Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:КЛИНИКО-ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЯИЧНИКОВ

00504» і —

Шамилова Нигяр Новруз кызы

КЛИНИКО-ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ ПРЕЖДЕВРЕМЕННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ЯИЧНИКОВ

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

і * фев гоїз

Москва-2012

005049732

Работа выполнена в отделении гинекологической эндокринологии и лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В. И. Кулакова» Минздрава России.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Марченко Лариса Андреевна

Научный консультант:

доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич

Официальные оппоненты:

Уварова Елена Витальевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий 2-м гинекологическим отделением Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им, академика В.И.Кулакова

Зайдиева Янсият Зайдиллаевна - доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения гинекологической эндокринологии Московского областного НИИ Акушерства и гинекологии

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Защита диссертации состоится » января 2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 при Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова по адресу 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им.академика В.И.Кулакова.

Автореферат разослан «Л.»

2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Несмотря на существенный прорыв в сфере изучения процессов

старения яичников остается ряд клинических и теоретических пробелов в

фундаментальных знаниях по данному вопросу. В 2011г рабочая группа

экспертов из 5 ведущих стран мира (STRAW), изучающая этапы старения

репродуктивной системы, показала необходимость проведения

дополнительных исследований и разработки современных биомаркеров,

отражающих стадийность формирования преждевременной недостаточности

яичников (Sioban D.Harlow, 2012). В процессе фолликулогенеза большинство

фолликулов находится на пути к дегенерации и апоптозу. Только не

рекрутированные к данному моменту примордиальные фолликулы составляют

истинный тотальный овариальный резерв. Однако клинико-лабораторные

тесты для его оценки пока не разработаны. Функциональный овариальный

резерв представляет собой пул растущих фолликулов, достигших

определенной степени зрелости. Маркерами его оценки являются возраст

женщины, регулярность ритма менструаций, уровни ФСГ, АМГ, объем

яичников и число в них антральных фолликулов (Уварова E.B.,2010;Ennis S.,

2006). В основе патогенеза преждевременной недостаточности яичников

(ПНЯ) лежит врожденное или приобретенное снижение тотального

овариального резерва, которое манифестирует в возрасте до 40 лет.

Патогенетической основой ПНЯ является либо генетически

детерминированное нарушение процесса фолликулогенеза, либо гибель

фолликулов за счет активации процесса их апоптоза (Nelson L.,2009)

Гетерогенность данной патологии обусловлена разнообразием причин,

вызывающих это заболевание. Согласно современной номенклатуре ПНЯ

встречается как в изолированном виде (несиндромная форма), так и в

сочетании с различными синдромами. При несиндромальных формах

генетические дефекты обнаруживаются преимущественно на X хромосоме, а

при синдромальных - на аутосомах. Ген FMR1 на сегодняшний день

рассматриваться как один из X сцепленных генов, отвечающих за модель старения яичников, т.к. закладка овариального пула и темпы его истощения определяются числом в этом гене CGG повторов (Gleicher N, 2010).

Среди малоизученных генов кандидатов, способствующих развитию ПНЯ, заслуживает внимания ген, кодирующий ооцит специфический фактор ВМР15, играющий ключевую роль в раннем фолликулогенезе и предотвращающий преждевременную лютеинизацию фолликулов (Juengel JL,2005).

Исследованиями последних лет показано, что при наследственном гемохроматозе, обусловленном мутацией картированного на 6 хромосоме гена HFE отложение в ткани яичников железа приводит к гибели фолликулярного аппарата за счет ускоренного процесса апоптоза (Farina G,1995; Tamanini С., 2003).

Наряду с инновационными открытиями в области молекулярно-генетических причин ПНЯ, продолжается дискуссия о роли различных аутоиммунных нарушений, блокирующих физиологический процесс роста и созревания фолликулов с преантральной стадии, приводя к преждевременной недостаточности яичников.

В последние годы наряду с проведением традиционной ЗГТ (Зайдиева Я.3.,2011; Gelbaya Т.А.,2010) появились работы о положительном влиянии дегидроэпиандростерона (ДГЭА) на различные звенья репродуктивной системы у больных с ПНЯ. Доказано положительное влияние на нормализацию уровней эстрогенов (Е2), тестостерона(Т) и андростендиона, способствующих восстановлению самостоятельного ритма менструаций и наступлению беременности в естественном цикле в 30-60% случаев (Wiser А.,2010), в то время как на фоне проведения ЗГТ этот показатель не преодолевает 5-10% барьера. Механизм лечебного действия ДГЭА многообразен и требует дальнейшего изучения.

Цель исследования: Разработка прогностических критериев формирования различных форм преждевременной недостаточности яичников.

Задачи исследования:

1. На основании клинико-иммунологического скрининга расширить критерии диагностики аутоиммунной формы ПНЯ.

2. Выявить представленность числа СвО-повторов в гене РКШ1 у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников и женщин с сохраненным ритмом менструаций.

3. Проанализировать связь числа СОй повторов в гене РМЫ с клиническими формами преждевременной недостаточности яичников и установить их связь с уровнем АМГ.

4. Выявить частоту представленности у больных с ПНЯ полиморфизма гена, ответственного за рост и развитие первичных фолликулов - ВМР15.

5. Изучить на системном и тканевом уровнях основные показатели обмена железа у больных с ПНЯ.

6. Оценить влияние дегидроэпиандростерона на гормональный профиль и фертильность у больных с преждевременной недостаточностью яичников.

Научная новизна

На основании использования современных молекулярно-генетических технологий расширены и дополнены представления о причинах истощения фолликулярного пула у больных с ПНЯ и разработаны прогностические критерии формирования различных форм этой патологии.

Пересмотрены и расширены диагностические критерии, подтверждающие аутоиммунный генез ПНЯ. Доказано, что диагностика аутоиммунной формы ПНЯ основывается на выявлении органоспецифических (антиовариальные антитела -19,2%, антитиреоидные антитела -19,2%) и неорганоспецифических аутоантител (антинуклеарные антитела-2,6%) и ассоциирована с аутоиммунной полиэндокринопатией (аутоиммунный тиреоидит-19,2%) и аутоиммунными заболеваниями неэндокринного генеза (6,4%).

Впервые для женщин с сохраненным ритмом менструаций российской популяции определена нормальная длина CGG повторов в гене FMR1 равная 28-36. Доказано, что большее или меньшее их число может указывать на риск формирования молекулярно-генетической формы ПНЯ и быть использовано в качестве раннего прогностического фактора формирования данного клинического варианта патологии. (0111=2,74, 95%ДИ 2,04-3,76).У больных с аутоиммунной формой ПНЯ длина CGG повторов находится в пределах популяционной нормы в связи с иным патогенетическим механизмом развития заболевания.

Сравнительный анализ числа CAG повторов гена Л/? с высокой степенью достоверности показал повышение частоты «короткого» CAG аллеля(<24) у больных с ПНЯ в сравнении с женщинами с сохраненным ритмом менструаций. Риск развития ПНЯ в 2,67 раз выше при наличии в генотипе женщины «короткого» аллеля, что позволяет рассматривать этот маркер как предиктор молекулярно-генетической формы заболевания.

(0111=2,67,95%Д И= 1,43-5,01)

Изучение основных биохимических параметров обмена железа при наличии мутаций в гене HFE и обнаружение у 40,9% пациенток с ПНЯ нетрансферрин-связанного железа (НТСЖ) на основании ЭПР спектроскопии позволило выявить депонирование в организме железа, включая его отложение в яичниковой ткани, что на клеточном уровне может способствовать запуску процесса ускоренного апоптоза в яичниках.

