Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Короткоцепочечные жирные кислоты толстокишечной микрофлоры у больных неспецифическим язвенным колитом, их значение в формировании клиники и диагностике

На правах рукописи

РГБ ОД

1 5 НЮ/1 ¿01/

СЕМЕНОВА ЭЛЬЖБЕТА ЭДУАРДОВНА

КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ФОРМИРОВАНИИ КЛИНИКИ И ДИАГНОСТИКЕ

14.00.05-внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г. Москва 2002 г.

На правах рукописи

СЕМЕНОВА ЭЛЬЖБЕТА ЭДУАРДОВНА

КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ТОЛСТОКИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ У БОЛЬНЫХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ФОРМИРОВАНИИ КЛИНИКИ И ДИАГНОСТИКЕ

14.00.05 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2002г.

Работа выполнена на кафедре гастроэнтерологии Учебно-научного центра Медицинского центра Управления Делами Президента Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор О.Н.Минушкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А.Виноградова доктор медицинских наук, профессор А.А.Шептулин

Ведущее учреждение: Российский Государственный

Медицинский Университет

Защита состоится « -/У» ULfaQJ-fJL- 2002 г. в /У ч. на заседании диссертационного совета Д 121.001.01. в Учебно-научном центре Медицинского центра Управления Делами Президента РФ по адресу: 103009, Москва, ул. Воздвиженка, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учебно-научного центра Медицинского центра Управления Делами Президента РФ.

Автореферат разослан « » 2002 г.

Ученый секретарь доктор медицинских наук

диссертационного совета Н.К.Розова

Р//УЪ kW/ 6 /О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неспецифический язвенный колит (НЯК) относится к группе хронических воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), которые являются одной из наиболее серьезных проблем современной гастроэнтерологии, что связано с ежегодным увеличением заболеваемости ВЗК во всем мире (Mendeloff А.1.,1993, Binder V., 1996), трудностями диагностики и лечения.

Современная диагностика ВЗК базируется на совокупности клинических, рентгено-эндоскопических и гистологических данных. Эндоскопические и морфологические данные являются достоверными критериями активности патологического процесса при НЯК и тестами для оценки эффективности проводимого лечения. Однако, получение этих данных в нужное время и в необходимом объеме не всегда возможно вследствие инвазивности используемых методов, сложности как подготовки больных, так и проведения исследования. Поэтому в настоящее время идет активный поиск простых, легко воспроизводимых и достаточно информативных тестов для получения требуемых данных.

Одним из них может являться определение короткоцепочечных жирных кислот (КЖК)микрофлоры толстой кишки. Метод имеет определенные преимущества: простота воспроизведения, возможность работать в реальном масштабе времени, что позволяет вносить своевременные коррективы в терапию (Дубинин A.B., Ардатская М.Д., Бабин В.Н.,1996).

Ранее были предприняты попытки изучения количества ЮКК у больных с НЯК (Roedigeer W.E.W.,1980, Breuer R.Y. et ah, 1991, Ерошкина Т.Д. и др., 1995). Однако, данные исследования не были систематизированными и их результаты имели неоднозначную оценку. По-разному интерпретируется и прогностическая ценность определения исходного уровня ЮКК. Одни исследователи подчеркивают, что положительный эффект терапии с высокой вероятностью можно прогнозировать у больных с НЯК с исходно низкими значениями КЖК в фекалиях, другие не обнаружили признаков, на основании которых можно прогнозировать хороший лечебный эффект.

В связи с вышеизложенным, исследование состава и спектра низкомолекулярных метаболитов сахаролитической микрофлоры толстой кишки у больных с НЯК представляет интерес для определения их диагностического и тактического значения.

Цель исследования: изучить содержание КЖК у больных с неспецифическим язвенным колитом в кишечном содержимом и периферической крови методом ГЖХ-анализа; оценить их диагностическое и тактическое значение. Задачи исследования:

1. Изучить содержание и профиль КЖК у больных с неспецифическим язвенным колитом в кишечном содержимом и сыворотке крови.

2. Оценить взаимосвязь между изучаемыми показателями и тяжестью течения заболевания, степенью распространенности и активности патологического процесса.

3. Изучить динамику содержания КЖК у больных с НЯК под влиянием лекарственных препаратов и оценить возможность их использования как теста лечебной коррекции НЯК. Научная новизна: впервые продемонстрирована возможность

использования метода ГЖХ-анализа для систематического изучения количественного и качественного содержания КЖК в кишечном содержимом и в крови при неспецифическом язвенном колите. Показана возможность внедрения данного метода в комплексной диагностике НЯК.

Установлена связь между содержанием КЖК и различной распространенностью и степенью активности патологического процесса при НЯК. Выявлены особенности в качественном составе КЖК у больных с различной протяженностью и активностью НЯК.

Впервые показана возможность использования данного метода в качестве тест-контроля эффективности лечения, а также продемонстрирована возможность прогнозирования эффективности проводимого лечения у больных НЯК. Найдены критерии индивидуального подбора того или иного вида комплексной терапии для больных НЯК на основе определения КЖК.

Практическая значимость работы: на основе полученных данных показана возможность использования исследования КЖК в комплексном обследовании больных НЯК, что ускорит и упростит диагностику ВЗК. Предложенное исследование дает возможность своевременно и индивидуально подобрать терапию для больных НЯК и объективно оценить ее эффективность в процессе лечения без использования инвазивных методов.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Определяемые КЖК в фекалиях и сыворотке крови, а также профиль кислот С2-С4, значения анаэробного индекса, отношение

изокислот к кислотам с неразветвленной цепью при НЯК четко соотносятся с клинической и эндоскопической симптоматикой, отличаются от таковых у здоровых лиц и у больных СРК.

