость перфузии в миокарде индуцировали окислительный стресс посредством введения в перфузат 100 мкМ Н202 при помощи инфузионного насоса

Sage с регулируемой скоростью, позволяющей поддерживать постоянную концентрацию Н202. Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории экспериментальной патологии сердца (руководитель - проф. В.И.Капелько) ФГУ РКНПК Росздрава.

Биохимические методы исследования. Для выделения ЛНП плазму крови больных подвергали двухкратному центрифугированию в градиенте плотности NaBr в течение 2 час, при 42000 об/мин. в угловом роторе 50Ti при 4° в рефрижераторной ультрацентрифуге Beckman L-8 (США) согласно методике Тертов В.В. и соавт.(2000). Окисление ЛНП инициировали при 37° введением в среду инкубации 30 мкМ CuS04 и через фиксированные интервалы времени измеряли кинетику накопления липогидропероксидов (конъюгированные диены) при 233 нм на спектрофотометре Hitachi 220А (Япония). Содержание липидных пероксидов в ЛНП, изолированных из плазмы крови больных, определяли специфичным колориметрическим методом, используя реакцию окисления ионов экзогенного Fe2+ липогидропероксидами и анализируя содержание стехиометрически образованного Fe3+ при помощи цветной реакции с ксиленолоранжем до и после специфичного восстановления органических (липидных) гидропероксидов трифенилфосфином (Nourooz-Zadeh J. et al., 1994; HermesLima M. et al., 1995).

Кинетику окисления эндогенных полиеновых липидов биомембран печени исследовали после индукции свободнорадикальных реакций при восстановлении эндогенного железа аскорбиновой кислотой по модифицированному методу Ланкина В.З. и Михеевой Л.П. (1975). Содержание МДА (продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой) определяли, анализируя количество образовавшихся триметиновых комплексов на спектрофотометре Hitachi 220А (Япония) при 532 нм. Окисляемость биомембран печени характеризовали величиной, обратной продолжительности периода индукции -1/т.

Активность Бе-содержащей GSH-пероксидазы в тканях экспериментальных животных и эритроцитах человека определяли в сопряженной глутатионредуктазной системе по скорости окисления NADPH при 340 нм с гидропероксидом трет-бутила в качестве субстрата по модифицированному методу Ланкина В.З. и Гуревич С.М. (1976), используя химический анализатор FP-900 Labsystems Оу (Финляндия) в кинетическом режиме работы. Активность Си,7п-СОД в тканях экспериментальных животных и эритроцитах человека определяли по ингибированию восстановления синего нитротетразолия супероксидным радикалом, генерируемым в системе ксантин-ксантиноксидаза, определяя кинетику образования формазана на регистрирующем спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) при 560 нм (Beauchamp С., Fridovich J., 1971).

Определение содержания убихинона Qa и Qw, и а-токоферола в сыворотке крови крыс проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием на приборе Coulochem II, («Environmental Scinces Associate, Inc.», США) с последующей обработкой данных при помощи компьютерной программы той же фирмы. Исследования проводили совместно с сотрудниками группы физико-химических методов исследования (руководитель - проф. Э.К.Рууге) ФГУ РКНПК Росздрава.

Для определения содержания макроэргических фосфатов крыс анестезировали уретаном и кусочки миокарда отбирали охлажденными в жидком азоте щипцами Волленбергера, после чего гомогенизировали в холодной 6% HCLO4 (10 мл/г ткани) в ледяной бане с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax Т-25 (IKA-Labortechnik, США). Белки осаждали центрифугированием в рефрижераторной центрифуге Beckman 3-6В (США) при 3000g в течение 10 мин, супернатанты нейтрализовали 5 М К2СО3 до рН 7,4. Сухую массу образцов определяли взвешиванием части осадков после экстракции HCLO4 и высушивали в течение 12 часов при 110° до постоянной массы. Содержание АТФ и фосфокреатина (РСг) в тканевых экстрактах

определяли спектрофотометрически, используя глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, гексокиназу и кретинкиназу (Р1багепко 0.1. й а1.,1996). Содержание АДФ определяли энзиматически с помощью пируваткиназы и лактагдегидрогеназы (Р15агепко 0.1 & а1.,1996), для определения уровня креатина (Сг) в тканях использовали реакцию с а-нафтолом и 2,3-бутандионом (Яетег К.А. а1.,1981). Анализы производили с использованием спектрофотометра Уапасо-2000 (Япония). Содержание общего креатина (£Сг) рассчитывали по формуле: 1Сг=РСг + Сг. Содержание адениннуклеотидов, фосфокреатина (РСг) и креатина (Сг) в тканях выражали в микромолях на 1 грамм сухой массы. Исследования проводили совместно с сотрудниками лаборатории метаболизма сердца (руководитель - д.б.н. О.И.Писаренко) ФГУ РКНПК Росздрава.

Содержание общего ХС и триглицеридов в плазме крови определяли при помощи энзиматического метода на химическом анализаторе РР-900 ЬаЬзуз1етз Оу (Финляндия) с использованием тест-наборов фирмы Вое1ищег. Содержание ХС в ЛВП определяли после осаждения ЛНП и ЛОНП марганцево-гепариновым реактивом.

Кроме особо оговоренных, все биохимические исследования проводили в лаборатории биохимии свободнорадикальных процессов ФГУ РКНПК Росздрава.

Биофизические методы исследования. Долгоживущие феноксильные радикалы пробукола в пробукол-содержащих частицах ЛНП выявляли методом ЭПР-спектрометрии. Для этого использовали ЛНП (2 мг белка/мл), изолированные из плазмы крови больных ИБС, получавших 250 мг/сут пробукола в течение 3-х месяцев. Ненасыщенные фосфолипиды наружного слоя ЛНП окисляли С-15 липоксигеназой ретикулоцитов кролика (Ьапкш V. еХ а!., 1985) до накопления 0,5 мкмолей ацилгидропероксидов/мг белка ЛНП, после чего гомолиз гидропероксидов с образованием алкоксильных лилидных радикалов инициировали путем

внесения в среду 25 мкМ гемина. Регистрацию спектров ЭПР феноксильных радикалов пробукола, образовавшихся при взаимодействии с алкоксильными радикалами фосфолипидов ЛНП, проводили согласно методу (Шумаев К.Б., Рууге Э.К. и др.,1997) на спектрометре Varian Е-109Е (США) в аэробных условиях при 25° и при модуляции магнитного поля 0,25 мТл (частота СВЧ-поля 100 кГц ; мощность - 100 мВт). Исследования проводили совместно с сотрудниками группы физико-химических методов исследования (руководитель - проф. Э.К.Рууге) ФГУ РКНПК Росздрава.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пакета статистических программ STATISTICA 6.0. Оценку достоверности межгрупповых различий проводили с помощью непараметрического метода Манна-Уитни. Достоверность динамики показателей на фоне лечения проводили с помощью непараметрического метода по Вилкоксону. Для выявления взаимосвязи между степенью стенозирования коронарных артерий и биохимическими показателями применяли непараметрический метод корреляционного анализа по Spearmen. Результаты биохимических показателей представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (M+SEM), ангиографических данных - в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±STD); различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсификация процессов свободнорадикального окисления сопутствует развитию многих патологических состояний (Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000-2001; Зенков Н.К. и др., 2001; Lankin V., 2003; Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З. и др., 2006). В регуляции

свободнорадикальных процессов участвуют ферментные системы утилизации активных форм кислорода (супероксиддисмутаза - СОД, каталаза) и органических гидропероксидов (глутатионпероксидаза - вйИ-пероксидаза), а также природные низкомолекулярные антиоксиданты, такие как фенольная (восстановленная) форма коэнзима С? (0Н2) и витамины-антиоксиданты: а-токоферол (витамин Е, а-Т-ОН), Р-каротин (провитамин А) и аскорбиновая кислота (витамин С). Схема, иллюстрирующая роль основных природных антиоксидантов в регуляции свободнорадикальных реакций в организме представлена на рис. 1.

Рис.1. Основные пути неферментативной и ферментативной регуляции свободнорадикальных прог)ессов в клетке

Отсутствие выраженных клинических эффектов в работах по использованию витаминов-антиоксидантов в комплексной терапии ИБС и атеросклероза (см.обзоры Панкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 20032004; МасЬтапсЫ КЯ. е1 а1., 2005) вызвало определенное падение

интереса к продолжению такого рода исследований у отдельных научных групп как в нашей стране, так и за рубежом (Грацианский H.A., 2002; Kuller L.H., 2001; Howes R.M., 2006). Тем не менее, проведенный нами критический анализ результатов позволяет заключить, что при проведении этих работ были сделаны существенные упущения, не позволяющие однозначно трактовать полученные данные. Так, при клинических исследованиях эффективности витаминов-антиоксидантов в комплексной терапии ИБС и атеросклероза не проводили определения каких-либо параметров, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов (например, уровень окси-ЛНП) у обследованных пациентов (Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2003-2004). При этом не учитывалось, что многократное превышение физиологических доз (соответствующих суточной потребности) при использовании витамина Е и других витаминов-антиоксидантов способно привести к инверсии антиоксидантного действия в прооксидантное, как это было продемонстрировано в экспериментах in vitro и in vivo (Ланкин В.З. и др., 1999; Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2003-2004). Более того, не были приняты к сведению данные о том, что а-токоферол (витамин Е), транспортируемый в периферические ткани частицами ЛНП, сравнительно слабо влияет на окисляемость этих липид-белковых структур, тогда как основная роль в защите частиц ЛНП от свободнорадикального окисления принадлежит другому природному жирорастворимому антиоксиданту - восстановленной (фенольной) форме коэнзима Q, который, в отличие от а-токоферола, способен синтезироваться в организме млекопитающих (Stocker R. et al., 1991). В соответствии с этими данными, в проведенном нами клиническом исследовании не было выявлено достоверных изменений окисляемости ЛНП после добавления фармакологической формы витамина Е - (а-токоферилацетата) к стандартной терапии больных ИБС в течение 3 месяцев в дозе многократно превышающей суточную потребность (400

мг/сут). Исходя из сказанного можно заключить, что для ограничения атерогенной окислительной модификации ЛНП при атеросклерозе целесообразно применять антиоксиданты отличные от витамина Е, причем весьма перспективны в этом отношении могут быть коэнзим Р-содержащие препараты. Кроме того, в каждой конкретной ситуации, вероятно, должны использоваться определенные антиоксиданты, выбор которых должен быть научно обоснован, а их антирадикальная эффективность должна быть подтверждена соответствующими экспериментальными исследованиями с использованием адекватных методов.

В настоящей работе с использованием биохимических и физико-химических методов было показано, что окислительный стресс, выражающийся в значительном накоплении окси-ЛНП у больных ИБС действительно имеет место при наличии фактора риска атеросклероза -гиперхолестеринемии, причем накопление окси-ЛНП, хотя и в значительно меньшей степени, возможно также у больных ИБС без признаков нарушения липидного обмена. Важно отметить, что наличие другого фактора риска атеросклероза - сахарного диабета 2 типа способствует развитию окислительного стресса у больных в еще большей степени, чем гиперхолестеринемия у больных ИБС. Таким образом, важнейшие факторы риска атеросклероза одновременно являются и факторами, стимулирующими интенсификацию свободнорадикальных процессов в организме. В связи с этим очевидно, что попытки ограничения окислительного стресса при ИБС могут внести существенный вклад в комплексную терапию этого заболевания.