Подтверждено, что у больных с ПНЯ наряду с проведением ЗГТ, методом выбора может быть лечение на протяжении 6 и более месяцев ДГЭА в суточной дозе 75 мг. При этом показано, у 20% больных через 3-4 месяца нивелируются проявления дефицита половых гормонов.

Практическая значимость Ведущим предиктором формирования аутоиммунной формы ПНЯ является присутствие антиовариальных антител. Дополнительным независимым фактором риска является наличие сопутствующей

аутоиммунной патологии как эндокринного, так и неэндокринного генеза, риск возникновения которой возрастает в 3,8 раз при наличии антиовариальных антител.

Несмотря на равнонаправленные изменения в гипоталамо-гипофизарно -яичниковой системе у больных с ПНЯ может встречаться как нормальное по отношению к овариальному резерву, так и аномальное число Сйв повторов в гене Определение большего или меньшего по отношению к

нормальному диапазону числа ССО-повторов (28-36) в гене РКШ1 может быть одним из ранних, объективных предикторов, указывающих на риск развития молекулярно-генетической формы ПНЯ, на основе чего можно осуществлять долговременный прогноз развития заболевания.

Показана необходимость расширения группы риска по развитию гемохроматоза за счет введения в нее пациенток с ПНЯ.

Показана эффективность лечения пациенток с ПНЯ ДГЭА в суточной дозе 75 мг.

Положения, выносимые на защиту 1. Преждевременную недостаточность яичников следует рассматривать

как мультифакториапьную патологию, в генезе которой в 63% случаев

выявляются молекулярно-генетические и эпигенетические нарушения,

преимущественно на X хромосоме. Любое отклонение числа СОй повторов в

гене РМШ по отношению к его нормальному диапазону (28-36), наличие

«короткого» аллеля (<24 САв повторов) в гене АН, наличие неслучайной

инактивации X хромосомы являются ранними предикторами развития

молекулярно-генетической формы ПНЯ. Аутоиммунная полиэндокринопатия

и определение органоспецифических и неорганоспецифических аутоантител

свидетельствуют об аутоиммунной форме заболевания, частота которой

составляет 33,3%.

2. Перегрузка организма железом на системном и тканевом уровнях с последующим его отложением в ткани яичников, возможно, являются одними из дополнительных патогенетических механизмов ускоренного

апоптоза фолликулов, что приводит к развитию преждевременной недостаточности яичников.

Пациенток с ПНЯ необходимо включать в группу риска по развитию гемохроматоза.

3. Помимо использования традиционной гормональной терапии больным с ПНЯ для нивелирования симптомов дефицита половых гормонов показано назначение мототерапии Дегидроэпиандростероном в суточной дозе 75 мг на протяжении б и более месяцев.

Личный вклад автора Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведено общеклиническое обследование, сбор коллекции биологического материала для проведения молекулярно-генетического исследования. Выполнена статистическая обработка, научное обоснование полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - акушерство и гинекология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на межклинической конференции 29 марта 2012 года и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова» Минздравсоцразвития РФ 4 июня 2012 года, протокол №11.

Материалы диссертации доложены на Всероссийских конгрессах с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты», «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы», «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре

женского здоровья» (Москва, 2010,2011,2012гг.), V и VI Международных конгрессах по репродуктивной медицине (Москва,2011,2012гг.), Всероссийской Конференции по гинекологической эндокринологии и менопаузе «Гормонально-ассоциированные заболевания репродуктивной системы: от новых научных концепций к тактике ведения» (Москва, 2011), XIII Всемирном конгрессе по менопаузе (Рим, 2011г.), VI региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.)

Внедрение результатов работы в практику Результаты данного исследования легли в основу разработок образовательных программ, сертификационных циклов и лекций для врачей в области гинекологической эндокринологии. Полученные данные внедрены в клиническую практику отделения гинекологической эндокринологии и научно-поликлинического отделения НЦ АГиП им. В. И. Кулакова. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 научных статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 200 страницах компьютерного текста, включает 7 глав (введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, главы с результатами собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список использованной литературы). Диссертация иллюстрирована 28 таблицами и 14 рисунками. Библиографический указатель включает 264 источников (32 отечественных и 232 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования В соответствии с поставленной целью и задачами исследования на базе

отделения гинекологической эндокринологии обследовано 200 женщин с

ПНЯ в возрасте от 18 до 40 лет. Проведено открытое проспективное

исследование в течение 36 месяцев.

Критериями включения в основную группу исследования явились:

возраст от 18 до 40 лет, отсутствие самостоятельных менструаций 6 и более месяцев, уровень ФСГ > 40 МЕ/л в двух измерениях. Из исследования исключались пациентки с первичной гипергонадотропной аменореей, ятрогенными причины ПНЯ (операции на яичниках, химиотерапия, лучевая терапия в анамнезе), тяжелыми наследственными заболеваниями (галактоземия, блефарофимоз).

В контрольные группы включены: 15 здоровых фертильных женщин репродуктивного возраста для оценки гормональных параметров и уровня антиовариальных антител; 15 женщин со своевременной менопаузой для оценки антиовариальных антител; 364 женщины репродуктивного возраста с сохраненным ритмом менструации для определения числа CGG повторов в гене FMR1; 101 женщина со своевременной менопаузой для изучения аллельных вариантов генов ВМР15 и HFE, аутопсийный материал яичниковой ткани 4 женщин, погибших при чрезвычайных обстоятельствах (средний возраст - 49,6±4,4 года) и биопсийный материал яичниковой ткани 5 женщин, которым произведена экстирпация матки и придатков по поводу несостоятельности мышц тазового дна (средний возраст 49,6±17 лет) для выявления гранул гемосидерина,

Пациенток обследовали с использованием комплекса современных и наиболее информативных методов исследования. Общеклиническое обследование проводили по стандартной схеме, используемой в НЦ АГиП. Уровни гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, Е2,Т, ТЭСГ, AMT, ТЭСГ, ДГЭА, T4cB) определяли методом ИФА с помощью соответствующих тест-систем на автоматическом анализаторе «Cobar Core II».

Особую роль в развитии ПНЯ, как известно, имеют аутоиммунные нарушения. Учитывая, что ПНЯ может является одной из составляющих аутоиммунного полигландулярного синдрома, нами было проведено исследование антиовариальных антител, а также уровней органоспецифических аутоантител к другим органам (щитовидной железе) и

неорганоспецифических антител к фосфолипидам, к ядрам клеток и митохондриям. В литературе эта панель иммунологических тестов представлена как достаточная для определения аутоиммунных нарушений на субклиническом уровне (Gleicher N. 2009; Tsigkou А. 2008). В рамках тиреоидного скрининга проводилось определение АТ-ТПО и АТ-ТГ иммуноферментными методами набором «Roche diagnostics» (Германия). Для качественного определения суммарных уровней антиовариальных, антинуклеарных и антимитохондриальных антител (IgM, IgG, IgA) и количественного определения уровней антифосфолипидных антител классов IgG,IgM (антител к кардиолипину, фосфатидилсерину, кофакторам: Р2-гликопротеину-1, протромбину, аннексинуУ) использовали метод непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) с помощью наборов фирмы Orgentec Diagnostica GmbH (Германия). Уровни железа и общей железосвязывающей способности сыворотки крови определяли калориметрическим методом с бета - фенантралином по методу Генри с помощью стандартных наборов фирмы «Иммунотех». Насыщение трансферрина железом (НТЖ) -отношение концентрации сывороточного железа к общей железосвязывающей способности сыворотки, выраженное в процентах. Трансферрин сыворотки крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в агаре. Ферритин сыворотки определяли стандартным радиоиммунологическим методом с использованием наборов ИРМО-ферритин. Трансвагинальное УЗ исследование органов малого таза и щитовидной железы проводили на аппарате Aloka SSD 1200, 2000 Toshiba SSA-240 (Япония) при помощи мультичастотного линейного датчика (8-10 МГц). Для определения интенсивности сигналов трансферрина, церрулоплазмина, метгемоглобина и выявления спектров НТСЖ нами применен метод ЭПР - спектроскопии с помощью прибора фирмы «Брукер» 3-см диапазона ECS-106. Гистохимическое исследование ткани яичников проводилось по методу Перлса.

