Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Клинико-иммуноцитохимическая характеристика и прогнозирование опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КОВЫНЕВ ИГОРЬ БОРИСОВИЧ* °

КЛИНИКО-ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ НЕХОДЖКИНСКИХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМ

14.00.29 - гематология и переливание крови 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2007

003068124

Работа выполнена в Новосибирском государственном медицинском университете Росздрава

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук, профессор

Лосева Мария Ильинична Поспелова Татьяна Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Журавская Эмилия Яновна Шурлыгина Анна Вениаминовна Елыкомов Валерий Анатольевич

Ведущая организация: Российский Онкологический центр им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва)

Защита состоится «_ _2007 года в_часов на за-

седании диссертационного совета Д 208.062.04 при Новосибирском государственном медицинском университете по адресу: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Новосибирского государственного медицинского университета.

Автореферат диссертации разослан « (/ОО^^'О/¿1 2007

года

Ученый секретарь

диссертацио иного совета

доктор медицинских наук, профессор

Зубахин А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неходжкинские злокачественные лимфомы (HX3JI) представляют собой опухоли системы крови (гемобластозы), характеризующиеся неопластической пролиферацией лимфоидных клеток. Отмечено, что заболеваемость этой патологией имеет неуклонную тенденцию к росту во всем мире (Подцубная И.В., 2001).

В последние десятилетия были приняты несколько классификаций HX3JI -Рабочая формулировка (Burke J S., 1990), REAL-ыоменклатура (Harns N., 1994; Jaffe E.S., 1997), с 1999-2000 года - Классификация лимфоидных опухолей по ВОЗ (Armitage J., 1998; Chan J.K.C., 2000; Jaffe E.S., Harns N.L., Stein H., 2001). Однако большинство клиницистов-гематологов разделяют мнение о том, что прогрессивно возрастающее от одной западной классификационной системы к другой число вариантов HX3JI, включающих описание многочисленных клинических, морфологических и молекулярно-биоло-гических деталей, мало отвечает потребностям онкогематологической практики по радикальному излечению этих неоплазий (Воробьев А.И., 2003; Под-дубная И.В., 2004). Ведущие гематологи и гематопатологи мира S.J. Horning, В. Coiffier, М.А Shipp , J.O. Armitage (2000) и другие сходятся во мнении, что главной целью всех классификационных систем и терапевтических программ для злокачественных лимфом должен стать гарантированный контроль над опухолевой прогрессией этой патологии.

Несмотря на обилие признаков, описывающих каждый вариант HX3JI, по-прежнему не решена главная задача диагностики лимфом - прогнозирование опухолевой прогрессии заболевания. Существующие прогностические модели - международные прогностические индексы IPI (Bastion Y., 1994), FLIPI (Fedenco M. et al., 2000; Perea G., Ghielmim M. 2005; Luminan S., 2006), IIL (Fisher R., 1995) и другие не позволяют в полной мере решать поставленные вопросы, поскольку опираются исключительно на клинико-морфологические критерии.

Работы I.S.Lossos, D. Yu (2001), D. Cozma, N. Dube (2000), R.L. Piekarz (2004), A.S. Freedman (2006), K. Blyth (2006) и других авторов не оставляют сомнений, что прогнозирование опухолевой прогрессии и чувствительность опухолевых клонов к цитостатическому воздействию во многом зависят от глубинных сдвигов в регуляции клеточного цикла и апоптоза, происходящих в опухолевой клетке (Johnstone R.W., 2002; Coleman W.B., 2006). M.Jerkeman, Е. Shiozawa, L. Rui (1998) и С. C.Goodnow (2000) на экспериментальных моделях убедительно показали, что ключевую роль в этих процессах играет функциональная активность продуктов генов-регуляторов программированной клеточной смерти. Из них наиболее изучено значение протеинов р-53 (Lanos M. et al., 2001), bcl-2 (Hermine О., 2000; Sohn S.K., 2003; Winter J.N. 2006), c-myc (Chang CC. 2003; Yu D. et al.,2005), мембранного рецептора FAS (APO-1/CD95) (Klasa R.J., 2004; Kojima Y., 2006), ядерного белка про-лиферативной активности Ki-67 (Kanavaros P., 2001; Piattelli A., 2002) и про-

дукта гена MDR1 - р-гликопротеина - АТФ-зависимого помпового белка, определяющего лекарственную резистентность (Marie J. P. et al., 2000; Liu Q., 2001). В настоящее время в литературе имеются лишь разрозненные сведения об исследовании влияния этих протеинов на прогрессию опухолей вообще и лимфопролиферативных заболеваний, в частности. Недостаточно работ по комплексной оценке влияния экспрессии молекулярно-биологических маркеров блока апоптоза на опухолевую прогрессию HX3JI. Большинство исследований посвящено отдельным вариантам лимфом или экспрессии отдельных протеинов без обобщающего анализа проблемы в целом.

Решение задачи выделения универсальных молекулярно-биологических маркеров прогностической оценки опухолевой прогрессии и последующей эффективности химиотерапии позволили бы существенно улучшить результативность современных протоколов программного лечения HX3J1.

Цель работы: дать клиническую и молекулярно-биологическую характеристику основных вариантов неходжкинских злокачественных лимфом, определить значение гиперэкспрессии белков-регуляторов апоптоза для опухолевой прогрессии и разработать модель ее прогнозирования.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту и структуру неходжкинских злокачественных лимфом в г. Новосибирске и Новосибирской области.

2. Выявить иммунофенотипические особенности отдельных вариантов лимфом, их влияние на прогноз заболевания.

3. Изучить экспрессию белков-регуляторов апоптоза в опухолевом субстрате неходжкинских лимфом.

4. Оценить влияние сочетанной гиперэкспрессии bcl-2, тр-53, с-тус, CD95, p-glycoprotein на клиническое течение, эффективность терапии, выживаемость и прогноз HX3JI.

5. Разработать новую прогностическую модель опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом.

Научная новизна

Впервые показана роль сочетанной гиперэкспрессии комплекса молекулярно-биологических факторов (антиапоптотического протеина bcl-2, му-тантной формы р53, онкопротеина с-тус, аномального CD95 и продукта гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 - р-гликопротеина) как универсальных маркеров опухолевой прогрессии и лекарственной резистентности неходжкинских злокачественных лимфом, связанных с торможением программированной клеточной гибели (апоптоза) опухолевых элементов и оказывающих влияние на прогноз заболевания вне зависимости от морфологического варианта лимфомы, стадии процесса и особенностей клинической картины дебюта заболевания.

Выявлено, что увеличение в опухолевом субстрате неходжкинских злокачественных лимфом неопластических клеток, экспрессирующих bcl-2-протеин >25,2 %, р53 - >24,6 %, с-шус - >17,8 %, р-гликопротеин - >21,3 % и CD95 - >9,0 %, непосредственно предшествует клиническим проявлениям

опухолевой прогрессии лимфом, а указанные протеины являются маркерами-предикторами неблагоприятного прогноза. Для рецидива заболевания и трансформации варианта неоплазии характерно достоверное, в сравнении со случаями лимфоидной опухоли, развившейся de novo, возрастание числа лимфомных клеток, экспрессирующих маркеры блока апоптоза и множественной лекарственной резистентности (MDR) (bcl-2, mp53, с-тус, CD95 - в 2,5-3 раза, р-гликопротеин-позитивных клеток - в 4,2 раза).

Впервые отмечено, что общая выживаемость больных неходжкинскими злокачественными лимфомами, вне зависимости от их иммуноморфологиче-ского варианта и других характеристик, коррелирует с количеством опухолевых клеток, экспрессирующих bcl-2, mp53, с-тус, CD95 и р-гликопротеин, а сочетанная гиперэкспрессия лимфомой этих маркеров способствует снижению уровня общей выживаемости в 4,5 раза в сравнении с пациентами, у которых экспрессия данных протеинов на клетках опухоли отсутствует.

Впервые установлено, что использование показателей международного прогностического индекса в комплексе с иммуноцитохимическими маркерами блока апоптоза и множественной лекарственной устойчивости позволяет повысить точность стратификации вероятности неблагоприятного прогноза HX3JI до 98,5 %, а благоприятного - до 96,7 %.

Анализ иммунофенотипической характеристики неходжкинских лимфом позволил выявить признаки клональной гетерогенности высокоагрессивных лимфобластных НХЗЛ, что проявилось в коэкспрессии миелоидных и лим-фоидных антигенов в 72,2 % случаев; а также в неоднородности иммунофе-нотипического профиля диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Дополнительные иммуноцитохимические критерии позволили с высокой достоверностью выделять подварианты диффузной В-крупноклеточной НХЗЛ, соответствующие трем типам клоногенных предшественников: подгруппу герминативного центра, постгерминативного происхождения и подгруппу с лимфо-плазмоцитарной дифференцировкой, отличающихся по общей 3-летней выживаемости пациентов (80 %, 58 % и 30 % соответственно) и чувствительности опухоли к химиотерапии.

Впервые на основании количественного анализа экспрессии иммунофено-типических признаков предложены дополнительные иммуноцитохимические критерии дифференциальной диагностики для наиболее распространенных вариантов мелкоклетонных лимфом, схожих по морфологическим и клиническим характеристикам: для фолликулярной - количество CD 10 позитивных клеток > 30,2±4,1 % и bcl-2(+) > 22,5+3,9 %); для лимфоплазмоцитарной -число CD19(+) клеток >15,1±5,6 %, CD20(+) >8,2±2,7 %, IgM >7±1,3 %.

Впервые изучена частота и структура неходжкинских злокачественных лимфом среди пациентов-жителей г. Новосибирска и Новосибирской области (НСО). Выявлено преобладание вариантов с индолентным характером течения, менее часто встречаются высокоагрессивные и агрессивные лимфоид-ные опухоли. В структуре НХЗЛ, в соответствии с их иммуноморфологиче-ским вариантом, выявлена высокая частота лимфобластных и анапластиче-

ских крупноклеточных вариантов лимфом, а среди мелкоклеточных - доминирование центрофолликулярных и маргинально-клеточных типов неопла-зий, а также лимфом зоны мантии.

Научно-практическая значимость работы

Результаты исследования дали возможность, используя комплекс имму-нофенотипических маркеров-предикторов, совместно с классическими критериями международного прогностического индекса, уже на этапе первичной диагностики стратифицировать группу риска неблагоприятного течения не-ходжкинских лимфом, прогнозировать ее резистентность к химиотерапевти-ческой программной терапии и разрабатывать лечебную тактику, адекватную молекулярно-биологическим свойствам опухоли.

Комбированная гиперэкспрессия маркеров-регуляторов апоптоза (Ьс1-2, шр53, с-тус, р-гликопротеин и СБ95) указывает на неблагоприятный прогноз заболевания и необходимость обсуждения вопроса о назначении более агрессивных программ терапии.

Использование комплекса иммуноморфологических показателей в динамике проводимого лечения позволили выявлять неблагоприятное течение опухоли, обнаруживать формирование химиорезистентных клонов лимфомы и прогнозировать вероятность будущего рецидива НХЗЛ или трансформации ее варианта в более агрессивный.

Результаты данного исследования могут быть использованы в практике работы иммуноцито (гисто) химических лабораторий, поскольку дают новые возможности для решения задач прогностической оценки профессии лимфо-идных неоплазий и дифференциальной диагностики фолликулярной и лим-фоплазмоцитарной лимфомы с другими вариантами В-клеточных НХЗЛ, имеющими схожие морфологические характеристики, а также для выделения трех иммуноморфологических подвариантов диффузной В-крупноклеточной лимфомы, различающихся по чувствительности к стандартным программам лечения и по общей выживаемости: подгруппу герминативного центра с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2(+) СБЗО(-) СВ38(-) (общая выживаемость составила 80 %), постгерминативного происхождения с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2(-) СБЗО(-) С038(-) (общая выживаемость - 58 %), подгруппа с лимфоплазмоци-тарной дифференцировкой и фенотипом СБЮ(-) Ьс1-2(+) СБ30(+) СБ38(+) (общая выживаемость -30%).

Полученные сведения о частоте и структуре неходжкинских злокачественных лимфом на территории г. Новосибирска и Новосибирской области имеют практическое значение для решения вопросов бюджетного финансирования лечебно-диагностической помощи этим пациентам и определения общей их потребности в дорогостоящих противоопухолевых препаратах при формировании перспективных планов поставок медикаментов для онкогема-тологической группы больных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клиническая прогрессия НХЗЛ и ее устойчивость к химиотерапии в 98 % случаев связана с трансформацией иммунологического фенотипа опу-

холи в направлении гиперэкспрессии белков, блокирующих апоптоз (тр53, Ьс1-2, с-тус и СЛЭ95) и маркера множественной лекарственной резистентности - р-гликопротеина.

2 Для белков-регуляторов апоптоза: р53, Ьс1-2 и с-тус характерны сильные положительные корреляционные взаимосвязи с продукцией протеина множественной лекарственной устойчивости МОШ (р^усорпЛет) и с показателями международного прогностического индекса НХЗЛ (коэффициент Пирсона равен (+)0,75-(+)0,9); сочетанная гиперэкспрессия маркеров блока апоптоза непосредственно предшествует клинической манифестации нового этапа опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом вне зависимости от их варианта, клинической симптоматики и стадии процесса.