Известно, что синтетический фенольный антиоксидант пробукол использовался в качестве холестеринснижающего препарата, хотя он обладал слабой гиполипидемической активностью (Ланкин В.З. и др., 1991; Кигиуа М., Кигиуа Б., 1993). В настоящее время необходимость в применении пробукола отпала в связи с созданием эффективных

холестеринснижающих препаратов из класса ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы. Тем не менее, в различных модельных системах и в экспериментах на животных пробукол проявляет антиоксидантные свойства (Ланкин В.З. и др., 1991; Kuzuya М., Kuzuya F., 1993), в связи с чем мы рассмотрели возможность его применения не в качестве гиполипидемического агента, а в качестве высокоэффективного нетоксичного антиоксиданта, для чего представлялось необходимым существенно снизить суточную дозу вводимого препарата. Исследовав влияние экзогенного пробукола на окисляемость ЛНП из плазмы крови больных ИБС in vitro мы показали, что в диапазоне концентраций 10-50 мкМ пробукол эффективно тормозит окисление нативных ЛНП, причем при увеличении содержания пробукола в среде инкубации до 100 мкМ было отмечено полное ингибирование их окисления. Поскольку фармакокинетика пробукола была хорошо изучена Зайцевой Т.М. и др. (1994), на основании результатов этих исследований и собственных экспериментальных данных мы рассчитали, что стационарная концентрация пробукола в циркулирующей крови, близкая 25-50 мкМ может быть достигнута путем двухкратного приема препарата по 125 мг с интервалом 12 часов. Следовательно, суточная доза пробукола 250 мг/сут, теоретически должна быть достаточной для обеспечения эффективной защиты ЛНП от окислительной модификации в кровяном русле in vivo. Выбор пробукола определялся также и тем, что как было неоднократно продемонстрировано (Тихазе А.К. и др., 1997; Kumar D. et al., 2001; Ланкин В.З. и др., 2004) in vivo он может действовать не только по прямому антиоксидантному механизму (как «ловушка радикалов»), но и опосредованно вызывая экспрессию активности утилизирующего липопероксиды фермента - GSH-пероксидазы в клетках и тканях. Проведенные нами исследования показали, что пробукол в суточной дозе 250 мг достоверно не влияет на изменение основных параметров липидного обмена, однако, существенно задерживает окисление ЛНП in

vivo, причем антиоксидантная эффективность пробукола в дозе 250 мг/сут по всем основным параметрам была сравнима с таковой в дозе 1000 мг/сут (рис.2А, 2Б и 2В). В частности, пробукол в суточной дозе 1000 мг или 250 мг в равной степени (различия статистически недостоверны) увеличивал продолжительность лаг-фазы свободнорадикального окисления ЛНП, снижал стационарную концентрацию окси-ЛНП (рис.2Е) и уровень МДА в крови, а также в равной степени способствовал увеличению активности утилизирующего липопероксиды фермента - эритроцитарной GSH-пероксидазы (рис.2В). При этом было показано, что при окислении пробукол-содержащих ЛНП из плазмы крови больных ИБС, получавших 1000 мг или 250 мг препарата, амплитуды сигналов ЭПР, соответствующие концентрации феноксильных радикалов в ЛНП не отличаются (рис.2А). Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что пробукол в дозе 250 мг/сут встраивается в ЛНП в количествах, достаточных для эффективной детоксикации липидных алкоксильных радикалов в этих частицах.

Полученные данные дали возможность попытаться использовать низкие дозы пробукола (250 мг/сут) для подавления рестенозирования коронарных артерий после ТКА. Как известно, на процессы рестенозирования существенное влияние оказывают тромбоз и воспаление в зоне вмешательства. В связи с этим важно отметить, что по литературным данным образование природного антитромбогенного фактора - простациклина существенно зависит от уровня окси-ЛНП, поскольку липогидропероксиды являются мощными ингибиторами простациклинсинтазы (Ланкин В.З. и др., 2000-2001; Зенков Н.К. и др., 2001; Lankin V., 2003). Кроме того, активные формы кислорода и производные ферментативного свободнорадикального окисления арахидоновой кислоты (лейкотриены) являются медиаторами воспаления

О - 1000 мг/сут О - 250 мг/сут

3240 3280

магнитное поле, Г с

10 15 20 25 30 | Длительность терапии, недели

Начало лечения

10 15 20 25

| Длительность терапии, недели Начало лечения

В

Рис. 2. Сигналы ЭПР феноксильныхрадикалов пробукола в ЛНП больных ИБС, получавших 1000 мг/сут (сверху) или 250мг/сут (снизу) пробукола в течение 3 месяцев (А); изменение уровня окси-ЛНП (Б) и активности СБН-пероксидазы (В) в крови больных ИБС в процессе терапии разными дозами пробукола (за 1 принимали исходный уровень окси-ЛНП и

исходную активность ОБН-пероксидазы).

(Ланкин В.З. и др., 2000-2001; Зенков Н.К. и др., 2001). Исходя из вышесказанного, применение антиоксидантов для ограничения тромбогенеза и воспаления в зоне вмешательства при ТКА представляется вполне оправданным. Более того, до начала настоящей работы независимыми группами японских и канадских авторов было показано, что пробукол в суточной дозе 1000 мг способен снижать частоту рестенозов после ТКА (Yokoi H. et al., 1997; Tardif J.C. et al., 1997). Существенным недостатком цитированных работ явилось отсутствие данных об интенсивности свободнорадикальных процессов до и после проведения ТКА, что не давало возможности судить о механизме действия пробукола на процесс рестенозирования. На основании литературных данных и собственных результатов представлялось целесообразным изучить влияние низкой дозы пробукола (250 мг/сут) на рестенозирование коронарных артерий после ТКА с одновременным исследованием основных показателей, характеризующих интенсивность свободнорадикальных реакций (уровень окси-ЛНП и МДА в ЛНП, активность GSH-пероксидазы) в крови пациентов. В результате проведенных исследований было показано, что исходные уровни окси-ЛНП (рис.3) и МДА в ЛНП, равно как исходная активность GSH-пероксидазы (рис.3) в крови больных контрольной (ТКА без пробукола) и опытной (ТКА с пробуколом) групп достоверно не отличались, причем величины этих показателей в контрольной группе не претерпели достоверных изменений и через 6 месяцев наблюдения (рис.3). В то же время, 6 месячная терапия больных с использованием 250мг/сут пробукола после проведения ТКА сопровождалась достоверным снижением уровней окси-ЛНП (рис.3) и МДА в ЛНП (в 2,1 и 1,9 раза соответственно), а также существенным увеличением (в 1,7 раза) активности GSH-пероксидазы (рис.3) в крови больных.

Уровень липопероксидов

1,5-

Активность GSH-пероксидазы

1,0-

0,5'

0,0.

/

ЧЬ

rfi

гЬ

1,5

1,0

-0,5

0,0

исходно через исходно через 6 мес. 6 мес.

Рис. 3. Изменение уровня липогидропероксидов (окси-ЛНП) и активности GSH-пероксидазы в крови больных ИБС до и через б месяцев после ТКА [заштрихованные столбики - опытная группа (терапия пробуколом в дозе 250мг/сут); светлые столбики -контроль (за 1 приняты исходные значения исследуемых параметров; * - р<0,05)]

По данным ангиографического обследования в группе больных, получавших 250 мг/сут пробукола через 6 месяцев после проведения ТКА минимальный диаметр артерий был достоверно больше (рис.4) на 15% по сравнению с таковым в контрольной группе больных, не получавших пробукол (р<0,01). Аналогичные данные были получены при определении степени рестенозирования в группе больных, получавших 250 мг/сут пробукола и контрольной группы (рис.4), в которых остаточный стеноз коронарных артерий в среднем по группе составлял через 6 месяцев после проведения ТКА 19% и 32,5% соответственно (р<0,01).

исходно сразу через 6 мес после после ТКА ТКА

исходно сразу через 6 мес.

после после ТКА ТКА

Рис. 4. Изменения минимального диаметра сосуда и степени его сужения до и через б месяцев после транслюминальной коронарной ангиопластики (заштрихованные столбики - терапия пробуколом в дозе 250 мг/сут.; светлые столбики - контроль). * - р<0,01

Важно отметить, что у больных через 6 месяцев после проведения ангиопластики на фоне приема пробукола (250 мг/сут) выявлена достоверная положительная корреляция между содержанием вторичного продукта свободнорадикального окисления липидов (МДА в ЛНП) в крови и степенью рестенозирования коронарных артерий (г=0,54; р<0,001), а также обратная корреляция между содержанием МДА в ЛНП и минимальным диаметром коронарных артерий (г=0,49; р<0,01). Следовательно, полученные результаты позволяют утверждать, что наши теоретические предположения о возможности снижения рестенозирования коронарных артерий после ТКА путем подавления проявлений окислительного стресса с помощью антиоксидантов подтверждаются данными количественных биохимических и ангиографических исследований. Из этих данных также можно сделать вывод о

перспективности дальнейших исследований в этом направлении, что может привести к обоснованию практического применения пробукола (или других антиоксидантов) для увеличения эффективности ТКА.

Как уже было отмечено, важной проблемой, связанной с использованием антиоксидантов при ИБС и атеросклерозе является необходимость подавления атерогенной окислительной модификации ЛИП. Широкое применение ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (статинов), наряду с большим прогрессом в лечении гиперлипидемий, с нашей точки зрения (В.ЗЛанкин, А.К.Тихазе, А.И.Каминный, Ю.Н.Беленков, 2004) и по мнению других исследователей (Bliznakov E.G., Wilkins D.J., 1998; Moosmann В., Behl С., 2004) таит в себе определенную опасность, поскольку одновременно с ингибированием синтеза ХС происходит ингибирование синтеза двух весьма эффективных природных антиоксидантов - фенольной формы коэнзима Q и антиоксидантного фермента GSH-пероксидазы (см. схему на рис.5). Проведенное нами исследование по оценке эффективности действия различных природных антиоксидантов показало, что на свободнорадикальное окисление биомембран печени крысы ß-каротин оказывал минимальное влияние, тогда как предварительное введение животным комплекса витаминов-антиоксидантов и селена, хотя и существенно тормозило окисление, но по своей эффективности было не сопоставимо с действием коэнзима Q, который проявлял наибольшую антиокислительную активность из всех испытанных нами природных антиоксидантов (рис.6). При исследовании влияния введения животным ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы на окисление биомембран в печени нативных крыс (симвастатин) и крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией (ловастатин) было показано, что в обоих случаях введение ингибитора ГМГ-КоА редуктазы достоверно (р<0,05) увеличивает окисляемость биомембран в 1,9 и 2,1 раза соответственно (рис. 7А,Б).