2. Изменения качественного состава КЖК, особенно С2-С4, следует рассматривать в совокупности. Данные показатели четко соотносятся с распространенностью и активностью НЯК, что позволяет использовать их в качестве опорных критериев для суждения о распространенности и активности воспалительного процесса при НЯК.

3. Количественный и качественный состав КЖК, профили кислот С2-С4, значения анаэробного индекса и отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью соотносятся с клиническими и эндоскопическими данными как исходно, так и на фоне лечения и могут быть использованы в качестве теста для оценки эффективности проводимого лечения, а также для индивидуального подбора' фармакологического средства при лечении больных НЯК.

Апробация работы проведена на заседании кафедры гастроэнтерологии УНЦ Медицинского центра Управления делами Президента РФ.

Отдельные материалы диссертации доложены и представлены на XXVII Ежегодной научной сессии Центрального НИИ Гастроэнтерологии «Гастроэнтерология на рубеже XXI века» (Москва, 2000г.), на 28 конференции «Перспективные направления в изучении патогенеза, новые технологии диагностики и лечения в гастроэнтерологии» (Смоленск, 2000г.), на Falk Workshop «Update in inflammatory bowel diseases» (Ljubljana, Slovenia, 2001 г.), на симпозиуме «Воспалительные заболевания толстой кишки (Левитановские чтения)» (Министерство здравоохранения РФ, ГНЦК, Ассоциация колопроктологов России, Москва, 2001г.).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем работы: диссертация изложена на 151 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав и выводов. Список литературы содержит 140 отечественных и зарубежных источников. Материалы диссертации представлены в 72 таблицах, иллюстрированы 8 графиками и 5 рисунками.

Материалы и методы исследования

Для решения поставленных задач было обследовано 85 больных с НЯК в фазе обострения, проходивших обследование и лечение на

кафедре гастроэнтерологии УНЦ МЦ УДП РФ на базе 51 ГКБ. Диагноз НЯК был верифицирован эндоскопически и морфологически: у 20 человек (24%) имелось тотальное поражение, у 30 человек (35%) - левостороннее и у 35 человек (41%) дистальное поражение в форме проктосигмоидита. Эндоскопическая активность была определена как минимальная у 27 больных (32%), умеренная у 48 больных (56%) и резко выраженная у 10 больных (12%) (по Тгие1оуе Б.С., 1981). У всех больных на основании клинических данных был диагностирован НЯК легкой (38 человека - 45%), средней (43 человек- 51%) и тяжелой (4 человека - 4%) степени тяжести.

Группу сравнения составили 65 больных СРК, отобранные согласно Римским критериям II (1999). Диагноз СРК поставлен методом исключения с использованием современных лабораторно-инструментальных методов исследования. По характеру нарушения стула эти больные были разделены на 2 подгруппы: у 30 человек СРК протекал с преобладанием диареи (СРК-Д), у 35 человек - с преобладанием запора (СРК-3).

Группу нормы составили 30 практически здоровых лиц, у которых в результате полного клинического обследования не было выявлено патологии.

Все группы были сопоставимы по полу и возрасту (таблица 1).

Таблица 1.

Характеристика изучения больных по нозологии, полу и __возрасту.__

Группа Количество больных Средний возраст, лет

N мужчины женщины М: Ж

НЯК 85 41 44 1 : 1,1 43,5±27,5

СРК-3 35 16 19 1 : 1,3 39,5+9,6

СРК-Д 30 13 17 1 : 1,2 34,8+7,4

Группа нормы 30 16 14 1 : 0,9 38,8±5,75

Обследование больных включало: оценку динамики клинических симптомов; клинический анализ крови, мочи; биохимическое исследование крови с определением общего белка и белковых фракций, сахара, холестерина, триглицеридов, общего билирубина и его фракций, AJIT, ACT, ЩФ, мочевины, креатинина, сывороточного железа, электролитов; ультразвуковое исследование органов брюшной полости; рентгенологическое исследование (выборочно); эндоскопическое исследование (ЭГДС, колоноскопия);

морфологическое исследование биоптатов СОТК; бактериологическое исследование кала; определение времени транзита 4 таблеток активированного угля по кишечнику («карболеиовая проба»); определение КЖК в кале и сыворотке крови до лечения, в процессе лечения и после лечения.

Методика определения короткоцепочечиых жирных кислот (С2-С6) методом ГЖХ-анализа.

Методика определения КЖК (С2-Сб) в кале и сыворотке крови складывается из двух этапов: процесса пробоподготовки и непосредственно ГЖХ-анализа.

Анализ образца методом ГЖХ проводится на хроматографе с детектором ионизации в пламени, используя кварцевую капиллярную колонку длинной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с неподвижной фазой типа РРАР толщиной пленки 0,25 мкм. Режим работы - изотермический с температурой термостата 140С°, температурой испарителя и детектора 23ОС0. Газ-носитель - азот, с давлением на входе в колонку 1,8 атм. Расход газа-носителя 2 мл/ мин, водорода 25 мл/ мин, воздуха 300 мл/ мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку - 50:1. Время анализа- 10 мин.

Процесс пробоподготовки фекальных образцов включает: отбор образца в стерильную пробирку, его взвешивание (вес образца около 2г), гомогенизацию в 3 мл дистиллированной воды и 2 мл "внутреннего стандарта" (а,а-диметилмасляной кислоты). Одна часть получаемого гомогенизата после центрифугирования (7000 об/мин в течение 10 мин.) используется для ГЖХ анализа (определение несвязанных КЖК). Во вторую часть вышеуказанного гомогенизата добавляют 2 мл 1 N раствора соляной кислоты (для определения суммарного количества кислот), перемешивают и центрифугируют (7000 об/мин в течение 10 мин). Микрошприцем вводят пробы надосадочной жидкости объемом 1 мкл в испаритель хроматографа.