3. Использование комбинации иммунофенотипических характеристик лимфомы, отражающих уровень клеток, экспрессирукнцих Ьс1-2-протеин (>25,2 %), мутантный р53 (>24,6 %), онкопротеин с-тус (>17,8 %), р^1усорго1ет (>21,3 %) и СБ95 (>9,0 %), в качестве универсальных маркеров-предикторов опухолевой прогрессии в сочетании с критериями международного прогностического индекса (МПИ) позволяет стратифицировать группу с низкой выживаемостью (логарифмический ранговый критерий р=0,000005), повышая точность прогностической оценки до 98,5 %.

4. В структуре неходжкинских злокачественных лимфом (НХЗЛ) у пациентов - жителей г. Новосибирска и Новосибирской области преобладают НХЗЛ с индолентным (44,2 %) и высокоагрессивным (32,8 %) характером клинического течения заболевания, тогда как частота агрессивных лимфом составляет 23 %; линейная принадлежность лимфоидных неоплазий характеризуется преобладанием В-клеточных типов над Т-клеточными (75,3 % против 24,7 %); по частоте отдельных вариантов выявлено высокое число крупноклеточных анапластических НХЗЛ (как среди В-клеточных, так и среди Т-клеточных), а также - фолликулярноклеточных, маргинальноклеточных вариантов и лимфом зоны мантии.

5. Дополнительными критериями гетерогенности иммунологического фенотипа диффузной В-крупноклеточной лимфомы являются маркеры СБ 10, Ьс1-2, СБЗО и СЕ)38, позволяющие верифицировать подварианты НХЗЛ в соответствии с тремя типами неопухолевых аналогов: лимфому из клеток герминативного центра с фенотипом СЮ10(+) Ьс1-2(+) СБЗО(-) СЕ>38(-), опухоль постгерминативного происхождения с фенотипом СБ10(+) Ьс1-2(-) СЕ)ЗО(-) С038(-) и подвариант с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом СОЮ(-) Ьс1-2 (+) СЮ30(+) СБ38(+); эти типы В-крупноклеточной неход-жкинской лимфомы значительно различаются по показателям общей выживаемости пациентов, которая равна 80 %, 58 % и 30 % соответственно.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на I Всероссийском съезде гематологов (Москва, 2002); Российско-норвежской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, 2003); конференции «Современные проблемы интегральной клиники» (Новосибирск, 2003); Юбилейной конференции, посвя-

щенной 40-летию гематологической службы г. Новосибирска (2004); 21(XLIV) сессии общего собрания Сибирского отделения РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы онкологии» (2003); Всероссийских конференциях по проблемам гематологии и трансфузиологии (Москва, 2004 и 2006); международных конференциях «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине» (Новосибирск, 2005, 2006); на ежегодных научно-практических конференциях «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006); на I съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005); на Всероссийском съезде терапевтов (Москва, 2006); Всероссийском съезде онкологов (Москва, 2006); на выездной сессии Президиума СО РАМН, посвященной проблемам онкологии и онкогематологии (Новосибирск, 2006), и на 3-межрегиональной научно-практической школе-семинаре «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 46 работ, в том числе 22 - в центральной печати (из них 14 - в виде научных статей в реферируемых журналах).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 403 страницах, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав результатов исследования, заключения, выводов и практических рекомендаций, содержит 51 таблицу, 60 рисунков, 4 фотографии и три клинических примера. Библиография включает 100 отечественных и 477 иностранных авторов. Весь представленный материал получен, обработан и проанализирован лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования Общая характеристика обследованных больных

В исследование вошло 1375 больных неходжкинскими злокачественными лимфомами (HX3JI), наблюдавшихся в Городском гематологическом Центре Управления здравоохранением мэрии г. Новосибирска (ГГЦ) с 1990 по 2005 гг.

Средний возраст пациентов составил 55,8±6,4 года. Анализ распределения по возрастным группам выявил преобладание лиц 60-64 лет. Максимальная заболеваемость (51,5 %) была определена между пятым и седьмым 10-летием жизни и носила монопиковый характер. Отмечено, что 36,2 % пациентов составили лица молодого и среднего возраста, а 5,9 % - дети и подростки, соотношение мужчин и женщин в обследованном контингенте - 1,2:1.

У 56,7 % пациентов иммунофенотип опухоли изучался на этапе первичной диагностики, у 43,3 % - при рецидиве процесса. Больные с первой стадией лимфомы составили 2 % от всего числа обследованных, II стадия была выявлена у 9 %, III стадия - у 13 %. Большинство пациентов (76 %), составили лица с генерализацией и/или диссеминацией опухолевого процесса, что

соответствовало IV стадии НХЗЛ. У 52 % больных отмечалась лейкемиче-ская форма прогрессии лимфомы и/или наличие внутрикостномозговых опухолевых пролифератов, в том числе, у 768 больных указанные изменения выявлялись в динамике наблюдения на этапах проведения полихимиотерапии и контроля ее эффективности.

Изолированная манифестация экстранодальных очагов лимфомы при отсутствии опухолевой лимфаденопатии была характерна для 5 % обследованных, в остальных 95 % случаев отмечалось наличие поражений лимфатических узлов. В группе экстранодальных неходжкинских лимфом было выявлено иное распределение стадий заболевания. Высокий удельный вес составили лимфомы 1Е (36 %) и 11Е (43 %) стадий, а продвинутые 1П-1УЕ отмечались в 21 % случаев.

Общеклинические методы исследования

Пациенты обследовались с использованием стандартного набора клинических и инструментальных методов, включавших исследование показателей гемограммы, стернального пунктата, трепанобиоптата с подсчетом миело-граммы и гистологической характеристикой гемопоэза. При наличии лимфаденопатии или органных поражений проводилась обязательная биопсия опухоли с морфологическим исследованием ткани лимфоидной неоплазии.

В целях изучения распространенности НХЗЛ и верификации стадии заболевания использовались инвазивные (ФГДС, ФКС и другие) и неинвазивные методы (УЗИ внутренних органов, рентгеновская компьютерная томография или магниторезонансная томография, по показаниям - с использованием спирального томографа).

Исследовались основные биохимические показатели, в том числе общая лактатдегидрогеназа, уровень белка плазмы крови, а для В-мелкоклеточных НХЗЛ - белковые фракции, М-градиент, соотношение классов ^ и монокло-нальный белок Бене-Джонса. На этапе первичной диагностики, в динамике наблюдения и лечения все больные проходили предусмотренные стандартными протоколами химиотерапии обследования. В части случаев при рецидиве заболевания проводилась повторная биопсия опухолевого субстрата.

Специальные методы исследования

Основной молекулярно-биологической технологией данной работы являлось иммуноцитохимическое и иммуногистохимическое исследование био-псийного материала опухоли.

Список моноклональных антител (МКА), входивших в исследовательскую панель включал следующие позиции и соответствующие им гибридом-ные клоны:

1. МКА против антигенов гемопоэтических предшественников: С034 (клон ВШМА-КЗ), ТсГГ (НТ-1), СБЗЗ (клон \VM-54), ЛЬА-БЯ (клон Ш22).

2. МКА против Т-клеток: С01а (М-Т102), ТСИ-сф (\¥Т 31), ТСИ-бу (1Ш2), СБ2 (МТ910), СБЗ (иСНТ1), СБ4 (МТ310), СБ5 (ОК23), СБ7 (БК24), СБ8 (ЕЖ25), СО 10 (882/36), СБ45Ш (ИСНЫ), СБ56 (МОС-1), СБ 103 (НМЬ-1)

3. МКА против миелоидных антигенов-. МРО (МРО-7), РМЬ (РО-МЗ), СБ11с

(КВ90), CD13 (WM-47), CD14 (TUK4), CD15 (C3D-1), CD41 (5B12); 4. MKA против В-клеточных антигенов: CD19 (HD37), CD20 (B-Lyl), CD23 (МНМ6), CD30 (Ki-1), CD38 (AT15/5), CD79a (JCB117), антитела против различных классов Ig и их цепей: Ig А (6Е2С1), Ig G (А57Н), Ig Е, Ig D, Ig M (Rl/69), |л-цепь Ig (A8B5), к-цепь Ig (A8/B5), ¿.-цепь Ig (N10/2); 5. MKA против белков-регуляторов апоптоза и онкопротеинов: CD95 (DX2), р-53 (D07), вс1-2 (клон 100/D5), c-myc (9Е11); 6. Маркеры пролиферативной активности: Ki-67 (MIB-1), Cyclin DI (DSC-6); 7. MKA против белка - продукта гена множественной лекарственной резистентности (MDRI) — р-glycoprotein (клон JSB-1); 8. МКА против нелинейных антигенов: CD99 (НОЗб-1), CD246 (ALK1); 9. МКА против общелейкоцитарного антигена: CD45 (позитивный контроль) (Т29/33); 10. МКА против антигена эпителиальных клеток - панцитокератина (MNF-116) (негативный контроль).

Исследование иммунологического фенотипа опухолевых клеток осуществлялось с помощью систем визуализации (LSAB+, LSAB2), основанных на стрептавидин-биотиновой или полимерной (EnVision Systems (DAKO) методиках с использованием цитохимической метки щелочной фосфатазой (для иммуноцитохимического исследования) или пероксидазой (для иммуноги-стохимии). Использовался стандартный метод иммуноцито-(гисто) химического исследования, владение которым подтверждено двумя сертификатами Всероссийской школы иммуногистохимии (Государственный университет г. Казани 1999 и 2002 гг.) и сертификатом международной школы иммуномор-фологии (Санкт-Петербург, 2004 г.

Основным материалом для работы являлся субстрат опухоли, полученный методом открытой или пункционной (при поражении костного мозга) биопсии опухоли. Всего исследовано более 1 200 биоптатов, в 30 % случаев проводилось параллельное иммуноцито- и иммуногистоморфологическое исследование препаратов одного и того же пациента.

Статистическая обработка материала проводилась с помощью пакета прикладных математических программ STATISTIKA, версия 6.0 (StatSoft Inc.), OriginPro версия 7,5 (OrigiriLab) и с использованием статистических возможностей Excel на основе сформированной базы данных.

При анализе клинических, морфологических и параклинических показателей были использованы методы описательной статистики с подсчетом средних величин числовых данных, ошибки средних и другие варианты анализа: непараметрическое сравнение и показатели F-статистики Фишера; коэффициент корреляции Спирмена для оценки взаимосвязи между параметрами с определением коэффициента ранговой корреляции; варианты частотного анализа, многофакторного регрессионного анализа (кластерный анализ), метод дисперсионного многофакторного анализа ANO VA, дискриминантный анализ и метод исследования критериев различий эмпирических распределений и расчета диагностических таблиц (Е. В. Гублер, 1978). Многолетняя выживаемость пациентов в группах исследовалась с помощью метода анализа цензурированных данных с использованием функции вероятности выжи-

вания по К а план у и Мейеру с расчетом логарифмического рангового критерия (log-rank) для оценки достоверности различий выживаемости. Все клинические, клиник о-л аб ораторны е, цитологические и иммуно-цитохимические исследования проводились автором работы лично или с его непосредственным участием.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Частота и структура неходжкинеких злокачественных лимфом у пациентов-жителей г. Новосибирска и Новосибирской области

По результатам анализа клинических, морфологических иммуноморфо-Яогических данных структура контингента была ранжирована по степени клинической активности, иммунологической линейной принадлежности, гистологическому характеру роста опухоли и иммуноморфологическим подва-риантам (рис.1).

ННППЛСПТНЫС лгрс ttPhHblf » Ц ГС (J Ни AI ¡Nt ITCH &11Ы f

степень агрессивности

Рас. I. Частот а встречаемости 11X3Л по клиническому течению (п = 896)

Инлолентные (медленнопрогрессирующие) НХЗЛ были представлены больными с мелкоклеточными вариантами неходжкинских опухолей, что составило 44,2 % от общего числа пациентов.

Агрессивные лимфомы диагностированы у 23 %, в эту группу вошли вее случаи крупноклеточных НХЗЛ, Высокоагрессивные лимфомы были прежде всего представлены пациентами с лимфобластными вариантами и беркитто-подобной лимфомой и составили 32,8 7с.

По основной иммунофеиотипической характеристике, Т или В-клеточной линейной принадлежности, все случаи неходжкинских лимфом разделились на В-клеточныс опухоли, которые выявлялись у 75,3 % больных и Т-клеточные - у 24,7 %. С учетом иммуиоморфологической характеристики

подгрупп HX3JI в соответствии с критериями классификации ВОЗ была выявлена структура неходжкинских лимфом и определена частота отдельных подвариантов (габл.1). Группа В-лимфобластных лимфом была представлена 149 пациентами. Среди B-HX3JI из ранних лимфоидных клеток преобладали пациенты с препреВ-клеточным типом опухоли («common» вариант) - 67 % (п=106) (рис.2). Второе место по частоте заняли лимфомы с самым «ранним» иммунофенотипом - проВ (9 %). ПреВ-клеточные лимфобластные HX3JI составили 3 % (п=5), а «зрелый» В-фенотип опухоли был представлен у 12 % пациентов (п=20). Т-лимфобластные опухоли были выявлены у 130 больных (15 % пациентов) (рис.3). Преобладали лимфомы с «поздним» иммунофенотипом опухолевых лимфобластов, экспрессирующих ар- или у5-цепи рецептора Т-клеток - у 19 % (п=20) и у 15 % больных (п=25), соответственно. Высокий удельный вес составляли лимфобластная Т-лимфома с кортикальным и преТ-фенотипом - у 25 % (п=32) и 23 % (п=30). Самая ранняя из Т-лимфом, экспрессирующая проТ-клеточный фенотип была диагностирована у 17 пациентов, что составило 13 % от числа пациентов этой группы HX3JI. Наиболее редкой Т-лимфобластной опухолью была NK-бластная лимфома-лейкемия - у 7 больных (5 %).

