Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинико-патогенетическое значение полиморфизма генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом в Республике Башкортостан

Ча правах рукописи

ХАБЕЛОВА ТАМАРА АЛЕКСАНДРОВНА

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ И ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКСИДА

АЗОТА У БОЛЬНЫХ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКОЙ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

14.00.10 - инфекционные болезни 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003055589

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики

Уфимского научного центра Российской академии наук

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дина Халиловна Хунафина доктор биологических наук, профессор Венер Абсатарович Вахигов

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Нина Михайловна Грачева

доктор биологических наук, профессор Виктор Алексеевич Спицын

Ведущая организация - ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава

Защита диссертации состоится 6 апреля 2007 г. на заседании диссертационного совета Д 208.114.01 в ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (111123, Москва, ул. Новогиреевская, За)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Автореферат разослан « « марта 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) представляет серьезную проблему в связи с широким распространением природных очагов, тяжестью болезни, недостаточностью разработанных методов специфической терапии и профилактики.

В мире ежегодно с диагнозом «ГЛПС» госпиталюируется около 200 тыс. человек, летальность составляет 0,5-15% (Магазов Р.Ш. и соавт., 2006). На территории Республики Башкортостан (РБ) расположен один из самых крупных и активных очагов ГЛПС. Ежегодно в РБ заболевает ГЛПС 1,5-2,5 тысяч человек, что составляет 40-60% заболеваемости по Российской Федерации (Онищенко Г.Г., Ткаченко Е. А., 2006). Болеют преимущественно лица молодого, трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб.

Важная роль в патогенезе ГЛПС принадлежит иммунопатологическим механизмам. Исследовалось состояние клеточного, гуморального звеньев иммунитета в зависимости от периода и тяжести заболевания: содержание Т-лимфоцитов, плазмоцитов и В-лимфоцитов, а также их субпопуляций (CD3, CD4, CD8, CD 16, CD22, CD25, CD95) (Алексеев О.И. и соавт., 1998; Валищин Д.А., 1999; Мурзабаева Р.Т., 2002); иммуноглобулинов А, М, G, Е (Алексеев О.И. и соавт., 1998; Еланская Л.Н., 1982); циркулирующих иммунных комплексов (Гавриловская И.Н. и соавт., 1987, Морозов В.Г. 1993), показателей комплемента (Суздальцев А. А., 1992).

Центральная роль в ауторегуляции иммунного ответа и его интеграции с функциями всех систем организма принадлежит цитокинам. Главной патофизиологической характеристикой ГЛПС является поражение эндотелия сосудов с развитием альтернативно-деструктивного панваскулита. Цитокиновую экспрессию в поврежденных клетках считают основной причиной нарушений микроциркуляции, центральной гемодинамики, плазморреи, ДВС-синдрома (Markotic A et at, 2001). Изучению цитокинового статуса у больных ГЛПС посвящен ряд исследований, в которых отражена динамика уровней про- и противововоспалительных цитокинов (Linderholm М. et а!., 1996; Markotic A et al, 1999; Мурзабаева Р.Т, 2002; Иванис В.А., 2004).

Большое значение в ранних иммунных реакциях у больных ГЛПС занимает повышенная секреция эндотелием оксида азота (NO) - молекулы с противовирусной активностью. Исследовался уровень оксида азота и его метаболитов в сыворотке крови

(Linderholm M. et al., 1996; Камилов Ф.Х. и соавт., 2003), супернатантах мочи, конденсатах выдыхаемого воздуха (Иванис В.А., 2002) у больных ГЛПС. Показана роль оксида азота в генезе инфекционно-токсического шока, активации механизмов сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза и проявлении эндотелиальной дисфункции сосудов при ГЛПС.

ГЛПС - многофакторное заболевание, характер развития которого зависит от дозы, патогенности, вирулентности возбудителя и иммунореактивности организма во взаимоотношении с условиями окружающей среды. Многочисленные исследования, проводимые во всем мире, показывают, что восприимчивость к инфекционным агентам генетически детерминирована.

Одним из наиболее доступных подходов, применяемых в молекулярно-генетических исследованиях многофакторных заболеваний, является изучение ассоциаций заболевания с полиморфными вариантами генов, белковые продукты которых участвуют в патогенезе болезни. Выявлены ассоциации ГЛПС с генами главного комплекса гистосовместимости (HLA), генами цитокинов и их рецепторов (TNFA, IL1, ILRN) (Mustonen J. et al., 1998; Makela S. et al., 2001). Однако результаты исследований разных авторов неоднозначны, кроме того, имеют место этнические различия в чувствительности к инфекционным заболеваниям. Данные по изучению ассоциаций гена индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2A) с ГЛПС в мировой литературе отсутствуют.

Поскольку в РБ молекулярно-гентическое исследование ГЛПС до сих пор не проводилось, является актуальным изучение полиморфных вариантов генов, ассоциированных с данным заболеванием.

В рамках рассматриваемой проблемы идентификация генов, вовлеченных в патогенез ГЛПС, является важной медико-генетической задачей, решение которой способствует формированию фундаментальных представлений о патогенезе этого тяжелого, социально-опасного заболевания, а также позволит прогнозировать риск развития и тяжесть течения ГЛПС.

Цель работы: выявить ассоциацию полиморфных вариантов генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота с предрасположенностью к заболеванию и характером течения ГЛПС в РБ.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по ГЛПС в РБ и проанализировать клинические особенности течения ГЛПС.

2. Провести исследование ассоциаций полиморфного локуса -308G>A гена TNFA с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

3. Провести исследование ассоциаций полиморфных локусов -511С>Т, 3953С>Т гена 1ЫВ с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

4. Провести анализ ассоциаций УЫШ полиморфизма гена 1ЫШ с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

5. Провести исследование ассоциаций сочетаний генотипов полиморфных локусов -511С>Т, 3953С>Т гена 111В и ШШ гена 1ЫШ с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

6. Провести анализ ассоциаций £7К-полиморфизма гена N0524 с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

Научная новизна исследования.

Впервые у больных ГЛПС проведено исследование полиморфных локусов генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота. Впервые охарактеризовано распределение частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локусов у больных ГЛПС и серонегативных доноров в РБ. На основании многофакторного статистического анализа выявлены существенные различия в распределении полиморфных вариантов генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота у больных ГЛПС с разной формой тяжести и серонегативных доноров. Показана ассоциация полиморфных вариантов генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота с основными клинико-лабораторными показателями, характеризующими тяжесть течения ГЛПС. Установлены маркерные аллели и генотипы генов цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота, указывающие на повышенную предрасположенность к тяжелому течению ГЛПС с риском развития таких специфических осложнений, как инфекционно-токсический шок, острая почечная недостаточность, ДВС-синдром.

Практическая значимость работы.

Результаты работы вносят вклад в расшифровку патогенеза ГЛПС, формирование представления о генетических основах заболевания.

Генотипирование больных ГЛПС по генам цитокинов и индуцибельной синтазы оксида азота позволяет определить индивидуальную предрасположенность к тяжелому течению болезни, с целью разработки комплекса лечебно-профилактических мероприятий, направленных на предотвращение неблагоприятного исхода ГЛПС.

Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов, влияющих на заболеваемость, характер течения и исход ГЛПС.

Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ассоциация полиморфных вариантов генов фактора некроза опухоли а {ШЛА), рецепторного антагониста интерлейкина 1р (ШШ), индуцибельной синтазы оксида азота (N052А) с предрасположенностью к заболеванию ГЛПС.

2. Ассоциация полиморфных вариантов генов 75УЕ4, интерлейкина 1р (1ЫВ), 1Ь1КК, N032А с тяжестью течения ГЛПС.

3. Генетические маркеры повышенного риска развития специфических осложнений (ИТШ, ОПН, ДВС-синдром) по оценке полиморфных вариантов генов ТША, 1ЫВ, N032А.

Апробация

Основные положения диссертации представлены: на V съезде Российского общества медицинских генетиков (г. Уфа, 2005), научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (г. Санкт-Петербург, 2006), VII Российском съезде врачей-инфекционистов (г. Н. Новгород, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики» (г. Уфа, 2006), 69-ой, 71-ой итоговых Республиканских научных конференциях молодых ученых с международным участием (г. Уфа, 2006), ученом совете ИБГ УНЦ РАН, совместном заседании кафедры инфекционных болезней БГМУ и кафедры инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии ИПО БГМУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 196 источников, из них 107 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками, 53 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы образцы ДНК больных ГЛПС, получивших лечение в городской клинической инфекционной больнице № 4 г. Уфы, а также серонегативных доноров, проживающих на территории Республики Башкортостан.

Для исследования отобрана группа неродственных между собой пациентов с подтвержденным методом РНИФ (МФА) диагнозом ГЛПС, в возрасте от 15 до 65 лет. Численность выборки составила 335 человек. Соотношение числа женщин и мужчин -1,2:7,6 (44 женщины и 291 мужчина). В возрастном аспекте большую часть больных составили лица наиболее трудоспособного возраста - от 21 до 50 лет (74,6%).

Среди обследованных преобладали городские жители - 289 чел. (86,3%), из сельской местности было 46 чел. (13,7%). Динамика заболеваемости имела сезонный характер. Пик заболеваемости отмечался в осенне-зимний период (88,0%).

Согласно общепринятой классификации Б. 3. Сиротина выделяли легкую форму ГЛПС - 15 чел. (4,5%), среднетяжелую - 234 чел. (69,8%) и тяжелую - 86 чел. (25,5%). Среди осложнений мы наблюдали ИТШ (8,9%), ОПН (5,9%) и ДВС-синдром (4,5%).

Всем больным, кроме общеклинического обследования, проводился общий анализ крови и мочи, определение уровня сывороточного креатинина и мочевины, исследование мочи по Зимницкому. При необходимости использовались дополнительные методы исследования: анализ мочи по Нечипоренко, коагулограмма, исследование кислотно-щелочного состояния и электролитов крови, ультразвуковое исследование почек.

Контрольная группа была сформирована из 300 серонегативных по ГЛПС доноров, проживающих на территории Республики Башкортостан, соответствующих выборке больных по возрасту, полу.

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (\lathew е1 а1.,1984). Анализ полиморфных ДНК-локусов генов 77УЕ4, 1ЫВ, 1ЫКИ, Ы082А проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва). Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 20 мкл, которая содержала 2,0 мкл 1(М^-буфера (67 мМ трис-НС1 (рН 8,8), 16,6 мМ (ИНОг 504,, 1,5мМ М§С12, 0,01% Т\>/ееп-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь (ШТР (ёАТР, сЮТР, <1СТР, ёТТР по 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Тегтиэ адиа^сиБ (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Полиморфизм локусов генов ТШ^А, 1ЫВ исследовался методом ПДРФ-анализа.

