Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинико-иммунологические особенности бруцеллеза

На правахрукописи

ПАВЛОВА Ольга Михайловна

Клинико - иммунологические особенности бруцеллеза

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону - 2004 год

Работа выполнена в Ставропольской государственной медицинской академии

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент

Попов Павел Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Сологуб Тамара Васильевна

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Зотова Валентина Владимировна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

медицинский университет им. И.П. Павлова

Защита состоится 2004г. в час, на заседании

диссертационного совета Д 208.082.02 при Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-на Дону, пер. Нахичеванский 29) .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «Л^ » _:2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н.

Кузина Т.Н.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДК - диагностический коэффициент

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЕК - естественные киллеры

ИЛ - интерлейкин

НСТ - нитросиний тетразолий

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

ФГА - фитогемагглютинин

ФНО - фактор некроза опухоли

CD - Cluster of Differentiation (кластер дифференцировки) М - среднее значение m - стандартная ошибка среднего

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост заболеваемости, хроническое рецидивирующее течение, недостаточная эффективность существующих методов лечения и профилактики ставит бруцеллез в ряд наиболее актуальных проблем инфекционной патологии человека. Отмечено, что по своему распространению и социально-экономической значимости это заболевание занимает одно из первых мест среди зоонозов [Белозеров Е.С. 1985, Лямкин Г.И., с соавт., 1995, Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. 1999, Лобзин Ю.В., с соавт., 2000, Санникова И.В., с соавт., 2002, Boschiroli M.L., et al 2001, Godfroid J. 2002, Sauret J.M., Vilissova N. 2002].

Многообразие клинических проявлений, стертое клиническое течение и недостаточная эффективность существующих методов лечения бруцеллеза ведет к хронизации заболевания, с последующей стойкой инвалидизацией больных. В то же время, до настоящего момента не существует методов прогнозирования перехода острой формы бруцеллеза в хроническую, что обусловливает актуальность исследований, проводимых в этом направлении [Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. 1999, Лобзин Ю.В., с соавт., 2000].

Особенности жизненного цикла бруцелл и инфекционно-аллерги-ческий характер бруцеллеза позволяют констатировать ведущую роль нарушений иммунитета в патогенезе этого заболевания. В то же время, многие аспекты иммунологии бруцеллеза, в частности особенности межклеточных взаимоотношений в процессе формирования противоинфекционного иммунитета при этой патологии изучены недостаточно, что не позволяет в полной мере использовать оценку иммунного статуса больных бруцеллезом для прогнозирования хронизации этой инфекции [Иванов К.С., с соавт., 1997, Саф-ронова В.М., с соавт., 1997, Цирельсон Л.Е., с соавт., 1997, Курманова Г.М., с соавт., 2002, Golding В., et al 2001, Moreno-Lafont M.C., et al 2002].

Открытие биологически активных веществ - цитокинов, регулирующих пролиферацию и уровень функциональной активности клеток, как в норме, так и при патологии, позволяет с новых позиций оценить механизм формирования воспалительных реакций, аллергических и иммунных состояний и разработать новые методы прогнозирования характера инфекционного заболевания. Между тем, в доступной литературе роль нарушений обмена цитокинов при бруцеллезе не получила достаточного освещения, что и определяет актуальность исследований, проводимых в этом направлении.

Цель исследования: на основании клинико-иммунологического обследования изучить роль иммунной системы в патогенезе бруцеллеза и разработать объективные критерии, позволяющие прогнозировать вероятность его хронизации.

Задачи исследования

1. Изучить современные клинические особенности бруцеллеза.

2. Определить субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови,' уровень иммуноглобулинов сыворотки крови и

активность нейтрофилов по данным НСТ-теста у больных острым и хроническим бруцеллезом.

3. Изучить in vitro спонтанную и стимулированную продукцию ИЛ1Р, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНО а в смешанной культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больных бруцеллезом.

4. Оценить диагностическую значимость отдельных клинических признаков и иммунологических показателей в прогнозировании хронизации бруцеллеза.

Научная новизна. Проведена комплексная, сравнительная оценка суб-популяционного состава иммунокомпетентных клеток в периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом.

Впервые выполнено сравнительное исследование in vitro спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом.

На основании анализа диагностической значимости клинических симптомов, серологических и иммунологических данных разработана схема дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза. Предложены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать возможность хронизации инфекции.

Практическая значимость. Полученные результаты комплексного иммунологического обследования больных бруцеллезом позволяют рекомендовать его проведение в целях прогнозирования хронизации заболевания и могут служить основанием для проведения специфической иммунокорриги-рующей терапии.

Предложенная диагностическая таблица позволяет упростить дифференциальную диагностику острого и хронического бруцеллеза при отсутствии достоверных данных о продолжительности течения заболевания.

Внедрение результатов в практику. Полученные результаты внедрены в работу Краевого бруцеллезного центра г. Ставрополя и ЛПУ Ставропольского края. Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях по инфекционным болезням со студентами и слушателями факультета последипломного образования Ставропольской государственной медицинской академии.

Апробация и публикации. Материалы диссертации доложены на XI итоговой конференции молодых ученых и студентов СГМА (г. Ставрополь, 2003), VI съезде инфекционистов России (г. С.-Петербург, 2003), краевых конференциях врачей инфекционистов (г. Ставрополь, 2002, 2003), V общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (г. Кисловодск, 2004) и на заседаниях кафедры инфекционных болезней с эпидемиологией СГМА (г. Ставрополь, 2003, 2004). По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Основные положения, выносимые назащиту.

1. Характерная динамика изменений иммунологических показателей в

процессе хронизации бруцеллеза позволяет рекомендовать комплексное иммунологическое обследование для его прогнозирования.

2. Особенности иммунологических изменений при бруцеллезе патогенетически обосновывают назначение иммунотерапии у больных бруцеллезом с учетом характера и длительности течения заболевания.

3. Предложенная диагностическая таблица, учитывающая информативность отдельных клинических проявлений и иммунологических показателей, позволяет увеличить эффективность дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза.

Структура и объем работы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 13 рисунками. В библиографический указатель включено 179 источника литературы, из которых 68 - отечественных и 111 -зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе диссертационного исследования было выполнено клинико-лабораторное обследование 130 больных бруцеллезом, находившихся на лечении в Ставропольском бруцеллезном центре с 2002 по 2003 год.

Клиническое обследование больных включало в себя изучение возраста, жалоб, данных эпидемиологического и соматического анамнеза, продолжительности заболевания до обращения к врачу, оценку объективного состояния больных с использованием дополнительных методов исследования (рентгенография, УЗИ, ЭКГ, лабораторное исследование крови и мочи).

Из 130 обследованных больных у 43 был выявлен острый бруцеллез, а у 87 - хронический.

Диагноз подтверждался результатами бактериологического исследования крови, серологических исследований (реакции Райта, Хеддльсона, РПГА), кожно-аллергической пробы Бюрне и ПЦР. ПЦР диагностика осуществлялась с использованием наборов для обнаружения ДНК бруцелл методом ПЦР (ООО «Амплисенс», ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва, Россия).

На втором этапе работы выполнялось иммунологическое обследование больных бруцеллезом, включающее в себя изучение субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови, уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови, оценку активности нейтрофилов и исследование продукции цитокинов в изолированной культуре мононуклеарных клеток. При выполнении иммунологического обследования нами были сформированы две основные группы:

1-я основная группа - 30 больных острым бруцеллезом со среднетяже-лым течением заболевания, продолжительностью болезни до 3-х месяцев, с положительными серологическими реакциями и ПЦР.

2-я основная группа - 30 больных хроническим бруцеллезом с субком-пенсированным течением заболевания, формированием очаговых поражений,

продолжительностью болезни от 6 до 12 месяцев, положительными серологическими реакциями, положительной пробой Бюрне и ПЦР.

В качестве контроля было обследовано 30 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту, полу и соматическому анамнезу с пациентами основных групп.

Объем иммунологических исследований включал:

Подсчет основных популяций иммунокомпетентных клеток в препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимза (лейкоциты, нейтрофилы, моноциты и лимфоциты).