Кариотип в лимфоцитах периферической крови исследовали с помощью стандартной цитогенетической методики (G-окраска). Длину CAG-повтора 1 экзона гена AR и неслучайную инактивацию хромосомы X определяли с помощью метилчувствительной количественной флуоресцентной ПЦР. Для определения числа CGG повторов в гене FMR1 использовали метод метил-специфической ПЦР. Определение замен одиночных нуклеотидов генов ВМР15 и HFE проводили модифицированным методом «примыкающих проб» полимеразной цепной реакции (adjacent probes, kissing probes), используя наборы реагентов и детектирующий амплификатор ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), согласно инструкции производителя. Секвенирование гена ВМР15 производили на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1 (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией к прибору.

Предварительно оформляли добровольное информированное согласие на забор биологического материала, лечение и обработку результатов исследования. Пациенткам с ПНЯ, подписавшим информированное согласие и не имеющим противопоказаний проводили ЗГТ в виде 2 мг эстрадиола валерата и 10 мг медроксипрогестерона ацетата в течение 12 месяцев. 25 женщинам с ПНЯ, не получающим ЗГТ в течение 3 месяцев для компенсации дефицита половых стероидов был назначен ДГЭА в суточной дозе 75 мг в течение 6 и более месяцев. Проводился динамический контроль уровней ФСГ, Е2, Т и АМГ на фоне 4 и 6 месяцев приема ДГЭА.

Статистический анализ полученных данных выполнен на компьютере PC IBM (США) с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc. (США), пакета SPSS (версия 10.0.7). Результаты исследования представлены как среднее±стандартное отклонение (M±SD). В зависимости от конкретных условий применялся парный критерий Вилкоксона при сравнении показателей в динамике, U-критерий Манна-Уитни для независимых групп, для оценки достоверности межгрупповых различий использован %2 (хи-

квадрат). При статистической обработке данных, не подчиняющихся закону нормального распределения, в качестве меры центральной тенденции количественных признаков выбрана медиана (Ме), а в качестве интервальной оценки - верхний (L) и нижний квартили (Н). Результаты представлены в виде Me (L-H). Статистически значимые крайние точки вычисляли по формулам:

= Max[XminiXzs - 1,5 х (Х75 - *„)] = Min[XmaxiX75 + 1,5 х (Х75 - X2S)] где ХтЫ - минимальные значения числа CGG повторов в гене FMR1, Хтах - максимальные значения числа CGG повторов в гене FMR1, Х2$ -1-ая квартиль, Х75- 3-ая квартиль (Tukey J.,1977). Различия между группами считались достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение На первом этапе работы проведено клинико-лабораторное обследование

200 пациенток с ПНЯ (средний возраст - 32,72 ± 6,17 года, средняя

продолжительность заболевания 4,1 ± 1,01 года, средний возраст наступления

аменореи - 29,4 ± 7,66 года). Возраст менархе в среднем по группе составил

13,25±1,43 года. Яичниковая недостаточность проявлялась вторичной

аменореей после достаточно длительного периода регулярных менструаций у

подавляющего числа пациенток (82,5%). В ходе представленной работы при

гормональном обследовании было установлено достоверное повышение

уровней ФСГ и ЛГ (100,51±35,1 МЕ/л и 72,3±33,8 МЕ/л, соответственно) и

снижение концентраций АМГ(0,22±0,2 нг/мл), Е2 (85,4±62,25 пмоль/л) и Т

(0,9±0,1 нмоль/л) у обследуемых больных по сравнению с контрольной

группой (р<0,05), что подтверждает наличие у них ПНЯ. Уровни ТТГ

(1,95±1,31 мМЕ/л) и Т4с. (14,93±3,61 пмоль/л) на момент обследования по

группе не отличались от их средних значений в группе контроля (р>0,05).

В группе больных с ПНЯ у 14,3% (15/105) женщин были выявлены

положительные яичниковые антитела, концентрация которых находилась на

уровне от 11,4 до 19,5 Ед/мл. Антитела к щитовидной железе были выше

нормы у 26%(52/200) пациенток. На момент обследования манифестная форма аутоиммунного тиреодита выявлена нами у 8 из 200 (4%), субклиническая (повышение уровня ТТГ в сочетании с нормальным уровнем Т4св, наличие антитиреоидных антител в диагностически значимых титрах и ультразвуковые признаки аутоиммунной патологии) - у 7/200 (3,5%) пациенток. В исследуемой группе у 2 пациенток (2,6%) выявлены положительные антинуклеарные антитела. Антимитохондриальные антитела у всех пациенток были отрицательными. Показатели средних уровней антител к фосфолипидам не выходили за пределы нормативных значений. (IgG - 2,7±1,7Ед/мл; IgM - 2,5±1,ЗЕд/мл). Показано, что относительный риск выявления сопутствующей аутоиммунной патологии у пациенток при наличии антиовариальных антител по сравнению с пациентками, не имеющими таковые, составил 3.82 (95% ДИ 2.57- 9.81) (х2=14,91, р=0.0001)

Известно, что в развитии ПНЯ большую роль играют генетические факторы. Генеалогический анализ показал, что семейная форма заболевания выявляется у 28,5% (57/200) обследованных нами пациенток с ПНЯ.

Экспериментально доказано, что нормальный диапазон CGG повторов в гене FMR1 ассоциирован с адекватной продукцией FMRP, ответственного за функционирование яичников [Chen,2003). Учитывая ассоциацию премутации гена FMR1 с ПНЯ, мы сочли необходимым определить норму числа CGG повторов в нем для женщин российской популяции. Впервые на базе отделения гинекологической эндокринологии совместно с «Лабораторией молекулярной генетики» у 364 женщин репродуктивного возраста с сохраненным ритмом менструации (средний возраст 42,3±0,95 года) проанализированно число CGG повторов в гене FMR1 .(рис.1) За норму по отношению к физиологическому тотальному овариальному резерву принят статистически значимый диапазон 28-36 повторов, исключающий выбросы. Проведенный нами анализ показал, что аномальная аллель этого гена в генотипе женщин в 2,74 раз чаще встречается у пациенток с ПНЯ (ОШ=2,74, 95%ДИ 2,04-3,67). На основании всего выше изложенного аномальную длину

Свв повторов в гене РМЯ1 следует рассматривать как предиктор молекулярно-генетической формы ПНЯ, ассоциированной с нарушениями на X хромосоме.

Рис.1.Распределение Свв повторов в гене в контрольной группе (п=364) и у

пациенток с ПНЯ (п=129)

При распределении пациенток основной группы с учетом числа СвО повторов в обоих аллелях гена РМЯ1 в группу А (аллель 1 <28) были включены 40/129 (31.01%,) в группу В (аллель 1 >28, аллель 2 <36)- 62/129 (48,06%) и в группу С (аллель 2 >34) - 27 женщин (20.93%) Таким образом, аномальная аллель Свв повторов в гене РМШ выявлена у 52% пациенток с ПНЯ.