Из полученных хроматограмм содержание отдельной кислоты в мг/г образца, определяли по формуле: Рп = Р' Бп Кп / Б' Ро, где Р'- вес "внутреннего стандарта" в анализируемом образце, мг, 8п- площадь пика анализируемой кислоты, Б'- площадь пика "внутреннего стандарта", Ро- вес анализируемого образца, мг, Кп- весовые поправочные коэффициенты: К2 /уксусная кислота/=2,54 (±0,01); КЗ /пропионовая кислота/=1,55 (±0,01); К4 /масляная и изомасляная/= 1,19 (±0,01); К5 / валериановая и изовалериановая/=1,08 (±0,01).

Определение содержания КЖК в сыворотке крови: образец сыворотки крови объемом 2мл помещают в центрифужную пробирку, добавляют 1мл стандартного раствора, подкисляют 6N соляной кислотой и центрифугируют при 7000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость объемом 1мкл микрошприцем вводят в испаритель хроматографа. Содержание КЖК для каждой кислоты отдельно в мг/ мл пробы определяли по формуле: Pn = Р' Sn Kn / S' Vo , где Vo-объем пробы, мл, Кп- весовые поправочные коэффициенты. Достоверность методики подтверждена в контрольных опытах на модельных смесях кислот. Ошибка не превышала 2-4%. Чувствительность методики 96±2%. Воспроизводимость результатов 98±2%.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием интегрированной системы статистической обработки и графической визуализации данных "Статграфик" и Microsoft Excel для вероятности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

А. Изучение содержания КЖК в кале и сыворотке крови у исследуемых групп пациентов.

Результаты изучения абсолютного содержания КЖК в кале у больных исследуемых групп и в норме показали, что суммарная концентрация КЖК в группе СРК-3 значительно снижена по сравнению с нормой, при НЯК и СРК-Д отмечается повышение суммарного количества кислот (таблица 2).

Абсолютные концентрации КЖК могут быть выражены следующим рядом: СРК-3>Норма>НЯК>СРК-Д. Вышеуказанные изменения могут быть связаны как с количественным и качественным изменением состава микроорганизмов, так и с изменением среды их обитания (истончение и "уничтожение" гликокаликса, изменение моторики) и уменьшением количества функционирующих колоноцитов.

Для объективизации полученных данных нами были рассчитаны профили уксусной - С2, пропионовой - СЗ и масляной - С4 - кислот, вносящих основной вклад в общий пул кислот (т.е. относительное содержание отдельных кислот в общем пуле, в норме не зависящее ни от количества продуцирующих и утилизирующих метаболиты микроорганизмов, ни от числа эпителиоцитов) (таблица 3).

Таблица 2.

Абсолютное содержание КЖК в фекалиях у больных исследуемых ,_групп и практически здоровых лиц (мг/г).__

Кислоты Норма п=30 СРК-3 п=35 СРК-Д п=30 НЯК п=85

с2 5,88±1,22 3,48±1,12 10,95± 1,42 5,35±1,23

С3 1,79±0,55 0,95±0,13 4,17±1,12 2,34±0,95

¡С4 0,25±0,11 0,19±0,11 0,40+0,13 0,25±0,11

С4 1,72±0,55 0,84±0,12 2,89±0,63 2,72±0,63

«С5 0,40±0,15 0,34±0,П 0,69±0,11 0,51 ±0.16

С5 0,34±0,12 0,17±0,11 0,69±0,20 0,33±0,12

«Q 0,01±0,01 0,02±0,01 0,03±0,01 0,02±0,01

С6 0,14±0,06 0,001+0,001 0,05±0,02 0,12±0,04

Сумма 10,51±2,50 6,18+1,12 19,87±3,61 11,64±2,65

М±ш для р< 0,05

Таблица 3.

Профили С2-С4, анаэробные индексы и отношение изокислот к кислотам у больных исследуемых групп и у практически

здоровых лиц в с »екалиях

Группа Норма n=30 СРК - 3 п=35 СРК - Д п=30 НЯК п=85

с2 0,634±0,004 0,689±0,002* 0,568±0,002* 0,553±0,002*'**

С3 0,189±0,001 0,169±0,006* 0,249±0,007* 0,211 ±0,006*'**

0,176±0,004 0,143±0,002* 0,183±0,004* 0,236±0,006*'**

АИ -0,576 ±0,012 -0,469 ±0,011* -0,757 ±0,012* -0,947±0,012*'**

EiCn/Cn 0,430±0,040 0,719±0,011* 0,299±0,011* 0,411±0,009**

iC4/C4 0,197±0,010 0,337±0,003* 0,135±0,004* 0,135±0,015*'**

iCS/C5 1,471±0,130 4,831±1,120* 0,968+0,121* 3,134±0,981*'**

М±ш для р< 0,05; * - р<0,05 по сравнению с группой нормы и ** - р<0,05 по сравнению между группами

Отмечается повышение долей пропионовой и масляной кислот у больных с НЯК и СРК-Д, и противоположно направленные изменения при СРК-3. Эти изменения свидетельствует об увеличении активности

строгих анаэробов- продуцентов пропионовой и масляной кислот при СРК-Д и противоположно направленные изменения при СРК-3. Эти изменения свидетельствует об увеличении активности строгих анаэробов- продуцентов пропионовой и масляной кислот при СРК-Д и НЯК и активности аэробного звена при СРК-3. Это связано с тем, что при патологии кишечника происходит переключение метаболизма колоноцитов с цикла Кребса на активацию гексозомонофосфатного шунтирования (ГМШ), что при СРК-3 приводит к увеличению продукции токсичных форм кислорода и аэробизации среды, подтвержденной изменениями значений анаэробного индекса АИ (т.е. отношения суммы концентраций пропионовой и масляной кислот к уксусной кислоте).