Изучение фенотипа иммунокомпетентных клеток периферической, крови методом непрямой иммунофлюоресценции с применением монокло-нальных антител к поверхностным антигенам лейкоцитов следующей специфичности: CD3 (общие Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цито-токсические лимфоциты/супрессоры), CD 16 (естественные киллеры), CD21 (В-лимфоциты).

1. Определение уровня IgA, M и G в сыворотке крови методом радиальной иммунодифузии по Manchini.

2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов по данным спонтанного и индуцированного НСТ-теста.

3. Исследование спонтанной и стимулированной фитогемаглютини-ном (ФГА) продукции цитокинов изолированными мононуклеарными клетками периферической крови in vitro методом твердофазового иммунофер-ментного анализа включало в себя определение уровня:

• Интерлейкина-1 ¡5 (ИЛр ) и фактора некроза опухоли-i (ФНОа ) - как провоспалительных цитокинов, отражающих функциональную активность мононуклеарных фагоцитов;

• Интерлейкина-2 (ИЛ2) - как провоспалительного цитокина, характеризующего функциональную активность Т-хелперов 1 типа и естественных киллеров (ЕК);

• Интерлейкина-4 (ИЛ4) - как противовоспалительного цитокина, отражающего функцию Т-хелперов 2 типа, являющегося антагонистом ИЛ2 и участвующего в дифференцировке В-лимфоцитов;

• Интерлейкина-6 (ИЛ6) - как цитокина, выполняющего ведущую роль в дифференцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки.

На третьем этапе исследования нами оценивалась диагностическая значимость и информативность отдельных клинических проявлений и иммунологических показателей для прогнозирования хронизации и дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза с использованием статистической обработки данных.

Статистическая обработка результатов проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программ «Primer Biostatistic 4.03. for Windows» и «Microsoft Excel 97 for Windows». Для количественных показателей определяли cpeдниe значения (М), а также стандартную ошибку среднего (m). Для качественных показателей определяли долю признака в группе (Р) и

стандартную ошибку доли (s), а при умножении полученных значений на 100 переводили их в проценты.

Для оценки степени достоверности различий между значениями использовался простой критерий Стьюдента (t). При уровне значимости р<0,05 различия между группами считали достоверными (5 % вероятность ошибки), при р<0,01 степень достоверности отличий оценивалась как высокая (1 % вероятность ошибки), а при р<0,001 степень достоверности между группами расценивалась как крайне высокая (0,1 % вероятность ошибки).

При определении диагностической значимости признаков при сравнении двух патологических состояний А1 и А2 (в нашем случае острого - А1 и хронического - А2 бруцеллеза) определялся диагностический коэффициент (ДК), который представляет из себя логарифм отношения вероятностей симптомов при состояниях А1 и А2, умноженный на 10. В том случае, если диагностический коэффициент больше 1 и имеет знак «+», то наличие рассматриваемого симптома делает более вероятным постановку диагноза А1. В том случае, если диагностический коэффициент меньше 1 и имеет знак «-», наличие рассматриваемого симптома у конкретного больного делает более вероятным постановку диагноза А2. Чем больше значение ДК, тем выше диагностическое значение рассматриваемого признака.

Несмотря на возможность высокого показателя диагностического коэффициента для рассматриваемого признака, частота распространения его в группах может быть небольшой, следствием этого будет снижение его диагностической значимости. Для исключения варианта подобной ошибки определялся критерий информативности Кульбака. К дальнейшему анализу допускали признаки с информативностью не менее 0,5.

После определения диагностической значимости признаков была создана диагностическая таблица и определен диагностический порог для диф-ференцировки острого и хронического бруцеллеза. Под диагностическими порогами, предложенными Wald (1947), подразумевается такое превышение вероятности диагностической гипотезы, которое соответствует постановке правильного диагноза с заранее избранной вероятностью. В нашем случае при вероятности постановки правильного диагноза в 95 % порог суммы диагностических коэффициентов для острого бруцеллеза составлял «+» 13, для хронического «-» 13; при вероятности правильного диагноза 99 % эти значения были соответственно «+» 20 и «-» 20, а при вероятности 99,9 % эти значения были «+» 30 и «-» 30.

После определения диагностических коэффициентов для каждого изучаемого признака их суммировали, пока не достигался один из диагностических порогов. Если был достигнут порог со знаком «+», то на основании использованных признаков следует ставить диагноз А1, в нашем случае «острый бруцеллез». При этом перечисленная комбинация симптомов расценивалась как оптимальная в диагностике этого заболевания. Если достигался порог со знаком «-», выносится решение о наличии заболевания А 2, в нашем случае «хронического бр>уцеллеза». Если после использования всех симпто-

мов ни один из порогов не достигался, выносилось решение о недостаточности имеющейся диагностической информации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническаяхарактеристика больных

С 2002 по 2003 годы в Ставропольском бруцеллезном центре было обследовано 130 больных бруцеллезом, из них острый бруцеллез был диагностирован у 43 человек (33,1±4,1 %), хронический - у 87 (66,9±4,1 %).

Возраст больных острым и хроническим бруцеллезом колебался от 19 до 56 лет. Преобладали лица трудоспособного возраста от 20 до 49 лет, которых в группе больных острым бруцеллезом было 35 человек (81,4±5,9 %), а в группе больных хроническим - 66 (75,8±4,6 %). Мужчин было 88 (67,9±4,1 %), женщин-42 (32,1 ±4,1 %).

При изучении эпидемиологического анамнеза было установлено, что. подавляющее большинство больных острым (62,8±7,4 %) и хроническим (60,9±5,2 %) бруцеллезом работали в животноводческой и мясоперерабатывающей промышленности. Вследствие этого заболевание чаще всего носило профессиональный характер.

При изучении клинических проявлений у обследованных пациентов нами было установлено, что у подавляющего большинства (81,4±5,9 %) больных острым бруцеллезом заболевание начиналось с повышения температуры. Жалобы на озноб предъявляли 39,5±7,5 % больных острым бруцеллезом, при хроническом бруцеллезе этот симптом встречался достоверно реже (16,1±3,9 %,р<0,01).

У 53,5±7,6 % больных острым бруцеллезом температура повышалась выше 38° С, у 27,9±6,8 % больных она была субфебрильная и у 18,6±5,9 % пациентов не наблюдалось повышения температуры. В отличие от острого, у большинства больных хроническим бруцеллезом температура была в пределах нормы (74,7±4,7 %, р<0,001), а субфебрильная температура наблюдалась примерно в одинаковом проценте случаев (22,9±4,5 %). Повышение температуры выше 38° С у больных хроническим бруцеллезом было выявлено всего в 2,4±0,16 % случаев, что достоверно реже, чем у больных острым (р<0,001).

Продолжительность температурной реакции у больных острым и хроническим бруцеллезом достоверно не отличалась. Превалировала продолжительность лихорадки не более 1 месяца, которая наблюдалась у 85,7±8,0 % температурящих больных острым и у 81,8±9,5 % больных хроническим бруцеллезом.

При изучении состояния периферической сосудистой системы было установлено, что более чем у половины больных острым бруцеллезом (51,2±7,6 %) выявлялся положительный симптом «щипка», явления эпискле-рита выявлены у 55,8±7,6 % больных, коньюктивита - у 62,7±7,4 % пациентов. Это косвенно свидетельствует о раннем развитии эндоваскулита при

данной форме болезни. У больных хроническим бруцеллезом достоверно чаше выявлялся только коньюктивит (83,9±3,9 %, р<0,01), частота выявления положительного симптома «щипка» (62,1±5,2 %) и эписклирита (59,8±5,3 %) от больных острым бруцеллезом достоверно не отличалась.

При объективном изучении работы сердечно-сосудистой системы у 9,3±4,4 % больных острым бруцеллезом была выявлена тахикардия и систолический шум, у 16,3±5,6 % - брадикардия и глухость сердечных тонов. Признаки миокардиодистрофии по данным ЭКГ и рентгенографии грудной полости были выявлены у 20,9±6,2 % больных острым бруцеллезом. У больных хроническим бруцеллезом признаки миокардиодистрофии наблюдались достоверно чаще (47,1±5,4 %, р<0,01). Частота выявления остальных симптомов у больных хроническим бруцеллезом от больных острым достоверно не отличалась. Так, у 20,7±4,3 % больных хроническим бруцеллезом наблюдался систолический шум в сердце, тахикардия или брадикардия, у 19,5±4,2 % -глухость сердечных тонов.