Ацетоацетил-КоА

ß - Ги др о к с и - ß - м ети л г л i о т а р и л - К о А

Ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы (стат1шы)

Мевалоновая кислота

V

Мевалонилпирофосфат

V

Изоиентилпирофосфат

Селенопротеин Геранилпирофосфат

I

Se-содержащая глутатпонпероксидаза

Фарнезилпирофосфат

Убихинон-10 (CoQio)

„ ft Сквален

J

Холестерин

Рис. 5. Схема подавления биосинтеза убихинона (CoQw) и холестерина при введении ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (по данным Bliznakov E.G., Wilkins D.J., 1998 и Moosmann В., Behl С., 2004 с изменениями)

Известно, что при свободнорадикальном окислении мембранных фосфолипидов происходит существенное повреждение мембранных структур гепатоцитов, зачастую приводящее к их дезинтеграции (Панкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н.,2001; Зенков Н.К. и др., 2001). Можно предположить, что наблюдаемое нами значительное увеличение окисляемости биомембран печени лежит в основе ее повреждения при терапии ингибиторами ГМГ-КоА редуктазы (особенно при приеме

1 2 3

Рис. 6. Влияние перорального введения в течение 1 месразличных природных антиоксидантов в эквшюлярных количествах на ингибирование свободнорадикального окисления в биомембранах печени крысы (1 - каротин; 2 - Р-каротин+витамины Е+С+селен; 3 - коэнзим 0 * -р<0,05

фсля туты м/н/ты

Рис. 7. Влияние симвастатина (А) и ловастатина (Б) на кинетику свободнорадикального окисления биомембран печени интактных крыс (А) и крыс с алиментарной гиперхолестеринемией (Б); 1 - контроль, 2 - опыт (приведены характерные кинетические кривые; количественные данные см. текст на стр.28)

больших доз), что может быть причиной свободнорадикального повреждения печени, приводящего к повышению уровня печеночных трансаминаз в крови.

Можно полагать, что действие ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы оказывает определенное влияние на метаболизм миокарда. Прежде всего, это может проявляться в нарушении биоэнергетики миокарда, поскольку ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы, подавляя синтез коэнзима Q -промежуточного переносчика электронов в митохондриальной дыхательной цепи, вероятно, способны воздействовать на процессы энергообразования в сердечной мышце. Действительно, в наших исследованиях, проведенных совместно с сотрудниками д.б.н. О.И.Писаренко, было показано, что введение ингибитора ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина достоверно (р<0,05) снижает синтез основных макроэргических фосфатов - АТФ и фосфокреатина в миокарде на 13% и 18% соответственно. Это может иметь отношение к проявлению друтого побочного действия статинов - развитию миопатий, причем наиболее эффективные статины, вызывающие резкое подавление активности ГМГ-КоА редуктазы и, тем самым, резкое ингибирование биосинтеза коэнзима Q, создают наибольшую опасность проявления признаков миопатии с возможным развитием рабдомиолиза и почечной недостаточности (Alsheikh-Ali A.A. et al., 2005). Кроме того, снижение энергообеспечения миокарда, особенно в условиях окислительного стресса, не может не сказываться на его физиологической функции и, прежде всего, на его сократимости. В исследованиях, проведенных нами совместно с сотрудниками проф. В.И.Капелько (рис.8), было показано, что при введении аторвастатина сократимость изолированного сердца крысы достоверно снижается на 13% (р<0,05). В то же время, при введении в перфузат пероксида водорода (моделирование окислительного стресса) сократимость миокарда животных, получавших аторвастатин достоверно

снижалась на 39% (р<0,05) по сравнению с соответствующим контролем (миокард крыс без введения статина).

1,0-

>5

О

X

Л

С

0) ч:

к- 0)

Н н

«$

О. О

т о

о X

о н

л о

н о

о

X 3"

ш

О X X >> ■8-

ш

н

X

5

0,8-

0,6-

0,4-

0,2 J

0,0

Й

-статин +статин -статин +статин

норма

окислительныи стресс (40 мин.)

Рис. 8. Изменение интенсивности сократительной функции изолированного миокарда крысы до (норма) и после моделирования окислительного стресса у интактных животных и животных, получавших аторвастатин (за I принимали ИСФ интактных животных до моделирования окислительного стресса). *- р<0,05

В процессе индуцируемого пероксидом водорода окислительного стресса в изолированных сердцах крыс отмечено достоверное снижение активности ключевых антиоксидантных ферментов - СОД и СБН-пероксидазы (на 38% и 24,5% соответственно), что может быть связано с частичной инактивацией этих ферментов под действием активных форм кислорода (Панкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000). После

предварительного перорального введения животным в течение 1 мес препарата коэнзима СЬо его содержание в плазме крови крыс (по данным ВЭЖХ-анализа) возрастало в 9,8 раза, причем моделирование окислительного стресса в миокарде этих животных не приводило к достоверному изменению активности СОД и С8Н-пероксидазы. Более того, в миокарде крыс, получавших коэнзим <3, при моделировании окислительного пресса удалось выявить сильную положительную корреляцию между интенсивностью сократительной функции миокарда и активностью СОД или ОБН-пероксидазы в сердечной мышце (г=0,91 и г=0,94 соответственно; р<0,05), что указывает на ведущую роль коэнзима О и антиоксидантных ферментов в защите миокарда от окислительного стресса.

Приведенные выше данные явились экспериментальным обоснованием необходимости исследования проявлений окислительного стресса у больных, получающих терапию различными ингибиторами ГМГ-КоА редуктазы, которые согласно схеме на рис. 5 способны подавлять биосинтез коэнзима и, в соответствии с литературными данными (Ьаакзопеп И. е! а1, 1995; МоЛепзеп Б. е! а1, 1997) вызывают реальное снижение уровня коэнзима 0 в ЛНП больных. Исходя из этого, нами было проведено двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, в котором больные ИБС получали в течение 6 месяцев либо ингибитор ГМГ-КоА редуктазы правастатин и плацебо коэнзима (2, либо правастатин совместно с коэнзимом СХ В результате было показано, что при монотерапии правастатином уровень окси-ЛНП в крови больных неуклонно увеличивается и к 6 мес достоверно (р<0,05) возрастает на 30% от исходного уровня (рис.9,10), тогда как в крови больных, получавших правастатин с коэнзимом С) уровень окси-ЛНП снижался более чем вдвое уже через 1 мес после начала терапии, а со 2 по 6 мес составлял не более 20-30% от исходного уровня (рис.9,10).

л =г

X

Ф

3 х л

о о

X

5

Рис. 9. Изменение уровня окси-ЛНП и активности СЪН-пероксидазы в крови больных, получавших в течение б месяцев правастатин+плацебо

коэнзима <2 (светлые столбики) или правастатин+коэнзим (2 (заштрихованные столбики); уровень показателей до терапии принят за

единицу, *-р<0,05

Монотерапия правастатином провоцирует не только увеличение уровня окси-ЛНП (рис.9), но и резкое снижение активности утилизирующего липопероксиды фермента - селен-содержащей ОБН-пероксидазы в крови больных (рис.9) в период с 4 по 6 мес наблюдения (почти на 80% от исходного уровня), что является экспериментальным подтверждением справедливости метаболической схемы, представленной на рис.5. В крови больных, получавших правастатин+коэнзим О активность ОБН-пероксидазы снижалась не столь резко и к 6 мес составляла около 60% от исходного уровня (рис.9). При монотерапии больных ИБС симвастатином в течение 2 месяцев уровень окси-ЛНП в крови больных также достоверно возрастал в 2,5 раза по сравнению с исходным (рис.10).

Рис.10. Уровень липопероксидов вЛНП (окси-ЛНП) в крови больных, получавших правастатин (2), симвастатин (3) и г/еривастатин (4) в течение 6, 2 и бмес соответственно по сравнению с соответствующими контролями (1); уровень окси-ЛНП в группе больных, не получавших статины, в каждом исследовании принят за единицу; * -р<0,05

Во втором двойном слепом плацебо-контролируемом исследовании больные ИБС получали в течение б мес либо ингибитор ГМГ-КоА-редуктазы церивастатин и плацебо пробукола, либо неривастатин совместно с пробуколом в суточной дозе 250 мг. Следует отметить, что наше исследование было проведено в 1999-2000 гг., т.е. в тот период, когда церивастатин широко использовался в клинической практике, до появления данных о повышенном риске миопатии и рабдомиолиза при применении этого препарата (2001 г.), что привело к прекращению его выпуска ((лтипс1у 8.М., 2005). Результаты проведенных нами исследований показали, что при монотерапии церивастатином содержание окси-ЛНП в крови больных резко увеличилось к 3-му мес лечения и оставалось до конца периода наблюдения (6 мес) на уровне в 6-7 раз превышающем

исходный (рис.10), тогда как в группе больных, получавших церивастатин с 250 мг/сут пробукола за 6 мес терапии не было отмечено достоверного изменения содержания окси-ЛНП по сравнению с исходным уровнем.

Суммируя результаты наших исследований можно утверждать, что полученные данные хорошо согласуются с метаболической схемой, представленной на рис.5 и свидетельствуют о том, что при терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы в крови больных ИБС может происходить значительное накопление атерогенных окси-ЛНП вследствие подавления биосинтеза коэнзима Q, а также существенное снижение активности селен-содержащей GSH-пероксидазы вследствие подавления биосинтеза селенопротеинов. Из этого можно сделать вывод, что снижая биосинтез двух важнейших природных антиоксидантов (фенольная форма коэнзима Q, GSH-пероксидаза), ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы обладают прооксидантным действием и способны усиливать проявления окислительного стресса, имеющего место при ИБС и атеросклерозе (см. стр. 21). Как видно из представленных результатов, прооксидантное действие ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы было продемонстрировано нами в многочисленных физиологических и биохимических опытах с использованием экспериментальных животных, а также в разнообразных клинических исследованиях, что усиливает доказательную базу нашей работы. Данные диссертации позволяют сделать логичные предположения о механизме возникновения негативных эффектов, отмеченных при терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы, таких как увеличение активности печеночных трансаминаз в крови пациентов, миопатия, рабдомиолиз и почечная недостаточность (Alsheikh-Ali A.A. et al.,2005). Полученные в нашей работе экспериментальные данные указывают также на потенциальную опасность снижения энергообеспечения миокарда и его сократительной функции при действии ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы. С другой стороны, результаты нашего исследования свидетельствуют о перспективности применения коэнзима Q для снижения уровня

атерогенных окси-ЛНП и защиты антиоксидантных ферментов при окислительном стрессе. По нашему мнению совместное применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы и коэнзима 0 для лечения больных ИБС позволит существенно снизить негативные побочные эффекты статинов (особенно при использовании высоких доз этих препаратов) и существенно повысить эффективность и безопасность холестеринснижающей терапии.

Выводы :

1. Синтетический антиоксидант пробукол в дозе 250 мг/сут не оказывает влияния на липидный обмен, но полностью сохраняет эффективность антиоксидантного действия, характерного для высоких (1000 мг/сут) доз этого препарата, тогда как природный антиоксидант витамин Е в дозе 400 мг/сут не оказывает достоверного влияния на окисляемость ЛНП плазмы крови больных ИБС.