После амплификации ПЦР-продукты локусов генов TNFA, IL1B подвергались гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции. Рестрикцию полиморфных локусов -308G>A гена TNFA, -51 lOTгена IL1B проводили эндонуклеазами Bspl9\, Ата871, при температуре 37°С, ПДРФ-анализ полиморфизма +39530Т гена IL1B - рестриктазой Taql при температуре 65°С, в соответствие с рекомендациями фирм-производителей. Разделение фрагментов ДНК генов TNFA, IL-IB, NOS2A после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле. Фрагменты ДНК гена IL1RN после амплификации разделяли в 1% агарозном геле.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием пакета программ: «Statistica for Windows 6,0» (StatSoft), RxC (Rows and Columns) (Roff, Bentzen, 1989), программного обеспечения MS Excel (Microsoft). При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц использовался точный двухсторонний критерий Фишера Р (F2), а также критерий (Р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Йейтса на непрерывность (Леонов, 1998). Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов Odds Ratio (OR) (Бабич П.Н и соавт., 2005). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводился с помощью критерия Шапиро-Уилка. В качестве описательной статистики выборочного распределения количественных признаков указывались медиана (Me), интерквартильный размах (интервал). Сравнение групп по количественному признаку проводилось непараметрическими методами Краскели-Уоллиса и Манна-Уитни. С целью преодоления проблемы множественных сравнений применялась поправка Бонферрони (Реброва О.Ю., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование полиморфизма генов цитокинов у больных ГЛПС и серонегативных

доноров

Нами изучено распределение частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов генов: TNFA (-308G>A), 1L1B (-5JJC>T, 39530T), IL1RN (VNTR) у больных с ГЛПС и серонегативных доноров из РБ.

Клинико-генетический анализ ассоциаций полиморфного локуса -308G>A гена фактора некроза опухоли (TNFA) у больных ГЛПС Анализ -308G>A полиморфизма гена TNFA выявил статистически значимые различия в распределении частот генотипов между больными ГЛПС и контрольной группой (^=13,02; Р=0,001). У больных ГЛПС наблюдалось достоверное увеличение частоты гомозиготного

генотипа ТЫРА*Л/*Л - 5,97% (Р=0,02; СШ=3,П; 95%С1 1,16-8,78) и снижение частоты гетерозиготного генотипа ШАЮ/*А - 28,66% (Р-0,005; 08=0,61; 95%С1 0,43-0,86), по сравнению с серонегативыми донорами (2,0% и 39,67%. соответственно). Оценка распределения частот аллелей не обнаружила достоверных отличий между сравниваемыми группами (Р>0,05).

Анализ -308 С>А полиморфизма гена ШРА выявил статистически значимые различия в распределении частот генотипов между контролем и больными со среднетяжелым (X1-14,01; Р-0,002), а также тяжелым (хг= 10,29; Р=0,006) течением ГЛПС Генотип ШР*А/*А с наибольшей частотой наблюдался у пациенток с тяжелой формой ГЛПС - 9,3%, чем среди серонегативных доноров - 2,0% (Р=0,005, (Ж=5,03; 95%С1 1,53-16,9) (рис. 1). У больных со среднетяжелым течением болезни отмечено увеличение частоты генотипа -

69,23% (Р-0,01; ОН.» 1,61; 95%С1 1,10-2,34) и снижение частоты генотипа 7ШАЮ/*А -25,64% (Р=0,02; ОЯЮ,52; 95%С1 0,36-0,78) по сравнению с котпролем (58,33% и 39,67%, соответственно). При сравнении групп больных ГЛПС между собой, отмечено значительное увеличение частоты мутантного аллеля TNF*A (26,74%) у пациентов с тяжелым течением болезни по сравнению с пациентами со среднетяжелым течением ГЛПС - 17,95% (Р=0,002; СЖ=],67; 95%С1 1,08-2,57).

лет. ф.

ср. тяж

Контроль

Рис. 1. Распределение частот генотипов полиморфного локуса -3080>А гена ТЪ!РА у больных ГЛПС с разной степенью тяжести и серонегативных доноров

Как было отмечено выше, среди заболевших ГЛПС преобладало мужское население, что вероятно связано с более активным образом жизни, характером труда, а также иммуноэндокринными особенностями Сравнение распределения частот аллелей н генотипов -3080>А поли морф н о ["О локуса гена ТЫ¥А не обнаружило статистически значимых различий между мужским и женским населением в целом и при распределении больных по степени

тяжести (Р>0,05). Однако при среднетяжелом течении ГЛПС наиболее высокая частота мутантного аллеля TNF*А наблюдалась у пациентов мужского пола и составила 19,16% против 5,0% у женщин (Р=0,03; OR=4,5; 95%С1 1,06-19,04).

Оценка распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A гена TNFA у больных ГЛПС в зависимости от развития осложнений (ИТЩ ОПН, ДВС-синдром) выявила достоверные отличия между группой больных с ИТШ и пациентами без ИТШ (XJ=6,92; Р=0,01 и х2=6,23; Р=0,04, соответственно). У индивидов с ИТШ отмечено увеличение частоты аллеля TNF*A - 33,33% против 19,02% у больных без данного осложнения (Р=0,01; OR=2,13; 95%С1 1,15-3,91). Генотип TNF*G/*G у пациентов с ИТШ наблюдался значительно реже - 46,67%, чем индивидов с неосложненным течением ГЛПС -67,21% (OR=0,42; 95%С1 0,19-0,96).

Анализ основных клинико-биохимических показателей в зависимости от степени тяжести у больных ГЛПС с разными генотипами методом Манна-Уитни показал, что при среднетяжелом течении заболевания у носителей гетерозиготного генотипа TNF*G/*A уровень креатинина (медиана и интерквартильный размах) был достоверно выше - 199,05 мкм/л (от 144,0 до 353,8 мкм/л), чем у пациентов с генотипом TNF*G/*G - 169,5 мкм/л (от 110,5 до 265,0 мкм/л) и TNF*A/*A - 143,35 мкм/л (от 75,0 до 272,45 мкм/л) (Р=0,05 и Р=0,01, соответственно). Протеинурия у пациентов с генотипом TNF*A/*A при данной форме тяжести (медиана) была менее выражена - 0,12 г/л, по сравнению с индивидами с генотипами TNF*G/*G и TNF*G/*A, у которых содержание белка в моче оказалось одинаковым и составило 0,33 г/л (Р=0,01 и Р=0,005, соответственно).

Полученные нами результаты анализа -308G>A полиморфизма гена TNFA у больных ГЛПС и серонегативных доноров РБ показали, что генотип TNF*A/*A является генетическим маркером повышенного риска развития ГЛПС, тогда как генотип TNF*G/*A способен выполнять протективную функцию. Кроме того, генотип TNF*A/*A ассоциирован с тяжелым, а аллель TNF*А с осложненным ИТШ течением ГЛПС.

Клинико-генетический анализ ассоциаций полиморфных локусов -511 С>Т и 395ЗС> Т

гена интерлейкина lß (IL 1В1) у больных ГЛПС Анализ полиморфного локуса -511С>Тгена IL1B не выявил статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей между больными ГЛПС и серонегативными донорами (Р>0,05).

Оценка распределения частот генотипов полиморфного локуса -511С>Т гена 1L1B между группами больных ГЛПС с разной степенью тяжести и контролем также не обнаружила достоверных отличий (Р>0,05). Однако частота генотипа IL1B*C/*T у пациентов с тяжелым течением ГЛПС - 72,09%, была выше (Р=0,04; OR=i,77; 95%С1 1,02-

3,09), а частота генотипа ШВ*С *С - 18,6% - ниже (Р=0,05; 0R=Û,53; 95%С1 0,28-1,0), чем в контроле (59.33% и 30,0%, соответственно) (рис. 2). Также установлены статистически значимые различия в распределении частот генотипов -51IC Т полиморфизма гена IL1H между больными с легким и тяжелым течением ГЛПС (х2=98,61; Р=0,0000), между пациентами со среди етяжедым и тяжелым течением болезни (х"=1,24. Р=0,004) Частота генотипа 11,1В*С/*Тбыла значительно выше у индивидов с тяжелой формой ГЛПС - 72,09%, чем у пациентов с легкой - 40,0% (Р=0,03; OR=3.88 95%С1 1,10-13,99) и сред нетяжелой формой болезни - 51.28% (Р=0.002, OR=2,45, 95%С1 1,39-4,35). Генотип IL1B*C *C преобладал у индивидов с легким - 53,33% {Р=0,01; UR=5,0; 95%С1 1,38-18,40) и сред нетяжелы м - 34,62% (Р=0,009; OR=2,31; 95% CI 1,22445) течением ГЛПС, против 18,6% у лип с тяжелой формой болезни.

[ ■ IL1B*C/*C

□ 1L1B*C/+T

BIL1B*T/*T

1 OR=l,77

■ tr^

1 OR=GiS3 ■

1 щ 1

_ ш - .М J 1 1 S 1 I

ntï Ф Cp.TBIt^l. ТЯЗК, ф. Комродь

Рис. 2. Распределение частот генотипов полиморфного локуса -511С>Тгена /LIB у больных ГЛПС с разной степенью тяжести и серо негативных доноров

Сравнение выборок больных по половому признаку не обнаружило статистически достоверных отличий в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 5J1C>Тгена ¡LIB среди мужчин и женшин (Р>0,05).

Анализ 511С>Т полиморфизма гена /LIB выявил статистически значимые различия в распределении частот генотипов между группами больных с ИТШ и без ИТШ (j^=6,05; Р=0,04) У больных ГЛПС, осложненной ИТШ отмечено увеличение частоты генотипа 1L1B*C?*T- 76,67%, по сравнению с пациентами без ИТШ, - 54,1% (Р=0,03; OR=2.78; 95%С) 1,10-7,38).

Оценка методом Краскели-Уоллиса основных клинико-биохимических показателей в зависимости от степени тяжести у больных ГЛПС с разными генотипами полиморфного локуса -.57/С> Г гена IL1B не обнаружила достоверных отличий (Р>0,05)

Таким образом, анализ -511С>Т полиморфизма гена IL1B показал, что генотип IL1B*C/*Tявляется маркером тяжелого и осложненного ИТШ течения ГЛПС.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов 39530Т полиморфного локуса гена IL1B между выборками больных ГЛПС и серонегативных доноров, а также при разделении их в соответствии с клинической формой тяжести не выявил ассоциаций с предрасположенностью к ГЛПС и характером ее течения.