Несмотря на равнонаправленные гормональные изменения у больных этих трех групп, практически с равной частотой у них выявлялось как нормальное в 48%, так и аномальное (в 52% случаев) число повторов, что явилось основанием для углубленного клинико-лабораторного обследования с целью уточнения генеза преждевременного старения яичников у них. Для решения этой задачи из 200 обследованных больных было отобрано 78 пациенток, которым было проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование и расширенный иммунологический скрининг. Пациентки по

основным клинико-лабораторным характеристикам не отличались от основной группы и, следовательно, репрезентативны им.

На основании расширения диагностических критериев ПНЯ аутоиммунный генез заболевания был подтвержден нами у 33,3% обследованных больных. Сравнительный межгрупповой анализ числа Свв повторов у пациенток с разным генезом заболевания с высокой степенью статистической значимости показал, что в группе с нормальным числом СвО повторов в гене РМШ(_п=33) чаще (в 75,8% (25/33) случаев) встречался аутоиммунный генез ПНЯ ( р<0,0001), и доля больных с нормальной длиной повторов среди пациенток с аутоиммунным генезом составила 96,2% (25/26). В то время как в группах с аномальными длинами Сйв повторов (п=45) аутоиммунный генез был выявлен у 1 пациентки, что составило 2,2%. (0111=157,14, 95%ДИ 18.06-6587). В 3 из 78 случаев (3,8%) генез заболевания выявить не удалось.(табл.1)

Таблица 1

Генез развития ПНЯ у пациенток с различной длиной ССО повторов в гене

РМШ

Группа А(п=24) Группа В (п=33) Группа С(п=21)

Антиовариальные антитела 1(4,2%) 14 (42,4%)* -

Антинуклеарные антитела - 1 (3,03%)* -

Аутоиммунная патология - 10 (30,3%)* -

эха 9 (37,5%) 6(18,2%) 4 (19,04%)

Неясный генез - 3 (9,09%)* -

*р<0,05

Сравнение качественных показателей осуществлялось с помощью критерия Хи-квадрат, для 0% и 100%- двухсторонний Меритерий Стьюденга с поправкой на концевые точки

На основании всего выше представленного можно сделать вывод, что нормальная длина СвО повторов у больных с ПНЯ может указывать на вероятность аутоиммунной формы ПНЯ, т.к. в ее развитии в большей степени задействованы не молекулярно-генетические нарушения на X хромосоме, а аутоиммунные детерминанты. При проведении сравнительного анализа гормональных показателей было установлено, что у пациенток с

аутоиммунным генезом ПНЯ уровень АМГ достоверно выше (0,23±0,03нг/мл в сравнении с 0,06±0,01 нг/мл, р<0,05), а уровень Т достоверно ниже (0,83±0,7нмоль/л) в сравнении с пациентками с молекулярно-генетической и идиопатической формами заболевания (1,41±0,9нмоль/мл, р=0,0025), что указывает на некую сохраненность примордиального пула при аутоиммунных поражениях и подтверждает выдвинутую в литературе гипотезу о селективном повреждении тека клеток яичников при интактности гранулезных в процессе формирования недостаточности яичников (Antonio La Marca, 2009) и, возможно, эта группа больных является наиболее перспективной в плане восстановления фертильности, что подтверждается нашими результатами (у 2 из 4 пациенток с миастенией наступила беременность на ЗГТ).

Проведенный нами анализ результатов молекулярно-генетического

исследования гена AR позволил доказать, что «короткий» (<24CAG повторов)

аллель достоверно чаще встречался среди пациенток с ПНЯ

(ОШ=2,67;95%ДИ=1,43-5,01), что позволяет рассматривать наличие

«короткого» аллеля (<24) в гене AR в качестве предиктора молекулярно-

генетической формы ПНЯ. Подобные результаты были получены и в

популяции японских женщин (Sugawa F., 2009) (рис.2).

100 80 0/feo

40 20 0

аа ab bb ab

Рис.2. Структура пациенток с ПНЯ и контрольной группы в соответствии с количеством CAG повторов в гене андрогенового рецептора

а-«короткий» аллель AR с длиной CAG повтора < 24, Ь-«длинный» аллель с длиной >25

SXCI, как эпигенетическая причина, косвенно свидетельствующая о молекулярно-генетических аномалиях на X хромосоме, при > 80%-ном пороговом уровне была обнаружена с частотой 25,8% только у пациенток с

□ Контроль

ПНЯ. Показано, что наличие SXCI в генотипе женщины в 49,6 раз повышает риск развития преждевременной недостаточности яичников у нее (ОШ=49,6, 95% ДИ=3,0-805), что подтверждает значимость выявления SXCI как одного из предикторов формирования ПНЯ и может быть использовано как ранний диагностический скрининговый фактор в прогнозе развития данной патологии.

При проведении SNP анализа гена ВМР15 (202С>Т, Arg68Trp, rs 104894763; 538G>A, А180Т, rs3897937; 905G>A, rsl04894767) нуклеотидные замены выявлены у 5% пациенток с ПНЯ и у 4% женщин со своевременной менопаузой, что говорит об отсутствии значимости данных полиморфизмов в качестве предикторов ПНЯ для российской популяции. Секвенирование кодирующей последовательности гена BMP 15 показало, что различные аллельные варианты выявляются у 12% пациенток с ПНЯ, два из которых не описаны в литературе (730 ОТ, 852 С>Т), при этом в контрольной группе (п=60) данные полиморфизмы выявлены не были. Однако для подтверждения значимости выявленных полиморфизмов необходимы дальнейшие исследования на большей выборке пациенток.

В связи с доказанной ролью ускоренного апоптоза как ведущей причины истощения фолликулярного пула нами предпринята попытка поиска новых его индукторов. При исследовании гена НЕЕ, ответственного за формирование наследственного гемохроматозам у 22 из 102(21,6%) обследованных пациенток с ПНЯ выявлены различные варианты нуклеотидных замен, при этом достоверных различий с контрольной группой выявлено не было. Совместно с гематологами эти 22 пациентки были дообследованы. Уровень трансферрина в сыворотке крови этих пациенток составил 2,5±0,4 г/л, СЖ - 21,7±12,5 мкмоль/л, НТЖ - 37,7±25,0%, ферритина -68,3±54,7 мкг/л. При этом, у 31,8% пациентов уровень СЖ был выше верхнего допустимого предела, уровень НТЖ был выше у 50 % (11/22) обследованных пациенток при снижении его концентрации у 45,5%(10/22) пациенток, а уровень ферритина в крови превышал допустимую норму у 27,3

%(6/22) и составил у них в среднем 172±37,5мкг/л. Таким образом, у 15/22 (68,2%) отмечены отклонения от нормативных показателей обмена железа. Полученные данные доказывают выраженные изменения метаболизма железа как одного из пусковых механизмов активации процесса апоптоза. У 40,9% пациенток с ПНЯ, имеющих нуклеотидные замены, спектральным методом обнаруживалось парамагнитное НТСЖ (§ среднее = 2,8), интенсивность которого в среднем составила 4,0±2,5 отн.ед. Оно обнаруживалось также у пациенток без нуклеотидных замен в гене НРЕ, но в значительно меньшем количестве (0,8±0,6отн.ед). У женщин-доноров интенсивность ЭПР сигнала НТСЖ соответствует фоновому значению. На основании полученных результатов можно сделать вывод о перегрузке организма больных с ПНЯ железом на системном уровне.