При изучении состояния паренхиматозных органов было установлено, что у большинства больных острым бруцеллезом наблюдается увеличение лимфоузлов (81,4±5,9 %), печени (79,1±5,3 %), и селезенки (27,9±6,8 %). У больных хроническим бруцеллезом частота выявления этих симптомов была достоверно ниже, чем у больных острым. Так, лимфаденит выявлялся у них в 64,4±5,1 % (р<0,05), гепатомегалия в 45,9±5,3 % (р<0,001), спленомегалия в 10,3±3,3%(р<0,01).

При оценке состояния опорно-двигательного аппарата было установлено, что более половины больных в острой фазе бруцеллеза предъявляли жалобы на боли в суставах (62,3±7,4 %) и позвоночнике (53,5±7,6 %), гораздо реже наблюдались миалгии (9,3±4,4 %). У 39,5±7,5 % больных были выявлены реактивные артриты. Несмотря на наличие болевого синдрома, рентгенологически остеохондроз был подтвержден лишь у 30,2±7,0 % больных, артрозы у 4,7±3,2 % больных, а внесуставные поражения были выявлены только у 18,6±5,9 % больных в виде синовиитов и у 6,9±3,9 % в виде бурситов наиболее функционально нагруженных голеностопных суставов.

У больных хроническим бруцеллезом в два раза чаще, чем у больных острым, отмечались жалобы, связанные с поражением опорно-двигательного аппарата. Так, боли в суставах наблюдались у 90,8±3,1 % (р<0,001), а боли в позвоночнике у 87,4±3,6 % (р<0,001) больных. Частота миалгий у больных хроническим бруцеллезом достоверно не отличалась от больных острым и наблюдалась у 17,2±4,0 % больных. В отличие от острого, при хроническом бруцеллезе поражение локомоторного аппарата становилось более грубым. Так, если боли в суставах у больных острым бруцеллезом были связаны с артритами, то при хроническом бруцеллезе у 73,6±4,7 % (р<0,001) больных суставной синдром был обусловлен развитием артрозов, подтвержденных рентгенологически. В таком же проценте случаев у больных хроническим бруцеллезом выявлялся поясничный и грудной остеохондроз. В то же время,

частота распространения внесуставных поражений при хроническом бруцеллезе достоверно не отличалась от острого. Синовииты наблюдались у 33,3±5,1 %, бурситы у 9,2±3,1 % больных.

Жалобами со стороны вегетативной нервной системы в группе больных острым бруцеллезом были слабость (93,0±3,9 %) и потливость (72,1±6,8 %). Потливость была различной интенсивности - от дистального гипергидроза ладоней и стоп у 87,1 ±6,0 % больных до профузного потоотделения у 12,9±6,0 %. У части пациентов были отмечены астен о-вегетативные проявления, которые характеризовались болями в области сердца - 4,7±3,2 % больных, головной болью - 37,2±7,4 %, нарушением работоспособности — 20,9±6,2 %. Вегетососудистая дистония по гипотоническому типу наблюдалась у 18,6±5,9 % больных острым бруцеллезом, а по гипертоническому у 6,9±3,9 % больных.

Обращает на себя внимание ранняя заинтересованность периферической нервной системы у больных острым бруцеллезом. Так, у 48,8±7,6 % больных наблюдались парастезии верхних и нижних конечностей, у 25,6±6,7 % больных были положительными симптомы Эриксена и Лассега, у 16,3±5,9 % пациентов - болезненность при пальпации в паравертебральных точках. У 13,9±5,3 % больных острым бруцеллезом наблюдалась раздражительность, у 11,6±4,9 % - снижение памяти.

У больных хроническим бруцеллезом по сравнению с острым, жалобы на слабость (82,3±4,1 %) и потливость (70,1 ±4,9 %) встречались с одинаковой частотой. Такая же закономерность наблюдалась и в частоте возникновения вегетососудистой дистонии по гипертоническому (11,5±3,4 %) и гипотоническому типу (24,1 ±4,5 %). В то же время, у больных хроническим бруцеллезом достоверно чаще наблюдались жалобы на кардиалгии (25,3±4,6 %, р<0,01) и головную боль (62,1±5,1 %).

Частота выявления парастезий верхних и нижних конечностей у больных хроническим бруцеллезом достоверно не отличалась от больных острым, составляя 60,9±5,2 %. Однако, положительные симптомы натяжения у больных хроническим бруцеллезом встречались достоверно чаще (52,8±5,3 %, р<0,01), чем у больных острым, так же как и болезненность при пальпации паравертебральных точек (41,4±5,3 %, р<0,01), что указывает на более грубые нарушения в периферической нервной системе при хроническом бруцеллезе. Поражение центральной нервной системы у больных хроническим бруцеллезом были более выражены, чем у больных острым. Так, снижение памяти наблюдалось у 26,4±4,5 % (р<0,05) больных, раздражительность - у 34,5±5,1 % пациентов.

Поражение мочеполовой системы в группе больных острым бруцеллезом было выявлено в 6,9±3,9 % случаев. У больных хроническим бруцеллезом поражение урогенитальной системы характеризовалось нарушением менструальной функции в 10,3±3,3 % случаев, метроэндометритами в 3,4±1,9 % и

снижением потенции у мужчин в 12,8±3,6 %.

После изучения клинических проявлений заболевания нами определялась степень тяжести острого бруцеллеза на основании выраженности интоксикации и объективных данных. Легкое течение заболевания было установлено у 11,6±4,9 %, среднетяжелое - у 86,1±3,7 % и тяжелое - у 2,3±1,б % больных.

Степень компенсации хронического бруцеллеза оценивалась по степени выраженности очаговых проявлений и выраженности нарушений в функции органов. Хронический бруцеллез в стадии компенсации выявлен у 6,9±2,7 %, субкомпенсации - у 81,6±4,2 % и декомпенсации - у 11,5±3,4 % больных.

При выполнении бактериологического исследования только у 32,6±7,1 % больных острым бруцеллезом из крови была выделена культура В.теШем8 1 и 2 биоваров.

При исследовании крови больных острым бруцеллезом в реакции Хеддльсона положительные результаты ее были получены у всех пациентов. При этом резко положительная реакция наблюдалась в 88,4±3,4 % случаев, что достоверно выше, чем положительная -11,6±3,4 % (р<0,001). При хроническом бруцеллезе положительные и резко положительные результаты реакции Хеддльсона были выявлены у всех больных. При этом, резко положительная и положительная реакция встречались примерно в одинаковом количестве случаев: положительная реакция была в 44,8±5,3 %, резко положительная в 55,2±5,3 %.

В реакции агглютинации Райта у 92,9±3,9 % больных острым бруцеллезом в крови выявляли агглютинины в разных титрах, причем у 74,3±6,7 % пациентов в диагностических (1:200 - 1:1600). При хроническом бруцеллезе положительная реакция Райта была в 69,0±5,0 % случаев, причем в диагностических титрах только в 29,8±4,8 %, что достоверно реже, чем у больных острым бруцеллезом (р<0,001).

Наличие в крови гемагглютининов по данным РПГА было выявлено у 93,0±4,9 % больных острым бруцеллезом, причем в диагностических титрах (1:200 - 1:1600) они определялись у 81,4±5,9 % пациентов. При хроническом бруцеллезе в РПГА гемагглютинины выявлялись у 71,3±6,9 % больных, а в диагностических титрах только у 42,5±5,3 %, что достоверно реже, чем при остром (р<0,001).