Оценка распределения частот комбинаций генотипов по полиморфным вариантам -5ЛОТ и 39530Т гена ILIB не обнаружила статистически значимых различий между больными ГЛПС и серонегативными донорами (Р>0,05). При анализе распределения частот сочетаний полиморфных локусов -51 ЮТ и 3953С>Т гена 11.¡В у больных различными формами ГЛПС с контрольной группой, а также попарном сравнении частот комбинаций генотипов между больными и серонегативными донорами достоверных отличий не отмечено (Р>0,05). Однако частота комбинации СС-СГ у пациентов с легким течением болезни была выше - 40,0%, чем в контроле - 15,0% (Р=0,03; OR=3,78; 95%С11,12-12,35).

Сравнение распределения частот сочетаний по полиморфизмам -51 ЮТ к 3953С>Т гена IL1B выявило статистически значимые отличия между больными легким и тяжелым течением ГЛПС (х5=16,52; Р=0,02) и не обнаружило между пациентами с легким и среднетяжелым, а также среднетяжелым и тяжелым течением болезни (Р>0,05). У индивидов со среднетяжелой формой наблюдалось значительное увеличение частоты комбинации СС-СС - 18,38%, по сравнению с больными тяжелой формой ГЛПС - 8,14% (Р=0,04; OR=2,54; 95%С1 1,04-6,48). Комбинация СС-СТ достоверно чаще встречалась у пациентов с легким течение ГЛПС - 40,0%, чем у лиц со среднетяжелым - 14,1% (Р=0,02; OR=4,06; 95%С11,19-13,59) и тяжелым течением болезни - 10,47% (Р=0,01; OR=5,7; 95%С1 1,4-23,51). Частота сочетания СТ-СТ была выше у больных тяжелой формой - 34,88%, по сравнению с больными среднетяжелой формой ГЛПС - 23,08% (Р=0,05; OR=l,79; 95%С11,01-3,16).

Анализ распределения частот комбинаций полиморфных локусов -511С>Ти 3953С>Т гена 1L1B по половой принадлежности не выявил статистически значимых отличий между выборками мужчин и женщин (Р>0,05). Однако сочетание СТ-СС чаще отмечалось у представительниц женского пола - 40,48%, чем мужского - 24,23% (Р=0,04; OR=2,12; 95%С1 1,03-4,37).

Обнаружены статистически значимые различия в распределении частот комбинаций полиморфных локусов -5ПОТ и 93530Т гена IL1B между больными с ДВС-синдромом и пациентами с неосложненным течением ГЛПС (^=\4,5; Р=0,05). Среди больных с ДВС-синдромом частота сочетания ТТ-СТ оказалась выше - 20,0%, чем у лиц без данного осложнения - 3,12% (Р=0,009; OR=6,4; CI 95% 1,45-21,3).

Ранговый анализ Краскели-Уоллиса основных клинико-лабораторных показателей у больных ГЛПС с разными комбинациями генотипов по полиморфизмам -511С>Ти 9353С>Т гена 1Ь1В выявил статистически значимые отличия в содержании креатинина в крови у лиц с тяжелой формой ГЛПС (Р=0,03) и не обнаружил достоверной разницы в уровнях мочевины, протеинурии и продолжительности лихорадки (Р>0,05). Также, выявлено отсутствие статистически значимых различий в продолжительности лихорадки, выраженности азотемии и протеинурии у пациентов с разными комбинациями генотипов полиморфных локусов -511С>Т и 9353С>Т гена 1ЫВ при легком и среднетяжелом течении ГЛПС (Р>0,05). Попарное сравнение показателей креатинина методом Манна-Уитни у пациентов с разными комбинациями полиморфных локусов -511С>Т и 9353С>Т гена 1ЫВ при тяжелой форме ГЛПС показало, что уровень креатинина у носителей сочетания СС-СС - 738,0 мкм/л (от 590,0 до 940,0 мкм/л) был выше, чем у индивидов с комбинациями СТ-СС - 552,35 мкм/л (от 291,0 до 723,2 мкм/л) и СТ-ТТ - 461,0 мкм/л (от 221,0 до 480,0 мкм/л) (Р=0,05 и Р=0,04, соответственно). У пациентов с комбинацией СТ-СТ также отмечено значительное увеличение креатинина в крови - 700,75 мкм/л (от 516,0 до 923,0 мкм/л) по сравнению с носителями сочетания СТ-СС - 552,35 мкм/л (от 291,0 до 723,2 мкм/л) и СТ-ТТ- 461,0 мкм/л (от 221,0 до 480,0 мкм/л) (Р=0,05 и Р=0,02, соответственно). Самое высокое содержание креатинина зарегистрировано у больных с комбинацией ТТ-СТ - 995,0 мкм/л, которое оказалось статистически достоверно выше, чем у пациентов с комбинациями СС-СТ- 552,5 мкм/л (от 498,0 до 664,0 мкм/л) и СТ-ТТ - 461,0 мкм/л (от 221,0 до 480,0 мкм/л) (Р=0,04 и Р=0,03, соответственно).

Кпинико-генетический анализ ассоциаций УШЛ полиморфизма гена антагониста рецептора интерлейкина ф С1ЫКЫ) у больных ГЛПС При исследовании минисателлитного полиморфизма гена 1Ь1КЫ, локализованного во 2 интроне, из пяти, ранее выявленных Таг1о\у 1К. с соавт. (1993) аллелей, в нашем исследовании были обнаружены три: 1Ь1Ш*1,1Ь1Ш*П и 1ЫШ*Ш и из шести возможных генотипов найдены только пять: ИШ*1/*1,1ЬШ *1/*11,1Ь1Ш *П/*П, 1ЫШ *1/*Ш и И1Ш *1П/*Ш.

При сравнении частот генотипов между больными ГЛПС и контролем выявлены статистически значимые отличия (х2= 10,59; Р=0,03). Частота генотипа 1ЫШ*Т*П у больных ГЛПС - 37,61% была достоверно ниже, чем среди серонегативных доноров - 46,67% (Р=0,03; (Ж=0,69; 95%С1 0,49-0,96). Редкий генотип 1ЫШ*Ш/*П1 в исследуемой выборке больных зарегистрирован не был, частота его в контрольной группе достигала 1,0% (х2=3,73; Р=0,05).

Анализ распределения частот аллелей №'77? полиморфизма гена /¿/АЛ' не обнаружил достоверных отличий в выборках больных ГЛПС и серонегативных доноров (Р>0,05).

Выявлены статистически значимые отличил между контролем и пациентами со среднегяжелым течением болезни и (^=11,37; Р=0,02) и не выявлены с больными легким и тяжелым течением ГЛПС (Р>0,05). У индивидов со среднетяжелой формой ГЛПС отмечено увеличение частоты генотипа // 1Ш*]]/*]1 - 17,95%, по сравнению с серо негативны ми донорами - 10,33% (Р=0,02; СЖ=1,89; 95%С1 1,12-3,22) (рис. 3). Генотип ШМ*!/*!! у пациентов со среднетяжелым течением болезни встречался значительно реже, чем в контроле (36,75% против 46,67%, соответственно, Р=0,03; (Ж=0,бб; 95%С1 0,46-0,96), Оценка распределения частот генотипов УИТВ. полиморфизма гена при сравнении

больных ГЛПС с разной степенью тяжести между собой не обнаружила статистически значимых отличий (Р>0,05).

65 60 55 50 45 40 35 JO 25 20 15 10 5 0

Рис. 3. Распределение частот генотипов УЫТК полиморфизма гена 1ЫШ у больных ГЛПС с разной степенью тяжести и серонегативных доноров

Клинико-генетический анализ ассоииаций комбинаций полиморфных локусов генов

ÍUB и JL1RN у больных ГЛПС Поскольку белковые продукты генов ÍLJRN и ¡L1B являются естественными антагонистами и конкурируют за связывание с одними клеточными рецепторами, нами проведен анализ сочетаний генотипов полиморфных локусов генов ILJRN (VNTR) и П. IB (-5ПС>Т и 3953С>7) с целью выявления возможньк ассоциаций с ГЛПС Аллель IL1B*T полиморфизма 3953С>Т гень ILJB ассоциирован с увеличенной секрецией IL1J3 in vitro (Daly А.К. et al., 2002). Аллель IL1JÍN*1I коррелирует с повышенной продукцией ILIRa in vitro и in vivo, причем, чаще аллель ILIRN*Il встречается у носителей аллеля IL1B*T (-5¡1C>T) (Hurme М. eta]., 1998; Santtila S, et al., 1998),

лег.Ф. cfl-ranf. vwcte контроль

Анализ распределения частот сочетаний генотипов полиморфных локусов -51/С>Т гена IL1B и VNTR гена ILIRN обнаружил статистически значимые различия между больными ГЛПС и контрольной группой (хг=21,69; Р=0,02). У больных ГЛЛС наблюдалось снижение частоты комбинации C/T-MI - 21,49%, по сравнению с серонегативными донорами - 34,0% (P=0,00I, 0R=0,73; 95%С1 0,59-0,88) Редкое сочетание генотипов OT-llI/lIl полиморфных локусов генов JL1B (-511 О7) и ILIRN (VNTR) у больных ГЛПС не встречалось, а в контроле составило всего 1,0% (х3=3,72, Р=0,05).

Выявлены статистически значимые различия в распределении частот комбинаций генотипов -51 ЮТ полиморфизма гена IL 1В и VNTR-полиморфизма гена IL1RN между серонегативными донорами и пациентами со с-реднетяжелым течением болезни (у}=72,2\ Р=0,02) и не обнаружены с больными тяжелой и легкой формой ГЛПС (Р>0,05) У пациентов со сред нетяжелым течением ГЛПС отмечено снижение частоты сочетания генотипов C/T-I/B -19,23%, по сравнению с контролем - 34% (Р=0,0009; OR=Q,46; 95%С1 0,30-0,71). При тяжелой форме ГЛПС преобладала комбинаты С/Т-Ш - 34,88% против 18,0% среди серонегативных доноров (Р=0,002; OR=2,44; 95%С1 1,38-4,29) (рис 4) При сравнении групп больных ГЛПС с разным клиническим течением между собой установлено, что частота сочетания С/Т-Ш при тяжелой форме была значительна выше - 34,88%, чем при среднетяжелой - 20,94% (Р-0,02; ÜR=2,02; 95%С( 1,13-3,61),

40

35 ■ 30 25 20 -15 -10 5 +■ 0

_OR=2,44 -

1 \ " Птп f lÄL.