При СРК-Д и НЯК переключение на ГМШ приводит к активизации анаэробного типа гликолиза, что при СРК-Д активизирует анаэробное звено микрофлоры, а при НЯК способствует нарушению утилизации пропионовой и, в большей степени, масляной кислот колоноцитами. В результате изменяется окислительно-восстановительный потенциал среды, что отражается в смещении АИ при НЯК в более отрицательную область по сравнению с нормой и СРК-Д и благоприятствует активизации условно-патогенных анаэробов.

При изучении соотношения изокислоты/ кислоты с неразветвленной цепью (2лСп/Сп, ¡С4/С4, ¡С5/С5) (таблица 3) отмечаются разнонаправленные сдвиги в продукции изомеров кислот при различных формах СРК и НЯК, указывающие на изменение процессов протеолиза. Данные изменения могут быть связаны с несколькими факторами: ухудшением вязкостных характеристик слизи, изменением муцинообразования, усилением экскреции слизи с фекальными массами, а также с изменением активности различных видов микрофлоры (анаэробы обладают болеее низкой протеолитической активностью, а протеолиз у аэробов наооборот резко выражен). При НЯК соотношение изокислот к кислотам смещается в сторону увеличения продукции изомеров, подобно изменениям при СРК-3. Вероятно, это связано с активизацией «микроорганизмов-гемолитиков», способных к протеолизу, при повышенном содержании крови у больных НЯК вследствие кишечной кровоточивости (гемолитические штаммы аэробов-Е.соП и анаэробов-Клостридии).

В сыворотке крови у больных НЯК отмечается повышение абсолютного и относительного содержания как отдельных кислот, так

и их суммарного количества. При этом в профиле С2-С4 выявлено снижение доли уксусной кислоты при увеличении долей пропионовой и, в основном, масляной кислот. Вероятно, это связано с повышенной проницаемостью СОТК при НЯК, что подтверждается нашими данными, т.к. при СРК нами не было выявлено отклонений от нормы показателей содержания ЮКК, что объясняется целостностью СОТК при данной патологии.

___________________Вышеуказа

иные параметры были изучены у больных НЯК в кале в

зависимост и от

локализаци и

воспаления, активности

График 1. Результаты изучения профилей С2-С4 в кале у больных НЯК различной распространенности.

дистальный левосторонний тотальный

патологического процесса и степени тяжести заболевания. Результаты представлены на графиках 1-2 и в таблице 4.

При дистальном поражении профили пропионовой и масляной кислот симметрично повышаются, в группах с левосторонним и тотальным поражением эти изменения разнонаправленны: при левостороннем язвенном колите доминирует увеличение доли масляной кислоты, а при тотальном - пропионовой (график 1). Это может быть связано с тем, что различные отделы толстой кишки заселены разными популяциями микроорганизмов и утилизация и абсорбция ЮКК также различны. При этом во всех трех группах отмечается тенденция к усугублению патологических изменений в составе ЮКК в зависимости от нарастания распространенности язвенного колита.

Профиль С2-С4 в зависимости от активности процесса представлен на графике 2. При увеличении степени активности воспаления отмечается увеличение доли масляной кислоты и снижение доли пропионовой кислоты, что может быть объяснено метаболическим блоком окисления масляной кислоты в колоноцитах.

Таблица 4.

Профили С2-С4 и АИ в фекалиях у больных с различной распространенностью и активностью НЯК и у практически _здоровых лиц.__

Группа Сг С3 АИ

Норма 0,634±0,004 0,189±0,001 0,176±0,004 -0,576 ±0,012

г Распрост-1раненность Д и стальным 0,564±0,003* 0,218±0,001* " 0,217±0,002* " -0,820±0,011" "

Левосторонний 0,566±0,003* 0,197±0,001* ** 0,239±0,003* ** -0,847±0,010* "

Тотальный 0,523±0,002* " 0,242±0,002* " 0,232±0,003* " -0,958±0,012*-"

Активность I степень 0.566±0.003* 0.213±0.002* 0.220±0.002* " -0.811±0.011* "

2 степень 0.556±0.003* 0.215±0.002* 0.228±0.002* ** -1.026±0.012* "

3 степень 0.540±0.002* 0.204±0.003* 0.255±0.003* ** -0.895±0.010* "

М±ш для р< 0,05; * - р<0,05 по сравнению с группой нормы и ** - р<0,05 по сравнению между группами

График 2. Результаты изучения профилей С2-С4 в кале у больных с различной активностью НЯК.

В

таблице 5 представле ны

результат ы

изучения отношения содержани я

отдельных изокислот (изоСп, изоС4) к кислотам

(Сп, С4) у больных НЯК с различной распространенностью и активностью воспалительного процесса и у практически здоровых лиц. Полученные данные в отношении суммы изо-Сп и изо-С4, по нашему мнению, не имеют диагностического значения для установления протяженности воспалительного процесса.

Таблица 5.