Достоверное увеличение интенсивности сигнала трансферрина (в 1.5-1.7 раз) по отношению к контролю свидетельствует об увеличении количества атомов железа на молекулу трансферрина. (0,6±0,4 против 0,2±0,1, р= 0,004 и 0,7±0,4 против 0,2±0,1, р<0,001).0тмечено незначительное повышение интенсивности ЭПР сигнала церулоплазмина у больных с ПНЯ (1,2 ± 0,2отн.ед. против 1,0 ± 0,2, р>0,05). При сравнении интенсивности ЭПР сигналов метгемоглобина (§=6,00) у пациенток с ПНЯ и контрольной группе выявлены достоверные отличия, при этом у пациенток, имеющих полиморфизмы в гене ЯF£ она была выше в 4,7 раза, что свидетельствует о выраженном снижении у них антиоксидантной активности (0,8±0,5 против 0,2±0,1,р<0,0001 и 3,6±2,3 против 0,2±0,1, р<0,0001).

Гистохимическое исследование яичниковой ткани показало, что у 6 из 8 образцов внутри и вне клеток в корковом, а также в периваскулярном пространстве мозгового слоев имеются единичные скопления гранул гемосидерина. Наличие этих гранул у 75% пациенток с ПНЯ, а также фиброза стромы и стенок сосудов в мозговом слое ткани яичников пациенток с ПНЯ могут свидетельствовать о перегрузке яичниковой ткани железом. В контрольных образцах яичниковой ткани отложений железа выявлено не было, что подтверждает выдвинутую нами гипотезу о возможном токсическом влиянии НТСЖ на фолликулярный аппарат пациенток с ПНЯ,

что на клеточном уровне может способствовать запуску процесса ускоренного апоптоза в яичниках.

А Б

Рис.3. Микропрепарат яичниковой ткани пациенток с ПНЯ (А) и контрольной группы (Б), реакция Перлса, х 200.Метод Стьюдента с поправкой на концевые точки, р<0,05

На сегодняшний день известно, что у пациенток с ПНЯ наряду с гипоэстрогенией формируется стойкое гипоандрогенное состояние.

Нами было отобрана группа из 60 женщин с ПНЯ. Уровень Т у них составлял 0,87±0,12 нмоль/л, при этом у 58,3% из он составил 0,54±0,2 нмоль/л, что явилось основанием для назначения этой категории больных заместительной гормональной терапии, гестагенный компонент которой был представлен медроксипрогестерон ацетатом с остаточной андрогенной активностью.

Полученные на фоне 12 месяцев лечения данные свидетельствовали об адекватном восполнении недостающих половых гормонов и подтверждались гормональными исследованиями (табл.2).

Таблица 2

Динамика гормонального статуса у пациенток с ПНЯ («=60) на фоне 12 месяцев терапии эстрадиола валерата + медроксипрогестерона ацетата (М±ЗВ)

Показатель До лечения На фоне 12 месяцев лечения Р

ФСГ (МЕ/л) 101,71±38,09 50,8±30,2 0,00002

ЛГ (МЕ/л) 59,35±39,82 29,7±9,35 0,00006

Ег (пмоль/л) 87,33±70,25 218,3±17,25 0,00022

Т(нмоль/л) 0,87±0,12 1,25±0,38 0,037

ТЭСГ (нмоль/л) 81,56±40,74 121,1±24,78 0,0027

ИСА (%) 1,85±0,63 1,37±0,71 0,776

Парный критерий Вилкоксона

Таким образом, гестагенный компонент этого препарата адекватно восполняет имеющийся недостаток андрогенов у женщин, страдающих ПНЯ, и данный препарат должен быть рекомендован этой категории больных.

На смену традиционной длительно проводимой ЗГТ для восполнения уровня половых стероидов у больных с ПНЯ приходит инновационный и безопасный метод лечения, основанный на наличии механизмов самозащиты, за счет быстрого насыщения локальных ферментных систем, трансформирующих ДГЭА в половые стероиды.

В исследование включено 25 женщин с ПНЯ, которые на протяжении предыдущих 3 месяцев не получали ЗГТ. По клинико-лабораторным критериям эти пациентки не отличались от основной группы. Уровень тестостерона составил 0,54±0,3 нмоль/л, Концентрация ДГЭА-С 3,75±2,15, что свидетельствовало о стойком гипоандрогенном состоянии у этой группы больных. Больные получали препарат ДГЭА по 25 мг 3 раза в течение 6 месяцев. Все пациентки на втором месяце лечения отметили исчезновение приливов, значительное повышение качества жизни - снижение депрессии, тревоги, повышение самооценки, что подтверждалось снижением уровня ФСГ на фоне 4-6 месяцев лечения в 2,7 раза (с 97,3±23,5 до 36,7±15,9 (р=0,00002), повышением концентрации Е2 в 2,8 раза (с 6б,03±16,21 до 183,7±56,12,р= 0,00002), а тестостерона в 6,3 раза ( с 0,54±0,3 до 3,4± 1,25нмоль/л, р=0,00002) и что особо значимо двукратное увеличение уровня АМГ (с 0,24±0,05 до 0,43±0,24, р=0,0004).

У 20% (5/25) пациенток на фоне 4-5 месяца приема ДГЭА возобновились самостоятельные менструации без использования традиционной ЗГТ. У двух пациенток уровень ФСГ снизился до нормативных значений, и они были включены в программу ЭКО. При этом в одном случае на фоне стимуляции сформировалась функциональная киста, больная была снята с программы, у второй была произведена пункция доминантных фолликулов, диагностирован синдром пустого фолликула.

Таким образом, в процессе проведенного исследования нами предложены предикторы формирования молекулярно-генетической формы ПНЯ, ассоциированной с дефектами на X хромосоме, расширены критерии диагностики аутоиммунной формы ПНЯ и предложен инновационный метод лечения. Однако мы категорически не утверждаем, что выявленные нами молекулярно-биологические маркеры являются основанием для доклинической постановки диагноза ПНЯ и детекции молекулярно-генетической или аутоиммунной формы заболевания. Эти биомаркеры указывают на высокий риск развития данной патологии. Для подтверждения наших данных необходимо проведение многоцентровых проспективных когортных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Расширены критерии диагностики аутоиммунной формы преждевременной недостаточности яичников, в результате чего диагноз ставится не только на основании обязательного наличия антиовариальных антител (19,2%), но и присутствия органоспецифических (АТ-ТГ+АТ-ТПО-19,2%) и органонеспецифических (антинуклеарные антитела - 2,6%) антител, в сочетании с аутоиммунными заболеваниями эндокринного (19,2%) и неэндокринного генеза (6,4%). Аутоиммунные факторы выявлены у 33,3% больных с ПНЯ.

2. Норма числа Свв повторов в гене РМЯ1 по отношению к тотальному овариальному резерву у женщин с сохраненным ритмом менструаций находится в диапазоне 28-36повторов. Для больных с ПНЯ с одинаковой частотой характерна представленность как нормального, так и аномального числа СОО повторов в гене FiШ?/ (48 и 52%, соответственно, р>0,05).

3. При аутоиммунной форме заболевания в 96,2% случаев число Свв повторов в гене РМЯ1 находится в пределах нормативного диапазона (28-36).

4. Ранним прогностическим маркером развития молекулярно-генетической формы ПНЯ, выявляемой у 63% больных, является аномальное число Свв повторов в гене РМЮ менее 28 и более 36 (ОШ=2,74, 95%ДИ 2,04-3,67), при

этом в 19-37% случаев отмечено ее сочетание с неслучайной инактивацией X хромосомы.

5. Уровень АМГ - как объективный критерий оценки функционального овариального резерва, у больных с аутоиммунной формой ПНЯ в сравнении с молекулярно-генетической достоверно выше и составляет 0,23±0,03 нг/мл против 0,06 ±0,01 (р<0,0001), что подтверждает наличие ассоциативной связи между длиной ССв повторов и овариальным резервом .