Анализ результатов кожно-аллергической пробы Бюрне у больных острым бруцеллезом показал, что у 27,9±6,8 % пациентов проба Бюрне была положительная, у 37,2±7,4 % - слабоположительная, у 16,3±5,6 % - сомнительная, у 18,6±5,9 % - отрицательная. При хроническом бруцеллезе положительная проба Бюрне была 71,3±4,8 % больных, слабоположительная - у 28,7±4,4 %, сомнительная и отрицательная проба Бюрне при хроническом бруцеллезе не выявлялась.

У больных острым бруцеллезом методом ПЦР ДНК бруцелл в перифе-

рической крови была выявлена в 87,4±5,2 %, а у больных хроническим бруцеллезом - в 77,6±6,6 %.

Особенности субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови при бруцеллезе.

На первом этапе оценки общего иммунитета больных бруцеллезом был изучен фенотип иммунокомпетентных клеток периферической крови у 30 больных острым и 30 больных хроническим бруцеллезом.

Таблица 1

Основные популяции иммунокомпетентных клеток в периферической крови больных бруцеллезом, (М±т)

Признак Здоровые (п=30) Острый бруцеллез (п=30) Хронический бруцеллез п=30)

№ группы 1 2 3

Лейкоциты (х Ю'/л) 6,18±0,25 5,92±0,21 4,89±0,22

Р1-2 — Р1-3<0,001 Р2-3<0,001

Нейтрофилы (х Ю'/л) 3,64±0,18 3,32±0,13 2,61±0,16

Р1-2 -Р1-3<0,001 Р2-3<0,001

Моноциты (х 109/л) 0,37±0,03 0,23±0,02 0,11 ±0,02

Р1-2 <0,01 Р1-3<0,001 Р2-3 <0,001

Лимфоциты (х 107л) 2,05±0,Ю 2,27±0,11 - 2,07±0,08

Р1-2-Р1-3- Р2-3-

Как видно из данных, представленных в табл. 1, по сравнению с нормой (0,37±0,03 х 109/л) в периферической крови больных острым бруцеллезом снижается только абсолютное количество моноцитов (0,17±0,02 х 109/л, р<0,001), количество остальных клеток достоверно от нормы не отличается.

У больных хроническим бруцеллезом отмечается достоверное снижение количества общих лейкоцитов (4,89±0,22 х 109/л, р<0,001), нейтрофилов (2,61+0,16 х 109/л, р<0,001) и моноцитов (0,11±0,02 х 109/л, р<0,001).

Таблица 1

Основные субпопуляции мононуклеарных клеток в периферической _крови_больных бруцеллезом,_(М+ш)_

Признак Здоровые (п=30) Острый бруцеллез (п=30) Хроннческий Бруцеллез (п=30)

№ группы 1 2 3

CD3 1,31*0,06 1,13±0,06 1,04*0,06

(х Ю'/л) Р1-2<0,05 Р1-3<0,001 Р2-3-

CD4 1,01±0,04 0,80±0,04 0,71*0,04

(х Ю'/л) Р1-2<0,01 Р1-3<0,001 Р2-3-

CD8 0,31±0,02 0,28±0,02 0,19*0,02

(х Ю'/л) Р1-2-Р1-3<0,001 Р2-3<0,001

CD16 0,12*0,01 0,17*0,01 0,14*0,01

(х Ю'/л) Р1-2<0,001 Р1-3- Р2-3<0,05

CD21 0,21*0,01 0^1*0,02 0,26*0,02

(х Ю'/л) Р 1-2<0,001 Р1-3<0,01 Р2-3-

Как видно из данных, приведенных в табл. 2, в периферической крови больных острым бруцеллезом по сравнению с нормой отмечается достоверное увеличение количества СБ21-лимфоцитов (0,31+0,02 х 109/л, р<0,001) и СБ16-лимфоцитов (0,17+0,01 х 109/л, р<0,001). Количество СБ3 (1,13+0,06 х 109/л, р<0,05) и СБ4-лимфоцитов (0,80+0,04 х 109/л, р<0,01) в периферической крови больных острым бруцеллезом по сравнению с нормой достоверно снижается.

У больных хроническим бруцеллезом на фоне достоверного увеличения количества СБ21-лимфоцитов (0,26+0,02 х 109/л, р<0,01), наблюдается достоверное снижение абсолютного количества СБ3 (1,04+0,0б х 109/л, р<0,001), СБ4 (0,71 +0,04 х 109/л, р<0,001) и СБ8-лимфоцитов (0,19+0,02 х 109/л,р<0,001).

Таким образом, в периферической крови больных бруцеллезом наблюдается снижение абсолютного количества иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в реализации Т-клеточного иммунитета, которое прогрессирует в процессе хронизации заболевания. Обращает на себя внимание, что у больных острым бруцеллезом увеличивается количество ЕК, а у больных хроническим бруцеллезом их количество от нормы не отличается.

Функциональная активность иммунокомпетентных клеток периферической крови при бруцеллезе.

Функциональная активность нейтрофилов периферической крови оценивалась на основании спонтанного и стимулированного НСТ-теста.

Таблица 3

Функциональная активность нейтрофилов поданным НСТ-теста, (М±т)

Признак Здоровые (п=30) Острый бруцеллез (п=30) Хронический бруцеллез (п=30)

№ группы 1 2 3

НСТ-спонтанный (%) 16,1±0,78 26,5±0,71 24,4±0,73

Р1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р2-3<0,05

НСТ-стимулированный (%) 52,5±1,84 35,4±0,72 32,5±0,81

Р1-2-Р1-3<0,001 Р2-3 <0,001

Как видно из данных, представленных в табл.3, в отличие от нормы (16,1 ±0,78 %) у больных острым (26,5±0,71 %) и хроническим бруцеллезом (24,4±0,73 %) активность нейтрофилов по данным спонтанного НСТ-теста, была достоверно выше (р<0,001).

В то же время, по сравнению с нормой (52,5±1,84 %) у больных острым бруцеллезом стимулированный НСТ-тест (35,4±0,72 %) был достоверно ниже (р<0,001). Наиболее низким показатель стимулированного НСТ теста был в группе больных хроническим бруцеллезом (32,5+0,81 %, р<0,001).

Согласно полученным данным в норме индуцированный НСТ-тест превышает спонтанный в 3,3 раза (р<0,001). У больных острым и хроническим бруцеллезом в ответ на стимуляцию увеличение активности нейтрофилов по данным НСТ-теста возрастает только в 1,3 раза и не зависит от стадии заболевания (р<0,001).

Таким образом, по данным НСТ-теста обращает на себя внимание повышенная исходная функциональная активность нейтрофилов у больных бруцеллезом, в особенности острым. Однако в ответ на стимуляцию отмечается незначительное увеличение активности нейтрофилов, (в 2,5 раза меньше нормы), что указывает на истощение их компенсаторно-приспособительных реакций в процессе хронизации бруцеллеза.

С целью изучения функциональной активности гуморального иммунитета при бруцеллезе нами определялся уровень иммуноглобулинов А, М и О в периферической крови обследуемых пациентов.

Как видно из данных, представленных в табл. 4, уровень в сыворотке крови больных острым (3,24+0,21 г/л) и хроническим бруцеллезом (2,83+0,15 г/л) был достоверно выше, чем у здоровых лиц (р<0,001).

У больных хроническим бруцеллезом наблюдается максимальное увеличение продукции ^О (38,29+1,02 г/л, р<0,001), а у больных острым оно менее выражено (32,60+1,19 г/л, р<0,001).

У больных острым бруцеллезом (3,46+0,04 г/л, р<0,001) уровень достоверно возрастает, а у больных хроническим бруцеллезом (0,86+0,04 г/л, р<0,001) достоверно снижается ниже нормы.

Таблица 4

Уровень иммуноглобулинов А, М и G в периферической крови __больных бруцеллезом, (М±т) _

Признак Здоровые Острый бруцеллез Хронический

(п=30) (п=30) бруцеллез (п=30)

№ группы I 2 3

IgA 1,03±0,06 3,24±0Д1 2,83±0,15

(г/л) Р1-2<0,001 Р2-3-

Р1-3<0,001

IgG 15,41±1,02 32,60±1,19 38Д9±1,02

(г/л) Р1-2<0,001 Р2-3<0,001

Р1-3<0,001

IgM 2,84 ±0,13 3,46±0,04 0,86±0,04

(г/л) Р1-2<0,001 Р2-3<0,001

Р1-3<0,001

Таким образом, при изучении продукции иммуноглобулинов у больных острым бруцеллезом отмечается увеличение продукции всех классов иммуноглобулинов, в том числе IgM. У больных хроническим бруцеллезом обращает на себя внимание преобладание продукции IgA и IgG при одновременном снижении уровня IgM.