Таблица 1

Частота и структура отдельных вариантов HX3JI

Вариант НХЗЛ с учетом иммунофенотипа Число пациентов, п Частота, %

В-лимфобластная лимфома 149 16

Беркиттоподобная В-лимфома 15 2

Диффузная В-крупноклеточная 59 7

Фолликулярная (центробластно-центроцитарная) 172 18

В-лимфома маргинальной зоны 74 8

В-лимфома зоны мантии 59 7

В-парапротеинемическая (миелома, иммуноцито-ма, АЬ-амилоидоз и др ) 32 4

проВ-ХЛЛ/В-ХЛЛ/лимфома из малых лимфоцитов 88 10

Волосатоклеточный лейкоз 27 3

Т-лимфобластная лимфома 130 15

Т-крупноклеточная лимфома 61 7

Т-мелкоклеточная лимфома 30 3

Всего 896 100

ггрсирс-В 67% (п=1 Ой)

Рис. 2. Частота и структура В-лимфобластных НХЗЛ (п = 149)

беркктто-ггодинная

преТ 23% (п=30)

МС-бластная лимф о иа-лейксмня

Т-лельга/гамма ^ (П_7) 15% (п=20)

вроТ 13% (п=17)

Т-альфа/б*тта 1Ш (п=25)

ТГгКО рТИКаЛМШН

25% (п=32)

Рис. Я. Частота и структура Т-лимф областных лимфом (п = 130)

Зрелоклеточные неходжкннскке злокачественные лимфомы с периферическим имму нофенотитгом также были разделены по степени дифференцирован ности и линейной принадлежности субстрата опухоли. В-крупно-клеточные лимфомы были на 2/3 представлен различными вариантами Диффузной Ш-крупноклеточной лимфомы (рис. 4). Фолликулярные лимфомы на крупных клеток в 14 % были представлены II цитологическим типом, а у 15 человек (17%) состояли сплошь из центробластов (Ш цитологический тип).

цснтрпЛласгмаи (1111 [>адиции) 17% (п=15)

Н-

анапластн ч ечкй« 2<п=25)

Б-крупно-к гг т||чпан

средостения 10% (п=У>

В-иммуно -бластняя 31 %(п=27)

ЦсЕ|Тр[>блаСТНО-

цсн тричитарная [II градации) 14% (п=12)

Рис.4. Частота и структура В-крупноклегочных лимфом (п = 88)

Т-крупноклеточные НХЗЛ встречались реже В-лимфом и составили небольшую группу - 63 пациента (рис. 5), В группе Т-кру пноклеточных лим-фом преобладала Т-анапластичсская НХЗЛ. она была выявлена более чем у половины обследованных этой группы (56 п = 35).

другие "ЧК крмпт-

Т-круцво- клеточная Т-вммуно

клеточные 3% (н= 2) бластная

Т-плсйо-мирфиая 1<"><Й (п=10>

ческаи

()

Рис. 5. Частота и Структура Т-к рун тж л сточных лимфом (и = 63)

Таким образом, в кластере круп но клеточных В-НХЗЛ преобладала диффузная В-лимфома, среди Т-линейных - Т-анапластическая. Необычным был высокий удельный вес анапластических В-крупноклеточных лимфом CD30(+) ALK (+).

Более половины пациентов (55,6 %) составили лица с мелкоклеточными поднариантами НХЗЛ, образовав наиболее многочисленную группу из 453 больных. В этой группе доминировали В-мепкоклеточные лимфомы (п = 427) (рис. 6), Преобладающей в кластере была фолликулярная лимфом а I цитологического типа (центроцитарная), она была диагностирована у трети больных (п = 148), На втором месте по частоте были первично лейкемические типы мелкоклеточных В-НХЗЛ: хронический В-клеточныЙ лимфолей-коз/лимфома из малых лимфоцитов - у 11 % (п = 49), пролимфоцитарный В-ХЛЛ - у 9 % (и= 30) и во носато кдето ч н ы й лейкоз, отмеченный у 27 больных (6 %).

IltMftgHJIl ИТ армян

(Г грилацин) 36% (в= I4S'|

'юны мат ли 14% (n=S9)

В-ХЛЛ 11 % lti= 49)

нмиуиощггош 4% (и=17) тшмщщгома, ММ

3% (11=12)

Т.' 1:1ОЧНЫМ

J [СИКОЗ

0,5% ¡п=2)

маргинальной :«1ны 17% (п=74)

£UJ .1 Гн' а г о -

клеютшй if iii~.ii i 6'"Ип=27|

проВХЛЛ

Рис.6. Частота и структура В-мслкоклегочных лимфом (п = 427)

Далее по частоте следовали В-мелкоклеточпые лимфомы из клеток маргинальной зоны, включая нодальный, спленомегалический и МАЬТ-подварианты. В целом лимфомы маргинальной зоны составили 17 % от числа В-мелкоклеточных (п = 74). Многочисленные подварианты парапротеине-мических мел ко клеточных лимфоидных опухолей были представлены 32 пациентами (7,5 %). В подгруппу были включены множественная миелома и илазмацитома (3 %), иммуноцитома, включая болезнь Вальденстрема (4 %)

и редкий вариант - плазмоклеточный лейкоз (0,5 %, п = 2). Таким образом, среди В-мелкоклеточных НХЗЛ преобладали фолликулярная лимфома из центроцитов и группа проВ-ХЛД/В-ХЛЛ/димфома из малых лимфоцитов.

Среди Т-мел ко клеточных НХЗЛ самой представительной была группа кожных лимфом Сезари и не-Сезари типов, она составила 36% (п - 11) от общего числа пациентов с этими опухолями (рис. 7).

ТДЧКлимфома вязального типа; 7% (¡1=2)

Т-лимфома/ лейкемия! 1% (11=2)

Г-мелко/кл дельтаУгам и» тина 7% (11=2)

Панн нкулнто-

ПОДОЙНЯЯ

Т-ЯЯ'мф.&ма-, ЗШв=1)

Т*Дн мфимн/ эйтсраптня 01=1)

проТ-ХЛЛ 20% (и=6)

Г-м (лко/кЛ лимфомы кожи; 36% (п=] 1)

агрессивная из зрельп N К 7% (п=2)

крупно-I ранулнрммн

т-хлл

10% (п=Э)

Рис. ?. Частота м структура Т-межокйЩЭТиых лимфом 1п = 30)

В целом, суммируя данные по структуре НХЗЛ, следует отметить преобладание В-мел ко клеточных лимфом, ранее относимых к различным формам хронического лимфолейкоза. К особенностям обследованного в работе контингента больных относилась более редкая встречаемость диффузной Ё-крупно клеточной лимфомы - 18,8 с/с против 30,6 % — по данным ВОЗ. Первично лейкемизированные В-мелкоклеточные НХЗЛ диагностировались нами на 10 % чаше (16,8 г/с и 6,7 % соответственно). Распространенность лимфом зоны мантии среди обследованных в нашей работе пациентов была на 3,4 % выше (9,4 % против в %).

Выявлена более частая встречаемость спленомегалической лимфомы маргинальной зоны (4,5 % против 1,9 %). парапрогеинемических опухолей (5,1% против 1,9%), анагшастическоЙ крупноклеточной лимфомы (5,6% против 2,4 %). Несколько реже встречались больные с В-крупноклеточной

лимфомой средостения (1,4 % против 2,4 % по данным ВОЗ) и, особенно, периферические Т-клеточные лимфомы (4,8 % против 7,6 %).

Таким образом, полученные нами данные по г. Новосибирску и НСО дают оценку частоты и структуры распространенности отдельных вариантов НХЗЛ. Получены показатели близкие к оценкам ВОЗ, но отражающие генетическую и этническую специфичность контингента.

Особенности клинико-иммуноцитохимической характеристики отдельных вариантов НХЗЛ

При анализе иммунофенотипических признаков лимфобластных неход-жкинских лимфом была выявлена высокая частота коэкспрессии антигенов миелоидной линии. Так, при НХЗЛ с проВ-лимфобластным фенотипом не-лимфоидный маркер СБ34 экспрессировался, в среднем, на 73,3±4,9 % опухолевых клеток, СБЗЗ - на 20 %, миелопероксидаза (МРО), выявляемая мо-ноклональными антителами, верифицировалась на 15,5±5,3 % клеток опухоли, при этом цитохимическая реакция на миелопероксидазу была отрицательна. Аналогичная картина выявлена и при других В-лимфобластных лим-фомах: при НХЗЛ с препреВ-клеточным фенотипом на 83,6±5,4 % опухолевых клеток отмечалось присутствие СБ34, у 31,7+4,9 - СБЗЗ, МРО, в среднем, на 20,8±4,5 %. Элементы пре-В варианта лимфомы обнаруживали присутствие в своем иммунофенотипическом профиле СЭ34 и СБЗЗ-маркера (31,5±5,5 % и 13,0±4,3 % соответственно), а на 10,8±4,5 % клеток - МРО при отсутствии позднего миелоидного антигена - СБ13. При лимфобластной лимфоме со зрелым В-фенотипом наличие миелоидных антигенов отмечалось реже: СПЗЗ на 12,3±7,1 % опухолевых клеток, СБ34- на 15,2±14,9 %. Отмеченный феномен не зависел от линейной принадлежности НХЗЛ из ранних предшественников. Лимфомы с проТ-клеточным фенотипом обнаруживали наличие стволовоклеточного маркера - СБ34 на 43,4±8,2 % клеток. При Т-НХЗЛ кортикального типа МРО определялась на 30,2±4,2 % клеток, а в 24,5±10,3 % клеток экспрессировался СБ34.

Таким образом, для большинства иммуноморфологических вариантов лимфобластных неходжкинских лимфом характерны признаки атипичной экспрессии антигенов миелоидной линии, что, вероятно, отражает гетерогенность популяции опухолевых клеток и, возможно, связано с генетическим «химеризмом» элементов неопластического клона.

С целью выявления дифференциально-диагностической значимости количественного определения позитивных клеток в субстрате В-крупноклеточных лимфом для достоверного разделения диффузной и фолликулярной НХЗЛ была проведена статистическая проверка различий средних с расчетом критерия Стьюдента и коэффициента корреляции Пирсона. В результате анализа всей совокупности иммунофенотипических данных реальная ценность для дифференциальной диагностики диффузной В-крупноклеточной и фолликулярной лимфом подтверждена только для СБЮ и Ьс1-2: выделение в иммунологическом профиле В-крупноклеточной лимфомы СОЮ(+) клеток

менее 30,2±4Д % и bcl-2 менее 22,5±3,9 % позволяет отвергнуть фолликулярную лимфому со степенью вероятности р<0,05.

Группа В-крупноклеточных HX3JI по клиническим и иммунофенотипиче-ским признакам была неоднородной. В соответствии с описанными в классификации ВОЗ неопухолевыми аналогами выделялись три кластера лимфомы. Дополнительно к критериям классификации ВОЗ был разработан комплекс иммуноцитохимических признаков для дифференциальной диагностики этих подвариантов, отличавшихся по уровню общей выживаемости: подгруппа герминативного центра с фенотипом CD10(+) bcl-2(+) CD30(-) CD38(-) (общая выживаемость равна 80 %), постгерминативного происхождения с фенотипом CD10(+) bcI-2(-) CD30(-) CD38(-) (общая выживаемость - 58 %), подгруппа с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом CDIO(-) bcl-2(+) CD30(+) CD38(+) (общая выживаемость - 30 %). Комплекс маркеров позволял с высокой достоверностью (р<0,05) дифференцировать типы диффузной В-крупноклеточной лимфомы, не используя «классические» показатели - протеины MUM1 и BCL6, моноклональные антитела к которым не входят в общепринятую диагностическую панель для неходжкинских лим-фом. В целях решения задачи поиска дополнительных иммуноморфологиче-ских маркеров парапротеинемических B-клеточных лимфом был проанализирован уровень экспрессии опухолью различных классов иммуноглобулинов и их цепей. Оказалось, что при количестве опухолевых клеток, позитивных на к-цепи > 79,8±9,2 % и Х-цепей >85,3±6,7 %, с ошибкой достоверности р<0,05 верен диагноз опухоли из плазматических клеток. Кроме того, если в субстрате В-мелкоклеточной HX3JI число CD19(+) клеток будет <15,1±5,6 %, CD20(+) <8,2±2,7 %, а IgM <7±1,3 % с уровнем ошибки достоверности менее 0,05 можно утверждать, что диагноз лимфоплазмоцитарной лимфомы исключен. При сопоставлении этих критериев с клиническими признаками и морфологией клеток опухоли ошибка при дифференциальном диагнозе парапротеинемических лимфом может быть практически исключена.