□ легкая форма

□ ср. тяжелая форма Я тяжелая форыа

Q контроль

DEÜtejüL

ис-ifi С/С4Л1 o/o-i i/i i С/С-1ЛИ с/тлл с/т-ifli c/t-ii/ii cm л и с/т-ишп т/г-й in-\m ТЯ-ПД1

Рис. 4 Распределение частот комбинаций генотипов полиморфных локусов -51 JO T гена ¡LIB и VNTR гена 1LIRN у больных различными формами ГЛПС и серонегативных доноров

Анализ осложнений (ИТШ, ОПН и ДВ С-синдромом) у больных ГЛПС не выя аил статистически значимых различий частот комбинаций полиморфных локусов -51 JOT гена 1L1B и VNTR гена 1L1RN между сравниваемыми группами. Не обнаружено достоверных отличий в продолжительности лихорадки, выраженное™ азотемии и протеинурии у больных ГЛПС с разными комбинациями генотипов по полиморфным локусам генов 1L1B (-51Ю Т) и UJRN(l/NTR) в целом и при разделении по формам тяжести

Статистически значимые различия в распределении частот комбинаций по 3953С>Т полиморфизму гена IL1B и VNTR полиморфизму гена 1L1RN при сравнении выборки больных ГЛПС в целом, а также при разделении по формам тяжести, и контрольной группы не обнаружены (Р>0,05). Однако у лиц со среднетяжелым течением болезни частота сочетания генотипов С/Т-Ш была ниже, чем среди серонегативных доноров (14,96% против 22,0%, соответственно, Р=0,05; OR=0,62; 95%С10,39-1,0).

Выявлены статистически значимые различия в распределении частот комбинаций генотипов по полиморфным ДНК-локусам 39530Т гена IL1B и VNTR гена IL1KN между мужчинами и женщинами (х2=21,79; Р=0,04). Среди женщин достоверно чаще наблюдалась комбинация С/С-Ш1-35,71%, против 16,38% у мужчин (Р=0,006; OR=2,84; 95%С1 1,32-6,04).

Помимо попарного сравнения сочетаний генотипов полиморфизмов гена IL1RN (VNTR) и гена IL1B (-511С>Т, 39530Т), проведен анализ сравнения комбинаций одновременно всех трех исследуемых полиморфных локусов. Анализ по распределению частот комбинаций полиморфных локусов генов IL1RN (VNTR) и IL1B (-511С>Т, 39530Т) между больными ГЛПС и контрольной группой обнаружил статистически значимые различия (х2=55,29; Р=0,0008). У больных ГЛПС отмечено увеличение сочетания генотипов II/II-C/T-C/C - 4,78%, против 1,67% среди серонегативных доноров (Р=0,05; OR=2,95; 95%С1 1,0-9,35). Тогда как комбинации MI-C/T-C/C (10,45%) и I/U-C/T-C/T (9,55%) у пациентов с ГЛПС встречались значительно реже, чем в контроле, где частота данных комбинаций была одинаковой и составила 16,67% (Р=0,03; OR=0,58; 95%С1 0,36-0,95 и Р=0,008; OR=0,53; 95%С10,32-0,87, соответственно).

Распределение частот сочетаний генотипов VNTR-(-511С>Ту3953С>Т у больных ГЛПС с разной степенью тяжести выявило достоверное отличие между серонегативными донорами и пациентами со среднетяжелым (xJ=56,35; Р=0,0002) и тяжелым течением болезни (х2=44,25; Р=0,001). Частота комбинаций генотипов I/II-C/T-C/C - 9,83% (Р=0,03; ORK),55; 95%С1 0,31-0,95), и MI-C/T-C/T - 7,69% (Р=0,002; OR=0,42; 95%С1 0,23-0,76), в группе больных среднетяжелой формой оказалась ниже, чем в контроле, где частота данных комбинаций была одинаковой и достигала 16,67%.

Анализ осложнений у больных ГЛПС не обнаружил статистически значимых различий в распределении частот сочетаний генотипов полиморфных локусов -5ПС>Т, 3953С>Т гена IL 1В и VNTR гена IL1RN между сравниваемыми группами. У пациентов с ИТШ отмечено значительное увеличение частоты комбинации Ш-С/Т-С/С - 23,33%, по сравнению с индивидами с неосложненным течением болезни - 9,84% (Р=0,05; OR=2,79; 95%С11,0-7,89).

В результате проведенного исследования полиморфных ДНК-локусов генов цитокинов ILIB и IL1RA показано, что различные сочетания генотипов полиморфных вариантов этих генов могут оказывать влияние на течение и исход ГЛПС. Поскольку, согласно данным литературы (de Giovine F.S. et al., 1992; Dominici R. et al., 2002) аллельные варианты -SUT и 3953T полиморфизмов -511C>T и 3953С>Т гена IL1B характеризуются повышенной продукцией ILlp, полученные нами данные позволяют предположить, что постоянная выработка достаточно высоких концентраций провоспалительного цитокина ГЫр приводит к выраженной воспалительной реакции. Возможно, сочетание в организме высокой продукции ПЛ|3 с относительно низкой концентрацией его рецепторного антагониста (при наличии аллеля IL1RN*I) способствует неблагоприятному течению ГЛПС.

Таким образом, результаты нашего исследования подтверждают предположение о том, что генетически детерминированное изменение продукции цитокинов оказывает значительное влияние на тяжесть воспалительного процесса у больных ГЛПС.

Исследование £7К-полиморфизма гена индуцибелькой синтазы окиси азота (NOS2A) у

больных ГЛПС и серонегативных доноров из Республики Башкортостан Большое значение в ранних иммунных реакциях у больных ГЛПС занимает повышенная секреция эндотелием оксида азота (N0) - молекулы с противовирусной активностью, синтезируемой ферментом NO-синтазой (NOS2). Нами изучен микросателлитный пентануклеотидный (ССТТТ),, полиморфизм, расположенный в промоторной области гена NOS2A, у больных ГЛПС из РБ.

Из возможных шестнадцати аллелей в популяциях РБ встречались одиннадцать с количеством повторов от 10 до 20. Сравнение распределения частот (ССТТТ) п аллелей гена NOS2A у больных ГЛПС и в контрольной группе вьивило статистически значимые отличия (Х2=49,77; Р<0,0001). У пациентов с ГЛПС отмечено значительное увеличение частоты аллелей NOS2A*ll - 12,68% (Р=0,005; OR=l,75; 95%С1 1,18-2,59) и NOS2A*I2 - 23,13% (Р=0,0006; OR=l,84; 95%С1 1,37-2,50) по сравнению с серонегативными донорами, у которых частота данных аллелей составила 7,67% и 14,0%, соответственно. Аллели NOS2A*I5 - 4,63% (Р=0,004; C)R=0,49; 95%С1 0,30-0,79) и NOS2A*16 - 4,78% (Р=0,001; C)R=0,44; 95%С1 0,280,71) у больных ГЛПС встречались достоверно реже, чем в контроле, где на долю этих аллелей приходилось 9,0% и 10,17%, соответственно.

При разделении больных ГЛПС по степени тяжести обнаружены статистически значимые различия в распределении частот (ССТТТ)„ аллелей между серонегативными донорами и пациентами со среднетяжелой (х2=33,96; Р<0,0001), а также тяжелой (х2—36,75; Р<0,0001) формой болезни. У индивидов с тяжелым течение ГЛПС наблюдалось увеличение частоты аллеля NOS2A*ll - 16,86%, по сравнению с контролем - 7,67% (Р=0,001; OR=2,44;

95%С1 1,43-4,14} (рис. 5). Кроме того, у лиц со среднегяжелой - 22,22%, и тяжелой - 25,0%, формами ГЛПС отмечено повышение частоты аллеля N0524*12 против 14,0% среди серонегативных доноров <Р=0,001; 011=1.75: 95%С1 1,26-2,44 и Р=0,002; (Ж=2,05; 95%С1 1,32-3,16, соответственно). Частота аллеля ЫО$2А*16 у больных среднегяжелой формой оказалась достоверно ниже - 4,7%, чем в контроле- 10,17% (Р--0,001; СЖ=0,46: 95%С1 0.280,76).

30 т-25 -

08Ь=1.75 011=205 0

го,

15 10

•10

□лег.ф,

ср. гяж.ф ■ тяж.ф. И Контроль

т12

•16

»18

♦19

*20

Рис 5. Распределение частот (ССТТТ)П аллелей гена М).Ч2А у больных с различными формами ГЛПС и серонегативных доноров

Анализ осложнений не выявил статистически значимых отличий в распределении частот (ССТТТ)п аллелей гена Ы082А в сравниваемых группах (Р>0,05). Однако у больных с ОГ1Н отмечено значительное увеличение частоты аллеля NOS2A*Il - 27,5%, по сравнению с пациентами с неосложненным течением ГЛПС - 11,75% (Р=0,005; 011=2,85; 95%С1 1,286,25)

Сравнение распределения частот генотипов 5ТК-полиморфизма гена N0,^2А показало статистически значимые различия между выборкой больных ГЛПС и контролем (х1=96,26, Р<0,0001). С целью преодоления проблемы множественных сравнений, с учетом поправки Еонферрони, решено было установить уровень значимости Р=0,001. Частота генотипа Ш~)$2А*12 *14 у пациентов с ГЛПС оказалась достоверно выше - 22,69, чем среди серонегативных доноров - 9,67% (Р=0,0005, ОЯ=2.74, 95%С1 1.69-4,46) Тогда как, генотип NOS2A *13 *14 у больных встречался значительно реже по сравнению с контролем (10,15% против 21.0%, соответственно, Р=0,0009; <Ж=0,62, 95%СЗ 0,46-0,82) Кроме того, у больных ГЛПС отмечено увеличение частоты генотипов N032А*II *12 - 5,07% (Р=0,006; ОЯ=5,29, 95%С1 1,54-18,24) и NOS2A*II *JЗ - 14,63% (Р=0,002; ОК-2,39, 95%С1 1,35-4,14) по сравнению с серонегативными донорами (1% и 6,67%. соответственно).