С целью изучения функциональной активности мононуклеарных фагоцитов периферической крови нами определялась спонтанная и стимулированная продукция мононуклеарными клетками in vitro ФНО а как цитокина, отражающего неспецифическую цитотоксичность макрофагов, а так же ИЛ1р как цитокина, отражающего активность макрофагов на этапе распознавания ими антигена и активации Т-хелпера.

Как видно из данных, представленных в табл. 5, в норме спонтанная продукция ФНО мононуклеарными клетками периферической крови составляет 1187+30,63 пкг/мл. Достоверное увеличение спонтанной продукции ФНОа в 2 раза наблюдается только у больных острым бруцеллезом (2602+ 199,4 пкг/мл, р<0,001), что возможно лежит в основе общеинтоксикационного синдрома у этих больных. У больных хроническим бруцеллезом (1050+90,13 пкг/мл) продукция ФНО «достоверно не отличается от нормы.

Стимулированная продукция ФНО в норме составляет 3366+237,3 пкг/мл. Стимулированная продукция ФНО а достоверно возрастает только у больных острым бруцеллезом, превышая нормальный показатель в 1,5 раза (5003+199,6 пкг/мл, р<0,001), что указывает на повышенную активность моноцитов у этих больных, несмотря на снижение их абсолютного количества. В то же время, у больных хроническим бруцеллезом отмечается достоверное снижение продукции ФНО а в 1,5 раза по сравнению с нормой (2536+249,9 пкг/мл, р<0,05), что указывает на снижение активности моноцитов у этих больных.

В норме спонтанная продукция ИЛ мононуклеарными клетками составляет 156,1+8,1 пкг/мл. Достоверное увеличение спонтанной продукции

ИЛ 1р наблюдается только у больных острым бруцеллезом (277,4±28,55 пкг/мл, р<0,001). У больных хроническим бруцеллезом (126,8±7,82 пкг/мл) спонтанная продукция ИЛ 1р снижается (р<0,05).

Стимулированная продукция ИЛ ф мононуклеарными клетками периферической крови в норме составляет 296,1± 16,7 пкг/мл. У больных острым бруцеллезом отмечается достоверное повышение продукции ИЛ1р (462,1 ±39,83 пкг/мл, р<0,001), что указывает на повышенную активность моноцитов в отношении их влияния на клеточные иммунные реакции у этих больных, несмотря на снижение их абсолютного количества. В то же время, у больных хроническим бруцеллезом отмечается достоверное снижение продукции ИЛ ф по сравнению с нормой (162,7—14,24 пкг/мл, р<0,001).

Таблица 5

Спонтанная и стимулированная продукция цитокинов мононуклеарны-

ми клетками периферической крови больных бруцеллезом, (М±т)

Признак Здоровые (п=30) Острый бруцеллез (п=30) Хронический бруцеллез (п»30)

№ группы 1 2 3

ФНОа спонтанная (пкг/мл) 1187130,63 2602±199,4 1050190,13

Р1-2<0,001 Р1-3- Р2-3<0,001

ФНОа тимулиро-ванная (пкг/мл) 33661237,3 5003±199,6 25361249,9

Р1-2<0,001 Р1-3<0,05 Р2-3<0,001

ИЛ1Р спонтанная (пкг/мл) 156,1±8,10 277,4±28,55 126,817,82

Р1-2<0,001 Р1-3 <0,05 Р2-3<0,001

ИЛ1р стимулированная (пкг/мл) 296,1116,70 462,1139,83 162,7114,24

Р1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р2-3 <0,001

ИЛ2 спонтанная (пкг/мл) 167,417,34 124,612,20 125,413,20

Р1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р2-3-

11Л2 стимулированная (пкг/мл) 232,917,86 150,315,06 152,414,2

Р 1-2<0,001 Р1-3<0,001 Р2-3-

Ш14 спонтанная (пкг/мл) 25,5±0,82 24,610,69 23,210,39

Р1-2-Р1-3 <0,05 Р2-3-

ИЛ4 стимулированная (пкг/мл) 36,9±1,15 35,611,16 32,511,24

Р1-2 — Р1-3 <0,05 Р2-3-

ИЛ6 спонтанная (пкг/мл) 8876±77,66 8865133,20 8310155,10 •

Р1-2-Р1-3<0,001 Р2-3<0,001

11Л6 стимулированная (пкг/мл) 9470194,95 9122135,60 8757137,30

Р 1-2<0,01 Р1-3<0,001 Р2-3<0,001

Таким образом, у больных острым бруцеллезом отмечается повышение цитотоксической активности мононуклеарных фагоцитов, о чем свидетельствует повышение продукции ими ФНОа, а так же возрастает их способность активировать реакции Т-клеточного иммунитета на этапе распознавания антигена, о чем свидетельствует увеличение продукции ИЛ ip. У больных хроническим бруцеллезом функциональная активность мононуклеарных фагоцитов снижается, в пользу чего говорит снижение продукции ими ИЛ ip и ФНО.

С целью определения функциональной активности Т-лимфоцитов больных бруцеллезом была изучена продукция ИЛ2 и ИЛ4 в смешанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови in vitro.

Как видно из данных, представленных в табл. 5, в норме спонтанная продукция ИЛ2 составляет 167,4+7,34 пкг/мл. У больных бруцеллезом отмечается достоверное снижение спонтанной продукции ИЛ2 вне зависимости от характера течения заболевания. Так, у больных острым бруцеллезом спонтанная продукция ИЛ2 составляет 124,6+2,2 пкг/мл (р<0,001), а у больных хроническим - 125,4+3,2 пкг/мл (р<0,001).

Стимулированная продукция ИЛ2 в норме составляет 232,917,86 пкг/мл. При этом, у больных бруцеллезом, как и в случае со спонтанной продукцией, наблюдается достоверное снижение стимулированной продукции этого ин-терлейкина, которая у больных острым бруцеллезом составляет 150,3+5,06 пкг/мл (р<0,001), а у больных хроническим - 152,4+4,2 пкг/мл (р<0,001).

Спонтанная продукция ИЛ4 в норме составляет 25,5+0,82 пкг/мл. Достоверное снижение спонтанной продукции ИЛ4 наблюдается только у больных хроническим бруцеллезом 23,2+0,39 пкг/мл (р<0,05), а у больных острым бруцеллезом (24,610,69 пкг/мл) спонтанная продукция ИЛ4 достоверно не отличается от нормы.

Стимулированная продукция ИЛ4 в норме составляет 36,911,15 пкг/мл. Достоверное снижение стимулированной продукции ИЛ4 наблюдается только у больных хроническим бруцеллезом 32,511,24 пкг/мл (р<0,05). У больных острым бруцеллезом (35,611,16 пкг/мл) уровень стимулированной продукции ИЛ4 достоверно не отличается от нормы.

Таким образом, при анализе особенностей продукции ИЛ2 и ИЛ4 моно-нуклеарными клетками периферической крови у больных острым бруцеллезом обращает на себя внимание снижение функциональной активности Т-хелперов, которые обеспечивают дифференцировку Т-лимфоцитов в цито-токсические клетки в реакции клеточного иммунитета, на что указывает уменьшение продукции ими ИЛ2. В то же время, у больных хроническим бруцеллезом отмечается снижение функциональной активности не только Т-хелперов, на что указывает сниженная продукция ИЛ2, но и Т-цитотоксических клеток, которые обладают прямым цитотоксическим действием. Подтверждением этого является снижение продукции мононуклеарами периферической крови ИЛ4 у больных хроническим бруцеллезом.

' С целью оценки активности дифференцировки В-лимфоцитов в плазма-

тические клетки нами изучалась спонтанная и стимулированная продукция ИЛ6 в смешанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови in vitro.