Экспрессия протеинов-регуляторов апоптоза и множественной лекарственной резистентности при различных вариантах первичных HX3JI и при рецидиве

Многочисленные исследования последних лет показали, что скорость прогрессии опухолевых заболеваний зависит зачастую не только и не столько от митотической активности субстрата, сколько от способности опухолевых клеток ускользать от запрограммированной клеточной смерти - апоптоза. Ключевую роль, в этом процессе играет функциональная активность продуктов генов-регуляторов этих процессов - р-53, bcl-2, с-шус, мембранного белка FAS (APO-1/CD95), ядерного протеина пролиферативной активности Ki-67 и собственно продукта гена MDR1 - р-гликопротеина - АТФ-зависимого помпового белка, определяющего лекарственную резистентность. Последнее и определило следующую задачу данной работы. Наибольшей экспрессией

отличался белок блока апоптоза bcl-2, он был выявлен на 38,5±1,9 % опухолевых клеток больных НХЗЛ. Мутант пая форма проапоптозного протеина р-53 определялась на 16,25±1,7 %, онкопротеина с-тус - на Î2, l±i,4 % (рис.S). Продукт гена множественной лекарственной резистентности MDR1 - р-гли-копротеин проявлял свою экспрессию, в среднем, на 15,6±1,5 % элементов НХЗЛ.

маркеры

Рис. 8. Уровень экспрессии белков-регуляторов алогггоза, пролиферативной активности у больных НХЗЛ (л = 896)

Келок пролиферативной активности клетки, охватывающий 80 % митоти-ческого цикла, Ю-67 экспреесировался на 37±1,6 % клеток, а рецептор системы фактора некроза опухоли альфа (ФНОа) Рак-РаяЬ - С095 — на21,5±2,7 %.

Таким образом, был констатирован факт присутствия в иммунофенотипи-ческом профиле неходжкинской лимфомы исследуемых молекулярно-биологических маркеров.

Оказалось, что исследуемые протеины неравномерно распределены на мембране опухолевых элементов при В- и Т-лимфомах (рис. 9).

hcl-2 p»53 c-myc CD9S Kí-67 p-

glycopr

маркеры

Примечание: * звездочкой отмечены показатели, достигшие достоверного уровня значимости отличия (р<0,05) в сравнении с аналогичным критерием из других групп

Рис. 9. Сравнительная характеристика экспрессии пел кон-регуляторов апоптоза, про-лиферативноЙ активности и МЛУ1 в группе Т- и В-клегочных (1X3J[

Наибольшее отличие касалось CÜ95: при Т-клеточных опухолях экспрессия маркера была в два раза выше, чем при лимфомах В-линии - 54,5±5,5 % и 27,8±4,8 % соответственно (р<0.05). Антиген bel-2, напротив, проявлял высокое представительство при В-НХЗЛ (41,1±4,2 %), а при Т-опухолях был в 2,5 раза ниже (16.4±4,4%) (р<0,05). Мутантный р-53 экспрессировался на всех линейных типах лимфом, но при Т-ИХЗЛ был несколько выше, чем при В-вариантах, хотя различие было недостоверным. Оба кластера лимфом отличались повышенной экспрессией р-гликопротеина (32,8±3,2 % - при Т- и 23,2±4,8 % - при В-НХЗЛ (р<0,05)).

Сравнительный анализ показал, что имеется существенное различие в представительстве btrl-2, р-53, c-myc, CD95, Ki-67 и р-гли ко протеи на в группах пациентов с различной клинической активностью процесса (рис, 10).

маркер!.]

б выеокоагресснвные □ агрессивные □ индол ентпые

Примечание: * звездочкой отмечены показатели, достигшие достоверного уровня значимости отличия (р<0.(К) в сравнении с аналогичным критерием из других групп

Рис. К). Уровень экспрессии бел коп-регуляторов апоптоза в группах МХЗЛ в соответствии с клиническим вариантом течения

Так, в кластере высокоагрессивных (лимфобластных и беркиттопо добных вариантов) НХЗЛ был выявлен высокий уровень р53 и онкопротейна с-тус 38,7±3,8 % и 40,4±5,4 % позитивных клеток соответственно. В группе НХЗЛ с агрессивным вариантом клинического течения, в которую были включены пациенты с крупноклеточными лимфомами, отмечалось наибольшее число клеток, позитивных на Ъс1-2, р53 и К1-67-маркеры - 36,5±3,0 %, 37,5±2,9 % и 40.1±!,4 % соответственно. V трети пациентов был выявлен высокий уровень ■экспрессии р-гл и ко протеина (28,б±2,9 %). ИммунофенотппическиЙ профиль индолентных лимфом характеризовался наиболее выраженной экспрессией Ьс!-2 (73,9±6,8 %) и СЭ95 (34,9±2.9 %). Остальные маркеры демонстрировали умеренное количество позитивных клеток: р-53 - 14,6±2,8 %, с-тус — 5,4±1,7 %, К1-67 - 14,8±2,2 % и р^1усоргр1ет - 19,5±ЗД %.

Учитывая вышеизложенные результаты, было сделано предположение о комбинированном характере экспрессии исследуемых маркеров. В целях подтверждения или опровержения этой гипотезы был предпринят поиск корреляционных взаимосвязей между экспрессией отдельных протеинов (рис. ! 1).

Рис 11. Корреляционные взаимосвязи между иммуноцитохимическими маркерами у больных HX3JI

Максимальное значение индекса Пирсона отмечено для следующих пар признаков: bcl-2 и р53, коэффициент корреляции был равен (+) 0,92, что свидетельствует о наличии прямой, сильной связи; bcl-2 и p-glycoprotein, коэффициент Пирсона был равен (+)0,81; р-53 и p-glycoprotein, коэффициент составил (+)0,8 - связь прямая сильная. Положительная корреляционная связь средней силы выявлена между bcl-2 и CD95 - (+) 0,4; между р-53 и с-шус -(+) 0,46; с-шус и Ki-67 - (+) 0,36; c-myc и р-гликопротеином - (+) 0,3. Индекс IPI хорошо коррелировал с пятью из шести показателей. Наиболее сильная прямая связь индекса была выявлена с р-гликопротеином (коэффициент Пирсона равен (+)0,85) и р53((+) 0,8) (рис. 12).

Проведенный анализ подтвердил, что прогностический индекс IPI определяет общую тяжесть состояния пациента и суммарный объем опухолевой массы и, тем самым, апеллирует не столько к степени злокачественности процесса в его молекулярно-биологическом смысле, сколько к общей толерантности пациента к программной полихимиотерапии. Иммунофенотипиче-ские маркеры-регуляторы апоптоза характеризуют другую сторону процесса. Они исследуют злокачественный потенциал опухолевой клетки в его молекулярно-биологическом смысле - способность клетки избегать атак иммунобиологического надзора организма и быть нечувствительной к циторедук-тивному воздействию противоопухолевых препаратов. Изложенные выше данные позволили подойти к исследованию влияния экспрессии белков-регуляторов апоптоза на прогноз течения заболевания и эффективность стандартных химиотерапевтических программ.

и иммуноцитохимическими маркерами у больных НХЗЛ

Сравнительный анализ экспрессии маркеров-регуляторов апоптоза и пролиферативной активности неходжкинской злокачественной лимфомы в различных прогностических группах

Из общего числа обследованных были выделены пациенты, достигшие конечной точки исследования («исход») и с помощью методов математической группировки данных сформирована случайная выборка из 300 больных, состоявшая из двух прогностических классов (0А1(-) прогноз и 0А2(+) прогноз) по 150 случаев и равными долями пациентов по основным клиническим типам течения НХЗЛ (рис. 13).

Было установлено, что неблагоприятная прогностическая группа экспрес-сировала, в среднем, 45,1±2,9 % Ьс1-2-позитивных клеток, против 4,9±1,5 % в 0А2-кластере (р<0,05). По уровню р53(+) и с-тус (+) клеток 0А1 и 0А2 группы так же значительно отличались (46,9±2,8 % против 2,3±0,9 % (р<0,05) и 16,9±2,3 % против 1,7±0,6 % (р<0,05) соответственно). Разительным было различие двух прогностических выборок по уровню экспрессии р-гликопротеина (0А1 - 40,9±3,5 % и 0А2 - 1,7+0,7 %, р<0,05) и по СБ95-антигену (0А1 - 14,9±2,3 % и 0А2 - 3,1±1,3 %, р<0,05).

Ьс1-2 |)-53 с-шус р-д1усорг Ю-67 маркеры

□ 0Л2(+)прОГНО» □ С1Л1(-)проги01

Рис. 13. Уровень экспрессии белков-регуляторов апоптоза, пролиферативной активности и МЛУ при 1ШЛ с благоприятным и неблагоприятным прогнозом

По пролиферативной активности статистически значимых отличий не было, На основе анализа референтных интервалов были получены пороговые значения экспрессии маркеров в процентах, оказывающие влияние на оценку прогноза. Для маркера Ьс1-2 критическое значение принадлежности случая к 0А1 (кластеру неблагоприятного прогноза) составило >25,2% позитивных клеток в субстрате, для р53 - >24,6 %(+) клеток, для с-тус - >17,8 для р-гли ко протеи на >21,3 %, для С095->9,0 %.

Таким образом, было установлено, что наличие на клетках лимфомы экспрессии бел ков-регуляторов апоптоза и/или р-гликопротеина выше пороговых значений позволяет с хорошей достоверностью (р<0,05) стратифицировать неблагоприятную прогностическую группу ! 1X3Л вне зависимости от других характеристик опухолевого клона.

Вместе с тем оказалось, что в опухолевом субстрате больных с рецидивом лимфоидноЙ опухоли уровень клеток, позитивных на белки-регуляторы апоптоза и МЛУ значительно выше, чем у первичных пациентов с НХЗЛ (рис. 14).

Рис. 14. Уровень экспрессии белков-регуляторов а но птоз а, пролиферативной активности и МЛУ у первичных больных НХЗЛ и мри рецидиве

Так, если у больных с лимфомами de novo экспрессия протеина bcl-2 составляла 23,0±2,5 то в группе рецидива 67,3±2,7 % (р<0,05), уровень р53-позитивных клеток в первой группе был равен 24,3±2,2 %, во второй -60,8±2,3 % (р<0,05), с-тус (+) - 6,2±1,3 % и 29,9±2,5 % (р<0,05), CD95 (+) -10,7±1,8 % и 25,7+2,5 §6 (р<0,05). Самая существенная разница между двумя кластерами была выявлена для р-гликопротеин (+) клеток, их число в рецидивирующей опухоли возрастало в - 4раза'. с 193+2.2 % у первичных больных до 75,9±2,3 % в группе рецидива, уровень значимости достиг р<0,001.

Для показателя пролиферативной активности Ki-67 достоверной разницы между исследуемыми группами получено не было (34,1±1,5 % у больных первичными HX3J! и 34.4± 1,6 % - при рецидивах, р>0,05).

Таким образом, в субстрате неходжки неких лимфой в фазу рецидива возрастает количество клеток, экспрессирующих маркеры блока апоптоза и множественной лекарственной резистентности (р-гликопротеин).

Для выявления вклада каждого критерия в разделение двух групп применен тип дискримянантного математического анализа ANOVA с расчетом показателей F-статистики. На рисунке 15 обозначена медиана значений каждого признака и 95 % центральный размах. Полученные двумя математическими методами данные доказывают, что при рецидиве НХЗЛ отмечается нарастание степени блокады апоптоза и лекарственной резистентности опухоли.

Mean Plot (первич-рецидивы 7v*410c)

Средство, Whisker Средство-,95 Conf Interval, Средство+,95 Conf Interval

первичные рецидив

больные

Рис 15. Характеристики маркеров блока апоптоза и МЛУ у больных первичной НХЗЛ и при рецидиве

С целью проверки правильности выводов по прогностической ценности маркеров был проведен дополнительный анализ данных с использованием метода построения прогностических таблиц по Е. В. Гублеру. Показатели для выборок 0А1 и 0А2 оказались аналогичными тем, что были получены с использованием критерия Пирсона. Максимальную информативность (39,4) продемонстрировала комбинация признаков: увеличение в субстрате неход-жкинской злокачественной лимфомы неопластических клеток, экспресси-руютцих Ьс1-2-протеин, р53, с-тус, р-гликопротеина и СБ95, выше пороговых значений непосредственно предшествовало клиническим проявлениям опухолевой прогрессии лимфомы.

Математическая модель прогнозирования опухолевой прогрессии НХЗЛ и дополнительные критерии

Целью разработки новых критериев прогноза НХЗЛ являлось привнесение в стандартную клинико-лабораторную модель дополнительных универсальных иммунофенотипических маркеров-предикторов, отражающих степень блокады апоптоза и первичную лекарственную резистентность опухолевых клеток к химиотерапии (табл. 2)

Дополнительные к международному прогностическому индексу иммуноцитохимические критерии

Признак (название критерия) Градациия признака Прогностическая оценка (в баллах) (2.)

Количество р-53-позитивных клеток в опухолевом субстрате >25,2 % 0,5

< 25,2 % 0

Количество Ьс1-2*позитивных клеток в опухолевом субстрате > 24,6 % 0,5

< 24,6 % 0

Количество р^1усорго1е1п позитивых клеток в опухолевом субстрате > 17,8 % 0,5

< 17,8 % 0

Количество с-тус**позитивных клеток в опухолевом субстрате >21,3 % 0,25

<21,3% 0

Количество СЬ95 позитивных клеток в опухолевом субстрате > 9,0 % 0,25

< 9,0 % 0

Одновременное наличие всех пяти показателей выше пороговых значений*** > критических значений 2,0

< критических значений 0

Примечание.

* при фолликулярной лимфоме показатель не учитывается;

** при лимфоме Беркитта и беркиттоподобной лимфоме показатель не учитывается; *** при наличии критерия отдельные молекулярно-биологические критерии не учитываются.