2. Применение синтетического антиоксиданта пробукола в дозе 250 мг/сут сопровождается снижением выраженности окислительного стресса и уменьшением степени рестенозирования коронарных артерий после ТКА, причем выявлена достоверная корреляция между объективными показателями, характеризующими степень рестенозирования и уровнем вторичных продуктов свободнорадикального окисления в крови пациентов.

3. Обнаружено, что при инициированном окислении биомембран печени крыс коэнзим О является наиболее эффективным из исследованных природных антиоксидантов ф-каротин; комплекс витаминов-антиоксидантов и селена).

4. Установлено, что окисляемость биомембран печени под действием ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (симвастатин и ловастатин) резко возрастает как у нативных крыс, так и у крыс с экспериментальной

гиперхолестеринемией, при этом, одновременное введение антиоксидантов способно полностью подавить индуцированный статинами окислительный стресс в печени.

5. Показано, что введение ингибитора ГМГ-КоА редукгазы симвастатина крысам сопровождается достоверным снижением синтеза макроэргических фосфатов (АТФ и креатинфосфат) в миокарде, причем при использовании модели изолированного сердца крысы обнаружено, что сократимость миокарда резко снижается у животных, предварительно получавших ингибитор ГМГ-КоА редуктазы аторвастатин, а индукция окислительного стресса приводит к еще большему снижению сократимости миокарда у этих животных.

6. Показано, что активность ключевых антиоксидантных ферментов (СОД и ОБН-пероксидазы) при окислительном стрессе в миокарде крыс резко снижается, но полностью сохраняется у животных, предварительно получавших коэнзим (3, причем у этих крыс выявлена сильная положительная корреляция между активностью антиоксидантных ферментов и показателем интенсивности сократительной функции миокарда.

7. Установлено, что интенсивность свободнорадикального окисления ЛНП существенно возрастает в крови больных ИБС при наличии таких факторов риска развития атеросклероза как гиперхолестеринемия и сахарный диабет 2 типа.

8. Обнаружено, что применение ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы (правастатин, симвастатин и церивастатин) сопровождается увеличением уровня атерогенных окси-ЛНП в плазме крови больных ИБС, при этом наиболее эффективный из исследованных холестеринснижающих препаратов церивастатин за 3-6 месяцев терапии увеличивает уровень окси-ЛНП в 6-7 раз по сравнению с исходным.

9. Показано, что при терапии больных ИБС с гиперхолестеринемией комбинирование ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы с антиоксидантами (правастатина с коэнзимом Q или церивастатина с пробуколом) предотвращает накопление атерогенных окси-ЛНП в плазме крови, причем при использовании одного правастатина активность GSH-пероксидазы резко снижается, но значительно возрастает при комбинировании правастатина с коэнзимом Q.

Практические рекомендации:

1. Определение уровня окси-ЛНП и активности эритроцитарной GSH-пероксидазы может быть использовано в качестве дополнительных критериев оценки тяжссти заболевания и контроля эффективности и безопасности проводимой терапии (особенно при интенсивной гиполипидемической терапии с использованием ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы).

2. Для профилактики рестенозирования коронарных артерий после ТКА может быть рекомендовано применение синтетического антиоксиданта пробукола в дозе 250 мг в сутки за неделю до вмешательства и в течение последующих 6 месяцев.

3. Рекомендовать использование препарата коэнзима Q в дозе 60 мг/сут в комбинации с ингибиторами ГМГ-КоА редуктазы при проведении интенсивной терапии ингибиторами ГМГ-КоА редуктазы для снижения атерогенной окислительной модификации ЛНП.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lankin V., Tikhaze A., Shumayev К., Nagler L., Kozachenko A., Kaminnyi A., Vyortkin A. - The action of antioxidants on the LDL free radical oxidatoin rate. Atherosclerosis, 1997, v. 134, № 1/2, p.204.

2. Тихазе A.K., Коновалова Г.Г., Михин В.П., Наглер Л.Г., Козаченко А.И., Каминный А.И., Каминная В.И., Верткин А.Л. - Перспективы использования антиоксидантов в комплексной терапии атеросклероза. В кн.: Биоантиоксидант, Изд-во ТГУ, Тюмень, 1997, с. 55-57.

3. Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Гуревич С.М., Козаченко А.И., Каминный А.И., Верткин А.Л., Ланкин В.З. - Влияние природных и синтетических антиоксидантов на чувствительность липопротеидов низкой плотности и биомембран к свободнорадикальному перекисному окислению. Тез. стенд, сообщ. 2-го съезда биохимич. общества РАН, ПНЦ РАН, Пущино, 1997, ч. 1, с. 239-240.

4. Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Козаченко А.И., Гуревич С.М., Наглер Л.Г., Зайцева Т.М., Каминный А.И., Титов В.Н., Кухарчук В В., Ланкин В.З. - Антиоксидант пробукол ингибирует накопление гидропероксидов в липопротеинах низкой плотности плазмы крови человека. Тез. 10-ой международной конф. по химии органич. и элементоорганич. пероксидов, ИХФ РАН, Москва, 1998, В 17.

5. Tikhaze A., Lankin V., Shumaev К., Gurevich S., Nagler L., Kozachenko A., Konovalova G., Kaminnyi A., Vyortkin A. - The influence of endogenous antioxidants on the susceptibility of LDL to free radical oxidation. Abstr. the 1-st Regional Meet, on Med. Sci. " The roles of free radicals in health and deseases ", Jerusalem, Israel & Amman, Jordan, 1998, p. 93.

6. Tikhaze A., Lankin V., Konovalova G., Gurevich S., Kozachenko A., Nagler 1., Shumaev K., Kaminnyi A., Kaminnaya V., Vyortkin A., Samuilov Ya. - Susceptibility of low dencity lipoproteins to free radical oxidation

during antioxidative therapy. Abstr. Int. Conf. "Regulation of biological processes by free radical", Moscow - Yaroslavl, 1998, L7.

7. Tikhaze A., Lankin V., Konovalova G., ICozachenko A., Gurevich S., Nagler L., Shumaev K., Kaminnyi A., Kaminnaya V., Vyortkin A. - The influence of in vitro antioxidants supplementation on the oxidative LDL susceptibility. Abstr. 7-th EAS Congr., Geneva, Switzerland, 1998, p. 156.

8. Tikhaze A., Lankin V., Konovalova G., Kozachenko A., Gurevich S., Nagler L., Shumaev K., Kaminnyi A., Kaminnaya V., Vyortkin A. - The natural and synthetic antioxidants in the prevention of atherogenic LDL modification. Abstr. 10-th Intern. Vascular Biol. Meet., Cairns, Australia, 1998,p.19.

9. Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Козаченко А.И., Гуревич С.М., Наглер Л.Г., Зайцева Т.М., Каминный А.И., Титов В.Н., Кухарчук В.В., Ланкин В.З. - Влияние антиоксиданта пробукола на свободнорадикальное окисление липопротеинов низкой плотности плазмы крови человека. Тез. 5-ой международн. конф. "Биоантиоксидант", ИБХФ РАН, Москва, 1998, с.32.

10.Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Гуревич С. М., Козаченко А.И., Наглер Л.Г., Каминный А.И., Рогинский В.А., Верткин А.Л., Самуилов Я.Д., Ланкин В.З. - Влияние природных и синтетических антиоксидантов на чувствительность ненасыщенных липидов мембран и липопротеидов к свободнорадикальному окислению. Тез. 5-ой международн. конф. "Биоантиоксидант", ИБХФ РАН, Москва, 1998, с.ЗЗ.

11.Tikhaze А.К., Lankin V.Z., Konovalova G.G., Kaminnyi A.I., Kaminnaya V.I. - The natural and synthetic antioxidants in the atherosclerosis therapy. Abstr. SFFR (Europe) Summer Meeting «Antioxidants, Adaptation, Aging», Dresden, Germany, 1999, PI04.

12.Тихазе A.K., Ланкин B.3., Каминный А.И., Шумаев К.Б., Кухарчук В.В. - Пробукол в терапии атеросклероза. Мат. 1-ой Всероссийск. конф. по

проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова, Москва, 1999, сЛ 67.

13.Тихазе А.К., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Шумаев К.Б., Каминный

A.И., Козаченко А.И., Гуревич С.М., Наглер Л.Г., Зайцева Т.М., Кухарчук В.В. - Антиоксидант пробукол является эффективной ловушкой липидных радикалов в липопротеинах низкой плотности in vitro и in vivo. Бюлл. эксп. биол. мед., 1999, т.128, № 8, с.186-189.

14.Тихазе А.К., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Каминный А.И., Каминная

B.И. - Комплексная терапия атеросклероза с использованием природных и синтетических антиоксидантов. Цитология, 1999, т.41, №9, с.778.

15.Тихазе А.К., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Каминный А.И., Каминная В.И. - Синтетические и природные антиоксиданты в предотвращении гиперлипопероксидемии при атеросклерозе. Сборник трудов национальной научно-практич. конф. с международным участием «Свободные радикалы и болезни человека», Смоленск, 1999, с. 108-109.

16.Ланкин В.З., Тихазе А.К., Каминная В.И., Каминный А.И., Коновалова Г.Г., Кухарчук В.В. - Интенсификация свободнорадикального окисления липопротеидов низкой плотности в плазме крови больных ИБС in vivo при терапии ингибитором ГМГ-КоА-редуктазы правастатином и подавление липопероксидации убихиноном Q-10. Бюлл. эксп. биол. мед., 2000, т.129, № 2, с.176-179.

17.Каминный А.И., Тутунов B.C., Каминная В.И, Тихазе А.К., Ланкин В.З. - Увеличение активности глутатионпероксидазы в крови больных ИБС при применении антиоксидантного препарата «Адрузен цинко». Бюлл. эксп. биол. мед., 2000, т.129, № 3, с.277-279.

18.Tikhaze A., Lankin V., Konovalova G., Kaminnyi A., Tutunov V., Kukharchuk V. - The using of different antioxidants in the atherosclerosis therapy. Abstr. Symp. «Oxidative stress & atherosclertosis», Oslo, Norway, 2000, № 048, p.59.

19.Tikhaze A., Lankin V., Konovalova G., Kaminnyi A., Kamiimaya V., Tutunov V., Kukharchuk V. - Prevention of LDL free radical oxidation during atherosclerosis by different antioxidants. Abstr. 10th Biennial Meeting of the Soc. for Free Radic. Res. Intern., Kyoto, Japan, 2000, № 010-7, p.51.

20.Lankin V., Tikhaze A., Konovalova G., Kaminnyi A., Kaminnaya V. - The antioxidative therapy of atherosclerosis with using of natural and synthetic antioxidants. Atherosclerosis, 2000, v.151, № 1, p.308.

21.Панкин B.3., Тихазе A.K., Коновалова Г.Г., Писаренко О.И., Каминный А.И., Тутунов B.C., Каминная В.И., Шепелькова Г.С., Кухарчук В.В. -Свободнорадикальное окисление липопротеинов низкой плотности in vivo при терапии атеросклероза ингибиторами р-гидрокси-р-метилглутарил-коэнзим А редуктазы (статинами) и защитное действие природных антиоксидантов. Тез.докл. 6-ой международн. конф. «Биоантиоксидант», ИБХФ РАН, 2002, с.339-341.