Отношение изокислот к кислотам в кале у больных с различной

распространенностью и активностью НЯК и у практически ___________ здоровых лиц. _

Группа EiCn/Cn IC4/C4 IC5/C5

Норма 0,430+0,040 0,197+0,010 1,471±0,130

Распространенность дистальный 0,370±0,010* 0,146+0,030* 2,30+0,150*

левосторонний 0,38 i ±0,011 0,136+0,025* 2,662+0,190*

тотальный 0,312±0,014* 0,106±0,020* 7,359+1,531 *

Активность 1 степень 0.174+0.010*** 0.093+0.030* ** 0.975±0.150* **

2 степень 0.441±0.019* ** 0.139±0.025*' ** 2.972+0.190* **

3 степень 0.485+0.021*" 0.151±0.020* ** 4.443+1.531* **

Примечание: М±гп для р< 0,05; * - р<0,05 при сравнении с группой нормы и ** - р<0,05 при сравнении между группами

С увеличением степени эндоскопической активности язвенного колита нарастает изменение отношения отдельных изокислот (изоСп, изоС4, изоС5) к кислотам (Сп, С4, С5). Исходно сниженные показатели отношения изокислот к кислотам у больных с первой степенью активности НЯК, по отношению не только к группе нормы, но и к группе СРК-Д, по всей вероятности, связаны с нарушенным слизеобразованием и слизевыведением, а также со сниженной протеолитической активностью негемолитических анаэробных штаммов. При нарастании степени активности и, соответственно, увеличении кишечной кровоточивости, а также с изменением окислительно-восстановительного потенциала внутренней среды, соотношение смещается в сторону нарастания изокислот, продуцируемых гемолизирующими микроорганизмами-

протеолитиками.

При изучении профилей С2-С4, АИ и отношения отдельных изокислот (изоСп, изоС4, изоС5) к кислотам с неразветвленной цепью (Сп, С4, С5)у больных НЯК с различной клинической степенью тяжести нами не было выявлено диагностически значимых изменений в зависимости от степени тяжести НЯК.

При изучении качественного состава КЖК в сыворотке крови были выявлены те же тенденции, что и изменения в кале, и которые явились их «зеркальным » отображением:

уменьшение доли уксусной кислоты при повышении долей пропионовой и масляной кислот при легкой степени тяжести и незначительные изменения долей уксусной и пропионовой кислот при повышении доли масляной кислоты при средней степени тяжести;

снижение долей пропионовой и масляной кислот в профиле кислот С2-С4 при 1 степени активности и разнонаправленные изменения профилей пропионовой и масляной кислот при 2-й и 3-й степенях активности: повышение в большей степени пропионовой кислоты при 2 степени и повышение в большей степени масляной кислоты при 3 степени;

снижение доли уксусной кислоты на фоне повышения доли пропионовой кислоты по мере увеличения распространенности НЯК и разнонаправленное изменение профиля масляной кислоты.

В. Изучение содержания КЖК у больных НЯК на фоне лечения.

75 больным НЯК проводилось лечение препаратами 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) в среднетерапевтической дозе 3,0 г в сутки в течение 28-30 дней. Критериями эффективности лечения служили: динамика основных клинических симптомов и эндоскопических данных через 30 дней.

По результатам оценки эффективности лечения (клиническим и эндоскопическим) больные были распределены на 2 группы:

- 1 группа - наступление клинической и эндоскопической ремиссии или наступление ремиссии по одному из показателей и стихание процесса по другому на фоне монотерапии 5-АСК - 45 человек (60%);

- 2 группа - незначительная динамика основных клинических и/или эндоскопических симптомов или отсутствие ее на фоне монотерапии 5-АСК (даже после увеличения дозы препарата) - 30 ; человек (40%).

Пациентам из второй группы после неэффективной монотерапии 5-АСК назначалось комплексное лечение:

- 12 больных на фоне приема 5-АСК получали гидрокортизон в дозе 125 мг в микроклизмах в течение 12 дней,

- 11 человек получали препарат "Энтеросан"* в дозе 0,9 г/сутки в течение 30 дней,

- 7 человек получали метронидазол в 0,75 г/сутки в течение 25 дней.

Результаты изучения КЖК показали, что у больных НЯК 1 группы после эффективного лечения препаратами 5-АСК отмечается снижение исходно повышенного абсолютного суммарного содержания КЖК за счет уменьшения концентрации отдельных кислот, в частности, уксусной, пропионовой и масляной. В качественном составе КЖК после лечения отмечается тенденция к формированию нормального соотношения отдельных кислот в общем пуле. Это связано, по всей вероятности, с изменением метаболической активности анаэробных популяций, с увеличением количества абсорбирующих единиц (функционирующих колоноцитов) и с нормализацией пассажа по толстой кишке. Подобные изменения подтверждаются при изучении профилей КЖК с длиной углеродной цепи С2-С4 и отношения изокислот к кислотам с неразветвленной цепью (таблицы 7 и 8).

Изменение соотношения кислот С2-С4 отражается в тенденции к нормализации окислительно-восстановительного потенциала среды на фоне лечения 5-АСК, что способствует активизации облигатной микрофлоры. Максимальные изменения наблюдаются у анаэробных популяций - продуцентов пропионовой и масляной кислот и у родов аэробных и анаэробных бактерий, обладающих протеолитической активностью с продукцией изомеров КЖК. Представленные изменения содержания КЖК четко согласуются с динамикой результатов клинических, клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования на фоне лечения (снижение частоты дефекаций, улучшение консистенции кала, восстановление целостности слизистой оболочки толстой кишки по данным эндоскопии) и могут служить критериями эффективности лечебной коррекции.

У больных 2 группы (с отсутствием положительного эффекта монотерапии 5-АСК) исходно отмечались более низкие показатели абсолютного содержания КЖК: как суммарного, так и отдельных кислот. Изменения качественного состава КЖК носили более грубый

«Энтеросан» - это природная смесь высушенной гомогенной массы покровной пластины мускульного желудка птицы, состоявшей из застывшего секрета простых желез и покровного эпителия. Он оказывает бактериостатическое действие на грамположительные микроорганизмы (уменьшает процессы гниения и брожения), адсорбирующее и антитоксическое действие на энтеропатогенные бактерии, а также влияет на приэпителиальный барьер «защиты» кишечной стенки.