Анализ частот (ССТТТ)П генотипов гена ЮБ2А у больных ГЛПС с разным клиническим течением, также выявил статистически значимые отличия между группой контроля и пациентами со среднетяжелой (х:=78,92; Р<0,0001) и тяжелой формами болезни (Х2=68,21; Р<0,0001). При тяжелом течении у больных ГЛПС с более высокой частотой наблюдался генотип N0524 *11/*12 (11,63% против 1,0% среди серонегативных доноров, Р=0,0005; СЖ=3,78; 95%С1 2,64-5,4). Также у пациентов с тяжелой формой отмечено повышение частоты генотипа N052А *12/*14 - 20,93%, по сравнению с контролем - 9,67% (Р=0,005; (Ж=2,47; 95%С1 1,24-4,94). Для больных со среднегяжелым течением ГЛПС характерно преобладание генотипов ЫОЯ2А *12/*14 - 22,22% (Р=0,0007; (Ж=2,67; 95%С1 1,59-4,49), и Ю52А *11/*13 - 14,1% (Р=0,004; (Ж-2,29; 95%С1 1,24-4,29), тогда как у серонегативных доноров частота данных генотипов составила 9,67% и 6,67%, соответственно. Генотип Ы052А *13/*14 у пациентов со среднетяжелой формой ГЛПС, наоборот, наблюдался реже - 10,68%, чем в группе контроля - 21,0% (Р=0,001; (Ж=0,45; 95%С1 0,27-0,76).

При сопоставлении групп больных с разным клиническим течением болезни между собой не обнаружено статистически достоверных отличий в распределении частот (ССТТТ)П генотипов гена Ж)52А (Р>0,001). Генотип Ы082А*11/*12 у индивидов с тяжелым течением ГЛПС наблюдался значительно чаще - 11,63%, чем среди пациентов со среднегяжелым течением болезни - 2,99% (Р=0,004; ОЯ=4,27; 95%С1 1,43-12,94).

Распределение частот генотипов 577?-полиморфизма гена ЬТ052А у больных с осложненными и неосложненными формами ГЛПС не выявило статистически значимых различий в сравниваемых группах (Р>0,05) У больных ГЛПС с ИТШ отмечалось увеличение частоты генотипа ЫОБ2А *14/*16 - 10,0%, по сравнению с пациентами без шока - 1,97% (Р=0,04; 011=4,01; 95%С1 1,49-10,85). У больных с ОПН преобладал генотип А'052А *11/*14 - 20% против 3,5% среди индивидов с неосложненным течением ГЛПС (Р=0,005; СЖ=5,17, 95%С1 1,97-13,57).

Половых различий в распределении частот аллелей и генотипов БТЯ-полиморфизма гена Ы052А у больных ГЛПС не обнаружено. Также не выявлены статистически значимые отличия в уровнях креатинина, мочевины в крови, содержании белка в моче и продолжительности лихорадочного периода у носителей различных (ССТТТ)п аллелей и генотипов в целом и при разделении больных ГЛПС по степени тяжести (Р>0,05).

выводы

1. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан, по данным настоящего исследования, характеризуется: выраженной сезонной заболеваемостью, преимущественным поражением лиц среднего возраста, мужского пола, протекающей в основном в среднетяжелой форме, с умеренно выраженным геморрагическим и почечным синдромом и развитием осложнений (инфекционно-токсический шок, острая почечная недостаточность, ДВС-синдром) в 19,4% случаев.

2. Генотип TNF*A/*A полиморфизма -308G>A гена фактора некроза опухоли a (Ib'FA), аллели NOS2A*ll, NOS2A*12, генотип NOS2A*12/*14 ^^-полиморфизма гена индуцибельной синтазы оксида азота (NOS2A) у жителей Республики Башкортостан ассоциированы с повышенной предрасположенностью к ГЛПС. Генотипы TNF*G/*A, IL1RN*I/*II гена рецепторного антагониста ПЛ (IL1RN), комбинации I/II-C/T-C/C и I/II-C/T-C/T (IL1RN*VNTR - 1L1B*-SUC>T - 1L1B*3953C>T), аллели NOS2A *15, NOS2A*16 и генотип NOS2A*13/*14 ассоциированы со сниженной вероятностью развития заболевания.

3. Генетическими маркерами повышенного риска тяжелого течения ГЛПС являются генотипы WF*A/*A, ILJB *С/*Т полиморфизма -5ИС> Т гена интерлейкина 1(5 (IL1B), комбинация генотипов CT-I/I (IL1B*-5UC>T - IL1RN*VNTR), аллели NOS2A*ll, NOS2A*12, генотип NOS2A*11/*12. Генотип IL1B*C/*C (ILJB*-5JJC>T) ассоциирован со сниженным риском развития тяжелых форм болезни.

4. Генетическими маркерами повышенного риска развития инфекционно-токсического шока у больных ГЛПС являются: аллель TNF*A, генотип 1L1B*C/*T(IL1B*-511C>T), комбинация генотипов CT-I/I (ILIB*-511C>T - ILIRN*VNTR)\ острой почечной недостаточности - аллель NOS2A *11\ ДВС-синдрома - сочетание генотипов ТТ-СТ полиморфных локусов гена IL1B (-5ПОТ, 395307). Генотип TNF*G/*G, ассоциирован со сниженным риском развития инфекционно-токсического шока.

5. Генотипы TNF*G/*G, ILIRN*II/*H, NOS2A*12/*14, аллель NOS2A*12 у больных ГЛПС ассоциированы с повышенной, а генотипы TNF*G/*A, NOS2A*13/*14, аллель NOS2A*1б, комбинации I/II-C/T-C/C и I/II-C/T-C/T (IL1RN*VNTR - 1L1B*-5110T -IL1B*39530T), - со сниженной вероятностью развития среднегяжелых форм болезни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

У больных ГЛПС выявлены генетические маркеры, ассоциированные с тяжелым течением ГЛПС: генотип TNF*A/*A гена TNFA (-308G>A), IL1B*C/*T-511С>Т гена IL1B (-

5 ЛОТ), комбинация C/T-1/I (-511С>Т гена II J В и VNTR гена IL1RN), аллели NOS2A*ll, NOS2А* 12 и генотип NOS2A*J]/*12 STR полиморфизма remNOS2A.

У больных ГЛПС обнаружены генетические маркеры повышенного риска развития инфекционно- токсического шока: аллель TNF*A, генотип IL1B*C/*T гена IL1B (-511С>Т), комбинация генотипов CT-I/I (ILlB*-5HOT - IL1RN*VNTR)\ ДВС-синдрома - сочетание генотипов ТТ-СТ полиморфных локусов гена IL1B (-57/07, 395307); острой почечной недостаточности - аллель N0S2A *//.

Результаты проведенного исследования могут быть использованы для своевременной оценки прогноз.а заболевания, что позволит выработать правильную тактику по ведению больных с целью профилактики осложнений (ИТШ, ОПН, ДВС-синдром) и предотвращения неблагоприятного исхода ГЛПС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Камалова Л.Р., Хунафина Д.Х., Бурганова А.Н., Хабелова Т.А. Применение индукторов интерферона у больных ГЛПС //Материалы 69-ой республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученных РБ с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2004. - С. 229.

2. Мамон М.А., Хабелова Т.А., Юсупова З.М. Функциональное состояние почек у больных ГЛПС //Там же. - Уфа, 2004. - С. 230.

3. Хунафина Д.Х., Кутуев О.И., Шамсиева А. М., Валишин Д.А., Мурзабаева Р.Т., Мамон А.П., Бурганова А.Н., Султанов P.C., Хабелова Т.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом //Учебно-методическое пособие. - Уфа, 2004. - 20 с.

4. Хабелова Т.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И., Мамон М.А. Особенности клинического течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом у детей и подростков в республике Башкортостан //Новые технологий в диагностике, лечении и профилактике заболеваний детей и подростков. - Уфа, 2004. - С. 189-194.

5. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Вахитова Ю.В., Хунафина Д.Х. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей а у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Медицинская генетика. Материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков. - 2005. - Т. 4, № 6. - С. 282.

6. Хабелова Т.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И., Шамсиева А. М. Некоторые иммуногенетические показатели больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Научный прорыв. - Уфа, 2005. - С. 22-23.

7. Хунафина Д.Х., Кутуев О.И., Шамсиева А.М., Каримова Г.Х., Абдулова Г.Р., Шайхуллина Л.Р., Султанов P.C., Хабелова Т.А., Ерошина Э.А. Терапевтическая тактика при

инфекционно-токсическом шоке у инфекционных больных //Здравоохранение Башкортостана. - 2005. - № 9 (спец. выпуск). - С. 163-164.

8. Хунафина Д.Х., Шамсиева А.М., Кутуев О.И., Каримова Г.Х., Абдулова Г.Р., Шайхуллина Л.Р., Султанов P.C., Хабелова Т.А., Ширяев А.П., Фахретдинов Р.Ф. Особенности острой почечной недостаточности при ГЛПС //Там же. - 2005. - № 9. - С. 242243.

9. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И. Влияние полиморфизма гена индуцибельной синтазы оксида азота на течение геморрагической лихорадки с почечным синдромом //Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины. Российская научно-практическая конференция. - Санкт-Петербург, 2006. - С. 305-306.

10. Хабелова Т.А. Особенности иммуногенетического статуса больных с геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Материалы 71-й республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученных РБ с международным участием. «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2006. - С. 95-96.

11. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И. Патогенетическое значение индуцибельной синтазы оксида азота у больных с геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: история изучения и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики». - Уфа, 2006. -С. 64-69.

12. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И. Полиморфизм гена индуцибельной синтазы оксида азота у больных с геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /ЛП Российский съезд инфекционистов, сборник тезисов. - Н. Новгород, 2006. -С. 134.

13. Хабелова Т.А. Роль полиморфизма гена фактора некроза опухолей альфа при геморрагической лихорадке с почечным синдромом //Актуальные вопросы инфекционной патологии в клинической практике. - Уфа, 2006. - С. 34-37.

14. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х. STR полиморфизм гена индуцибельной синтазы оксида азота в оценке прогноза течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом //Там же. - Уфа, 2006. - С. 34-37.

15. Хунафина Д.Х., Шамсиева А. М., Кутуев О.И., Султанов P.C., Шайхуллина Л.Р., Абдулова Г.Р., Бурганова А.Н., Каримова Г.Х., Хабелова Т.А. Современные аспекты патогенеза ГЛПС //Там же. - Уфа, 2006. - С. 52-53.

16. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И. Полиморфизм гена фактора некроза опухолей а у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2006. - №2. - С. 24-27.