Ъ - значение бальной оценки признака в соответствии с критериями 1Р1. Для определения показателя Ъ извлекается натуральный логарифм из величины соотношения частостей признака, полученное число умножается на 0,5 и округляется.

Если принять показатель (а) как расчетное значение оценки 1Р1 пациента в баллах, формула модели примет вид:

К =а+у!+ у 2 + уз +.....+ У к

где И - суммарная бальная оценка риска неблагоприятного прогноза неход-жкинской злокачественной лимфомы, а - значение 1Р1, у„ - сумма баллов прогностической оценки Ъ. Таким образом, градации критериев новой модели примут значения, представленные в таблице 3.

Градации степеней риска с учетом новой модели

Степень риска Наличие неблагоприятных факторов прогноза (одновременно)

Низкая 0-1

Низкая/промежуточная >1-2

Промежуточная/высокая >2-3

Высокая >3

Показатели Международного прогностического индекса были полностью введены в новую модель. Однако предлагаемая модель не есть простое дополнение к 1Р1, она представляет собой попытку ввести комплекс молекуляр-но-биологических признаков и объединить возможности 1Р1 с современными знаниями о влиянии механизмов торможения апоптоза на опухолевую прогрессию злокачественных лимфом.

Новый методологический подход позволил придать модели прогнозирования опухолевой прогрессии НХЗЛ свойства, обеспечивающие ей неоспоримые преимущества перед другими прогностическими системами:

- превентивность прогностической оценки, которая может быть осуществлена уже на ранних стадиях опухолевого заболевания;

- динамический характер - возможность использования оценки прогноза в динамике клинического наблюдения, при этом учитывается феномен «кло-нальной селекции» на фоне нестабильного генома с отбором доминирующих клонов при взаимодействии опухоли и внешних факторов онкосупрессии (в том числе - лечебных);

- независимость от новых протоколов лечения, поскольку модель отражает глубинные патогенетические сдвиги в канцерогенезе клеточных систем;

- универсальность, так как новый индекс не зависит от морфологического, иммунофенотипического варианта опухоли и особенностей ее клинических проявлений;

- открытость прогностической модели, возможность введения в систему новых критериев, учитывая постоянное обновление знаний о молекулярно-биологических свойствах НХЗЛ и возможность удаления устаревших в силу появления новых подходов к терапии показателей.

Существенным позитивным моментом, который следует отметить, является то, что индекс 1Р1 и комплекс предлагаемых маркеров не перекрывают компетенции друг друга по параметрам характеризуемого явления - опухолевой прогрессии НХЗЛ, но охватывают различные стороны исследуемого объекта.

Учитывая предполагаемое использование нового метода прогноза в онко-гематологической клинике, была проведена комплексная оценка его характеристик как диагностического инструмента. Прогностичность положительного

результата была определена на уровне 96,7 %; прогностичность отрицательного результата оказалась равной 99,3 %.

Верификация прогностической значимости дополнительных иммуно-цитохимических критериев прогноза прогрессии НХЗЛ

При испытании эффективности полученной модели был использован весь массив данных по больным лимфомами. Методом кластерного математического анализа по совокупности молекулярно-биологических критериев прогноза больные были разделены на два кластера.

100%

* общая выживаемость (OS) в группе SV2 общая выживаемость (OS) в группе SV1 (п=688, р=0,000005)

80%

60%

SV2

/

медиана выживаемости

40% -

20% -

SV1 /

0% -

Рис. 16. Кривые выживаемости пациентов с НХЗЛ в двух иммуноцитохимических кластерах

Радиус кластеризации был подобран таким образом, что в группы попали больные с максимально отличавшимися данными по экспрессии маркеров.

Группа SVl(survival 1) включала 335 пациентов, группа SV2 (survival 2) -307 пациентов, остальные больные оказались в равной удаленности от эпицентра кластеров, численность «остатков» составила 46 пациентов, что не превышало допустимый порог ошибки замеров уровней признаков (для р<0,05). На рисунке 16 представлено 2 графика, отражающих общую выживаемость (OS) в двух выборках, сформированных при кластерном анализе. После построения кривой выживаемости было отмечено, что эта группа SV1 имела неблагоприятный прогноз. На другом графике показана выживае-

мость пациентов из кластера SV2. Разница очевидна: уровень log-rank-критерия р=0,000005, медиана выживаемости в кластере SV2 - более 4 лет, в кластере SV1 - значительно ниже - около года. Выделенные из общей выборки по дополнительным иммуноцитохимическим критериям группы больных достоверно различались по прогнозу опухоли, что является надежным доказательством эффективности предложенной модели. Завершающий этап исследования показал, что использование определения уровня экспрессии опухолевыми клетками белков-регуляторов апоптоза и р-гликопротеина в качестве дополнительных к показателям международного прогностического индекса иммуно-цитохимических маркеров-предикторов опухолевой прогрессии лимфом позволяет с высокой достоверностью стратифицировать прогностические группы пациентов вне зависимости от варианта опухоли, морфологических особенностей и линейных характеристик опухоли.

Резюме

Опухолевая прогрессия HX3JI во многом определяется тесно взаимосвязанными патогенетическими механизмами торможения апоптоза и приобретением опухолевой клеткой резистентности к химиотерапии, индуцируемой активизацией комплекса генетически детерминируемых факторов. Эти процессы формируют молекулярно-биологические условия для манифестации прогрессирования опухоли, непосредственно предшествуют ей и лежат в основе различных клинических вариантов этой прогрессии.

Результаты исследования позволили выявить вектор ключевых молеку-лярно-биологических событий в опухолевом субстрате неходжкинских лимфом, который связан с мутациями онкосупрессорного гена р53 с гиперэкспрессией нефункционального протеина тр53, амплификацией и активизацией гена bcl-2 с наработкой стабильно высоких концентраций внутриклеточного антиапоптотического белка bcl-2, гиперэкспрессией индуктора проли-феративной активности онкопротеина с-тус и с разобщением главной транс-дуктивной системы передачи проапоптотических сигналов в ядро, благодаря мутационному альтернативному сплайсингу генов FAS и синтезу растворимых форм рецептора ФНО Fas (CD95).

Вышеизложенные механизмы объясняют взаимосвязь гиперэкспрессии шр53, bcl-2, с-шус и CD95 с неблагоприятным прогнозом HX3JI. Эти данные подтверждают предположение о том, что при опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом реализуется закрепленная генетически программа внутриклеточного подавления апоптоза в элементах неоплазии. Данный процесс обеспечивает низкую чувствительность опухоли к внешним факторам онко-супрессии, обуславливает прогрессирование лимфомы и ее химиорезистент-ность. Из этого следует, что совокупность молекулярно-биологических признаков, отражающих динамику этих нарушений, имеет прямое отношение к прогнозированию клинических проявлений опухолевой прогрессии и общей эффективности циторедуктивной химиотерапии. Быстрота накопления в субстрате опухоли химиорезистентных клонов отражается на общей выживаемо-

сти больных. Универсальный характер этих изменений подтверждается их независимостью как от гистологических и иммуноморфологических характеристик лимфомы, так и от вариантов клинического течения НХЗЛ.

Полученные данные служат основанием для внедрения в практику онко-гематологии новой модели прогноза неходжкинских лимфом с использованием набора иммунофенотипических маркеров, уровень экспрессии которых непосредственно связан с динамикой глубинных молекулярно-биологических перестроек в опухолевых клонах. Такими маркерами являются Ьс1-2, р53, с-шус, СБ95 и р-гликопротеин.

Данный методологический подход позволяет использовать ресурс Международного прогностического индекса (1Р1) при разработке современной системы прогноза опухолевой прогрессии НХЗЛ. Показатели 1Р1 полностью введены в новую модель, однако предлагаемая система не есть простое дополнение к 1Р1, она представляет собой попытку внедрить комплекс молеку-лярно-биологических маркеров-предикторов, объединить возможности ГР1 с современными знаниями о влиянии механизмов торможения апоптоза на опухолевую прогрессию злокачественных лимфом и получить новые качественные характеристики, которых лишены другие модели. Полученные результаты позволяют приблизиться к решению важной научной проблемы изучения механизмов торможения апоптоза при опухолевой прогрессии НХЗЛ.

ВЫВОДЫ

1. В группе больных неходжкинскими злокачественными лимфомами (НХЗЛ) - жителей г. Новосибирска и Новосибирской области (НСО) - преобладают пациенты с индолентным характером течения (44,2 %), на втором месте регистрируются высокоагрессивные НХЗЛ (32,8 %), третье - занимают агрессивные лимфоидные опухоли (23 %).

2. В структуре лимфом отмечается преобладание В-клеточных НХЗЛ (75,3 %) над Т-клеточными (24,7 %), выявлена высокая частота лимфобласт-ных (33 %) и анапластических вариантов лимфом (39,8 % всех крупноклеточных); среди мелкоклеточных доминируют НХЗЛ центрофолликулярной зоны (32,4 %), маргинальноклеточные (16,2 %) и лимфомы зоны мантии (12,9 %).

3. Комплекс дополнительных иммунофенотипических маркеров: СБ 10, Ьс1-2, СОЗО и СБ38 позволяет с высокой степенью достоверности (р<0,05) выделять три подварианта диффузной В-крупноклеточной лимфомы в соответствии с типами клоногенных предшественников, различающихся по общей выживаемости: подгруппу герминативного центра с фенотипом СЭ10(+) Ьс1-2(+) СБЗО(-) СБ38(-) (общая выживаемость - 80 %), постгерминативного происхождения с фенотипом СШ0(+) Ьс1-2(-) СБЗО(-) СБ38(-) (общая выживаемость - 58 %), подгруппа с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом СБ10(-) Ьс1-2(+) СОЗО(+) СБ38(+) (общая выживаемость - 30 %).

4. Опухолевый субстрат лимфобластных неходжкинских лимфом отличается иммунофенотипической неоднородностью, что проявляется в коэкс-прессии миелоидных и лимфоидных антигенов в 72,2 % случаев заболевания и отражает клональную гетерогенность опухоли.

5. Дополнительными иммуноморфологическими критериями, позволяющими отвергнуть диагноз фолликулярной лимфомы являются: количество CD10 позитивных клеток менее 30,2±4,1 % и bcl-2(+) менее 22,5±3,9 % (р<0,05). Число CD19(+) клеток <15,1+5,6 CD20(+) <8,2+2,7%, IgM <7±1,3 %, позволяет исключить диагноз лимфоплазмацитарной НХЗЛ (р<0,05).

6. Общая выживаемость больных НХЗЛ коррелирует с количеством опухолевых клеток, экспрессирующих bcI-2, mp53, c-myc, CD95 и р-глико-протеин: в группе пациентов с сочетанной гиперэкспрессией этих маркеров уровень общей выживаемости в 4,5 раза ниже, чем в случаях, при которых эти протеины отсутствуют.

7. Увеличение в субстрате неходжкинской злокачественной лимфомы неопластических клеток, экспрессирующих bcl-2-протеин >25,2 %, р53 ->24,6 %, c-myc - >17,8 %, р-гликопротеин >21,3 % и CD95 - >9,0 %, непосредственно предшествует клиническим проявлениям опухолевой прогрессии лимфомы.

8. При рецидиве и трансформации НХЗЛ возрастает число опухолевых клеток, экспрессирующих маркеры блока апоптоза и множественной лекарственной резистентности: экспрессия протеина bcl-2 у больных с лимфомами de novo составляет 23,0±2,5 %, в группе рецидива - 67,3+2,7 % (р<0,05), тр53

- 24,3±2,2 % против 60,8±2,3 % (р<0,05), c-myc (+) - 6,2±1,3 % и 29,9±2,5 % (р<0,05), CD95 (+) - 10,7+1,8 % и 25,7±2,5 % (р<0,05). Количество р-гликопротеин-позитивных клеток в рецидивирующей опухоли увеличивается, в среднем, в 4,2 раза (с 19,3±2,2 % у первичных больных до 75,9±2,3 %), р<0,001.

9. Использование сочетания показателей международного прогностического индекса (МПИ) с комбинацией иммуноморфологических маркеров блока апоптоза и множественной лекарственной устойчивости (bcl-2 - протеин > 25,2 %, мутантный р53 > 24,6 %, онкопротеин c-myc > 17,8 %, p-glycoprotein > 21,3 % и CD95 > 9,0 %) позволяет повысить точность стратификации вероятности неблагоприятного прогноза НХЗЛ до 98,5 %, благоприятного - до 96,7 %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве иммунофенотипических маркеров-предикторов неблагоприятного прогноза НХЗЛ целесообразно использовать увеличение в субстрате опухоли неопластических клеток, экспрессирующих bcl-2-протеин > 25,2 %, тр53 - > 24,6 %, с-тус - > 17,8 %, р-гликопротеина > 21,3 % и CD95

- > 9,0 %, для чего рекомендуется ввести моноклональные антитела против

этих белков в стандартную диагностическую панель для неходжкинских злокачественных лимфом.

2. В целях прогнозирования химиорезистентности лимфом на новом этапе опухолевой прогрессии (при рецидиве НХЗЛ или трансформации ее варианта) для определения терапевтической тактики рекомендовано учитывать уровень экспрессии опухолевым субстратом белков-регуляторов апоптоза (Ьс1-2, тр53, с-шус, и СБ95), и множественной лекарственной устойчивости (р-гликопротеина), их комбированная гиперэкспрессия указывает на неблагоприятный прогноз заболевания и необходимость использования более агрессивных программ лечения.