22.Каминный А.И., Панкин В.З., Самко А.Н., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г., Левицкий И.В., Созыкин А.В., Проваторов С.И., Перепелица Е.И., Кухарчук В.В. - Антиоксидант пробукол как перспективный препарат для снижения опасности рестенозирования коронарных сосудов после баллонной ангиопластики. Тез.докл. 6-ой международн. конф. «Биоантиоксидант», ИБХФ РАН, 2002, с.229-231.

23.Коротаева А.А., Проваторов С.И., Самойлова Е.В., Каминный А.И.-Уровень секреторной фосфолипазы Аг в сыворотке крови как предиктор рестеноза после коронарной ангиопластики. Тер.Архив 2002, №4, с. 12-15.

24.Kaminnyi A.I., Kukharchuk V.V., Lankin V.Z., Samko A.N. - Effect of low dosage of an antioxidant probucol on the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). Free Radic. Biol. Med., 2002, v.33(suppl.l), S226.

25.Kaminniy A.I., Kukharchuk V.V., Lankin V.Z., Samko A.N. - Influence of an antioxidant Probucol in a dosage of 250 mg/day on the frequency of

restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). Atherosclerosis, 2002, v.3, (suppl.2), p. 134.

26.Kaminniy А.1., Kukharchuk V.V., Levitsky I.V., Sozikin A.V., Lankin V.Z., Samko A.N. - Effect of low dosage of an antioxidant probucol on the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). Abstr. of 17-th international congress on thrombosis, Bologna, Itali, 2002, p.61.

27.А.И. Каминный, И.В. Левицкий, A.B. Созыкин, Е.И. Перепелица, С.И.Проваторов, А.Н. Самко, В.З. Ланкин, В В. Кухарчук - Влияние антиоксиданта пробукола в дозе 250 мг/сут на частоту рестенозов после транслюминальной коронарной ангиопластики. Материалы 1-го Российского съезда интервенционных кардиоангиологов, Москва, 2002, с. 80.

28.Kaminniy A.I., Lankin V.Z., Samko A.N., Kukharchuk V.V. - Effect of antioxidant probucol in low dosage on the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). - Abstr. of Int.Conf. " Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health", Smolensk, Russia, 2003, p.61.

29.Lankin V.Z., Tikhaze A.K., Kukharchuk V.V., Konovabva G.G., Pisarenko O.I., Kaminnyi A.I., Shumaev K.B., Belenkov Yu.N. - Antioxidants decreases the intensification of low density lipoprotein free radical peroxidation during therapy with statins. Mol. Cell. Biochem., 2003, v. 249, №1/2, p.129-140.

30.Каминный А.И., Ланкин B.3., Кухарчук B.B. Самко А.Н. -Антиоксидантный эффект пробукола в дозе 250 мг/сут на частоту возникния рестенозов после транслюминальной баллонной коронарной ангиопластики. Кардиоваскулярная терапия и профилактика,2004, т.З, №4, с.211.

31.Недосугова Л.В., Тихазе А.К., Лисина М.О., Агеев Ф.Т., Арзамасцева Н.Е., Каминный А.И., Кухарчук В.В., Ланкин В.З. - Липопероксидация

липопротеидов низкой плотности при заболеваниях сердечнососудистой системы и сахарном диабете. Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2004, т.З, №4, с.354.

32.Kaminniy A.I., Lankin V.Z., Samko A.N., Kukharchuk V.V. - Antioxidant effect of low dosage of Probucol on the development of restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). Atherosclerosis, 2004, v.5,№l (suppl.), p. 126.

33.Lankin V.Z., Tikhaze A.K., Kaminniy A.I., Kukharchuk V.V.- Influence of statins on LDL in vivo peroxidation. Atherosclerosis, 2004, v.5, №1 (suppl.), p.131.

34.Панкин B.3., Тихазе A.K., Каминный А.И., Беленков Ю.Н. -Антиоксиданты и атеросклероз: критический анализ проблемы и направление дальнейших исследований. Патогенез, 2004, №1, с.71-86.

35.Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И.В., Каминный А.И., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И. -Изменение антиоксидантного статуса миокарда под влиянием коэнзима Q-10 при окислительном стрессе. Биохимия, 2005, т.70, № 1, с.79-84.

36.Каминный А.И., Ланкин В.З., Самко А.Н., Созыкин А.В., Проваторов С.И., Коновалова Г.Г., Перепелица Е.И., Тихазе А.К., Кухарчук В.В., Беленков Ю.Н. - Антиоксидант пробукол в низкой суточной дозе снижает частоту и степень рестенозирования коронарных артерий после транслюмин&чьной баллонной ангиопластики. Бюлл. эксп. биол. мед., 2005, т.139, №2, с.183-185.

37.Ланкин В.З., Лисина М.О., Арзамасцева Н.Е., Коновалова Г.Г., Недосугова Л.В., Каминный А.И., Тихазе А.К., Агеев Ф.Т., Кухарчук В.В., Беленков Ю.Н. - Окислительный стресс при атеросклерозе и диабете. Бюлл. эксп. биол. мед., 2005, т.140, №1, с.41-43.

38.А.К.Тихазе, Г.Г.Коновалова, В.3.Ланкин, А.И. Каминный, В.И.Каминная, Э.К.Рууге, В.В.Кухарчук - Влияние убихинона Qio и витаминов-антиоксидантов на свободнорадикальное окисление

фосфолипидов биомембран печени крысы. Бюлл. эксп. биол. мед., 2005, т.140, №2, с.181-183.

39.Tikhaze А.К., Lankin V.Z., Kaminniy A.I., Kukharchuk V.V.- Statins and LDL in vivo modification. Atherosclerosis, 2005, v.6/1, №1 (suppl.), p.80.

40.Ланкин B.3., Тихазе A.K., Коновалова Г.Г., Каминный А.И., Арзамасцева Н.Е., Шепелькова Г.С. - Модификация белков при окислительном и карбонильном стрессе. Тез.докл. международн. междисциплинарного конгресса «Достижения современной медицины», Судак, Крым, Украина, 2005, с.108-110.

41.Тихазе А.К., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Каминный А.И., Арзамасцева Н.Е., Кухарчук В.В. - Коэнзим Q и прооксидантный эффект холестеринснижающих препаратов из класса ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы. Труды Международного симпозиума "Молекулярные механизмы регуляции функции клетки", изд-во ТГУ, Тюмень, 2005, с.17-18.

42.Тихазе А.К., Ланкин В.З., Каминный А.И., Кухарчук В.В. -Возможность увеличения эффективности холестеринснижающих препаратов из класса ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы. Тез.докл. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, с.566.

43.Korotaeva A., Samolova I., Kaminniy А.. - The catalitical activity secretory phospholipase A2 is involves in restenosis development after percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA). Moll. Cell. Biochem., 2005, v.270, № 1/2, p. 107-113.

44.Каминный А.И., Ланкин B.3., Каминная В.И., Перепелица Е.И., Шувалова Ю.А., Самко А.Н., Кухарчук В.В. - Положительное влияние антиоксиданта пробукола на частоту и степень рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной баллонной коронарной ангиопластики. Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2006, № 5, с.32-35.

45.Tikhaze A., Lankin V., Kaminnyi A., Arzamastseva N., Kukharchuk V. -Pro-oxidant action of statins. Atherosclerosis, 2006, v.7, issue 3, p.585.

46.Тихазе A.K., Коновалова Г.Г., Каминный А.И., Лакомкин В.Л., Капелько В.И. - Коэнзим Q как ингибитор прооксидантных эффектов холестерин-снижающих препаратов. Материалы XIV международн. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Гурзуф, Крым, Украина, 2006, с.414-415.

47.Ланкин В.З., Тихазе А.К., Лисина М.О., Коновалова Г.Г., Арзамасцева Н.Е., Каминный А.И., Недосугова Л.В. - Окислительный стресс при ишемической болезни сердца и сахарном диабете 2 типа (обзор литературы). Пульмонология, 2006, №12

48.Каминный А.И., Ланкин В.З., Перепелица Е.И., Коновалова Г.Г., Самко А.Н., Тихазе А.К., Кухарчук В.В., Беленков Ю.Н.- Связь процессов свободнорадикального окисления липидов с эффективностью коронарной ангиопластики у больных ишемической болезнью сердца. Бюлл. эксп. биол. мед., 2007, т. , №2

49.Ланкин В.З., Иванова М.В., Коновалова Г.Г., Тихазе А.К., Каминный А.И., Кухарчук В.В. - Влияние ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы и витаминов-анти оксидантов на свободнорадикальное окисление липидов печени крыс. Бюлл. эксп. биол. мед., 2007, т. , №4

50.Лакомкин В.Л., Капелько В.И., Ланкин В.З., Коновалова Г.Г., Каминный А.И. - Влияние ингибитора ГМГ-КоА-редуктазы аторвастатина на сократимость изолированного сердца крыс в норме и при окислительном стрессе. Бюлл. эксп. биол. мед., 2007, т. ,№5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДФ - аденозиндифосфат АТФ - аденозинтрифосфат

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИСФ - интенсивность сократительной функции миокарда

КАТ - коронароангиография

ЛВП - липопротеиды высокой плотности

ЛЖ - левый желудочек

ЛНП - липопротеиды низкой плотности

ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности

МДА - малоновый диальдегид

СОД - супероксиддисмутаза

ТКА - транслюминальная коронарная ангиопластика ТГ - триглицериды ХС - холестерин

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс Сг - креатин

ОБН-пероксидаза - глутатионпероксидаза

ИАОРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный РСг - фосфокреатин

Принято к исполнению 14/02/2007 Исполнено 15/02/2007

Заказ № 103 Тираж: 120 экз.