характер и в процессе монотерапии 5-АСК, оказавшейся неэффективной, было отмечено усугубление имевшихся нарушений. По всей вероятности, это можно считать неблагоприятным прогностическим признаком в отношении эффективности монотерапии 5-АСК. Возможно это связано с усилением активности НЯК на фоне затянувшегося обострения и усугублением морфо-функциональных нарушений в эпителии СОТК, а следовательно и метаболического блока окисления масляной кислоты в колоноцитах, который в свою очередь инициируется и/или усугубляется интестинальной потерей жидкости и нарушением обмена ионов и Н+, в регуляции которых через цАМФ-зависимые системы участвует пропионовая кислота.

Таблица 7.

Профили С2-С4 и анаэробные индексы в фекалиях у больных НЯК в зависимости от эффективности проводимого лечения и у

практически здоровых лиц (ретроспективная оценка).

Группа С2 сз С4 АИ

Норма 0.634±0.004 0.189±0.001 0.176±0.004 -0.576±0.012

до лечения (группа эффективной монотерапии 5-АСК) 0.553±0.003* 0.211±0.002* 0.236±0.003* -0.947±0.014*

после эффективной монотерапии 5-АСК 0.589±0.004** 0.190±0.001** 0.225±0.003** -0.740±0.013**

неэффективная монотерапия 5-АСК (1 тип) 0.418±0.006* 0.268±0.003* 0.312±0.004* -1.387±0.015*

после лечения 5-АСК и гидрокортизоном 0.629±0.003** 0.198±0.001** 0.171±0.002** -0.590i0.012*"

неэффективная ¡ионотерапия 5-АСК (2 тип) 0.496±0.004* 0.235±0.004* 0.268±0.003* -1.014±0.015*

после лечения 5-АСК и метронидазолом 0.572±0.004** 0.195±0.004** 0.175±0.004** -0.647±0.012"

неэффективная монотерапии 5-АСК(3 тип) 0.564±0.003* 0.251±0.003* 0.184±0.003* -0.771±0.013*

после лечения 5-АСК и энтеросаном 0.618±0.004** 0.192±0.002** 0.178±0.003** -0.598i0.012*4

Примечание: М±м, где р< 0,05; * - р<0,05 при сравнении с группой нормы и между группами и **-- р<0,05 при сравнении показателей до и после лечения.

Таблица 8.

Отношение содержания отдельных изокислот (изоСп, изоС4, нзоС5) к кислотам (Сп, С4, С5) в фекалиях у больных НЯК в зависимости от эффективности проводимого лечения и у

Группа Е ¡Сп/Сп ¡С4/С4 ¡С5/С5

Норма 0.430± 0.04 0.197+ 0.02 1.471± 0.13

до лечения (группа эффективной монотерапп 5-АСК) 0.414±0.003* 0.135±0.002* 3.134±0.003*

после эффективной монотерапии 5-АСК 0.420±0.004** 0.178±0.001** 0.947±0.003**

неэффективная монотерапия 5-АСК (1 тип) 0.122±0.006* 0.039±0.003* 9.219±0.004*

после лечения 5-АСК и гидрокортизоном 0.173±0.003** 0.101±0.001** 0.619±0.002**

неэффективная монотерапия 5-АСК (2 тип) 0.78 ¡±0.004* 0.378±0.004* 2.100±0.003*

после лечения 5-АСК и метронидазолом 0.485±0.004** 0.218±0.004** 1.502±0.004**

неэффективная монотерапии 5-АСК(3 тип) 0.169±0.003* 0.074±0.003 * 0.981±0.003*

после лечения 5-АСК и энтеросаном 0.347±0.004** 0.145±0.002** 1.263±0.003**

Примечание: М±м, где р< 0,05; * - р<0,05 при сравнении с группой нормы и между группами и **-- р<0,05 при сравнении показателей до и после лечения.

При дальнейшем ретроспективном анализе полученных данных оказалось, что группа больных НЯК с отсутствием положительного эффекта от монотерапии 5-АСК может быть разделена на 3 подгруппы с различными типами изначального изменения состава КЖК. Было выявлено, что каждая из подгрупп имеет характерные особенности в содержании КЖК.

В первой подгруппе больных изначально отмечается резкое снижение доли уксусной кислоты на фоне повышения доли масляной кислоты и пропионовой, что отражается в смещении АИ в резко отрицательную область.

Рисунок 1. Хроматограмма разделения КЖК в кале. Больной II., 37 лет. НЯК, хронического рецидивирующего течения, в стадии обострения, левостороннее поражение, умеренной степени активности, средней степени тяжести. Отсутствие положительного эффекта при монотерапии препаратом 5-АСК в дозе 4,0 г/сут. Положительный эффект после включения в схему лечения гидрокортизона в дозе 125 мг в микроклизмах №12.

При этом содержание изокислот снижается, а соотношение изоС5/С5 превышает нормальные показатели в 6 раз (таблицы 7 и 8, рис.1). Изменения показателей уровня КЖК в этой группе могут быть связаны с нарушением муцинообразования, дифференцировки и пролиферации эпителиоцитов СОТК и нарушением состава и функциональной активности микрофлоры толстой кишки. В результате этого просветные микробные агенты и/или продукты их жизнедеятельности получают доступ к слизистой оболочке через нарушенный слизистый барьер, где они активируют иммунокомпетентные клетки. При этом нарушенное регулирование местного (СОТК) и системного звеньев иммунной системы приводит к активации самоподдерживающегося воспалительного каскада. Этот

каскад может вовлекать некоторые или все провоспалительные и противовоспалительные медиаторы. Увеличение всасывания бактериальных агентов, нарушение симбионтных отношений между микрофлорой и организмом, оказывают стимулирующий эффект на эти процессы. Данная подгруппа больных получала комбинированное лечение препаратами 5-АСК в дозе 3,0 г/сут. и гидрокортизоном 125 мг с выраженным положительным эффектом. Очевидно, у больных первой подгруппы ведущее место в формировании заболевания играли аутоиммунные нарушения, что и отразилось в резистентности к монотерапии 5-АСК и положительном эффекте от применения глкжокортикоидов, который отражается в тенденции к формированию нормального соотношения кислот с длиной углеродной цепи С2-С4, изокислот и кислот с неразветвленной цепью, а также в нормализации АИ после лечения.