Как видно из данных, представленных в табл. 5, в норме спонтанная продукция ИЛ6 мононуклеарными клетками периферической крови составляет 8876+77,66 пкг/мл. У больных острым бруцеллезом спонтанная продукция ИЛ6 достоверно не отличается от нормы, составляя 8865+33,2 пкг/мл, а у больных хроническим бруцеллезом продукция этого интерлейкина достоверно снижается (8310+55,1 пкг/мл, р<0,001).

В норме стимулированная продукция ИЛ6 составляет 9470194,95 пкг/мл. У больных острым бруцеллезом отмечается умеренное снижение стимулированной продукции ИЛ6 (9122+35,60 пкг/мл, р<0,001), у больных хроническим снижение более выражено (8757+137,3 пкг/мл, р<0,001).

Таким образом, у больных острым бруцеллезом снижается только спонтанная продукция ИЛ6, что указывает на нарушение финальных этапов дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки у этих больных. У больных хроническим бруцеллезом нарушения механизмов дифференциров-ки В-лимфоцитов в плазматические клетки прогрессирует, на что указывает не только снижение продукции ИЛ6, но и продукции ИЛ4, который участвует в ранних этапах дифференцировки В-лимфоцитов.

Резюмируя полученные данные относительно показателей иммунитета у больных бруцеллезом, можно констатировать следующие факты. У больных острым бруцеллезом имеется типичная реакция противоинфекционного иммунитета с активацией всех его основных звеньев. Это проявляется увеличением в периферической крови количества CD 16 и СБ21-лимфоцитов, увеличением функциональной активности нейтрофилов по данным спонтанного НСТ-теста, увеличением продукции IgA, IgM и IgG. Некоторое снижение количества моноцитов компенсируется увеличением их функциональной активности как цитотоксической, о чем свидетельствует увеличение продукции ФНОа, так и стимулирующей Т-хелперы, в пользу чего говорит увеличение продукции ИЛ . В то же время, функционирование Т-клеточного противо-инфекционного иммунитета у этих больных не совсем полноценно. Так, у них отмечается снижение количества CD3 и СD4-лимфоцитов в периферической крови, а так же снижается функциональная активность Т-хелперов, активирующих цитотоксические Т-лимфоциты, на что указывает снижение продукции ИЛ2.

В отличие от острого, у больных хроническим бруцеллезом наблюдается не только снижение абсолютного количества моноцитов, но и снижается их функциональная активность, о чем убедительно свидетельствует снижение продукции ими ИЛ и ФНО . Несмотря на увеличение активности нейтро-филов по данным НСТ теста, наблюдается снижение их абсолютного количества в периферической крови. У больных хроническим бруцеллезом снижается абсолютное количество и функциональная активность CD3, CD4 и CD8-

лимфоцитов, обеспечивающих специфическую клеточную цитотоксичность, в пользу чего говорит снижение ими продукции ИЛ2 и ИЛ4. В то же время, в периферической крови сохраняется высокий уровень CD16 и CD21-лимфоцитов. Однако, несмотря на высокий уровень продукции ^ А и IgG, процесс дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки нарушен, о чем говорит снижение продукции ИЛ4 и ИЛб.

Оценка диагностической значимости клинических, лабораторных и иммунологических признаков острого и хронического бруцеллеза.

На третьем этапе исследования с целью увеличения эффективности дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза, а так же выработки объективных критериев, позволяющих прогнозировать хрониза-цию этой инфекции, нами были рассчитаны диагностические коэффициенты и определена информативность для каждого клинического, лабораторного и иммунологического признака заболевания.

В сводной табл. 6 представлены признаки, информативность которых в дифференциальной диагностике острого и хронического бруцеллеза была статистически доказана. При этом использование представленной диагностической таблицы возможно только после верификации диагноза «бруцеллез» лабораторными методами, к которым следует отнести бактериологический и серологические методы, кожно-аллергическую пробу Бюрне и ПЦР.

Таблица 6

Диагностическая таблица критериев острого и _хронического течения бруцеллеза_

Признак Диагностиче-

ский коэффи-

циент

I. Жалобы и анамнез

1. Озноб + 4

2. Боли в позвоночнике -2

3 Кардиалгия -7

4 Раздражительность -4

5 Снижение памяти -5

6. Нарушение потенции -7

7. Нарушения менструальной функции -6

II. Объективные данные

8. Нормальная температура -6

9. Повышение температуры выше 38иС + 14

10. Миокардиодистрофия -4

11. Гепатомегалия + 4

12. Спленомегалия + 4

13. Положительные симтомы Ласега и Эриксена -3

14 Боль при пальпации паравертебральных точек -4

15. Остеохондроз -4

16 Артроз - 12

III. Лабораторные методы диагностики

17. Реакция Хеддпьсона резко положительная + 2

18. Реакция Хеддльсона положительная -6

19. Титр агглютининов в реакции Райта более 1 : 400 + 13

20. Титр гемагглютининов в РПГА менее 1:200 -4

21. Титр гемагглютининов в РПГА более 1 :400 + 6

22. Проба Бюрне отрицательная, слабоположительная + 4

23. Проба Бюрне положительная -4

IV. Субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток

24. Количество лейкоцитов меньше 5 х 10у/л -3

25. Количество лейкоцитов больше 6,5 х 10*/л + 7

26. Доля нейтрофилов менее 50 % -10

27. Количество нейтрофилов менее 2,5 х Ю'/л -5

28. Доля моноцитов менее 2 % -6

29. Количество моноцитов менее 0,15 х 107л -5

30. Количество моноцитов от 0,15 до 0,25 х 10% + 5

31. Количество моноцитов более 0,25 х Ю"/л + 7

32. Доля общих лимфоцитов более 45 % -7

33. Доля СРЗ-лимфоцитов менее 40 % -4

34. Количество С04-лимфоцитов менее 0,7 х 10*/л -3

35. Количество С08-лимфоцитов менее 0,15 х 10*/л -3

36. Количество СЭ21 -лимфоцитов менее 0,2 х 10а/л -7

37. Количество С021-лимфоцитов более 0,35 х 10"/л + 3

38. Доля С016-лимфоцитов более 8 % + 8

39. Количество С016-лимфоцитов более 0,2 х 109/л + 9

V. Функциональная активность клеток иммунной системы

40. НСТ-спонтанный менее 25 % -2

41. НСТ-индуцированный менее 30 % -9

42. Уровень IgA в сыворотке крови более 4 г/л + 10

43. Уровень IgG в сыворотке крови менее 30 г/л + 6

44. Уровень IgG в сыворотке крови более 40 г/л -10

45. Уровень IgM в сыворотке крови менее 1 г/л - 14

46. Уровень IgM в сыворотке крови более 2 г/л + 14

47. Спонтанная продукция ФНОа изолированными мононуклеар-ными клетками крои in vitro менее 1000 пкг/мл -13

48. Спонтанная продукция ФНОа изолированными мононуклеар-ными клетками крои in vitro более 2000 пкг/мл + 13

49. Индуцированная ФГА продукция ФНОа изолированными мо-нонуклеарными клетками крои in vitro менее 3000 пкг/мл -13

50. Индуцированная ФГА продукция ФНОа изолированными моно-нуклеарными клетками крои in vitro более 4000 пкг/мл + 14

51. Спонтанная продукция ИЛф изолированными мононуклеарны-ми клетками крои in vitro менее 100 пкг/мл -10

52. Спонтанная продукция ИЛф изолированными моконуклеарны-ми клетками крои in vitro более 100 пкг/мл + 5

53. Индуцированная ФГА продукция ИЛ Iß изолированными моно-нуклеарными клетками крои in vitro менее 200 пкг/мл -13

54. Индуцированная ФГА продукция ИЛ Iß изолированными моно-нуклеарными клетками крои in vitro более 400 пкг/мл + 12

55. Спонтанная продукция ИЛ4 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro более 25 пкг/мл + 5

56. Индуцированная ФГА продукция ИЛ4 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro менее 30 пкг/мл -5

57. Индуцированная ФГА продукция ИЛ4 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro более 40 пкг/мл + 6

58. Спонтанная продукция ИЛ6 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro менее 8000 пкг/мл -8

59. Спонтанная продукция ИЛ6 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro более 8900 пкг/мл + 7

60. Индуцированная ФГА продукция ИЛ6 изолированными мононуклеарными клетками крои in vitro менее 8800 пкг/мл -7

Примечание: «+» - признак соответствует острому бруцеллезу

«-» - признак соответствует хроническому бруцеллезу

Если сумма диагностических коэффициентов соответствующих обнаруженным у больного признакам равняется «+ 13» то с вероятностью в 95 % можно констатировать наличие острого бруцеллеза, если «- 13» - хронического.