3. В качестве универсальной модели для прогнозирования опухолевой прогрессии НХЗЛ, в целях повышения точности стратификации групп риска неблагоприятного течения заболевания (до 98,5 %), рекомендуется использовать новую модификацию международного прогностического индекса в сочетании с комбинацией иммуно-цитохимических маркеров блока апоптоза (Ьс1-2-протеин >25,2 %, шр53 - >24,6 %, с-шус - >17,8 %, р-гликопротеина ->21,3 % и СБ95 - >9,0 %).

4. При планировании бюджетного финансирования лечебно-диагностической помощи, формировании заявки на приобретение цитостати-ческих средств для онкогематологических больных г. Новосибирска и НСО необходимо учитывать следующие особенности: в структуре гемобластозов более половины случаев неоплазий приходится на неходжкинские злокачественные лимфомы (НХЗЛ), подавляющее большинство случаев (75,3 %) составляют В-клеточные НХЗЛ, 44,2 % всех больных представлено лимфомами с индолентным, 32,8 % - высокоагрессивным, 23 % - агрессивным характером течения; в сравнении с данными литературы отмечается более высокая частота лимфобластных неоплазий и крупноклеточных НХЗЛ анапластиче-ского типа, а среди мелкоклеточных - лимфом центрофолликулярной, мар-гинальноклеточной и мантийноклеточной зон; каждому из этих вариантов международным стандартом определена индивидуальная программа терапии со своим набором циторедуктивных средств и терапии сопровождения.

5. Дополнительными иммуноморфологическими критериями диагностики являются: для фолликулярной лимфомы - количество СОЮ позитивных клеток > 30,2 %, Ьс1-2(+) > 22,5 %; лимфоплазмоцитарной лимфомы - число С019(+) клеток >15 %, СБ20(+) > 8,2 %, ГдМ > 7 %, что позволяет проводить более надежную (р<0,005) дифференциальную диагностику их с другими вариантами В-НХЗЛ, имеющими схожие морфологические и клинические черты.

6. На этапе первичной диагностики диффузной В-крупноклеточной лимфомы и определения лечебной тактики рекомендуется использовать комплекс дополнительных маркеров (СБ 10, Ьс1-2, СБЗОи СБ38) для выделения трех иммуноморфологических подвариантов опухоли, различающихся по чувствительности к стандартным программам лечения и, как следствие, по общей выживаемости (ОЗ): подгруппу герминативного центра с фенотипом

CD 10(+) bcl-2(+) CD30(-) CD38(-) (C)S=80 %), постгерминативного происхождения с фенотипом CD10(+) bcl-2 (-) CD30 (-) CD38(-) (OS=58 %), подгруппу с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом CDIO(-) bcl-2(+) CD30(+) CD38(+) (OS=3Q %).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лисуков И. А., Ковынев И. Б, Лосева М. И. Изучение экспрессии дифференцировочных антигенов лимфопоэза на мембране мононуклеаров периферической крови при опухолевой прогрессии лимфосарком // Терапевтический архив. - 1991. - № 7. - Т. 63. - С. 78-80.

2. Лисуков И. А., Ковынев И. Б., Лосева М. И. Экспрессия эритроидных дифференцировочных антигенов на мононуклеарных клетках периферической крови при опухолевой прогрессии неходжкинской злокачественной лим-фомы // Гематология и трансфузиология. - 1991. - № 36(3). - С. 9-10.

3. Лосева М. И., Ковынев И. Б., Ширинский В. С. Количественные и функциональные характеристики Т-лимфоцитов и моноцитов у пациентов лимфосаркомой на различных стадиях опухолевого процесса // Гематология и трансфузиология. - 1993. - № 38(9). - С. 3-5.

4. Зенков А. Н., Черноловская Е. Л., Ковынев И. Б., Лосева М. И. Мониторинг уровня экспрессии гена MDR1 у онкогематологических больных // Проблемы гематологии. - 2002. - № 1. - С. 31

5. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Иммуно-морфологическая диагностика лимфопролиферативного синдрома // Проблемы гематологии. - 2002. - № 1. - С. 40

6. Дьячкова Н. Ю., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Морфологические особенности вторичного миелодиспластического синдрома у больных гемобла-стозами // Тез. докл. междунар. Российско-Норвежской конференции гематологов. - С-Пб, 2003. - С. 68

7. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Лосева М. И. Методология иммуномор-фологического диагноза в онкогематологической и онкологической клинике // Тез. докл. междунар. Российско-Норвежской конференции гематологов. -С-Пб, 2003. - С. 76-77.

8. Зенков А. Н., Скворцова Н. В., Черноловская Е. Л., Ковынев И. Б Определение и сравнение частоты встречаемости повышенного уровня экспрессии генов MDR1 и MRP у больных злокачественными лимфомами // Тез. докл. междунар. Российско-Норвежской конференции гематологов.. - СПб, 2003. - С. 73-74.

9. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Дьячкова Н. Ю, Нечунаева И. Н. Опыт иммуноморфологической диагностики Т-крупноклеточных анапластических лимфом. // Материалы 13 научно-

практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины». - Новосибирск, 2003. - С. 174.

10. Дьячкова Н. Ю., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Морфологические особенности вторичного миелодиспластического синдрома у больных гемобла-стозами в динамике полихимиотерапии.]// Журнал клинической и экспериментальной медицины/ 2004. - № 1-2. - С. 72-78

11. Ковынев И. Б., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Значение иммуномор-фологических маркеров апоптоза при оценке опухолевой прогрессии лим-фобластной неходжкинской лимфомы // Журнал клинической и экспериментальной медицины. - 2004. - № 1-2. - С. 190-195.

12. Ковынев И. Б., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Иммуноморфологиче-ский анализ экспрессии р-53, Ьс1-2 и с-шус опухолевыми клетками больных крупноклеточной неходжкинской злокачественной лимфомой // Тез. докладов научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Ю. Г. Целлариуса «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях»/ Новосибирск, 2004. -С. 103-104.

13. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Лосева М. И. Экспрессия белков-регуляторов апоптоза на клетках различных вариантов неходжкинских злокачественных лимфом // Журнал клинической и экспериментальной медицины. -2004.-№ 1-2.-С. 52-60

14.Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Особенности цитокинового статуса у больных неходжкинскими лимфомами // Журнал клинической и экспериментальной медицины. - 2004. - № 1-2. -С. 62-72.

15.Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б., Агеева Т. А. Основы опухолевой прогрессии гемобластозов // Бюл. СО РАМН - 2004. - № 2. -С.73-76

16.Ковынев И. Б., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Интенсивность накопления онкопротеинов Ьс1-2 и р-53 как фактор прогноза при онкогематологиче-ских заболеваниях. // Актуальные вопросы современной медицины: тезисы докладов XIV научно-практической конференции врачей. - Новосибирск, 2004. - С. 87-88.

17. Дьячкова Н. Ю., Лосева М. И., Ковынев И. Б., Поспелова Т. И. Морфологические и иммуноморфологические маркеры апоптоза у больных различными вариантами миелодиспластического синдрома. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004. - С. 80.

18. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Методология иммуноморфологических исследований в онкогематологической практике. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004. - С. 81.

19. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Клинико-иммуноморфологические особенности системных злокачественных гистио-

цитозов взрослых. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004. - С. 82.

20. Лямкина А. С., Поспелова Т. И., Ковынев И. Б., Лосева М. И. Анемический синдром у больных лимфопролиферативными заболеваниями и методы его коррекции. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004. - С. 83.

21. Нечунаева И. Н., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Новые возможности терапии неходжкинских лимфом. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004. - С. 83

22. Скворцова Н. В , Поспелова Т. И., Зенков А. Н., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Интенсивность накопления онкопротеинов bcl-2 и р53 как фактор прогноза при онкогематологических заболеваниях. // Материалы 14 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы медицины». - Новосибирск, 2004 - С 87.

23. Лямкина А. С., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Анемический синдром у больных лимфопролиферативными заболеваниями: патогенез и новые возможности коррекции. // Журнал экспериментальной и клинической медицины. - Новосибирск, 2004. - № 1-2. - С. 171-176

24 Поспелова Т. И., Лямкина А. С., Ковынев И. Б., Лосева М. И. Патогенетический подход к коррекции анемического синдрома у больных неход-жкинскими лимфомами. // Проблемы гематологии и переливания крови. -№ 2. - Москва, 2004. - С. 55

25. Поспелова Т. И., Лямкина А. С., Ковынев И. Б., Лосева М. И. Лечение анемического синдрома у больных лимфопролиферативными заболеваниями и у лиц пожилого возраста препаратом «Эпокрин» // Терра Медика Нова. -Санкт-Петербург, 2005. - № 1. - С. 55-57

26 Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Зенков А. Н., Ковынев И. Б. Множественная лекарственная устойчивость и чувствительность клеток к противоопухолевым препаратам у больных гемобластозами. // Фундаментальные науки - медицине: материалы науч. практ. конф. - Новосибирск, 2005. - С. 75

27. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Лосева М. И., Поспелова Т. И. Особенности иммунофенотипа опухолевых клеток неходжкинских злокачественных лимфом. // Материалы 15 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины». - Новосибирск, 2005. - С. 257.

28. Дьячкова Н. Ю., Лосева М. И., Ковынев И. Б., Воропаева Е. Н. Имму-номорфологические особенности вторичного миелодиспластическокго синдрома у больных гемобластозами в динамике полихимиотерапии.// Материалы 15 научно-практической конференции врачей «Актуальные проблемы современной медицины». - Новосибирск, 2005. - С. 266.

29. Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Клиническое и патогенетическое значение некоторых цитокинов при злокачественных неходжкинских лимфомах // Материалы 15 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины». - Новосибирск, 2005. - С. 266.

30. Ковынев И. Б., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Агеева Т. А. Иммуно-морфологический анализ экспрессии Р-53, ВСЬ-2 и С-МУС опухолевыми клетками больных крупноклеточной неходжкинской злокачественной лим-фомой. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Клинико-морфологические аспекты общепатологических процессов при социально-значимых заболеваниях». - Москва, 2005. - С. 103.

31. Ковынев И. Б., Лосева М. И., Поспелова Т. И., Дьячкова Н. Ю. Исследование маркеров апоптоза на опухолевых клетках неходжкинских злокачественных лимфом. // Материалы конференции «Медицина и образование в XXI веке». - Новосибирск, 2005. - С. 166.

32. Лямкина А. С., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Терапия анемического синдрома у больных гемобластозами и лиц пожилого возраста препаратом рекомбинантного человеческого эритропоэтина. // Материалы конференции «Медицина и образование в XXI веке». - Новосибирск, 2005. -С. 223.

33. Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Концентрация про- и противовоспалительных цитокинов как возможный фактор прогноза у больных гемобластозами. // Материалы конференции «Медицина и образование в XXI веке». - Новосибирск, 2005. - С.345.

34. Ковынев И. Б., Агеева Т. А., Лосева М. И., Поспелова Т. И. Особенности иммунофенотипа опухолевых клеток неходжкинских злокачественных лимфом.//Материалы 16 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 2005, С. 261-262.

35. Дьячкова Н. Ю., Лосева М. И., Ковынев И. Б., Воропаева Е. Н., Волко-высская В. Б. Иммуноморфологические особенности вторичного миелодис-пластического синдрома у больных гемобластозами в динамике полихимиотерапии. // Материалы 16 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 2005, С. 261-262.

36. Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Клиническое и патогенетическое значение некоторых цитокинов при злокачественных неходжкинских лимфомах. // Материалы 16 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 2005 -С. 266-267.

37. Воропаева Е. Н., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Влияние экспрессии р-53 и ВСЪ-2 на клиническое течение лимфом и эффективности терапии I линии. // Материалы 16 научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 2005 - С.268-269.

38. Лямкина А. С., Поспелова Т. И., Ковынев И. Б., Лосева М. И., Воропаева Е. Н Анемия у больных лимфомами: механизмы развития и возможности коррекции.//Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2006.-С. 120-121

39. Нечунаева И. Н., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Ритук-симаб в терапии В-крупноклеточных неходжкинских лимфом. // Сборник материалов конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 142-143

40. Ковьшев И. Б., Агеева Т. А., Поспелова Т. И., Лосева М. И. Иммуно-морфологическая характеристика Т-мелкоклеточных вариантов неходжкин-ских злокачественных лимфом. // Сборник тезисов и докладов «Первый съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока». - Новосибирск, 2006. - С. 344-345.

41. Скворцова Н. В., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Ковынев И. Б. Цито-киновый статус у больных лимфомами в динамике полихимиотерапии. // Сборник тезисов и докладов «Первый съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока». - Новосибирск, 2006. - С. 668-670.

42. Скворцова Н. В., Поспелова Т. Т., Лосева М. И., Ковынев И. Б Влияние сывороточного уровня цитокинов на экспрессию регуляторных молекул у больных неходжкинскими злокачественными лимфомами. // Сборник тезисов и докладов «Первый съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока». -Новосибирск, 2006. - С. 666-668.

43. Ковынев И. Б., Поспелова Т. И., Лосева М. И., Агеева Т. А. Молеку-лярно-биологические маркеры опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки биотехнологии и медицине». - Новосибирск, 2006. - С.61.