17. Хабелова Т.А., Вахитов В.А., Хунафина Д.Х., Кутуев О.И., Зилеева З.Р. Молекулярно-генетический анализ STR-полиморфизма гена индуцибельной синтазы оксида азота у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом //Медицинская генетика. - 2006. - Т. 5., № 11. - С. 35-39.

Заказ №57. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальное! к проблемы геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (глпс) представляет серьезную проблему a связи с широким распространением природных очагов, тяжестью болезни, недостаточностью ршрабоштшс методов специфической терапии и профилактики. в мире ежегодно с диагнозом «глпс» roe питали j нрустся около 200 тыс. человек, легальность составляет q.s~i5% (и, 36. 37). на территории республики башкортостан (рб) расположен одни in самих крупных к активных очагов глпс. ежстодно в рб заболевает глпс от 1,5 до тысячи человек, чго сосга&ляег 40-60% заболеваемости по российской федерации (14. за, 73], ьолекут преимущественно ли un молодого, тру дос i ioc c>6jk> го возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб. несмотра на длительную историю тучеин* глпс, патогенетические механизмы »болеезди* остаются до конца неясными, что »нипями затрудняет разработку системы профилактических мер. поиск эффективных tptwti эпютрошюи терапии и затрудняет прогноз течения и исход заболевания. в литературе имеются работы, посвященные изучению системы гемостаза (17. w]. жйроаидокриннол регуляции 16. 7,у больных глпс, накоплен обширный фактический материал п области нммунмипогепеза заболевания, исследовалось состояние клеточного [45,46,49], гуморального звеньев иммунитета (2, 21, 70) в яйнепюп от периода и тяжести заболевания содержание т-лнмфацнтов, плазмопитов и в'лимфашггов. а также их субпопу ляний (cdj. cd4, cd8, cdi6, cd22, cd25. cd95) [i, 7,21. 25]; иммуноглобулинов а, м, g. е |1, 20,]; циркулирующих иммунных комплексов (11,67|, показателей комплемента |$й, 71). центральная роль в ауторегудяшш иммунного ответа и его интеграции с функциями всех систем организма принадлежит цигокннам главной питофнтиолопгчбскол характеристикой глпс является поражение зндотелия сосудом С распитием «льтсриатнню-лсструктнвного нанваекулнга. 'Экспрессию цитаюлюв в марециинш клетках считают основной причиной нарушении микрониркуллиии, центральной гемодинамики, плазморрег, Д ВС-синдрома |2Ъ. 81. 127. 138|. Игученню статуса шгтокинов у больных ГЛПС посвяики ряд исследований. в которых отражена динамика уровней про- н прол 1 вовоспалнтелъиых цитокннов (П.-1(1,IL-2. IL-4. IL-6. IL-H, 11-10, П.-13. CFN-o. TFN-Y.TNF-O) [7,23.46.138.145].

Большое значение в ранних иммунных реакциях у больных ГЛПС занимает секреция эндотелием оксида atora (NO) молекулы с противовирусной «СТМИОСТМО. Иссяедоюлси уровень оксида а то та н его метаболитов а сыворотке кропи (30|, супсрнатантах мочи, конденсатах выдыхаемого воздуха [2i[ у больных ГЛПС Покатана роль оксида озота в генсэе инфекииоимо-токеического шока, актипанин чеханишоп сосудието-тромбоинтэрного звена гемостпн и пршмпа МЩСЯШЫНЙ ШСфдщиШН сосудов при ГЛПС 114|.

ГЛПС - мнлгофоторнм мбсломиме, характер ратмтш которого ЗОВНСИ1 от даты, патогсиности. вирулентности возбудителя и окружающей среды Многочисленные исследования, проводимые во всем чире, покатывают, что восприимчивость к инфекционным агентам гснетнчсскн детерминирована (142.150,151J.

Одним из наиболее доступных подходов, q«H»K»a в молекудярно-гснстнчесхич исследованиях чнотофякторных заболеваний, является изучение ассоннаиий заболевания с полиморфными вариантами генов, белхсчые продукты которых участвуют в питотаюте бодеги»- Выявлены aCccHtttnuHH ГЛПС с генами главного «телекса гнсто»вмести м«т« (HLA). генами цитокннов и их рецепторов {TNFA. ILl, ILRN) 1142, ИЗ. t50|, Однако результаты исследований разных аггоров неоднозначны. кроме того, имеют место этнические различия в чувстии гыыюсти к инфскодюНИнм органюма во взаимоотношении с условиями заболеваниям. Данные по Изучению nccoiinaiuift гена иидуцибельиой еинтазы оксида азота (АШ4) с ГЛПС в мировой литературе отсутствуют^

Поскольку в РФ малскуллрно-геиетнчеекое исследование ГЛПС до сих пор ne провалялось. ■плястс* актуарным изучение имиыорфиых вариантов iciioH. ассоциированных с данным заболеванием

В рамках рассматриваемой проблемы идентификация ivhöjl вовлеченных ■ патогенез ГЛПС. чвляетсн важной медкко-пенетическоД чМйчей, решение которой способствует формированию фуцшшппшш представлений о патогенезе этого «яжелого. социально значимого заболевания. я также пошали i прогнозировать риск развитии и тяжестз. течения ГЛПС.

Цель работы выявить ассоциацию полиморфных вариантов генов цнтожимов и нндуцибелыюЛ еннтазы оксида пота с лрсфюшккииикпн к заболеванию и характером течения ГЛПС.

I Окармлецотадять эпидемиологическую ситуяцию по ГЛПС » РБ и проанализировать клинические особенности течения ГЛПС

2. Пронести исследование ассоциаций полиморфного до кус о -MtSG -А гена TUFA с предосположеНЕЮСТыа к заболеванию и тяжестью течения глпе.

3. Провести исследование ассоциаций полиморфных локусов -5ПОТ. 39S30T гена iLtB с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

4. Провести анализ ассоциаций VNTR полиморфизма гена HJRN с прелрасположеимостью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС

S Пронести исследование ассоциаций сочетании генотипов модиморфны* локусов -SHOT. 39530Т№и* ¡LIB и У,VFB гена IURN с предрасположенностью к заболеванию н тяжестью течения ГЛПС.

Ь Провести анализ ассоциаций 5ГЯ-иолнморфитмц гена NOS2A с предрасположенностью к заболеванию и тяжестью течения ГЛПС.

Илу-тли нови i ни ИССЖЯвКНПт»

Bncpítue у больных ГЛГЮ прокдеио исследование полиморфных «кусов 1С пои цитокииов и индугиибельиой сиитлзы оксида азота. Воершс охарактеризовано распределение частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локуеоа у больных ГЛПС м мрсикгвТивних доноров, Ил OCHOWKHM стйтистичоского анализа выявлены существенные различия в распределении полиморфных вариантов генов нитокннов и нндуцнбсльноЛ синтаты оксида »юта у больных ГЛПС с рачюй формой тяжести и ссронепгтнвных доноров. I IoKirmna ассоциация полиморфных вариантов генов цитокннов и нндуинбельной сшгтазы оксида азота с основными клиниш-дайораторными пошпеини, хфялсрядошими тяжесть течения ГЛПС, Установлены маркерные аллели и генотипы РСНОВ нитокннов и нндуиибельноА сиитвзы оксида атота. укатывающие на повышенную предрасположенность к тяжелому течению ГЛПС с риском развития такт специфических осложнения, как »мфекининю-токснчсскнй шок. острая почечная недостаточность, /ИК'-сиидрои

IlpjK'i ычеекяп значимость работы.

Результаты работы «носят вклад в limitan не механизмов патогенен ГЛПС. формирование представления о генетических основах шбсисаання.

Гпютипнртйнне болты* ГЛПС по генам нитокииов н нндуцибелыюй сип газы оксида азота позволяет определить индивидуальную предрасположенность к тяжелому течению бодегни, с целью разработки комплекса лечебно-профнляггнческих мероприятий, ппртемш ня предотвращение неблагоприятного исхода ГЛПС.

Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих ИКИИМПНЙ по определен!по генетических факторов, влияющих ил Ы»левоеи ост h. характер течения и исход ГЛПС

Результат исследования могут быть 1коолт.жиыны при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Ости

I. Ассоциация полиморфны v вариантов rcnoii фактора некроза опухоли иидуимбедыюй chhtbjh оксид» лэота с предрасположенностью и

3ft6o,KBaniiw ГЛПС.

2, Ассоциации полиморфных вариантов генов TNFA, ингерлепкнна 10 УШ), ¡ИМ, N0S2A с тяжестыо течений ГЛПС,

Генетические маркеры повышенного риска развития специфических осложнений (ИТШ. ОПН, ЛВС-синдрома ) но опенке рояиморфиых вариантов генов TNFA, 1L1B, NQS2A.

ЛйрпйвЦШ

Осшншыс положении диссертации представлены на V съезде Российского общества мевицннсккк генетиков (г. Уфа. 2005). научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафелры инфекционных болезней Воеино-.иедипинской акалемнн им. С.М Киром (г Санкт-Петербург, 2006), VII Российском cvrue врачей'инфекционистов (г Н Новгород, 2006), Вееросснйсхой научно- практической конференции «Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: истории юучеиин и современное состояние эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечен и* и профилактики» (г. Уфа, 2006), 69-ой. 7!-ой итоговых Республиканских научных конферсииних молодик ученых с международным участием (г. Уфа. 2006). ученом совете ИЕГ УНЦ РАН. совместном иседиш кафедры инфекционных, болезней БГМУ н кафедры инфекционных болезней с курсом дерматовенерологии НЛО БГМУ.

По теме диссертаций опубликовано 17 научных работ. а том числе 3 в по upan иной печати, антагониста ипфМЬйн fp <¡!JRW

ВЫВОДЫ

I. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан, m данным настоящего исследования, характеризуется, выраженной сезонной заболеваемостью, преимущественным поражением лиц среднего aoipocra. мужского поля, протекающей я основном в среднетяжеяой форме, с умеренно выраженным геморрагическим и почечным спнлромом н развитием осложнении < инфекционно-токсический шок. острая почечная недостаточность, ДВС-СШЦрОМ) в 14,4% случаев

2 I ей опт TNF*A/*A полиморфизм 308<3>А гена фактора некроза опухоли a [TNFA). аллели NOS2A4I. SOS2A42. генотип NOS2Aat2f)4 STR-пал аморфизма гена индуинбельной синтезы оксида а Юта (NOS2А) у жителей Республики Башкортостан ассоциированы с повышенной предрасположенностью к ГЛПС. Генотипы TNF*Gf*A, iLIRN*l/*JI гена реценториого антагониста IL! (iURN). комбинация генотипов ¡/И-СТ-ОС н t/t/GT-GT (ILIRX+VNTR - lUB*-SHOT - lLIB*JfSSC-l\ иалели SOS2A45. NOS2A*ió it генотип NOS2A*13 *¡4 ассоциированы со сниженной вероятностью развития заболевания.