хронического рецидивирующего течения, в стадии обострения, в форме проктосигмоидита, умеренной степени активности, средней степени тяжести. Положительный эффект на фоне комплексной терапии препаратом 5-АСК в дозе 4,0 г/сут. и метронидазолом в дозе 0,75 г/сут.

Рисунок 3. Хроматограмма разделения КЖК в кале. Больная С., 43 года. НЖ, хронического рецидивирующего течения, в стадии обострения, левостороннее поражение, умеренной степени активности, легкой степени тяжести. Положительный эффект на фоне комплексной терапии сульфасалазином в дозе 4,0 г/сут. и энтеросаном в дозе 0,9 г/сут.

Во второй подгруппе больных до лечения в профиле кислот С2-С4 отмечается доминирование масляной кислоты (таблица 7). В соотношении изокислоты/кислоты с неразветвленной углеродной цепью у этой группы больных обнаружено превалирование изомеров кислот (таблица 8, рис.2). По всей вероятности, это происходит за счет изменения внутрипросветной среды и активизации анаэробной (род Clostridium) микрофлоры, которые являются сильными протеолитиками. Это подтверждает положительный эффект проводившегося лечения 5-АСК 4,0 г/сут и метронидазолом 0,75 г/сут, который относится к числу эффективных средств для лечения

анаэробной инфекции. На фоне комбинированного лечения выраженно снижается доля масляной кислоты и изокислот, повышается доля уксусной кислоты и нормализуется окислительно-восстановительный баланс среды, что отражается в повышении АИ и создает благоприятные условия для активизации облигатной микрофлоры.

У больных третьей подгруппы до лечения в профиле кислот С2-С4 отмечается наибольшее увеличение доли пропионовой кислоты (таблица 7). Доля масляной кислоты повышена незначительно. Уровень изокислот резко снижен (таблица 8, рис.3). Ремиссия у данной подгруппы больных была достигнута на фоне комбинированной терапии 5-АСК в дозе 4,0 г/сут. и энтеросаном в дозе 0,9 г/сут. После лечения снижается частотное содержание пропионовой кислоты (которая является метаболитом жизнедеятельности как сапрофитных штаммов бактероидов (Г-), так и условно-патогенных штаммов), изменяются профили уксусной и масляной кислот с тенденцией образования нормопрофиля. Восстанавливаются нормальные показатели содержания изокислот. Это связано с улучшением состава приэпителиального гликокаликсного слоя, что способствует восстановлению полноценного состава микрофлоры.

ВЫВОДЫ.

1. КЖК в фекалиях и сыворотке крови, а также профиль С2-С4, значения анаэробного индекса, отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью, при НЯК четко соотносятся с клинической и эндоскопической симптоматикой и отличаются от таковых у здоровых лиц и у больных СРК.

2. О распространенности и активности НЯК свидетельствует изменение качественного состава КЖК:

при дистальном поражении в профиле С2-С4 повышены доли пропионовой (0,218±0,005 ед.) и масляной кислот (0,217±0,002 ед.);

при левостороннем поражении в профиле С2-С4 повышены доля масляной кислоты (0,239±0,003 ед.) и пропионовой (0,197^0,004

ед-);

при тотальном поражении в профиле С2-С4 увеличена доля пропионовой кислоты (0,242±0,004 ед.) при меньшем увеличении

масляной кислоты (0,232^0,006 ед.) на фоне снижения доли уксусной (0,523±0,002 ед.);

эти изменения отражаются в резком отклонении значений АИ в более отрицательную область по мере распространения НЯК: от -0,820±0,012 ед. при дистальном поражении, -0,847±0,012 ед. при левостороннем поражении, до -0,958±0,012 ед. при тотальном поражении;

при 1 степени активности профиль масляной кислоты 0,220±0,003 ед., отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью EiCn/Cn=0,174±0,01, iC4/C4=0,093±0,03, ¡С5/С5=0,975±0,15ед.;

при 2 степени активности профиль масляной кислоты 0,228±0,003 ед., отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью Е1Сп/Сп=0,441±0,019, Ю4/С4=0,139±0,03, ¡С5/С5=2,972±0,19ед.;

при 3 степени активности профиль масляной кислоты 0,255±0,006 ед., отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью EiCn/Cn=0,485±0,021, iC4/C4=0,151±0,02, ¡С5/С5=4,443±1,53ед.

3. Количественный и качественный состав КЖК, профили С2-С4,

значения анаэробного индекса и отношение изокислот к кислотам с неразветвленной цепью при НЯК достоверно изменяются в процессе лечения и соответствуют клинической и эндоскопической динамике процесса.

4. Определение КЖК может использоваться в качестве

скринингового теста для динамической оценки эффективности проводимой терапии. При положительном эффекте отмечается тенденция к улучшению определяемых показателей. Отсутствие положительной динамики или усугубление имевшихся нарушений свидетельствует о неэффективности назначенной терапии и требует либо коррекции дозы препарата либо назначения комплексной терапии: лечение препаратами 5АСК наиболее эффективно при исходном увеличении пропионовой и масляной кислот (0,211±0,002 и 0,23 6±0,003 ед. соответственно) и исходно сниженном отношении изокислот к кислотам (EiCn/Cn=0,414±0,003, Ю4/С4=0,135±0,002

ед.);

проведение комплексной терапии 5-АСК и глюкокортикоидными гормонами наиболее оправдано при увеличении долей пропионовой и масляной кислот (0,268±0,003 и 0,312±0,004 ед.