При сумме диагностических коэффициентов равной «+ 20» о наличии острого бруцеллеза можно говорить с 99 % вероятностью, при сумме равной «- 20» с 99 % вероятностью можно констатировать хронический бруцеллез.

Если сумма диагностических коэффициентов равна или больше «+ 30» вероятность острого бруцеллеза составляет 99,9 %, а если сумма равна или меньше «- 30» то с 99,9 % вероятностью можно констатировать наличие хронического бруцеллеза.

ВЫВОДЫ

1. При постановке диагноза острого бруцеллеза, помимо продолжительности заболевания до 3 месяцев, положительной гемокультуры и ПЦР, наибольшее дифференциально-диагностическое значение имеют следующие признаки: повышение температуры до 38° С, увеличение размеров печени и селезенки, титры агглютининов в реакции Райта и гемагглютининов в РПГА выше 1 : 400, слабоположительная или отрицательная проба Бюрне.

2. При постановке диагноза хронического бруцеллеза, помимо продолжительности заболевания более 6 месяцев и положительной ПЦР, наибольшее дифференциально-диагностическое значение имеют следующие признаки: нормальная температура тела, жалобы со стороны центральной и периферической нервной системы, снижение потенции у мужчин, нарушение менструальной функции у женщин, наличие миокардиодистрофии, остеохондроза и артрозов, титры аглютининов в реакции Райта и гемаглютининов в

РПГА менее 1 : 200, положительная и резкоположительная проба Бюрне.

3. При отсутствии у больного бруцеллезом выше перечисленных признаков или наличия комбинации признаков, характерных как для острого, так и для хронического бруцеллеза, целесообразно проведение углубленного иммунологического обследования, которое позволяет не только установить дополнительные дифференциально-диагностические критерии, но и прогнозировать риск хронизации заболевания.

4. У больных острым бруцеллезом наблюдается повышение в крови количества СБ16-лимфоцитов, увеличение активности нейтрофилов по данным НСТ-теста и активности макрофагов за счет увеличения продукции ими ИЛ 1(1 и ФНО а. В процессе хронизации бруцеллеза наблюдается уменьшение абсолютного количества нейтрофилов в периферической крови и снижение активности макрофагов за счет низкого уровня продукции ИЛ и ФНО .

5. При остром бруцеллезе наблюдается увеличение активности плазматических клеток, на что указывает повышение уровня иммуноглобулинов всех классов в сыворотке крови. Однако финальные процессы дифференци-ровки В-лимфоцитов в плазматические клетки у этих пациентов нарушены, на что указывает низкий уровень продукции ИЛб и увеличение содержания в крови CD21-лимфоцитов. У больных хроническим бруцеллезом активность плазматических клеток снижается, на что указывает низкий уровень продукции IgM. Дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки нарушается на всех этапах, подтверждением чего является низкий уровень продукции ИЛ6 и ИЛ4.

6. Активность клеточного звена иммунитета при остром бруцеллезе снижена о чем свидетельствует уменьшение количества CD3 и CD4-лимфоцитов и низкая продукция ИЛ2. У больных хроническим бруцеллезом нарушение клеточного иммунитета прогрессирует, что подтверждается снижением у них количества не только CD3 и CD4, но и CDS-лимфоцитов, а так же низким уровнем продукции ИЛ2 и ИЛ4.

7. Уменьшение абсолютного количества нейтрофилов, моноцитов, CD4, CD8, CD21-лимфоцитов и IgM в периферической крови, а так же снижение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ , ИЛ4, ИЛ6 и ФНО в смешанной культуре мононуклеарных клеток in vitro можно расценивать как неблагоприятный прогноз в отношении хронизации бруцеллеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложенная диагностическая таблица критериев острого и хронического бруцеллеза позволяет упростить дифференциальную диагностику стадии этого заболевания в сомнительных случаях.

2. Определение субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови, а также спонтанной и стимулированной продукции ими ИЛ , ИЛ4, ИЛ6 и ФНО in vitro может быть рекомендовано для включения в комплексное обследование больных бруцеллезом с целью прогнозирования хронизации заболевания.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Павлова О.М., Санникова И.В., Голубь О.Г., Попов П.Н. Клинико-эпидемиологические особенности острого бруцеллеза // Научная конференция и VIII съезд Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине». - СПб., 2002. - С. 300.

2. Санникова И.В., Голубь О.Г, Попов П.Н., Павлова О.М. Рациональная схема антибиотикотерапии острого бруцеллеза // Научная конференция и VIII съезд Итало-Российского общества по инфекционным болезням «Проблема инфекции в клинической медицине». - СПб., 2002. - С. 267 - 268.

3. Санникова И.В., Голубь О.Г, Попов П.Н., Павлова О.М., Зубарева Ю.Н. Эволюция эпидемиологии и клиники бруцеллеза в Ставропольском крае // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. - СПб., 2003. - С. 308.

4. Павлова О.М., Зубарева Ю.Н. Клинико-эпидемиологические особенности бруцеллеза у детей // XI итоговая (межвузовская) научная конференция студентов и молодых ученых. - Ставрополь, 2003. - С.374 - 375.

5. Зубарева Ю.Н., Павлова О.М. Изучение качества жизни у больных бруцеллезом // XI итоговая (межвузовская) научная конференция студентов и молодых ученых. - Ставрополь, 2003. - С.329 - 330.

6. Попов П.Н., Павлова О.М. Особенности субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови при бруцеллезе // Фундаментальные исследования. - 2004. - № 1. - С. 81.

7. Попов П.Н., Павлова О.М. Особенности обмена отдельных цитокинов при бруцеллезе // Фундаментальные исследования. - 2004. -№ 1. - С. 81- 82.

8. Боташева Ю.Н., Павлова О.М. Качество жизни больных бруцеллезом в процессе комплексного лечения // XII итоговая (межвузовская) научная конференция студентов и молодых ученых. - Ставрополь, 2004. - С.335 -336.

9. Павлова О.М. Боташева Ю.Н. ПЦР диагностика бруцеллеза // XII итоговая (межвузовская) научная конференция студентов и молодых ученых. - Ставрополь, 2004. - С 409 - 410.

ПАВЛОВА Ольга Михайловна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЛР № 020326 от 20 января 1997 г.

Сдано в набор 13.05.04. Подписано в печать 13.05.04. Формат 60x84 '/|6 Бумага типогр. № 2. Печать офсетная. Гарнитура офсетная. Усл. печ. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7. Заказ 1690. Тираж 100 экз.

Ставропольская государственная медицинская академия, 355024, г. Ставрополь, ул. Мира, 310.

J1081 i

Актуальность проблемы

Рост заболеваемости, хроническое рецидивирующее течение, недостаточная эффективность существующих методов лечения и профилактики ставит бруцеллез в ряд наиболее актуальных проблем инфекционной патологии человека. Отмечено, что по своему распространению и социально-экономической значимости это заболевание занимает одно из первых мест среди зоонозов [Здродовский П.Ф. 1953, Яровой JI.B. 1959, 1977, Вершилова П.А., с соавт., 1972, 1974, Кортнев А.И., с соавт., 1976, Белозеров Е.С. 1985, Лямкин Г.И., с соавт., 1995, Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. 1999, Лобзин Ю.В., с соавт., 2000, Санникова И.В., с соавт., 2002, Boschiroli M.L., et al 2001, Godfroid J. 2002, Säuret J.M., Vilissova N. 2002].