6. Прогностическим маркером развития молекулярно-генетической формы ПНЯ является наличие неслучайной инактивации хросмосомы X, встречающейся в 26% случаев (ОШ=49,6, 95% ДИ=3,0-805). Достоверное превышение частоты встречаемости «короткого» аллеля гена АЛ (< 24 САО повторов) у больных с ПНЯ позволяет рассматривать этот маркер в качестве предиктора развития ПНЯ. (0111=2,67,95%ДИ=1,43-5,01)

7. Нуклеотидные замены в гене наследственного гемохроматоза - НЕЕ обнаружены у 21,6% пациенток с ПНЯ, при этом у каждой третьей пациентки отмечено повышение уровня сывороточного железа, ферритина в 27,3%, на фоне сниженного уровня трансферрина и увеличения его насыщенности железом в каждом втором случае.

8. Выявление нетрансферрин - связанного железа у 40,9% пациенток пациенток с ПНЯ методом ЭПР спектроскопии и гранул гемосидерина в яичниковой ткани в 75% случаев свидетельствуют о перегрузке организма железом и его токсическом действии на фолликулярный аппарат.

9. Больным с ПНЯ помимо проведения традиционной ЗГТ, возможно назначение монотерапии дегидроэпиандростероном. При этом у всех больных повышается качество жизни, в 2,7 раза снижается уровень ФСГ, в 2,8 раза повышается концентрация эстрадиола, в 6,3 раза тестостерона и двукратно увеличивается уровень АМГ. Восстановление ритма менструаций на фоне прима ДГЭА без проведения традиционной ЗГТ отмечено в 20% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Во время диспансерного наблюдения молодых женщин с наличием факторов риска ПНЯ (олигоменорея с менархе, ПНЯ у матери, аутоиммунный тиреоидит, перенесенные эпидемический паротит и краснуха, носительство определенных фенотипов главного комплекса гистосовместимости II класса (DRB1*01, DRB1*03, DQB1*0501, DQB 1*0302)) необходимо расширение алгоритма обследования с проведением молекулярно-генетического исследования, включающего определение числа CGG повторов в гене FMR1, выявление неслучайной инактивации X хромосомы с определением длины CAG повторов гена AR.

2. Учитывая, что у каждой третьей больной с ПНЯ встречается семейная форма заболевания, при наличии в семье девочек с целью построения прогноза в отношении репродуктивной функции показано раннее кариотипирование, определение длины CGG повторов в гене FMR1 и наличие неслучайной инактивации X хромосомы.

2. Наличие нормального числа CGG повторов в гене FMR1 в пределах 28-36 у больных с ПНЯ указывает на аутоиммунную форму заболевания, в связи с чем этой категории больных необходим расширенный иммунологический скрининг, включающий определение уровня не только антиовариальных, но и антитиреоидных, антинуклеарных, антимитохондриальных и антифосфолипидных антител и подробный сбор анамнеза на наличие аутоиммунной патологии эндокринного и неэндокринного генеза. При наличии полигландулярной патологии больная должна наблюдаться совместно со смежными специалистами.

3. Выявление аномальной длины CGG повторов в гене FMR1 у больных с ПНЯ свидетельствует о молекулярно-генетической форме заболевания.

4. Пациенток с ПНЯ необходимо включать в группу риска по возможному развитию гемохроматоза. При выявлении значимых мутаций в гене HFE доказана необходимость направлять больных с ПНЯ к гематологам для

углубленного обследования обмена железа и проведения специфического лечения.

5. При выявлении гипоандрогенного состояния у больных с ПНЯ при выборе препарата ЗГТ предпочтение следует отдавать гестагенам, обладающим частичной андрогенной активностью, что способствует достоверному повышению уровня Т, ИСА и улучшению качества жизни.

6. Пациенткам с ПНЯ в качестве альтернативного метода лечения для коррекции дефицита половых стероидов можно рекомендовать дегидроэпиандростерон в суточной дозе 75 мг на протяжении 6 и более месяцев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шамилова H.H., Марченко JI.A. Можно ли рассматривать ген FMR1 как предиктор раннего старения яичников?// Мать и дитя: материалы XI Всероссийского научного форума.-М., 2010. С.554.

2.Шамилова H.H., Марченко Л.А. Аутоиммунные нарушения и преждевременная недостаточность яичников.// Мать и дитя : материалы XII Всероссийского научного форума.-М.,2011.С.446

3. Evaluation of Molecular-Genetic Predictors of Premature Ovarian Insufficiency./ V.P.Smetnik, N.N.Shamilova, L.A.Marchenko, L.B.Butareva, D.S. Mihaylenko, A.E.Donnikov // 13th World Congress on Menopause.- Roma, 2011.P.585

4. Особенности связывания железа в плазме крови при преждевременной недостаточности яичников./ H.H. Шамилова, Л.А. Марченко, E.H. Бургова В.А.Сереженков // Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека: материалы 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием. - Смоленск,2011.С.298-301.

5. Шамилова H.H., Марченко Л.А. Перегрузка организма железом» как одна из причин преждевременной недостаточности яичников.// Материалы XXIV Международного конгресса с курсом эндоскопии.- М.,2011. С.206.

6. Шамилова H.H., Марченко Л.А. Ген FMR1:новые возможности оценки овариального резерва.//Акушерство и гинекология. 2011 .№ 2.С.58-64

7. Шамилова Н.Н., Марченко Л.А. Можно ли рассматривать ген FMR1 как предиктор раннего старения яичников?//Акушерство и гинекология.

2011.№4. С.11-15

8. Шамилова Н.Н., Марченко Л.А. ВМР15 - внутрифолликулярный предиктор развития преждевременной недостаточности яичников.// Проблемы репродукции.2011.№6. С.26-31.

9.Шамилова Н.Н., Марченко Л.А. Роль генетических и аутоиммунных нарушений в развитии преждевременной недостаточности яичников. //Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья: материалы форума.- М., 2012. С.387.

10. Шамилова Н.Н., Марченко Л.А. Новые лечебные подходы при преждевременной недостаточности яичников.//Материалы VI Международного конгресса по репродуктивной медицине. - М., 2012.С.167.

11. Роль генетических и аутоиммунных нарушений в развитии преждевременной недостаточности яичников./ Н.Н.Шамилова, Л.А. Марченко, Н.В. Долгушина, О.Б.Кузнецова, Д.В.Залетаев // Акушерство и гинекология. 2012. №4/2. С.67-72

12. Шамилова Н.Н., Марченко Л.А., Табеева Г.И. Дифференцированный подход к назначению заместительной гормональной терапии при преждевременной недостаточности яичников. // Проблемы репродукции.