44. Ковынев И. Б., Лосева М. И., Поспелова Т. И. Особенности иммуно-морфологической диагностики лимфобластных неходжкинских лимфом // Вест. НГУ. - 2006. - том 4, вып.З. - С. 15-22.

45. Ковынев И. Б., Лосева М. И., Поспелова Т. И. Особенности частоты и структуры неходжкинских злокачественных лимфом в Новосибирске, НСО и городах Сибирского федерального округа // Бюллетень СО РАМН. - 2006. -№4(122).-С. 175-181.

46. Ковынев И. Б., Лосева М. И., Поспелова Т. И Иммуноморфо-логические варианты лимфобластных неходжкинских лимфом у взрослых и детей // Вест, гемат. - 2006. - Т. 2 - № 3. - С. 16-21.

Соискатель:

И Б. Ковынев

Список сокращений

ГГЦ - Городской гематологический центр г. Новосибирска

НХЗЛ - неходжкинские злокачественные лимфомы

REAL - пересмотренная европейско-американская классификация лимфом

МЛУ (MDR) - множественная лекарственная резистентность

CD - кластер дифференцировки (международная классификация дифферен-

цировочных антигенов гемопоэтических клеток)

МПИ (IPI) - международный прогностический индекс

OS - общая выживаемость по Каплан-Мейер

МКА - моноклональные антитела

Подписано в печать 05.02.07 г. Формат 60 х 84/16 Усл. печ. л. 2,0. Тираж 150 экз. Изд. № 11п/07. Заказ № 39п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4 Тел.: (383) 225-24-29. E-mail: sibmedisdat@rambler.ru

Отпечатано в типографии НГМУ г. Новосибирск, ул. Залесского, 4. Тел.: (383) 225-24-29

Актуальность проблемы. Неходжкинские злокачественные лимфомы (НХЗЛ) охватывают широкий спектр лимфоидных неоплазий, характеризующихся опухолевой пролиферацией лимфоидных клеток. Отмечено, что заболеваемость этой патологией имеет неуклонную тенденцию к росту во всем мире. Так, за периоды с 1975 по 2003 годы в США она возросла на 76% [148], что согласуется с соответствующими показателями по нашему региону. [31] По данным статистики, более полумиллиона американцев страдают лимфомами и ежегодно 20 тысяч из них умирают от НХЗЛ [148].

В последние десятилетия были приняты несколько классификаций НХЗЛ - Рабочая формулировка, ИЕАЬ-номенклатура и последняя -Классификация лимфоидных неоплазий по ВОЗ [33,66,70,103, 105,145,239,558].

Тем не менее, клинико-морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика основных вариантов неходжкинских лимфом далека от совершенства. Большинство клиницистов-гематологов в мире разделяют мнение патриарха отечественной медицины академика А.И.Воробьева о том, что прогрессивно возрастающее от одной западной классификационной системы к другой число вариантов НХЗЛ, включающих описание многочисленных клинических, морфологических и молекулярно-биологических деталей, мало отвечает потребностям онкогематологической практики по радикальному излечению этих неоплазий [8,9].

Патогенетические механизмы развития новообразований из лимфоидных клеток в динамике взаимодействия опухолевых клонов с онкосупрессорными факторами, в том числе - полихимиотерапией, объединенные в классических работах Ь. РиШз (1947) термином «опухолевая прогрессия» [273,274], сегодня являются объектом интенсивных научных исследований.

Ведущие гематологи и гематопатологи мира 8Л.Ногпт§, B.Coiffler, М.А.ЭЫрр, J.O.Armitage и другие сходятся во мнении, что главной целью всех классификационных систем и терапевтических программ для злокачественных лимфом должен стать гарантированный контроль над опухолевой прогрессией этой патологии [487].

Несмотря на обилие клинических, гистологических, иммунофено-типических и генетических признаков, описывающих каждый вариант НХЗЛ, по-прежнему не решена главная задача диагностики лимфом -прогнозирование опухолевой прогрессии заболевания [458,466,519,568].

Вместе с тем, клиническая практика ведения пациентов требует уже в дебюте заболевания выделения внутри основных клинико-морфологических групп НХЗЛ больных с неблагоприятным прогнозом опухоли. С появлением новых высокотехнологичных программ агрессивной циторедуктивной терапии актуальность проблемы возросла. Ежедневно перед клиницистом встает выбор: использовать наиболее эффективные схемы химиотерапии, но при этом подвергать больного максимально оправданному риску осложнений миелоаблативных программ.

Существующие прогностические модели - международные прогностические индексы 1Р1, РЫР1, НЬ [268,334,375,401] и другие - не позволяют в полной мере решать поставленные вопросы, поскольку опираются исключительно на клинико-морфологические критерии.

Вместе с тем, данные литературы и наш собственный опыт свидетельствует, что, несмотря на точное распознавание иммунологического варианта гемобластоза, остается актуальной задача поиска маркеров опухолевой прогрессии заболевания. В одних и тех же подгруппах неходжкинских лимфом (НХЗЛ) чувствительность к лечению и прогноз заболевания претерпевают значительные колебания. Направление поиска молекулярно-биологических критериев прогностической оценки течения опухолевой прогрессии и лекарственной устойчивости НХЗЛ в последние годы тесно связано с учением об апоптозе [43,52,75,84].

Большинство работ по этой проблеме свидетельствуют, что скорость прогрессии опухолевых заболеваний зависит зачастую не только и не столько от митотической активности субстрата, сколько от способности опухолевых клеток ускользать от запрограммированной клеточной смерти. Возможности опухолевого роста во многом связаны с изменениями активностей цитоплазматических, внутриклеточных и внутриядерных белков-регуляторов апоптоза [118,183,214,292,359,484].

По мнению Е.Могга, проблема изучения экспрессии этих протеинов тесно связана с важнейшей клинической задачей исследования механизмов лекарственной резистентности лимфоидных неоплазий с целью разработки лечебных программ ее преодоления [407].

Работы I.S.Lossos [242], K.Blyth [501], D.Yu и D.Cozma [279], N.Dube [286] и других авторов не оставляют сомнений, что прогнозирование опухолевой прогрессии и изучение чувствительности опухолевых клонов к цитостатическому воздействию во многом зависит от глубинных сдвигов в регуляции клеточного цикла и апоптоза, происходящих в опухолевой клетке.

M.Jerkeman [123], E.Shiozawa [219], L.Rui и C.C.Goodnow [500] убедительно показали, что ключевую роль здесь играет функциональная активность продуктов генов-регуляторов этих процессов - р-53, bcl-2, с-шус, мембранного белка FAS (APO-1/CD95), ядерного протеина пролиферативной активности Ki-67 и собственно продукта гена MDR1 - р-гликопротеина -АТФ-зависимого помпового белка, определяющего лекарственную резистентность. На сегодняшний день в литературе имеются лишь разрозненные сведения об исследовании влияния этих протеинов на прогрессию опухолей вообще и лимфопролиферативных заболеваний в частности.

Одним из основных постулатов современного учения о лимфомо-генезе и онкогенезе в целом является признание роли апоптоза как молекулярно-биологического посредника реализации цитотоксических лечебных воздействий на опухолевую клетку [106,107,130,147,241,318,392]. Из этого следует вывод, что все факторы молекулярно-биологической природы, регулирующие чувствительность опухолевого клона к апоптозу, должны оказывать влияние на эффективность противоопухолевой терапии. Известно также, что степень блокады механизмов программированной клеточной гибели имеет прямое отношение к первичной лекарственной резистентности опухоли и выживаемости пациентов [150, 190].

Были получены неоспоримые данные о том, что апоптоз является звеном между генетикой рака и химиотерапией. R.W.Johnstone и соавторы в 2002 году постулировали, что именно дефекты механизмов апоптоза являются основной причиной, по которой химиотерапия у части больных неходжкинской лимфомой терпит неудачу [346].

В литературе недостаточно работ по комплексной оценке влияния экспрессии молекулярно-биологических маркеров блока апоптоза на опухолевую прогрессию HX3JI. Большинство исследований посвящено отдельным вариантам лимфом или экспрессии отдельных протеинов без обобщающего анализа проблемы в целом.

Нами не встречено указаний на наличие прогностических систем неходжкинских злокачественных лимфом, включавших иммуноморфологические показатели экспрессии протеинов-регуляторов апоптоза и множественной лекарственной устойчивости.

Тем не менее, большинство литературных источников сходятся во мнении о возможности получения новых иммунофенотипических маркеров прогнозирования опухолевой прогрессии НХЗЛ на основе исследования показателей активности универсального механизма патогенеза этой прогрессии - апоптоза [130,150,137,175,241,286,318,392,437]. Критерии прогностической оценки, разработанные на их основе, по-видимому, также должны обладать универсальностью и независимостью от варианта лимфомы, степени зрелости опухолевого субстрата и клинических особенностей самой лимфомы.

Решение проблемы выделения универсальных молекулярно-биологических маркеров прогностической оценки опухолевой прогрессии и последующей эффективности химиотерапии позволили бы существенно улучшить результативность современных протоколов программной химиотерапии НХЗЛ.

Вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: дать клиническую и молекулярно-биологическую характеристику основных вариантов неходжкинских злокачественных лимфом, определить значение гиперэкспрессии белков-регуляторов апоптоза для опухолевой прогрессии и разработать модель ее прогнозирования. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить частоту и структуру неходжкинских злокачественных лимфом в г.Новосибирске и Новосибирской области.

2. Выявить иммунофенотипические особенности отдельных вариантов лимфом, их влияние на прогноз заболевания.

3. Изучить экспрессию белков-регуляторов апоптоза в опухолевом субстрате неходжкинских лимфом.

4. Оценить влияние сочетанной гиперэкспрессии Ьс1-2, тр-53, с-тус, СИ95, р^усоргФет на клиническое течение, эффективность терапии, выживаемость и прогноз НХЗЛ.

5. Разработать новую прогностическую модель опухолевой прогрессии неходжкинских злокачественных лимфом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показана роль сочетанной гиперэкспрессии комплекса молекулярно-биологических факторов (антиапоптотического протеина Ьс1-2, мутантной формы р53, онкопротеина с-шус, аномального С095 и продукта гена множественной лекарственной устойчивости ШЖ1 - р-гликопротеина) как универсального патогенетического механизма опухолевой прогрессии и лекарственной резистентности неходжкинских злокачественных лимфом, приводящего к торможению программированной клеточной гибели апоптоза) опухолевых элементов и определяющего прогноз заболевания вне зависимости от морфологического варианта лимфомы, стадии процесса и особенностей клинической картины дебюта заболевания.

Выявлено, что увеличение в опухолевом субстрате неходжкинской злокачественной лимфомы неопластических клеток, экспрессирующих Ьс1-2-протеин > 25,2%, р53 - > 24,6%, с-шус - > 17,8%, р-гликопротеина > 21,3% и СБ95 - > 9,0%, непосредственно предшествует клиническим проявлениям опухолевой профессии лимфомы, а указанные протеины являются маркерами-предикторами неблагоприятного прогноза. Для рецидива заболевания и трансформации варианта неоплазии характерно достоверное в сравнении с первичной опухолью возрастание числа лимфомных клеток, экспрессирующих маркеры блока апоптоза и множественной лекарственной резистентности (МОЯ) (Ьс1-2, шр53, с-тус, СЭ95 - в 2,5 - 3 раза, р-гликопротеин-позитивных клеток - в 4,2 раза).

Впервые отмечено, что общая выживаемость (ОБ) больных неходжкинскими злокачественными лимфомами вне зависимости от их иммуноморфологического варианта и других характеристик коррелирует с количеством опухолевых клеток, экспрессирующих Ьс1-2, тр53, с-шус, СБ95 и р-гликопротеин. Сочетанная гиперэкспрессией лимфомой этих маркеров способствует снижению уровня 08 в 4,5 раза в сравнении со случаями, при которых экспрессия данных протеинов отсутствует.

Впервые установлено, что использование показателей международного прогностического индекса (МПИ) в комплексе с иммуноцитохимическими маркерами блока апоптоза и множественной лекарственной устойчивости (Ьс1-2-протеин > 25,2%, мутантный р53 > 24,6%, онкопротеин с-шус > 17,8%, р-^1усорго1ет > 21,3% и СЭ95 > 9,0%) позволяет повысить точность стратификации вероятности неблагоприятного прогноза НХЗЛ до 98,5% , а благоприятного до 96,7%.

Анализ иммунофенотипической характеристики неходжкинских лимфом позволил выявить признаки клональной гетерогенности высокоагрессивных лимфобластных НХЗЛ, что проявилось в коэкспрессии миелоидных и лимфоидных антигенов в 72,2% случаев; а также в неоднородности иммунофенотипического профиля диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Дополнительные иммуноцитохимические критерии позволили с высокой достоверностью выделять подварианты диффузной В-крупноклеточной НХЗЛ, соответствующие трем типам клоногенных предшественников: подгруппа герминативного центра, постгерминативного происхождения и подгруппа с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой, отличающихся по общей 3 летней выживаемости пациентов (80%, 58% и 30% соответственно) и чувствительности опухоли к химиотерапии.

Впервые на основании количественного анализа экспрессии иммунофенотипических признаков предложены дополнительные иммуноцитохимические критерии дифференциальной диагностики для наиболее распространенных вариантов мелкоклеточных лимфом, схожих по морфологическим и клиническим характеристикам: для фолликулярной -количество СБЮ позитивных клеток > 30,2±4,1% и Ьс1-2(+) > 22,5±3,9%); для лимфоплазмоцитарной - число С019(+)клеток >15,1 ±5,6% , СЭ20(+) >8,2±2,7%, ^М >7±1,3%.