Тииография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

В настояшее время патология сердечно-сосудистой системы занимает ведущее место среди неинфекционных заболеваний, в связи с чем, весьма важен поиск рациональных подходов к ее терапии. В последние годы получено большое количество результатов, указывающих на важную роль окислительного стресса в этиологии и патогенезе заболеваний сердечнососудистой системы [4,27,28,36,354,400,406]. При атеросклерозе окислительная модификация атерогенных ЛНП способствует увеличению их атерогенности и активному захвату ЛНП моноцитами-макрофагами с последующим образованием пенистых клеток. При апоптозе макрофаги освобождают факторы, способствующие миграции гладкомышечных клеток из медии в интиму с их последующей пролиферацией, что способствует созданию клеточной основы атеросклеротичеекой бляшки, стенозированию артерии и появлению симптомов ИБС [117,242,312]. В настоящее время для реваскуляризации коронарного русла наряду с аортокоронарным шунтированием применяется транслюминальная коронарная ангиопластика (ТКА). Тем не менее, одной из проблем, ограничивающих эффективность этого метода, является последующее рестенозирование [389]. Важную роль в процессе рестенозирования играет тромбообразование и последующая воспалительная реакция, причем продукты свободнорадикального окисления являются медиаторами и тромбообразования, и воспаления [312]. Несмотря на отсутствие видимых успехов при попытках клинического использования антиоксидантов при ИБС, что может быть связано с объективными ошибками в планировании подобных исследований, теоретическая целесообразность их использования, подтвержденная в целом ряде работ является очевидной [27]. В настоящее время обсуждаются определенные трудности, возникающие при широком использовании статинов, особенно при необходимости применения высоких доз этих препаратов, что б сопровождается повышением уровня печеночных трансаминаз в крови пациентов, а также возможностью развития миопатий [56,304]. Эти осложнения объяснимы, учитывая, что статины, являясь ингибиторами ГМГКоА-редуктазы, одновременно подавляют не только синтез ХС, но и синтез важнейших природных антиоксидантов [122], таких как коэнзим Q ! 0 и антиоксидантный фермент глутатионпероксидазу (GSH-пероксидазу). Не вызывает сомнений, что любые попытки повысить эффективность терапии ИБС и атеросклероза являются весьма актуальными. Исходя из этого, в настоящем исследовании мы изучали возможность применения синтетического антиоксиданта пробукола для снижения степени рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики и стентирования, а также рассмотрели вопрос о повышении эффективности холестеринснижающей терапии больных ИБС путем дополнительного введения коэнзим Q-содержащих препаратов.Цель исследования: Разработка подходов к рациональной коррекции окислительного стресса при ТКА и гиполипидемической терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы (статинами) Задачи исследования: 1. Исследовать окисляемость ЛНП при введении высоких доз витамина Е и действие синтетического антиоксиданта пробукола в дозе 250 мг/сут на содержание продуктов свободнорадикального окисления и активность утилизирующего липопероксиды фермента GSHпероксидазы в крови больных ИБС.

2. Изучить действие синтетического антиоксиданта пробукола в низкой суточной дозе (250 мг) на степень рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики.3. Исследовать эффективность антиоксидантного действия коэнзима Q на модели индуцированного окисления биомембран печени.4. Изучить влияние ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы (симвастатина и аторвастатина) на окисляемость биомембран печени у интактных крыс и крыс с экспериментальной гиперхолестеринемией.5. Исследовать влияние ингибитора ГМГ-КоА-редуктазы симвастатина на синтез макроэгических фосфатов (АТФ и креатин фосфата) в миокарде крыс и на модели изолированного сердца изучить влияние аторвастатина на сократительную функцию миокарда в норме н при моделировании окислительного стресса.6. Исследовать влияние окислительного стресса на активность миокардиальных антиоксидантных ферментов супероксид-дисмутазы (СОД) и GSH-пероксидазы у интактных крыс, а также крыс, предварительно получавших коэнзим Q.7. Изучить влияние факторов риска развития атеросклероза гиперхолестеринемии и сахарного диабета 2 типа на уровень оксиЛНП в плазме крови больных.8. Изучить влияние ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы (правастатина, симвастатина и церивастатина) на уровень окси-ЛНП и активность GSH-пероксидазы в крови больных ИБС.

9. Исследовать уровень окси-ЛНП в плазме крови и активность эритроцитарной GSH-пероксидазы у больных ИБС при введении комбинации коэнзима Q с правастатином и пробукола с церивастатином.Научная новизна исследования: Проведен критический анализ недостатков, отмеченных при проведении клинических исследований с использованием природных антиоксидантов, дана углубленная научнообоснованная оценка результатов этих исследований и намечены основные пути преодоления существующих трудностей. В клинических исследованиях нами подтверждено, что высокие дозы витамина Е (400 МЕ/сут) не оказывают достоверного влияния на окисляемость ЛНП в плазме крови больных ИБС и, следовательно, не могут быть использованы для эффективного подавления окислительного стресса при атеросклерозе. При проведении модельных экспериментов с использованием ЭПРспектроскопии, а также в результате клинических исследований установлено, что синтетический антиоксидант пробукол в низкой суточной дозе (250 мг) не обладает гиполипидемическим действием, однако, проявляет такую же антиоксидантную активность in vivo как и при использовании его в дозе 1000 мг/сут. Впервые показано, что использование пробукола в дозе 250 мг/сут сопровождается значительным снижением параметров, характеризующих окислительный стресс in vivo (уровень оксиЛНП и МДА в ЛНП), повышает активность GSH-пероксидазы и существенно снижает степень рестенозирования коронарных артерий после транслюминальной коронарной ангиопластики. Установлено, что основные факторы риска развития атеросклероза - гиперхолестеринемия и сахарный диабет одновременно индуцируют образование окисленных ЛНП плазмы крови. В экспериментах на животных продемонстрировано, что восстановленная форма коэнзима Q является значительно более эффективным антиоксидантом, подавляющим свободнорадикальные процессы в биомембранах, чем комплекс витаминов-антиоксидантов и селена. Впервые обнаружено, что введение животным ингибиторов ГМГКоА-редуктазы, подавляющих биосинтез промежуточного переносчика электронов в митохондриальной цепи окисления - коэнзима Q, сопровождается достоверным снижением синтеза макроэргических фосфатов (АТФ и креатинфосфата) в миокарде экспериментальных животных, при одновременном снижении сократимости сердечной мышцы, причем в условиях окислительного стресса введение статинов приводит к более выраженному снижению сократимости миокарда. Впервые обнаружено, что при введении ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы окисляемость биомембран печени как у интактных животных, так и у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией резко увеличивается, причем введение антиоксидантов способствует нормализации этих процессов. При проведении двойных слепых плацебо-контролируемых исследований впервые было установлено, что ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы способны резко снижать активность эритроцитарной GSH-пероксидазы и провоцировать экстремальное накопление окси-ЛНП в плазме крови больных ИБС, причем одновременное введение препарата коэнзима Q полностью подавляет процессы свободнорадикального окисления в ЛНП и в значительной степени способствуют сохранению исходной GSHпероксидазной активности. Показано, что прооксидантное действие ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы возрастает в ряду: правастатин, симвастатин и церивастатин, что сопоставимо с увеличением гиполипидемической активности этих препаратов. Полученные данные подтверждают высказанные нами ранее предположения о целесообразности применения низких доз пробукола для снижения степени рестенозирования при ТКА, а также свидетельствуют о целесообразности введения коэнзима Q в комплексную холестеринснижаюшую терапию больных ИБС при условии биохимического тестирования основных параметров окислительного стресса.Основные положения, выносимые на защиту: 1. Синтетический фенольный антиоксидант пробукол при применении в суточной дозе 250 мг эффективно подавляет свободнорадикальное окисление липидов в крови больных ИБС (снижает накопление окси-ЛНП и МДА в ЛНП) н увеличивает активность утилизирующей липопероксиды эритроцитарной GSH-пероксидазы, не влияя на показатели липидного обмена.2. Снижение интенсивности свобод норади кал ьных процессов путем предварительного введения пробукола в дозе 250 мг/сутки за 7 дней до ю проведения ТКА и в течение 6 месяцев после ТКА сопровождается снижением степени рестенозирования коронарных артерий.3- Введение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы экспериментальным животным (крысы) вызывает интенсификацию свободнорадикального окисления мембранных фосфолипидов печени, снижает энергообеспечение миокарда и интенсивность сократительной функции изолированного сердца.4. Применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы сопровождается накоплением окси-ЛНП и снижением активности утилизирующей липопероксиды GSH-пероксидазы, причем добавление к гиполипидемической терапии коэнзима Q подавляет прооксидантное действие статинов.Практическая значимость работы: 1. Показано, что синтетический антиоксидант пробукол в дозе 250 мг/сут не оказывает достоверного влияния на липидный обмен, но полностью сохраняет антиоксидантные свойства, характерные для высоких доз (1000 мг/сут) этого препарата, что позволяет использовать его в качестве антиоксидантного препарата в клинике для комплексной терапии заболеваний, сопровождающихся интенсификацией свободнорадикальных процессов.2. Установлено, что использование пробукола в дозе 250 мг/сут существенно снижает степень рестенозирования сосудов после транслюминальной коронарной ангиопластики, что повышает эффективность данного метода при минимальных дополнительных затратах.3. Обоснована целесообразность добавления коэнзима Q к стандартной и, особенно, интенсивной терапии ингибиторами ГМГ-КоАредуктазы для снижения атерогенной окислительной модификации лнп.

Результаты исследования

ТерШИ* симластатнном в течение 8 недель привела к достоверному снижению уровня общего ХС с 7,5 ± 0,5 ммоль/я до 6.2 ± 0,9 ммоль/л (на 1 8%) и ХС ЛНП с 5,2 ± 0,8 ммоль/л до 4,9 ±0,7 ммоль/л (на 25%). За время лечения изменения концентрации ХС ЛВП н ТГ у пациентов исследованной группы были не достоверными. Следует отметить, что полученные нами результаты сопоставимы с данными других исследований, в которых изучалось гиполипндемнческос действие симвастатниа в аналогичной дозе.

При сравнении щполнцнлемнческого эффекта необходимо отметить более выраженную эффективность церивастатнна по сравнению с правастатином, Таким образом, наши предположения верны н одновременно с подавлением биосинтеза ХС происходит подавлен не биосинтеза убнхнноня О,*, и мы в нашем исследовании выявили более высокую интенсификацию процессов свободнорадикального окисления в ЛНП. чем в исследовании с использованием правастатина. Действительно, приведенные на рисунке 37 данные показывают, что при монотерапнн цернвастатином уровень лилогидролероксндов в ЛНП резко возрастал к 3-му месяцу терапии, увеличиваясь в 6-7 раз и при дальнейшей лечении существенно не изменялся. Следует отмстить, что в исследовании с использованием правастатина, уровень липогидропероксидов в ЛНП за 6 месяцев терапии возрастал всего на 30% (рис.37). Уровень МДА в результате терапии правастатином также увеличился почти на 40%.

Полученные результаты указывают на возможность резкой интенсификации процессов свободнорадикального окисления ЛНП in vivo при терапии цсривастатнном, что, несомненно, должно приводить к увеличению их атсрогенной модификации.

Относительная активность стнтииов а плане снижения уровня холестерина ЛНП выглядит следующим образом;

Аторвастатин > церивастатнн >симвастатнн > нравастагин и ловастатин > флувастатин, Следовательно, при применении симвастатииа можно было бы ожидать более высокую интенсификацию процессов свободнорадикального окисления ЛНГТ, чем при применении правастатнна, но меньшую, чем при применении цернвастатина.

Рисунок 37, Уровень лнпоперокендов в ЛНП (оксн-ЛНП) в крови больных, получавших лравастатнн (2), снмвастатин (3) и цернвастатнн (4) в течение 6, 2 и 6 мес соответственно но сравнению с соответствующими контролямп (I), уровень окси-ЛНП в группе больных, не получавших стати ны, в каждом исследовании принят за единицу; * - р<0.05

Действительно, результаты проведенного нами исследования показывают (рис.37), что 2~х месячная терапия ингибитором ГМГ-КоА-рслуктаэы снмвасгатнном в лозе 20 мгЛгут сопровождалась значительны*! накоплением липопероксидов в ЛИП Ln vivo, содержание которых возрастало в 2,5 раза. г?г

Изменение уровня МДА в ЛИП носили похожий характер: уровень МДА в ЛИП увеличился на 53% в результате терапии (ркс.38).