2012.№4.С.126-13.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НТЖ-коэффициент насыщения трансферрина железом НТСЖ-нетрансферрин-связанное железо ОШ-отношение шансов

ПНЯ-преждевременная недостаточность яичников

ТЭСГ-тестостерон-эстрадиол связывающий глобулин

ЭПР-электронный парамагнитный резонанс

AR-андрогенный рецептор

BMP 15- bone morphogenetic protein 15

CAG-цитозин-аденин-гуанин

CGG - цитозин-гуанин-гуанин

FMRl-fragile mental retardation 1

HFE-ген наследственного гемохроматоза

SNP-одиночные нуклеотидные замены

SXCI-неслучайная инактивация X хромосомы

Подписано в печать: 14.12.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 721 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Несмотря на существенный прорыв в сфере изучения процессов старения яичников остается ряд клинических и теоретических пробелов в фундаментальных знаниях по данному вопросу. В 2011 г рабочая группа экспертов из 5 ведущих стран мира (STRAW), изучающая этапы старения репродуктивной системы, показала необходимость проведения дополнительных исследований и разработки современных биомаркеров, отражающих стадийность формирования преждевременной недостаточности яичников [102]. В процессе фолликулогенеза большинство фолликулов находится на пути к дегенерации и апоптозу. Только не рекрутированные к данному моменту примордиальные фолликулы составляют истинный тотальный овариальный резерв. Однако клинико-лабораторные тесты для его оценки пока не разработаны. Функциональный овариальный резерв представляет собой пул растущих фолликулов, достигших определенной степени зрелости. Маркерами его оценки являются возраст женщины, регулярность ритма менструаций, уровни ФСГ, AMT, объем яичников и число в них антральных фолликулов [29,50]. В основе патогенеза преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) лежит врожденное или приобретенное снижение тотального овариального резерва, которое манифестирует в возрасте до 40 лет. Патогенетической основой ПНЯ является либо генетически детерминированное нарушение процесса фолликулогенеза, либо гибель фолликулов за счет активации процесса их апоптоза [189]. Гетерогенность данной патологии обусловлена разнообразием причин, вызывающих это заболевание. Согласно современной номенклатуре ПНЯ встречается как в изолированном виде (несиндромная форма), так и в сочетании с различными синдромами. При несиндромальных формах генетические дефекты обнаруживаются преимущественно на X хромосоме, а при синдромальных - на аутосомах. Ген FMR1 на сегодняшний день рассматривается как один из X сцепленных генов, отвечающих за модель старения яичников, т.к. закладка овариального пула и темпы его истощения определяются числом в этом гене CGG повторов [132,219].

Среди малоизученных генов кандидатов, способствующих развитию ПНЯ, заслуживает внимания ген, кодирующий ооцит-специфический фактор BMP 15, играющий ключевую роль в раннем фолликулогенезе и предотвращающий преждевременную лютеинизацию фолликулов [116,158].

Исследованиями последних лет показано, что при наследственном гемохроматозе, обусловленном мутацией картированного на 6 хромосоме гена HFE отложение в паренхиматозных органах железа приводит к разрушению клеточных структур за счет ускоренного процесса апоптоза в них [23,87,236].

Наряду с инновационными открытиями в области молекулярно-генетических причин ПНЯ, продолжается дискуссия о роли различных аутоиммунных нарушений, блокирующих физиологический процесс роста и созревания фолликулов с преантральной стадии, приводя к преждевременной недостаточности яичников [81,143].

В последние годы наряду с проведением традиционной ЗГТ [12; 144] появились работы о положительном влиянии дегидроэпиандростерона (ДГЭА) на различные звенья репродуктивной системы у больных с ПНЯ. Доказано положительное влияние на нормализацию уровней эстрогенов (Ег), тестостерона(Т) и андростендиона, способствующих восстановлению самостоятельного ритма менструаций и наступлению беременности в естественном цикле в 30-60% случаев [35,169], в то время как на фоне проведения ЗГТ этот показатель не преодолевает 5-10% барьера. Механизм лечебного действия ДГЭА многообразен и требует дальнейшего изучения.

Цель исследования: разработать прогностические критерии формирования различных форм преждевременной недостаточности яичников.

Задачи исследования:

1. На основании клинико-иммунологического скрининга расширить критерии диагностики аутоиммунной формы ПНЯ.

2. Выявить представленность числа CGG-повторов в гене FMR1 у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников и женщин с сохраненным ритмом менструаций.

3.Проанализировать связь числа CGG повторов в гене FMR1 с формами преждевременной недостаточности яичников и установить их связь с уровнем AMT.

4. Выявить частоту представленности у больных с ПНЯ полиморфизма гена, ответственного за рост и развитие первичных фолликулов - BMP 15.

5. Изучить на системном и тканевом уровнях основные показатели обмена железа у больных с ПНЯ.

6. Оценить влияние дегидроэпиандростерона на гормональный профиль и фертильность у больных с преждевременной недостаточностью яичников.

Научная новизна

На основании использования современных молекулярно-генетических технологий расширены и дополнены представления о причинах истощения фолликулярного пула у больных с ПНЯ и разработаны прогностические критерии формирования различных форм этой патологии.

Пересмотрены и расширены диагностические критерии, подтверждающие аутоиммунный генез ПНЯ. Доказано, что диагностика аутоиммунной формы ПНЯ основывается на выявлении органоспецифических (антиовариальные антитела -19,2%, антитиреоидные антитела -19,2%) и неорганоспецифических аутоантител (антинуклеарные антитела-2,6%) и ассоциирована с аутоиммунной полиэндокринопатией (аутоиммунный тиреоидит-19,2%) и аутоиммунными заболеваниями неэндокринного генеза (6,4%).

Впервые для женщин с сохраненным ритмом менструаций российской популяции определена нормальная длина Свв повторов в гене ГМЯ1 равная 28-36. Доказано, что большее или меньшее их число может указывать на риск формирования молекулярно-генетической формы ПНЯ и быть использовано в качестве раннего прогностического фактора формирования данного клинического варианта патологии (ОШ=2,74; 95%ДИ=2,04-3,76).У больных с аутоиммунной формой ПНЯ длина Свв повторов находится в пределах популяционной нормы в связи с иным патогенетическим механизмом развития заболевания.

Сравнительный анализ числа САв повторов гена АЯ с высокой степенью достоверности показал повышение частоты «короткого» САв аллеля(<24) у больных с ПНЯ в сравнении с женщинами с сохраненным ритмом менструаций. Риск развития ПНЯ в 2,67 раз выше при наличии в генотипе женщины «короткого» аллеля, что позволяет рассматривать этот маркер как предиктор молекулярно-генетической формы заболевания (0111=2,67;95%ДИ=1,43-5,01).

Изучение основных биохимических параметров обмена железа при наличии мутаций в гене НЕЕ и обнаружение у 40,9% пациенток с ПНЯ нетрансферрин-связанного железа (НТСЖ) на основании ЭПР спектроскопии позволило выявить депонирование в организме железа, включая его отложение в яичниковой ткани, что на клеточном уровне может способствовать запуску процесса ускоренного апоптоза в яичниках.

Подтверждено, что у больных с ПНЯ наряду с проведением ЗГТ, методом выбора может быть лечение на протяжении 6 и более месяцев ДГЭА в суточной дозе 75 мг. При этом показано, у 20% больных через 3-4 месяца нивелируются проявления дефицита половых гормонов.

Практическая значимость

Ведущим предиктором формирования аутоиммунной формы ПНЯ является присутствие антиовариальных антител. Дополнительным независимым фактором риска является наличие сопутствующей аутоиммунной патологии как эндокринного, так и неэндокринного генеза, риск возникновения которой возрастает в 3,8 раз при наличии антиовариальных антител.

Несмотря на равнонаправленные изменения в гипоталамо-гипофизарно - яичниковой системе у больных с ПНЯ может встречаться как нормальное по отношению к овариальному резерву, так и аномальное число Свв повторов в гене ЕМШ. Определение большего или меньшего по отношению к нормальному диапозону числа СвО-повторов (28-36) в гене ЕМШ может быть одним из ранних, объективных предикторов, указывающих на риск развития молекулярно-генетической формы ПНЯ, на основе чего можно осуществлять долговременный прогноз развития заболевания.

Показана необходимость расширения группы риска по развитию гемохроматоза за счет введения в нее пациенток с ПНЯ.

Показана эффективность лечения пациенток с ПНЯ ДГЭА в суточной дозе 75 мг.