Впервые изучена частота и структура неходжкинских злокачественных лимфом среди пациентов-жителей г.Новосибирска и Новосибирской области (НСО). Выявлено преобладание вариантов с индолентным характером течения, менее часто встречаются высокоагрессивные и агрессивные лимфоидные опухоли. В структуре НХЗЛ, в соответствии с их иммуноморфологическим вариантом, выявлена высокая частота лимфобластных и анапластических крупноклеточных вариантов лимфом, а среди мелкоклеточных - доминирование центрофолликулярных и маргинально-клеточных типов неоплазий, а также лимфом зоны мантии.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты исследования дают возможность врачу-гематологу, используя комплекс иммунофенотипических маркеров-предикторов совместно с классическими критериями международного прогностического индекса (МПИ), уже на этапе первичной диагностики надежно стратификацировать группу риска неблагоприятного течения неходжкинской лимфомы, прогнозировать ее резистентность к химиотерапевтической программной терапии и разрабатывать лечебную тактику, адекватную молекулярно-биологическим свойствам опухоли.

Комбированная гиперэкспрессия маркеров блока апоптоза указывает на неблагоприятный прогноз заболевания и необходимость назначения более агрессивных программ терапии.

Использование комплекса иммуноморфологических показателей в динамике проводимого лечения позволяет выявлять неблагоприятное течение опухоли, обнаруживать формирование химиорезистентных клонов лимфомы и прогнозировать вероятность будущего рецидива лимфомы или трансформации ее варианта в более агрессивный.

Результаты данного исследования могут быть использованы в практике работы иммуноморфологических лабораторий, поскольку предоставляют новые возможности для решения задач прогностический оценки прогрессии лимфом и дифференциальной диагностики фолликулярной и лимфо-плазмоцитарной лимфомы с другими вариантами В-НХЗЛ, имеющими схожие морфологические характеристики, а также для выделения трех иммуноморфологических подвариантов диффузной В-крупноклеточной лимфомы, различающихся по чувствительности к стандартным программам лечения и по общей выживаемости (подгруппу герминативного центра, постгерминативного происхождения и подгруппу с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой).

Полученные сведения о частоте и структуре неходжкинских злокачественных лимфом на территории г.Новосибирска и Новосибирской области имеют практическое значение для решения вопросов бюджетного финансирования лечебно-диагностической помощи этим пациентам и определения общей их потребности в дорогостоящих противоопухолевых препаратах при формировании перспективных планов льготных поставок медикаментов для онкогематологической группы больных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Клиническая прогрессия НХЗЛ и ее устойчивость к химиотерапии в 98% случаев связана с трансформацией иммунологического фенотипа опухоли в направлении гиперэкспрессии белков, блокирующих апоптоз (тр53, Ьс1-2, с-тус и СБ95) и маркера множественной лекарственной резистентности - р-гликопротеина.

2. Для белков-регуляторов апоптоза - р53, Ьс1-2 и с-тус - характерны сильные положительные корреляционные взаимосвязи с продукцией протеина множественной лекарственной устойчивости ШЖ1 (р^усорпЛет) и с показателями международного прогностического индекса НХЗЛ (коэффициент Пирсона равен (+)0,75-(+)0,9); сочетанная гиперэкспрессия маркеров блока апоптоза непосредственно предшествует клинической манифестации нового этапа опухолевой прогрессии неходжкинских лимфом вне зависимости от их варианта, клинической симптоматики и стадии процесса.

3. Использование комбинации иммунофенотипических характеристик лимфомы, отражающих уровень клеток, экспрессирующих Ьс1-2-протеин (>25,2%), мутантный р53 (>24,6%), онкопротеин с-тус (>17,8%), р-glycoprotein (>21,3%) и СЭ95 (>9,0%), в качестве универсальных маркеров-предикторов опухолевой прогрессии в сочетании с критериями международного прогностического индекса (МПИ) позволяет стратифицировать группу с низкой выживаемостью (логарифмический ранговый критерий р=0,000005), повышая точность прогностической оценки до 98,5% .

4. В структуре неходжкинских злокачественных лимфом (НХЗЛ) у пациентов - жителей г.Новосибирска и Новосибирской области - преобладают НХЗЛ с индолентным (44,2%) и высокоагрессивным (32,8%) характером клинического течения заболевания, тогда как частота агрессивных лимфом составляет 23%; линейная принадлежность лимфоидных неоплазий характеризуется преобладанием В-клеточных типов над Т-клеточными (75,3% против 24,7%); по частоте отдельных вариантов выявлено высокое число крупноклеточных анапластических НХЗЛ (как среди В-клеточных, так и среди Т-клеточных), а также фолликулярноклеточных, маргиналь-ноклеточных вариантов и лимфом зоны мантии.

5. Дополнительными критериями гетерогенности иммунологического фенотипа диффузной В-крупноклеточной лимфомы являются маркеры СОЮ, Ьс1-2, СЭЗО и СЭ38, позволяющие верифицировать подварианты НХЗЛ в соответствии с тремя типами неопухолевых аналогов: лимфому из клеток герминативного центра с фенотипом СЭ10(+) Ьс1-2(+) СБЗО(-) СЭ38(-), опухоль постгерминативного происхождения с фенотипом СЭ10(+) Ьс1-2(-) СЭЗО(-) СЭ38(-) и подвариант с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом СЭЮ(-) Ьс1-2 (+) СЭ30(+) СЭ38(+); эти типы В-крупноклеточной неходжкинской лимфомы значительно различаются по показателям общей выживаемости пациентов, которая равна 80%, 58% и 30% соответственно.

ВЫВОДЫ

1. В группе больных неходжкинскими злокачественными лимфомами (НХЗЛ) - жителей г.Новосибирска и Новосибирской области (НСО) -преобладают пациенты с индолентным характером течения (44,2%), на втором месте регистрируются высокоагрессивные НХЗЛ (32,8%), третье - занимают агрессивные лимфоидные опухоли (23%).

2. В структуре лимфом отмечается преобладание В-клеточных НХЗЛ (75,3%) над Т-клеточными (24,7%), выявлена высокая частота лимфобластных (33%) и анапластических вариантов лимфом (39,8% всех крупноклеточных); среди мелкоклеточных доминируют НХЗЛ центрофолликулярной зоны (32,4%), маргинальноклеточные (16,2%) и лимфомы зоны мантии (12,9%).

3. Комплекс дополнительных иммунофенотипических маркеров: СЭ10, Ьс1-2, СЭЗО и СЭ38 позволяет с высокой степенью достоверности (р<0,05) выделять три подварианта диффузной В-крупноклеточной лимфомы в соответствии с типами клоногенных предшественников, различающихся по общей выживаемости: подгруппу герминативного центра с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2(+) СОЗО(-) СЭ38(-) (общая выживаемость - 80%), постгерминативного происхождения с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2(-) СОЗО(-) СЭ38(-) (общая выживаемость - 58%), подгруппа с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом CDIO(-) bcl-2(+) CD30(+)CD38(+) (общая выживаемость - 30%).

4. Опухолевый субстрат лимфобластных неходжкинских лимфом отличается иммунофенотипической неоднородностью, что проявляется в коэкспрессии миелоидных и лимфоидных антигенов в 72,2% случаев заболевания и отражает клональную гетерогенность опухоли.

5. Дополнительными иммуноморфологическими критериями, позволяющими отвергнуть диагноз фолликулярной лимфомы являются: количество CD10 позитивных клеток менее 30,2±4,1% и bcl-2(+) менее 22,5±3,9% (р<0,05). Число С019(+)клеток < 15,1±5,6%, CD20(+) < 8,2±2,7%, IgM < 7±1,3%, позволяет исключить диагноз лимфоплазмацитарной НХЗЛ (р<0,05).

6. Общая выживаемость больных НХЗЛ коррелирует с количеством опухолевых клеток, экспрессирующих bcl-2, mp53, c-myc, CD95 и р-гликопротеин: в группе пациентов с сочетанной гиперэкспрессией этих маркеров уровень общей выживаемости в 4,5 раза ниже, чем в случаях, при которых эти протеины отсутствуют.

7. Увеличение в субстрате неходжкинской злокачественной лимфомы неопластических клеток, экспрессирующих bcl-2-протеин > 25,2%, р53 - > 24,6%, с-шус - > 17,8%, р-гликопротеин > 21,3% и CD95 - > 9,0%, непосредственно предшествует клиническим проявлениям опухолевой прогрессии лимфомы.

8. При рецидиве и трансформации НХЗЛ возрастает число опухолевых клеток, экспрессирующих маркеры блока апоптоза и множественной лекарственной резистентности: экспрессия протеина bcl-2 у больных с лимфомами de novo составляет 23,0±2,5%, в группе рецидива - 67,3±2,7% (р<0,05), тр53 - 24,3±2,2% против 60,8±2,3% (р<0,05), с-шус(+) - 6,2±1,3% и 29,9±2,5% (р<0,05), CD95 (+) - 10,7±1,8% и 25,7±2,5% (р<0,05). Количество р-гликопротеин-позитивных клеток в рецидивирующей опухоли увеличивается, в среднем, в 4,2 раза (с 19,3±2,2% у первичных больных до 75,9±2,3%), р<0,001.

9. Использование сочетания показателей международного прогностического индекса (МПИ) с комбинацией иммуноморфологических маркеров блока апоптоза и множественной лекарственной устойчивости (Ьс1-2 -протеин > 25,2%, мутантный р53 > 24,6%, онкопротеин с-шус >17,8%, р-§1усорго1ет > 21,3% и С095 > 9,0%) позволяет повысить точность стратификации вероятности неблагоприятного прогноза НХЗЛ до 98,5% , благоприятного - до 96,7%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве иммунофенотипических маркеров-предикторов неблагоприятного прогноза НХЗЛ целесообразно использовать увеличение в субстрате опухоли неопластических клеток, экспрессирующих Ьс1-2~протеин > 25,2%, шр53 - > 24,6%, с-шус - > 17,8%, р-гликопротеина > 21,3% и СБ95 - > 9,0%, для чего рекомендуется ввести моноклональные антитела против этих белков в стандартную диагностическую панель для неходжкинских злокачественных лимфом.

2. В целях прогнозирования химиорезистентности лимфом на новом этапе опухолевой прогрессии (при рецидиве НХЗЛ или трансформации ее варианта) для определения терапевтической тактики рекомендовано учитывать уровень экспрессии опухолевым субстратом белков-регуляторов апоптоза (Ьс1-2, шр53, с-тус, и СЭ95), и множественной лекарственной устойчивости (р-гликопротеина), их комбированная гиперэкспрессия указывает на неблагоприятный прогноз заболевания и необходимость использования более агрессивных программ лечения.

3. В качестве универсальной модели для прогнозирования опухолевой прогрессии НХЗЛ и повышения точности стратификации групп риска неблагоприятного течения заболевания (до 98,5%), рекомендуется использовать новую модификацию международного прогностического индекса в сочетании с комбинацией иммуно-цитохимических маркеров блока апоптоза

Ьс1-2-протеин >25,2%, шр53 - >24,6%, с-шус - >17,8%, р-гликопротеина ->21,3% и СБ95 - >9,0%).

4. При планировании бюджетного финансирования лечебно-диагностической помощи, формировании заявки на приобретение цитостатических средств для онкогематологических больных г.Новосибирска и НСО необходимо учитывать следующие особенности: в структуре гемобластозов более половины случаев неоплазий приходится на неходжкинские злокачественные лимфомы (НХЗЛ), подавляющее большинство случаев (75,3%) составляют В-клеточные НХЗЛ, 44,2% всех больных представлено лимфомами с индолентным, 32,8% высокоагрессивным, 23% - агрессивным характером течения; в сравнении с данными литературы отмечается более высокая частота лимфобластных неоплазий и крупноклеточных НХЗЛ анапластического типа, а среди мелкоклеточных - лимфом центрофолликулярной, маргинальноклеточной и мантийноклеточной зон; каждому из этих вариантов международным стандартом определена индивидуальная программа терапии со своим набором циторедуктивных средств и терапии сопровождения.

5. Дополнительными иммуноморфологическими критериями диагностики являются: для фолликулярной лимфомы - количество СБЮ позитивных клеток > 30,2%, Ьс1-2(+) > 22,5%; лимфоплазмоцитарной лимфомы - число С019(+)клеток >15% , СР20(+) > 8,2%, ^М > 7%, что позволяет проводить более надежную (р<0,005) дифференциальную диагностику их с другими вариантами В-НХЗЛ, имеющими схожие морфологические и клинические черты.

6. На этапе первичной диагностики диффузной В-крупноклеточной лимфомы и определения лечебной тактики рекомендуется использовать комплекс дополнительных маркеров (СБЮ, Ьс1-2, СЭЗО и СБ38) для выделения трех иммуноморфологических подвариантов опухоли, различающихся по чувствительности к стандартным программам лечения и, как следствие, по общей выживаемости (ОБ): подгруппу герминативного центра с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2(+) СОЗО(-) С038(-) (08=80%), постгерминативного происхождения с фенотипом СОЮ(+) Ьс1-2 (-) СБЗО (-) С038(-) (08=58%), подгруппу с лимфоплазмоцитарной дифференцировкой и фенотипом СОЮ(-) Ьс1-2(+) СОЗО(+) СБ38(+) (08=30%).