Q До качала терапии В Через 2 месяца терапии

Рисунок 38, Изменение содержания МДА в ЛИП (относит ед), выделенных из плазмы крови больных ИБС в процессе терапии с использованием ингибитора А'Гндроксн-Р-мстилглутарнл-гаэнзнм д редуктазы снмвастэтнна в дозе 20 мг/сут. (*р=0+ЕН),

Таким образом, с ростом гнполнпидсмнческой активности препарата возрастает уровень продуктов ПОЛ. Так, в исследований с использованием правастатина уровень липогидропероксидов в ЛИП за 6 месяцев терапии возрастал всего на 30% при одновременном снижении уровня холестерина ЛИП на 24%, применение симвастатина увеличило содержание липогидропероксидов в ЛИП а 2,5 раза, а терапия более

192 активным лштроювпг препаратом иернггдстатнном сопровождалась резким увеличением уроння лнпогндроперокендов {более чем в б раз) уже к 3 месяцу исследования.

Суммируя полученные в этой главе данные можно сделать несколько чрезвычайно важных выводов. Справедливость биохимической схемы, приведенной на рис.23, в главе 5 полностью подтверждается результатами наших исследований. Так, наши исследования свидетельствуют о подавлении биосинтеза коэнзима Q (о чем косвенно свидетельствует накопление оксн-ЛНП) и GSH-пероксндазы при терапии больных ИБС ингибиторами ГМГ-КоЛ-редукгазы (рис. 32,34,35,37). Кроме того, введение экзогенного коэнзима Q при терапии ингибиторами ГМГ-КоА-рсдуктазы способствует резкому снижению уровня окси-ЛНП а крови больных ИБС и увеличивает сохранность эрнтроцнтарной GSH-пероксилазы (риСг32,35). Важно отметить, что поскольку мы использовали стагины с разной гиполнпидемической эффективностью, тахис как правастатин. снмвастатин и «ерящтатин, нх влияние на уровень оксн-ЛНП (рис. 37) соответствовало литературным данным об их активности в подавлении ГМГ-КоА-редуктизы, т.е. правастатин вызывал наименьшее увеличение уровня окси-ЛНП. а церивастатнн - напротив вызывал экстремально высокое увеличение уровня оксн-ЛНП при одинаковом времени действия этих препаратов. Таким образом. проведенные исследования подтверждают возможность прооксидантного действия статинов не только в опытах на экспериментальных животных, как было показано в главах 5 и 6, но и при проведении клинических исследований. Стать хорошее совпадение основных результатов, полученных в экспериментальных и клинических исследованиях с нашей точки зрения не может быть случайным. Более того, полученные результаты убедительно подтверждают высказанную нами гипотезу о важной роли коэнзима Q в регуляции свободнораднкального окисления в организме и об опасности резкого снижения синтеза ХС при действии статинов в связи с возможностью резкого снижения синтеза важнейших природных аитноксндантов - убихииона Q и GSH-лсрокснлазы. Результаты наших исследований также убеждают в там, что введение коэнзнма Q в дополнение к гшюлнпидемнческой терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктяЗЫ может быть оправданным и целесообразным, особенно при проведении «агрессивной» шполипндемическ&й терапии, когда увеличивается опасность мнопатнй и поражения печени.

В последние годы появились данные об антноксидантном действии статннов, связывая этот эффект с нх противовоспалительным действием и подавлением активности NADPH-эависнмой оксидазы в стенке сосуда, которая продуцирует супероксидный анион радикал. Эти данные получены в экспериментальных условиях и не всегда выполнены с использованием корректных методов, Чаше используется метод хемнлюминисценини, который при высокой чувствительности не всегда позволяет дать однозначную трактовку результатов. Кроме того, снижение генерирования супероксидного радикала не может рассматриваться как актноксндантнос действие (П ]. В любом случае мы в своей работе рассматриваем конечный • брутто эффект действия статиное. Даже при наличии ангноксидантиой активности наши данные об увеличении уровеня охси-ЛНП пр действии ста типов убедительно свидетельствуют о том, что in vivo статнны проявляют преимущественно лрооксидантны н эффект [11].

Следует отмепггь, что полученные нами данные после нх публикации нашли подтверждение и в работах других авторов 1225]. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о возможности совершенствования подходов к терапии атеросклероза с целью обеспечения более безопасного применения иигнбиторов ГМГ-КоА-редуктазы. Очевидно, что коэнзнм Q может использоваться в качестве антидота, нивелирующего известные побочные эффекты статннов, В настоя шее время не ставится вопрос об отказе от применения статннов, для многих из которых клиническая эффективность достаточно обоснована, Разнитие исследований в предлагаемом нами направлении, в конечном итоге должно способствовать повышению эффективное™ и безопасности терапии с применением ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы. Следует отмстить, что фармкомпания Метек &. Со,, tnc. на основании результатов пилотных клинических исследований оформила два патента на использования коэнэнма Q в случаях повышения уровня трансаминаз в крови паднеитов и в случаях проявления у них признаков миопатии (патенты США №305140, 1989 и №298535,1989), Приведенные в настоящей главе и главах 5 и б данные, с нашей точки трения, еще более убедительно свидетельствуют о целесообразности включения коэнзнм содержащих препаратов в комплексную терапию ИБС с использованием ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы.

Глава 8.

Основные клинические* инстручентальиыг и лабораторные методы исследования. Клинические методы исследований.

Проводилось клиническое обследование каждого пациента, включающее в себя: осмотр, сбор анамнеза с учетом вредных привычек, факторов риска, диетологических привычек, заболевании родственников, антропометрическое исследование с последующим вычислением ИМТ Во время лечения проводилось наблюдение за общим состоянием больного, частотой приступов стенокардии, переносимостью и побочными эффектами препаратов.

Диетное основного заболевания был установлен на основании клннико-анамнестических данных, результатов инструментальных методов исследования (ЭКГ покоя. ВЭМ, суточного моннторированни ЭКГ). Диагноз постинфарктного кардиосклероза устанавливался при наличии в анамнезе документированного инфаркта миокарда или при наличии патологического зубца Q на ЭКГ. ЭКГ покоя регистрировалась всем пациентам в 12 стандартных отведениях на 4-х канальном электрокардиографе "MingOgraf" фирмы "Siemens" (Германия). С целью определения толерантности к физической нагрузке проводилась ВЭМ проба, Проба выполнялась на велоэргомстре "Multiscriptor "фирмы "Heilige" (Германия) по методике, принятой в НИИ кардиологии РКНПК МЗ РФ с регисграцней ЭКГ в 12 общепринятых отведениях. Диагноз гиперхолсстсринсмии основывался на двукратном определении содержания уровня лнлидов в плазме крови: до и через 2 мсс после соблюдения гнполипндемнческой диеты.

Коронарныйшщннрим и транслюмынальная коронарная ангиопластика, Коронарную ангиопластику' проводили по стандартной методике. Выполняли преднлятацию баллонном, диаметр которого подбирали согласно среднему диаметру участков артерии проксимальнес и дистальнсс стеноза,

Далее в поряженном сегменте либо позиционировался стент без лекарственного покрытия с его последующим расширением, либо проводилась дальнейшая днлатацня сегмента до достижения оптимального ангиографического результата. Номинальный диаметр сгента соответствовал должному диаметру артерии а стено~}нроваином участке. После проведения последней дилятапяи и удаления из коронарной артерии баллонного катетера и коронарного проводника выполнялось контрастирование дилятнрованного участка со съемкой минимум в 2-х ортогональных проекциях. При проведении контрольной КАГ, сьемка выполнялась в тех же проекциях. Остаточный стеноз после стеитнровання составлял не более 10 %, после баллонной ангиопластики - не более 20%, Контрольная КАГ выполнялась всем пациентам через б мес после проведения ТКА. Исследование проводилось на аппарате «tGoroscop 33» (Simens, Германия); съемка каждого стеноза проводилась как минимум в 2-х ортогональных проекциях для его лучшей визуализации. Последующий анализ полученных ангиограмм проводился с помощью системы компьютерного анализа Axiom Artis (Simcns, Германия). Антнографнческий рестеноз определялся как сужение артерии >50% в диаметре в месте днлятааии или стентнровання через 6 месяцев после проведения ТКА.

Б.иохи минские,биофншчеекне и физиологические методы исследования.

Выделение ЛИП, ил: медь-шшциирмтпое окисление in vitro и количественное определение дипогидроперокснйов в ЛИП in vivo. Для выделения ЛИП венозную кровь больных отбирали натощак в присутствии 1 мт/мл ЭДТА и плазму подвергали двухкратному це1гтрнфугированию в градиенте плотности Naßr в течение 2 ч при 42000 об'мнн. в угловом роторе 5QTi при 4°С в ультраЕ|ентрнфуге Bcckman L-8 согласно методике [46], после чего ЛИП диализовалн при 4"С в течение 16 час, ЧйСПШЫ ЛНП полученные по методу [46] были идентичны па элекгрофоретическому поведению, размеру и липидному составу ЛНП, полученным в соответствии с классическим методом Р-ТТщ^^геп [229) Содержание белка й лнп определяли по методу О.Н.Ьовдту е( а1. [235], после чего ЛНП рйзбавлялн до 50 мкг белка/мл раствором, содержащим 0,) 54 М N80 и 50 мМ фосфатный буфер рН 7,4. Окисление ЛНП инициировали при 37° введением 30 мкМ СиБО*, после чего через фиксированные интервалы времени намеряли накопление лнпогидроперокендов при 233 им на спектрофотометре Н]1асЫ 220А (исходные показания автоматически вычитали). По результатам исследований (ДОаз) строили кинетические кривые окисления ЛНП, из которых определяли продолжительность лаг-фазы (период индукции окисления - т. пропорциональный уровню антноксидантов в ЛНП) [25]. Окнсляемость ЛНП ш характеризовали величиной, обратной продолжительности периода индукции - !/т.

Содержание липндных пероксидов в ЛНП определяли специфичным колориметрическим методом, используя реакцию окисления ионов Ре1" в Ре*' а присутствии лнпогидроперокендов и анализируя содержание образованного стехиометрнчсскн Ре'1' при помощи цветной реакции с ксиленолоранжем до и после специфичного восстановления органических (липндных) гидропсроксидов (1*ООН)трифсннлфосфином (ТФФ) [155,272] в соответствии с уравнениями реакции: ЮОН + Рс(1!) + Н* -* №' + Ре(Ш) + Н30

Рс(Ш) + ху1епо1(оранжевый) Рс(Ш)-ху1епо1(краснокоричневый) LOOH + ТФФ восстановленный ЬОН + ТФФ окисленный Содержание вторичных продуктов свободнорадикального окисления (МДА н другие карбонильные соединения) в плазме крови определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в кислой среде как описано ранее [25], анализируя количество образовавшегося трнметннового комплекса на спектрофотометре 1-ШасЫ 220А при 532 км.