3. Генетическими маркерами повышенного риска тяжело™ течения ГЛПС являются генотипы TNF9A/*At ILIB'C/'T полиморфизма -5НОТ гена шгтерлеИкина lfl (IL1B), комбинация генотипов CT-VI (fLI8'-5ilOT-1LÍR\4NTR), аллеян NOS2A41. NOS2A42. тенотнп NOS2A*tt/*t2. Генотип ILIB*C *С ifLIB*'5IIOT) ассоциирован со сниженным риском развития тяжелых форм болезни.

4. Генетическими маркерами повышенного риска развития ннфекииоино-токснчсского пиши у больных ГЛПС являются. алдель TNF*A, генотип IUB*C'*T комбинат« генотипов ОТ-Ш (IUB*. 5ЧС-Т - iURS'VNTRw острой почечной недостаточности - аллель SOS2A*!ДВС-синдрома - сочетание генотипов ТТ-С/Т полиморфных докусов -5ПОТ, 3953С -Г гена IUB. Генотип T\'F*G/'G онмипфсми со сниженным риском развития инфосщюнно-токсического ыюка

5, Генотипы TNF*C 'G, iLIRN'fl 'li, NOS2A*i2/*H. аллель NOS2A*!2 y больных ГЛПС ассоциированы е повышенной, а генотипы TSF'G'*A. //./AV•//•//, №S2A43"t4. аллель SOS2Aêl6. комбинации i/H-CST-C C и ШШТ-С/Т (/URS*VNTR . IUB'-ЗИОТ IUB*395iOT) - со сниженной вероятностью развнпм срсдиетокелых форм болезни.

П РАКТИ Ч ЕСКН К РЕ КО M F. Il ДА ЦПИ

Установлены генетические маркеры, пссоиинромнные с тяжелым течением ГЛПС: генотип TXF*A*A гена TNFA (-3WG>Al 1ЦВ*0*Т гена IUB (-J//0 д комбинации генотипе» ОТ-/// OU В'5 ПОТ -ILIRS*VNTR), аллели NOS2A4I, NOS2A42 и генотип NQS2Aallf*l2 STR-полнморфитма гена SOS2A.

Обнаружены генетические маркеры повышенною риска развития инфскппоиио-токсического шо*а аллель TSF*А. Генотип ILIBaC/*T гена lit В l-J/ZOn. комбинация СТ-1,'1 (ILIB'-SHOT - IURN4NTR), ДВС-сицдроыа - сочегание генотипов ТТ-С/Т полиморфных локусоа НОТ. 39НОТгена //.IB, острой почечной недостаточности - аллель NOS2Aêii

Результаты прокцпшоп исследования могут быть нснольтованы для своевременной опенки протном заболевания, что позволит выработать правильную тактику по ведению больных с целью профилактики осложнений (ИТШ, ОПН, ДВС-снндром) и предотвращения неблагоприятного исхода ГЛПС.

ГЛАВА 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы вопросы патогенеза ршМШК инфекционных болезней раеем.ттр1Пныотся с позиций клинической иммунологии. (Сак известно. взаимодействие воэбудн1еля и микроорганизма не во всех случаях приводит к заболеванию. В случае разлития инфекционного процесса он может протекать а разных формах: латентней (субклнннческой), стертой, манифестной. Активность иммунного ответа организма человека и особенности реакций на одни и тот же антиген разных индивидуумов определяется их иммунорсаюзгвиостыо. Уровень иммунной прослойки носелення PI» к вирусу ГЛГ1С по отдельным районам составляет от 6,0 до 40,0% |73|.

Нами были изучены полиморфные доку с ы генои шгтоишо» TNFA {'30HG---A). IL Г В {-Я ¡ОТ, 395SOT) и IL IRA (ИШ) у больных ГЛПС из РБ, а также проанализированы все возможные комбинации этих локусов с выявлением разнообразных ассоциаций, что позволяет обобщить полученные данные с учетом функциональной значимости исследованных полиморфизмов

Роить TNF-о. IL- Iß н ILIRa достаток! to хорошо изучена на модельных животных при различных инфекционных заболеваниях. Исследованию TNF-а. ИЛ-Iß у больных ГЛПС посвящено большое количество работ, демонстрирующих высокую активность данных шггокинов в раннюю фазу инфекции |25, 46. 81]. Повышение уровней TNF-н, IL-1(1 в разгар болезни способствует формированию эффективной противовирусной защиты, обеспечивая воспалительную и именные реакции |48). У больных ГЛПС показана прямая зависимость тяжести клинических проявлений от активное m ВрОНСйимшта ц шпию1(М4, ЕЫ$)(7, Я у

-Í08G>A полиморфном гена TNFA является фуикинонапыто значимым, влияющим как на базарную, так it на индуцированную зкспрсссию гена J188|. Установлено, что аллель TNF*А является более мошным активатором транскрипции, чем аллель TNF'G. Ha линиях B-oeioK человека показано, что полиморфизм -30SG>A связан с повышенной экспрессией пяи TNFA ¡и vitro; присутствие ОЛЛСЛЯ TNF*A ассоциировало с вдвое повышенной продукцией шттокнна но сравнению с аллслем T\FA*G [J9l|. Проведенные нами исследования -3G8G~=~A полныорфикма lena TNFA продемонстрировали, что у больных ГЛПС достоверно чище был прелствштен генотип TNF*A/*A JÏ связи с этим, можно предположить, >па лица с генотипом TNF*A/*A имеют более высокую степень предрасположенности к развитию манифестной формы ГЛПС с реализацией всего комплекса патологических реакций. Кроме того, значительное увеличение частоты генотипа T~NF*Ar*A наблюдалось у пациентов с тяжелым течением болезни. Л у носителей муттттноп» мяеля TNF*A повышен риск развита вифекционно-токсического шока, тогда как гомозиготы по TNF*Q ил л ел ю оказались более устойчивы к возникновению 1ТТШ, что согласуется с результатами исследований, пронесенными v Сольных ГЛПС финской популяции (142], Согласно литературным данным. TNF-n играет ключевую роль в увеличении проницаемости сосудистой стенки, плазморреи. птпотензнн и готовности к шоковым реакциям [27. 81, 134). 8 зкепериментах на животных покапано, что мри внутривенном введении определенной дозы микробных «раздражителей» у животных развивайся смертельный шок. причиной которого был одновременный выброс активированными тканевыми макрофагами огромного количества TNF-O- [18TJ. Таким образом, можно предположить. что высокие концентрации TNF-«, ассоциированные с ыутшгтным штлелсы 77VFM, у обеледованиых нами больных могут способствовать тяжелому течению ГЛПС. осложненному развитием И ГШ

Гетерознгопсый генотип TNF*Gf*A у обследованных нами больных встречался значительно реже, чем и серонсгзгтитом контроле Кроме тот отмечено снижение частоты генотипа TSF*G'*A у больных срелнетяжелой формой ГЛГ1С Таким образом, по данным ihuuhx исследований можно предположить* что гепрООНГОТЫ более устойчивы к заболеванию ГЛПС, что согласуется с представлениями о благоприятном влиянии «етеротиготностн я эволюции человека,

У лии со срелнетяжслым течением болечии наблюдалось достоверное увеличение частоты гомотиготного генотипа TSF'G'G, что, по-видимому, свякпю с широким распрострмгеинсм общего аллели TNF*G в популяции, а также количественным преобладанием сред нетяжелых форм ГЛПС среди обследованных больных.

Сравнительный милю основных клннико-лабораторных показателей у больных с ратными генотипами полиморфною локуел -3ÙSG>A гена TNFA выявил статистически значимые отличия в уровнях креатинина в крови н содержании бедка в моче у больных срслнетяжсдой формой ГЛПС. Покатателн креатииниау индивидов с гетеротнгогным генотипом TNF*Gf*A были достоверно выше, чем у носителей гомозиготных генотипов T\'F*G/*G и T.\F*A/mA. [[ротсииурия была менее выражена у обладателей гемогип* TNF*A/*A как по сравнению с гомозиготами по TNF*G алледю, так и с гетерозигошмн,

Необходимо отметить комплексный подход к оценке тяжести у больных ГЛПС, с учетом выраженности ведущих синдромов' интоксикационного, геморрагического, почечного, а также динамики течения болезни. По результатам нашего исследования тяжесть течения ГЛПС у носителей генотипа TNF*A/*A определялась выраженностью интоксикации к развитием шоковых реакций. Также, следует отметить, иго выборки больных с генотипами TNF*G/*G, lttF*Gf*A превышают но численности выборку больных гомозиготных по редкому аллслю TNF*A

Анализ полиморфных локусов -5! 1С>Т н 3933С&*Т гена ILIB и VNTR полиморфизма гена IL1RN выявил ассошишио полиморфных вариантов данных ге^юь с ГЛПС ti популяции PU Нами установлено достоверное повышение частоты генотипа !Lt*C'*T гена ILIB l-SUC^T) у пациентов с тяткелой формой заболевания, ки* по сравнению с ссронегатнвнымн донорами. taK и болы«ычн с легким и срсдиегяжслым течением ГЛПС кроме того, у носителей гетерозиготного генотипа JLI'Cf*T гсзга IL!В (-51 IOT) охазался повышен риск развития НТШ Бналлельный полиморфизм raía 1L1B в положении JJJOT, точнее, аллельный вариант •51 IT этого гена характеризуется, но литературным данным. повышенной продукцией ИЯ-ip 1112]. Значительный подъем уровней провоспа-нгтслызых шпокииов в разгар болезни выполняет протектианузо функции с реализацией всего комплекса воспалительных н иммунных реакций, На многих экс пере ментальных моделях продемонстрировано, что введение экзогенного 1L-J способствует усилению зашитых мехазппмов н позволяет эффективно противодеЛетвовагь развитию инфекционного процесса, f Ipir введении дайоразориым животным, зараженным летальными дозами патогенных микроорганизмом. IL-1 о&вадвет ярко выраженными протектнвными свойствами, защищая от гибели до 100% животных [61] Однако чрезмерное повышение уровня синтеза провоепшнттельных иитокннов (TNF-o. lL-lp}. вызывающих запредельную активацию не i гроз н док р и н muí системы, избыточную продукцию оксида лзоти, повышение проницаемости сосудов, плазморрею. усиление коагухязенн, способно оказывать и повреждающее действие с развитием клиники ннфекшюнно-токснческого шока. В свяли с чем можно предположить, что постоянная выработка достаточно высоких концентраций lLlfk ассоциированная с -SHC>T полиморфизмом гена ILIB неблагоприятно сказывается на течении ГЛПС.