Положения, выносимые на защиту

1. Преждевременную недостаточность яичников следует рассматривать как мультифакториальную патологию, в генезе которой в 63% случаев выявляются молекулярно-генетические и эпигенетические нарушения, преимущественно на X хромосоме. Любое отклонение числа Свв повторов в гене РМЯ1 по отношению к его нормальному диапозону (28-36), наличие «короткого» аллеля (<24 САв повторов) в гене АК, наличие неслучайной инактивации X хромосомы являются ранними предикторами развития молекулярно-генетической формы ПНЯ. Аутоиммунная полиэндокринопатия и определение органоспецифических и неорганоспецифических аутоантител свидетельствуют об аутоиммунной форме заболевания, частота которой составляет 33,3%.

2. Перегрузка организма железом на системном и тканевом уровнях с последующим его отложением в ткани яичников, возможно, являются одними из дополнительных патогенетических механизмов ускоренного апоптоза фолликулов, что приводит к развитию преждевременной недостаточности яичников.

Пациенток с ПНЯ необходимо включать в группу риска по развитию гемохроматоза.

3. Помимо использования традиционной гормональной терапии больным с ПНЯ для нивелирования симптомов дефицита половых гормонов показано назначение мототерапии Дегидроэпиандростероном в суточной дозе 75 мг на протяжении 6 и более месяцев.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика -новые горизонты» (Москва, 2010г.), V Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва,2011г.), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011г.), Всероссийской Конференции по гинекологической эндокринологии и менопаузе «Гормонально-ассоциированные заболевания репродуктивной системы: от новых научных концепций к тактике ведения» (Москва, 2011), Всемирном конгрессе по менопаузе (Рим, 2011 г.),VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012г.), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2012г.), VI региональном научном форуме «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012г.). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции в отделении гинекологической эндокринологии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (29.05.2012) и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (04.06.2012г.).

Внедрение результатов исследования в практику

Комплексное обследование и принципы лечения у пациенток с ПНЯ внедрены в клиническую практику «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Материалы диссертации используются при чтении лекций по гинекологической эндокринологии.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, глав, отражающих результаты собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, изложена на 200 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 28 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 264 источников (32 на русском и 232 на иностранных языках).

выводы

1. Расширены критерии диагностики аутоиммунной формы преждевременной недостаточности яичников, в результате чего диагноз ставится не только на основании обязательного наличия антиовариальных антител (19,2%), но и присутствия органоспецифических (АТ-ТГ+АТ-ТПО-19,2%) и органонеспецифических (антинуклеарные антитела - 2,6%) антител, в сочетании с аутоиммунными заболеваниями эндокринного (19,2%) и неэндокринного генеза (6,4%). Аутоиммунные факторы выявлены у 33,3% больных с ПНЯ.

2. Норма числа CGG повторов в гене FMR1 по отношению к тотальному овариальному резерву у женщин с сохраненным ритмом менструаций находится в диапозоне 28-36повторов. Для больных с ПНЯ с одинаковой частотой характерна представленность как нормального, так и аномального числа CGG повторов в гене FMR1.(4% и 52%, соответственно, р>0,05).

3. При аутоиммунной форме заболевания в 96,2% случаев число CGG повторов в гене FMR1 находится в пределах нормативного диапозона (28-36).

4. Ранним прогностическим маркером развития молекулярно-генетической формы ПНЯ, выявляемой у 63% больных, является аномальное число CGG повторов в гене FMR1 менее 28 и более 36 (0111=2,74, 95%ДИ 2,04-3,67), при этом в 19-37% случаев отмечено ее сочетание с неслучайной инактивацией X хромосомы.

5. Уровень AMT - как объективный критерий оценки функционального овариального резерва, у больных с аутоиммунной формой ПНЯ в сравнении с молекулярно-генетической достоверно выше и составляет 0,23±0,03 нг/мл против 0,06 ±0,01 (р<0,0001), что подтверждает наличие ассоциативной связи между длиной CGG повторов и овариальным резервом .

6. Прогностическим маркером развития молекулярно-генетической формы ПНЯ является наличие неслучайной инактивации хросмосомы X, встречающейся в 26% случаев (0111=49,6, 95% ДИ=3,0-805). Достоверное превышение частоты встречаемости «короткого» аллеля гена AR (менее 24 CAG повторов) у больных с ПНЯ позволяет рассматривать этот маркер в качестве предиктора развития ПНЯ. (ОШ=2,67,95%ДИ=1,43-5,01)

7. Нуклеотидные замены в гене наследственного гемохроматоза - HFE обнаружены у 21,6% пациенток с ПНЯ, при этом у каждой третьей пациентки отмечено повышение уровня сывороточного железа, ферритина в 27,3%, на фоне сниженного уровня трансферрина и увеличения его насыщенности железом в каждом втором случае.

8. Выявление нетрансферрин - связанного железа у 40,9% пациенток пациенток с ПНЯ методом ЭПР спектроскопии и гранул гемосидерина в яичниковой ткани в 75% случаев свидетельствуют о перегрузке организма железом и его токсическом действии на фолликулярный аппарат.

9. Больным с ПНЯ помимо проведения традиционной ЗГТ, возможно назначение монотерапии дегидроэпиандростероном. При этом у всех больных повышается качество жизни, в 2,7 раза снижается уровень ФСГ, в 2,8 раза повышается концентрация эстрадиола, в 6,3 раза тестостерона и двукратно увеличивается уровень AMT. Восстановление ритма менструаций на фоне приема ДГЭА без проведения традиционной ЗГТ отмечено в 20% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Во время диспансерного наблюдения молодых женщин с наличием факторов риска ПНЯ (олигоменорея с менархе, ПНЯ у матери, аутоиммунный тиреоидит, перенесенные эпидемический паротит и краснуха, носительство определенных фенотипов главного комплекса гистосовместимости II класса (DRB1*01, DRB1*03, DQB1*0501, DQB 1*0302)) необходимо расширение алгоритма обследования с проведением молекулярно-генетического исследования, включающего определение числа CGG повторов в гене FMR1, выявление неслучайной инактивации X хромосомы с определением длины CAG повторов гена AR.

2. Учитывая, что у каждой третьей больной с ПНЯ встречается семейная форма заболевания, при наличии в семье девочек с целью построения прогноза в отношении репродуктивной функции показано раннее кариотипирование, определение длины CGG повторов в гене FMR1 и наличие неслучайной инактивации X хромосомы.

3. Наличие нормального числа CGG повторов в гене FMR1 в пределах 28-36 у больных с ПНЯ указывает на аутоиммунную форму заболевания, в связи с чем этой категории больных необходим расширенный иммунологический скрининг, включающий определение уровня не только антиовариальных, но и антитиреоидных, антинуклеарных, антимитохондриальных и антифосфолипидных антител и подробный сбор анамнеза на наличие аутоиммунной патологии эндокринного и неэндокринного генеза. При наличии полигландулярной патологии больная должна наблюдаться совместно со смежными специалистами.

4. Выявление аномальной длины CGG повторов в гене FMR1 у больных с ПНЯ свидетельствует о молекулярно-генетической форме заболевания.

5. Пациенток с ПНЯ необходимо включать в группу риска по возможному развитию гемохроматоза. При выявлении значимых мутаций в гене НЕЕ доказана необходимость направлять больных с ПНЯ к гематологам для углубленного обследования обмена железа и проведения специфического лечения.

6. При выявлении гипоандрогенного состояния у больных с ПНЯ при выборе препарата ЗГТ предпочтение следует отдавать гестагенам, обладающим частичной андрогенной активностью, что способствует достоверному повышению уровня Т, ИСА и улучшению качества жизни.

7. Пациенткам с ПНЯ в качестве альтернативного метода лечения для коррекции дефицита половых стероидов можно рекомендовать дегидроэпиандростерон в суточной дозе 75 мг на протяжении 6 и более месяцев.