Исследование кинетики аскорбят-записи наго енобпднорлтикальною окислении мснасышснньа фосфолнинлои биомембран печени крысы.

Кинетику окисления эндогенных полненовых лниидов в гомогеватах печени исследовали путем индукции сиободнораднкальмык реакций при восстановлении эндогенного железа аскорбиновой кислотой (аскорбат-зависимое окисление) в соответствии с модифицированным методом [25]. Для утою крыс забивали деканнтаиней. после чего печень перфорировали охлажденным нзотоннчиым КС) и гомогенизировали при охлаждении в мнкроразмельчителе тканей Ultra-Turrax SDT-I810 фирмы Tekmar нз расчета 15 мг сырой ткани/мл раствора, содержащего 0,154 M NaC) и 50 мМ K,Na-фосфатный буфер рН 5,9. Полученные гомогенаты инкубировали при постоянном встряхивании в аэробных условиях в присутствии 0,5 мМ аскорбзта [25]. Через определенные интервалы времени (1-5 мин) отбирали пробы инкубационной смеси и выявляли в них содержание вторичных продуктов ПОЛ по реакции с 2-Тнобарбитуровой кислотой, после чего определяли оптическую плотность образцов при 532 им на спектрофотометре HHachi-220A. Исходное поглощение ТБК-реактивных продуктов (до начала инкубации) вычитали нз оптической плотности последующих проб н по результатам определения ДРда строили кинетические кривые, по которым рассчитывали продолжительность лаг-фазы (периода индукции) окисления ненасыщенных фосфолипнлоа биомембран [25].

Окисляеыостъ биомембран характеризовали величиной, обратной продолжительности периода индукции — 1/т.

Выявление фенокенльнмх радикалов пробукола в ЛНП с использованием Э П Р-сп с ктром етр и и. Для обнаружения долгожнвуших феноксильных радикалов пробукола при окислении пробукол-содержаших

I» частиц ЛНП метолом ЭПР-спектрометрии использовали ЛНП (2 мг белка/мл) из плазмы крови бальных, получавших 250 мг/сут пробукола в течение 3-х мес. Фосфолипиды наружного слоя ЛНП окисляли С-15 липокенгенаэой ретикулоцитов кролика [215] до накопления 0,5 мкмоль ацилгидроперокендов/мг белка, после чего гомолиз гидроперокендов с образованием алкоксильных лнпидных радикалов ндуинровали путем внесения 25 мкМ гемнна. Регистрацию спектров ЭПР фенокенльиых радикалов пробукола, образовавшихся при взаимодействии с алкоксн-пронзводными фосфат и пндов ЛНП, проводили как описано ранее [52} на спектрометре Van an E-I09E в аэробных условиях при 25°С и при модуляции магнитного поля 0,25 м'Гл {частота СВЧ-поля 100 кГц , мощность - 100 мВт),

Определение содержания лнпофильных природных антноксидантов в плазме крон и крыс Определение содержания убихинона Q? и Qio, и а-токоферола в сыворотке крови крыс проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии {ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием на приборе Coulochem II, («Environmental Scinces Associate, Inc.», США) с последующей обработкой данных при помошн компьютерной программы той же фирмы.

Определение активности внтнокенляктных ферментов в тканях животных и эрнтршппях Сольных. Селен-зависимая GSI 1-пероксидаза растворимой фракции клеток катализирует реакцию восстановления глутатионом (GSH) перекиси водорода и органических гидроперокендов, включая гидропероксиды полннснаеышенных жирных кислот (LOOH), которые превращаются при этом в стабильные соединения -соответствующие окси-кислоты (LOH), как следует из уравнения реакции: GSH-пероксидаза LOOH + 2 GSH-► LOH + GSSG + HiO

Другой фермент - глутатионрелуктаза (ОКЯО-рсдухтаза) в присутствии восстановленного ннкотннамидаденннлннуклеогидфосфата (ИАОРН) осуществляет регенерацию окисленного глутатнона (0880), образовавшегося в глутатнонпераксидвзной реакции:

0$$С-редукта?а ОЗБО + ЫАОРН + Н*-* 2 СБН + ЫАЭР'

Эти ферментативные реакции положены в основу метола определения липоиероксидаэной активности Зе-содержащей ОЗН-лероксндазы; при этом реакционная среда содержит избыток субстратов - 05Н. ЫАОРН и органический гндролерокенд, а также экзогенную СЗБО'рсдуктазу из дрожжей. В настоящей работе активность цнтозольиой 5е-солсржашей 08Н-перокендазы в тканях экспериментальных животных и эритроцитах человека определяли в сопряженной глутатмонредуктазиой системе по скорости окисления ЗЧАОРН при 340 нм с гндропсроксидом трст-бутила в качестве субстрата по методу 1282] в модификации [23], используя химический анализатор ГР-900 1,аЬ5ув[ет$ Оу в кинетическом режиме работы. При расчете начальной скорости вводили поправку на неферментатнвное окисление 08Н за время реакции. За единицу активности ОЯН-пероксидазы принимали количество фермента, необходимое для окисления I мкмоля С$Н за I мни в условиях эксперимента- Использованный нами вариант метода позволяет проводить анализ без ингнбнровання каталазной активности и определять активность всех 05Н-завнсимых пероксидаз крови, способных восстанавливать липилные гидролерокенды.

Си,2п-супероксидднсмугаза, обнаруженная в растворимой фракции всех исследованных клеток млекопитающих детокенцирует супероксидный анион-радикал (О/"), предотвращая его участие в реакциях, сопровождающихся образованием высоко токсичного гидрокенл-радикала (НО*), способного повреждать молекулы ненасыщенных липндов, углеводов, белков и нуклеиновых кислот: супероксиддисмутаэа 2 0Г+ 2 Н*-* НгСЬ +0г

Б настоящей работе активность Си^п-СОД в тканях экспериментальных животных н эритроцитах человека определяли согласно методу [64] по нншбнрованню восстановления синего нитротстразолня супероксидным радикалом, генерируемым в системе ксантнн-ксантиноксндзза, определяя кинетику образования формазана на регистрирующем спектрофотометре Н|1асЬМ57 при 560 им. За единицу активности СОД принимали количество фермента, необходимое для 50% подавления восстановления синего нитротетразолия в условиях определения. Перед определением активности СОД в эритроцитах проводили осаждение гемоглобина смесью этанол-хлороформ (3:5) [20],

Исследование параметров лниндлого обмена. Содержание общего ХС и трнглнцернлов в плазме крови определяли при помощи эизнматического метода на химическом анализаторе РР-900 [.аЬзуйепи Оу с использованием тест-наборов фирмы ВоеКг^ег. Содержание ХС в ЛВП определяли после осаждения ЛИП и ЛОНП марганисво-^париновым реактивом [47].

Исследование содержания млкрозргичсскнх фосфатов в миокарде. Крыс анестезировали уретэном (2 г/хг массы тела) и кусочки миокарда отбирали охлажденными в жидком азоте щипцами Волленбергера, после чего гомогенизировали в холодной 6% НСЬО* (10 мл/г ткани) в ледяной бане с помощью гомогенизатора "ШОв-Тиггах Т-25" (и!КА - ЬаЬоПесЬик?*), Белки осаждали центрифугированием в рефрижераторной центрифуге "Весктап Ь 6ВИ при ЗОООв в течение 10 мин, супернатанты нейтрализовали 5 М К1СО3 до рН 7,4. Сухую массу образцов определяли взвешиванием части осадков после эксграхцнн НСЬ04 после высушивания в течение 12 часов при ПО" С до постоянной массы. Содержание АТФ н РСг в тканевых экстрактах да определяли спсктро фотометрически. используя глюкозо-6* фосфатдегидрогсиазу, гексакнназу и кретинки назу [286]. Содержание АДФ определяли знзнматически с помощью пиру ватки пазы и лактатдегндрогеназы [286]. для определения уровня Сг в тканях использовали реакцию с а-кафтолом и 2,3-бутандноном. [301). Анализы производили с использованием спектрофотометра "Уапасо-2000'\ Содержание общего креатина (ЕСг) рассчитывали но формуле: ЕСг = РСг + Сг. Содержание аденнннуклеотндов, РСг и Сг в тканях выражали в мнкромолях на 1 грамм сухой массы.

Исследование сократимости изолированного сердца крысы и моделирование в нем окислительного стресса. Согласно методике [19] сердца у крыс удаляли под уретановым наркозом (1,7 г/кг) и нерфузнровалн через аорту раствором Кребса~Хензелейта рН 7,4 с II мМ глюкозы, насыщенным карбогеном (5%СОг+95%Ог) при 37°С. Перфузию осуществляли со скоростью, близко соответствующей величине 10 мл/мии/г. Через левое предсердие в левый желудочек сердца вводили латехеный баллончик, заполненный физиологическим раствором. ОбьЙм баллончика устанавливали на уровне, прн котором днастолнчсскос давление в ЛЖ составляло 12-14 мм рт.ст. н поддерживали его на постоянном уровне. Давление в аорте и ЛЖ, а также <1Р/А регистрировали прн помощи электроманометров Оои№ ЗтаЦшт Р23 ОЬ на полиграфе Ооик1 ВгийЬ 2400 (США), В условиях нзоволюмнческого режима основными показателями силы сокращений миокарда и его энергорасхода были развиваемое давление и показатель интенсивности сократительной функции (произведение развиваемого давления и частоты сердечных сокращений). Схема опыта включала определение максимальной ИСФ при градуальном повышении скорости перфузии в 2 раза, после чего в миокарде индуцировали окислительный стресс посредством введения в перфузат 100 мкМ Н^ при помощи инфуэнонного насоса Заве с регулируемой скоростью, позволяющей поддерживать постоянную концентрацию НД.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пахста статистических программ STATTSTICA 6,0. Оценку достоверности межгрунповых различий проводили с помощью непарамстрнческого метода Майна-Унтни. Достоверность динамики показателей на фоне лечения проводили с помощью непарамстрнческого метода по Вилкоксону. Для выявления взаимосвязи между степенью етенозировання коронарных артерий н биохимическими показателями применяли ненарамстрнчееккй метод корреляционного анализа по Spearmen, Результаты биохимических показателей представлены в виде среднего значения и ошибки среднего (M1SEM), анхн о граф нческнх данных - в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±STD); различия считали достоверными при р<а05.

Практические рекомендации:

1. Определение уровня окси-ЛНП к активности эрнтроцнтирной 0$Н-перохендазы может быть использовано в качестве дополнительных критериев оценки тяжести заболевания н контроля эффективности и безопасности проводимой терапии (особенно при интенсивной гиполипндемнческой терапии с использованием ингибиторов ГМГ-КоА-рсдуктазы).

2. Для профилактики рестенозирования коронарных артерий после ТКА может был. рекомендовано применение синтетического внтнокенданта пробукола в дозе 250 мг в сутки за неделю до вмешательства и в течение последующих 6 месяцев.

3. Рекомендовать использование препарата коэнзима У в дозе 60 мг/сут в комбинации с ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы при проведении интенсивной терапии ингибиторами ГМГ-КоА-редуктазы для снижения зтерогеиной окислительной модификации ЛНГТ