Аллели 3953Т гена ¡UB, также как и аллель -51 IT. ассоциирован с высокой продукцией нитокина 1L-I|3. Хотя нами ие выяизеио влияния 3953 С> Г полиморфизма гена ILIB на заболеваемость и характер течения ГЛПС, однако сочетание аллелей 395ЗТ и -í/¡T, по-видимому, ofijtajiaer втаимоусилн воющим эффектом: комбинация Т Т-С Т полиморфных локусов гена ILIB (-51 ЮТ. 3953С>Т) достоверно чаще определялась у больных ГЛПС. осложзкной ДВС-снилромем Кроме этого, у носителей комбинации генотипов 1УТ-С/Г гена Ц.1Н (-51 ЮТ, 395ЗОТ) отмечено значительное повышенна уровня креатин инк в крови.

Проведенный нами анализ Г\ТЙ полиморфизма гена /IIЯМ выявит значительное уменьшение частоты тетсрспиготиого генотипа 1МЦМ*1/*!1 у больны* ГЛПС по сравнению с контролем. Кроме "»того, у носителей генотипа Ц,1№*1'ЯИ снижена вероятность среднетяжелого течения болезни, тогда как индивиды с генотипом *///•//. наоборот, предрасположены к раз в ил оо срсднетяжелих форм ГЛПС. Но данным литературы, аллель II, №N41 ассоциирован с повышенной продукцией секреторного ИЛЯа по сравнению с другими аллелями [164. 1Й7| Известно, что почти 50% европейской популяции является носителями аллеля 1Ш№И [95], По-видимому. широкая распространенность данного аллеля среди популяций позволяет гстерош готам быть более устойчивыми к заболеванию ГЛПС. Гомозиготы И1И\'*1141, согласно КалпНа 5. е! а), |95, 1»7|. намного чаи» подвергаются роиичным инфекционным н воспалитслы1Ым заболеваниям

При анализе комбинашгй полиморфных вариантов генов ШВ {-511 С>Т. 3953 ОТ) и ШЯМ (ГЛТД) установлена, что сочегшгня гсиотиибв С/Т* 1/11 ииВ*'5ПОТ- ШЮРШТН ) И1СТОС и Ш1-СТ-С/Т(УНшчжя - 1иВ9-5ПОТ ~ И1В*39530Т) чаще встрсчалзкь среди серсткгатнвных доноров, чем у больных ГЛПС Кроме этого, у носителей комбинаций ■сногииов Ш-СТ-СС и ШОТ-ОТ снижена «1ероятиость развития средиетяжедых форм боляин,

Являясь естественным специфическим ингибитором [1,-1, 1Ь1Ка, конкурируя за связывания с одними и теми же клеточными рецепторами, блокирует активирующее действие 1Ырт другие клетки, и, таким образом, «ослабляет» воспалительную реакцию (92| Макрофшн, стимулированные ОМ-СХР »О продуцируют избыточное количество реоептортго й1гтапнпкта II, Ша и сниженное количество 11.-1 р. если содержат аллель /£//№*// [91. ¡87], Нштпе е1. аЕ. [124| продемонстрировали, что аллель Й./ДЛ'*// также способствует повышению концентрации КЛКэ в плазме, но только в комбинации с шкяем Si IT rcns ILIB. & другом исследовании 1167[ выявлено, что моиоцнты '«носители» аллеля ¡L ¡RS*H продуцируют большое количество !L-lp iiv vílro, итмкимо от характера полиморфизма в гене ILIB. У мышей, дефицитных no ll-IRa. также как у мышей с повышенной продукцией реиеторного антагониста обнаружены высокие уровни (1-1 в период эндотоксемин |Ы| Возможно, ILtRa действует щ viso в качестве как позитивного. так и негативною рклулжтора экспрессии IL»i [líSJ, Обойти прицеленные выше данные литературы, моюю предположить, что сочетание С/ГШ ЦИВ'-ШОТ - !URN*VNTR). 1/Ц-СТ-С С и /7/-СТ-СТ {JLlR\4mR ■ HlR*-5HC>T - ILIB*3»S30T) у больных ГЛПС, способствует поддержшню баланса между провоепшигтельным иитокином 11-1(5 и его рецепторным антагонистом EL 1 Ra, обеспечивая адекватный иммуииый о гост на вирусную инфекцию, тем самым, выполняя про те ктн иную функцию

Комбинация С/Г-// генов ILIB {-5НОТ) и ILIRN по роулышам наших исследомнмй. способсгвоиялд тяжелому течению ГЛПС с риском развития ИТТ11. Аллель IL1R\*I гена ILIRN, согласно данным литературы, не оказывает существенною влияния на экспрессию гена. Можно думать, что сочетание ■ организме высокой кониентряцнй 11.-10, ассоциированной с аллелем -Í//7", с относительно ниткой продукцией его реценториого антагониста у гомозигот но аллелю ILIRN*! усугубляет течение инфекционного процесса.

Проведенный анализ подтверждает предположение о том, что |гзменснис прол>кш1 и питокииов оказывает значителыюс влияние на тяжесть воспалительного процесса у больных ГЛПС

Большое значение и pftHMKX иммунных ремсциах у больных ГЛПС занимает повышенная секреция эндотелием оксида азота (NO) - молекулы с противовирусной активностью. Изученный нами микросателлшный пе»ггаиуклеотидиый (ССТТТ). полиморфизм н промоторной области пена KOS24. покатал, что у больных ГЛПС аллели NOS2A4S, \OS2A*l6 и генотип NG62A*ISf*I4 встречались достоверно реже, чем среди офмкгетммшх доноров.

Предполагается, что увеличение числа (ССТТТ)„ повторов приводит к повышению транскрипционной активности гена NOS2A [394]. Повышенный синтез млкрофагвдьнымн клетками оксида айна, в результате активации NOS2 при ГЛПС направлен на ограничение распроорансиня хантавируса. Это реализуете« в «истности ингнбированием N4> (II) репликации вируса внутри клетки j (481 и вазолнллтацней на уровне сосудов срелнего калибра с последующим усилением притока крови к органам и тканям е целью увеличения поступлении в них факторов нсспецнфической и специфической защиты При невысокой вирулентности вируса в сочетании с достаточной степеныо зрелости иммунной системы, видимо, возможна локализация инфекционного процесса уже на згой стадии (14] Таким образом, можно предположить, что повышенная продукция оксида тозя. ассоциированная с аллелями HOS2A'/i и SOS2A46 и генотизюм \OS2A4i *U, способствует формирован ню протекпшюго иммунитета |фи ГЛПС

По данным нашего исследования, аллели NOS2A4I, MOS2A42 и генотип NQS2A*IJ/*i2 являются маркерами тяжелого течения ГЛПС. У носителей адледя SOS2A 42 также имеется предрасположенность к развитию срсд>1етяжелых форм болезни.

В }кс пресс ирующих векторах, содержащих ген NOS2A с разным числом ССПТ-повтороа. а также рспортериый »сн люиифераш, показано, что аллель (ССТТТ)» гена NOS2А при индукции TLlp увеличивает экспрессию рспорт^рного гена в 2Л раза, (CCI 11 )(j - в 3,4 pain. (ССТТТ)и и (CCTTl)ir* В 4,0 раза, (ССТТТ)|? - в 3,9 раза [284J. Таким обрдоч, средние формы (ССГТГЪ адлелсй тая KOS2A, к которым условно отзгосятся а-тлели SOS2A * J J и NOSi4*/2, также ассоциированы с лостаточзю высокой продукцией N0. характерной для тяжелых форм ГЛПС Помимо iNOS источником оксида азота (II) при хантавнрусном инфицировании также являются* синтез его зндокаиалынй ЗЧО-снитазой и З'нитрозотиолы и динитрозилыгыс комплексы NO с ионами железа в клетках щдотедия Все эти факторы и обеспечивают выброс в кровь больших количеств оксида азота (II). более характерных лля среднетяжелой и тяжелой форм ГЛПС и при появлении осложнении 114|.

В значительных коииситрашик окай anna способе« выполнять не только гротекгмную функцию, но и оказывать интотокснческий эф<}»евгт на собственные клетки организма. опосредованный обратовакиеч псроксиннтрита. инициируя апо<тл или некроз клеток, Некроз имеет место при ГЛПС в клетках коркового слоя почек. Нидуцнбсдьную еннтаэу оксидв азота способны синтезировать клетки эпителия канальцев ночек, мдеотелий афферентной артернолы и другие почечных артерий (411. Избыточная секреция оксида азота приводит к тяжелой ппютеизин, нарушению мнкроциркуляции, гипоксии и вызванным сю метаболическим нарушениям, с последующим некрозом клеток коркового слоя почек, что может послужить причиной развития острой почечной НвШКПТОЧИОПН. Также среди основных патохимичсскнх и п итофтгп гол о ш чес ккх причин развития ОНИ выделяют аутоиммунную реакцию к собственным белкам почечной ткани, изменившим свои антигенные свойства нз-зл нитрования под действием пероксниитрмта 1141 По-видимому, достаточно высокая продукция NO. связанная с аллелсм NOS2A*// по данным наших исследовании, неблагоприятно сказываются на почечной гемодинамике и способствуют тяжелому течению ГЛПС с риском развития ОПН. Неоднозначность подученных нами результатов по (CCTTTfc, полиморфизму гена NOS2A у больных ГЛПС можно объяснить наличием неравновесною сцепления с другими пенами, задействованными в патоге»гей данною заболевания, например генами HL1> провоспшпттельиых штчннов Кроме ЗТОП5, активность индуцибелыюй синтезы оксида азота регулируется цитокинами W-o, 1LIJ1 (резко повышенными в раиикио стадию ГЛПС) н может с) премироваться глюкокортнконламн. концентрация которых в крою« больных ГЛПС со сред нетяжел ой и тяжелой формами в однгурнческнй период повышена 114|.

Таким обрхюм, полученные »ими результаты по аесоЧИШЦИМ полиморфных маркеров генов ТУРА. ILIB. ILtRN. NOS2A с тяжестью течения I ЛИС. раскрывают молскулярно-генетические аспекты данного заболевания и свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований по поиску генов, вовлеченных в патогенез ГЛПС