Многообразие клинических проявлений, стертое клиническое течение и недостаточная эффективность существующих методов лечения бруцеллеза ведет к хронизации заболевания, с последующей стойкой инвалидизацией больных. В то же время, до настоящего момента не существует методов прогнозирования перехода острой формы бруцеллеза в хроническую, что обусловливает актуальность исследований, проводимых в этом направлении [Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. 1999, Лобзин Ю.В., с соавт., 2000].

Особенности жизненного цикла бруцелл и инфекционно-аллергический характер бруцеллеза позволяют констатировать ведущую роль нарушений иммунитета в патогенезе этого заболевания. В то лее время, многие аспекты иммунологии бруцеллеза, в частности особенности межклеточных взаимоотношений в процессе формирования противоинфекционного иммунитета при этой патологии изучены недостаточно, что не позволяет в полной мере использовать оценку иммунного статуса больных бруцеллезом для прогнозирования хронизации этой инфекции [Иванов К.С., с соавт., 1997,

Сафронова В.М., с соавт., 1997, Цирельсон JI.E., с соавт., 1997, Курманова Г.М., с соавт., 2002, Golding В., et al 2001, Moreno-Lafont М.С., et al 2002].

Открытие биологически активных веществ - цитокинов, регулирующих пролиферацию и уровень функциональной активности клеток как в норме, так и при патологии, позволяет с новых позиций оценить механизм формирования воспалительных реакций, аллергических и иммунных состояний и разработать новые методы прогнозирования характера инфекционного заболевания. Между тем, в доступной литературе роль нарушений обмена цитокинов при бруцеллезе не получила достаточного освещения, что и определяет актуальность исследований, проводимых в этом направлении.

Цель исследования

На основании клинико-иммунологического обследования изучить роль иммунной системы в патогенезе бруцеллеза и разработать объективные критерии, позволяющие прогнозировать вероятность его хронизации.

Задачи исследования

1. Изучить современные клинические особенности бруцеллеза.

2. Определить субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови, уровень иммуноглобулинов сыворотки крови и активность нейтрофилов по данным НСТ-теста у больных острым и хроническим бруцеллезом.

3. Изучить in vitro спонтанную и стимулированную продукцию ИЛ1 (3, ИЛ2, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа в смешанной культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больных бруцеллезом.

4. Оценить диагностическую значимость отдельных клинических признаков и иммунологических показателей в прогнозировании хронизации бруцеллеза.

Научная новизна

Проведена комплексная, сравнительная оценка субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток в периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом.

Впервые выполнено сравнительное исследование in vitro спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом.

На основании анализа диагностической значимости клинических симптомов, серологических и иммунологических данных разработана схема дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза. Предложены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать возможность хронизации инфекции.

Практическая значимость

Полученные результаты комплексного иммунологического обследования больных бруцеллезом позволяют рекомендовать его проведение в целях прогнозирования хронизации заболевания и могут служить основанием для проведения специфической иммунокорригирующей терапии.

Предложенная диагностическая таблица позволяет упростить дифференциальную диагностику острого и хронического бруцеллеза при отсутствии достоверных данных о продолжительности течения заболевания.

Внедрение результатов в практику

Полученные результаты внедрены в работу Краевого бруцеллезного центра г. Ставрополя и ЛПУ Ставропольского края. Материалы диссертации используются в лекциях и на практических занятиях по инфекционным болезням со студентами и слушателями факультета последипломного образования Ставропольской государственной медицинской академии.

Апробация и публикации

Материалы диссертации доложены на XI итоговой конференции молодых ученых и студентов СГМА (г. Ставрополь, 2003), VI съезде инфекционистов России (г. С.-Петербург, 2003), краевых конференциях врачей инфекционистов (г. Ставрополь, 2002, 2003), V общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (г. Кисловодск, 2004) и на заседаниях кафедры инфекционных болезней с эпидемиологией СГМА (г. Ставрополь, 2003, 2004). По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Характерная динамика изменений иммунологических показателей в процессе хронизации бруцеллеза позволяет рекомендовать комплексное иммунологическое обследование для его прогнозирования.

2. Особенности иммунологических изменений при бруцеллезе патогенетически обосновывают назначение иммунотерапии у больных бруцеллезом с учетом характера и длительности течения заболевания.

3. Предложенная диагностическая таблица, учитывающая информативность отдельных клинических проявлений и иммунологических показателей, позволяет увеличить эффективность дифференциальной диагностики острого и хронического бруцеллеза.

Структура и объем работы

Работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 13 рисунками. В библиографический указатель включено 179 источника литературы, из которых 68 - отечественных и 111 - зарубеленых.

ВЫВОДЫ

1. При постановке диагноза острого бруцеллеза, помимо продолжительности заболевания до 3 месяцев, положительной гемокультуры и ПЦР, наибольшее дифференциально-диагностическое значение имеют следующие признаки: повышение температуры до 38° С, увеличение размеров печени и селезенки, титры агглютининов в реакции Райта и гемагглютининов в РПГА выше 1 : 400, слабоположительная или отрицательная проба Бюрне.

2. При постановке диагноза хронического бруцеллеза, помимо продолжительности заболевания более 6 месяцев и положительной ПЦР, наибольшее дифференциально-диагностическое значение имеют следующие признаки: нормальная температура тела, жалобы со стороны центральной и периферической нервной системы, снижение потенции у мужчин, нарушение менструальной функции у женщин, наличие миокардиодистрофии, остеохондроза и артрозов, титры аглютининов в реакции Райта и гемаглютининов в РПГА менее 1 : 200, положительная и резкоположительная проба Бюрне

3. При отсутствии у больного бруцеллезом выше перечисленных признаков или наличия комбинации признаков, характерных как для острого, так и для хронического бруцеллеза, целесообразно проведение углубленного иммунологического обследования, которое позволяет не только установить дополнительные дифференциально-диагностические критерии, но и прогнозировать риск хронизации заболевания.

4. У больных острым бруцеллезом наблюдается повышение в крови количества СБ 16-лимфоцитов, увеличение активности нейтрофилов по данным НСТ-теста и активности макрофагов, за счет увеличения продукции ими ИЛ1р и ФНОа. В процессе хронизации бруцеллеза наблюдается уменьшение абсолютного количества нейтрофилов в периферической крови и снижение активности макрофагов, за счет низкого уровня продукции HJIip и ФНОа.

5. При остром бруцеллезе наблюдается увеличение активности плазматических клеток, на что указывает повышение уровня иммуноглобулинов всех классов в сыворотке крови. Однако финальные процессы дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки у этих пациентов нарушены, на что указывает низкий уровень продукции ИЛ6 и увеличение содержания в крови CD21-лимфоцитов. У больных хроническим бруцеллезом активность плазматических клеток снижается, на что указывает низкий уровень продукции IgM. Дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки нарушается на всех этапах, подтверждением чего является низкий уровень продукции ИЛ6 и ИЛ4.

6. Активность клеточного звена иммунитета при остром бруцеллезе снижена о чем свидетельствует уменьшение количества CD3 и CD4-лимфоцитов и низкая продукция ИЛ2. У больных хроническим бруцеллезом нарушение клеточного иммунитета прогрессирует, что подтверждается снижением у них количества не только CD3 и CD4, но и СТ)8-лимфоцитов, а так же низким уровнем продукции ИЛ2 и ИЛ4.

7. Уменьшение абсолютного количества нейтрофилов, моноцитов, CD4, CD8, CD21-лимфоцитов и IgM в периферической крови, а так же снижение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ1Р, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа в смешанной культуре мононуклеарных клеток in vitro можно расценивать как неблагоприятный прогноз в отношении хронизации бруцеллеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложенная диагностическая таблица критериев острого и хронического бруцеллеза позволяет упростить дифференциальную диагностику стадий этого заболевания в сомнительных случаях.

2. Определение субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови, а также спонтанной и стимулированной продукции ими ИЛ1р, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа in vitro может быть рекомендовано для включения в комплексное обследование больных бруцеллезом с целью прогнозирования хронизации заболевания.

118