соответственно) и снижении доли уксусной кислоты (0,418±0,006 ед.), при снижении отношения суммы изокислот к кислотам и изомасляной к масляной кислоте (Е1Сп/Сп=0,122±0,006, ¡С4/С4=0,039±0,003 ед. соответственно) и повышенном соотношении изовалериановой к валериановой кислоте (¡С5/С5=9,219±0,004 ед.);

комбинированная терапия препаратами 5-АСК с метронидазолом наиболее целесообразна при исходном повышении в основном масляной кислоты (0,312±0,004 ед.), повышении пропионовой кислоты (0,23 5±0,004 ед.) и снижении уксусной кислоты (0,496±0,004 ед.), при повышенных значениях индексов отношения изокислот к кислотам (Е1Сп/Сп=0,781 ±0,004, 1С4/С4=0,378±0,004, ¡С5/С5=2,101±0,003 ед);

комбинированная терапия препаратами 5-АСК с энтеросаном наиболее целесообразна при исходном повышении в основном пропионовой кислоты (0,251 ±0,003 ед.), при повышении масляной кислоты (0,184±0,004 ед.) и снижении уксусной кислоты(0,564±0,034 ед.), при сниженных значениях отношения изокислот к кислотам (Е!Сп/Сп=0,169±0,003, ¡С4/С4=0,074±0,003, ¡С5/С5=0,981±0,003 ед.).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Использование метода ГЖХ-анапиза определения КЖК позволяет работать с малыми количествами исследуемого биоматериала: фекальные образцы - до 1 г, сыворотка крови - до 1 мл (т.к. при указанном режиме работы хроматографа в испаритель вводится 1 мкл образца).

2. Положительная эффективность проводимой терапии характеризуется снижением абсолютного суммарного содержания КЖК за счет уменьшения концентрации отдельных кислот, в частности, уксусной, пропионовой и масляной, ростом относительного содержания уксусной кислоты при снижении долей пропионовой и масляной кислот, нормализацией анаэробного индекса и отношения изокислот к кислотам с неразветвленной цепью. Отсутствие положительной динамики указанных показателей или усугубление их нарушений свидетельствует о неэффективности проводимого лечения.

3. Предложен новый подход к мониторингу эффективности терапевтического воздействия на основе определения КЖК методом ГЖХ-анализа. При положительном эффекте отмечается

стабильность или тенденция к улучшению определяемых показателей. Усугубление имевшихся нарушений свидетельствует о неэффективности назначенной дозы и требует коррекции лечения.

4. Определение ЮКК дает возможность провести индивидуальный подбор терапии, что позволяет оптимизировать лечение и избежать полипрогмазии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Арутюнян Э.Э., Ардатская М.Д., Елизаветина Г.А., Минушкин О.Н., Иконников Н.С. Динамика содержания короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) у больных неспечифическим язвенным колитом (НЯК) на фоне лечения препаратом «Пентаса». Российский гастроэнтерологический журнал, 1999, т. 3, N 4, с. 9293.

2. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Арутюнян Э.Э. Изучение содержания летучих жирных кислот в фекалиях и сыворотке крови у больных неспецифическим язвенным колитом на фоне лечения 5-аминосалициловой кислотой, их значение в диагностике и тактике выбора лечения (предварительные данные). Материалы 28 конференции «Перспективные направления в изучении патогенеза, новые технологии диагностики и лечения в гастроэнтерологии». Смоленск, 2000, с.195-204.

3. Ардатская М.Д., Арутюнян Э.Э., Минушкин О.Н. Оценка эффективности лечения препаратами 5-АСК и тактика выбора терапии больных НЯК (по данным изучения содержания летучих жирных кислот в фекалиях и сыворотке крови). Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии, 2001, т. XII, N 6, с.65-70.

4. Ардатская М.Д., Минушкин О.Н., Арутюнян Э.Э. Efficacy of 5-ASA treatment and therapeutic tactics in patients with ulcerative colitis (according to volatile fatty acids levels in serum and fecal masses ). Update in inflammatory bowel diseases, Falk Workshop. Ljubljana (Slovenia), 2001, P. 1.

5. Арутюнян Э.Э., Ардатская М.Д., Минушкин О.Н. Изучение короткоцепочечных жирных кислот у больных неспецифическим язвенным колитом. Кремлевская медицина, 2002, №1, с.21-25.

6. Минушкин О.Н., Арутюнян Э.Э., Ардатская М.Д. Позволяет ли изучение короткоцепочечных жирных кислот выбрать фарм-

препарат для лечения больных неспецифичексим язвенным колитом. Русский медицинский журнал, 2002, № (в печати).

Список сокращений и условных обозначений.

ТК - толстая кишка

СОТК - слизистая оболочка толстой кишки ГЖХ - газо-жидкостная хроматография КЖК - короткоцепочечные жирные кислоты СРК - синдром раздраженного кишечника

СРК-Д - синдром раздраженного кишечника с преобладанием диареи

СРК-3 - синдром раздраженного кишечника с преобладанием запора

НЯК - неспецифический язвенный колит

АИ - анаэробный индекс

С? - уксусная кислота

С3 - пропионовая кислота

1С4 - изомасляная кислота

С4 - масляная кислота

1С5 - изовалериановая кислота

С5 - валериановая кислота

1С6 - изокапроновая кислота

С6 - капроновая кислота

5-АСК - 5-аминосалицилова

Зак. 12794 Подписано в печать 25.04.02. г. Объем 1.5 печ.л. Тир. 100 Типография ООО "Фирма Колибри 2000"