Автореферат и диссертация по медицине (14.00.18) на тему:Клинико-генетическое исследование умственной отсталости в Республике Башкортостан

На правах рукописи УДК 616.89-008.454-053.2

Исламгулов Денис Владимирович

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УМСТВЕННОЙ ОТСТАЛОСТИ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

14.00.18 - «Психиатрия» 03.00.15 - «Генетика» (медицинская)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук и на кафедре психиатрии и наркологии с курсом ИПО Башкирского государственного медицинского университета

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Валинуров Ринат Гаянович доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Овсянников Сергей Алексеевич доктор биологических наук, профессор Янковский Николай Казимирович

Ведущая организация:

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится "_" декабря 2005 года в"_" часов на заседании

диссертационного совета К208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» РОСЗДРАВА (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а). почтовый адрес: г. Москва, 127473, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан "_"_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

У. X. Гаджиева

—ZZTbÖ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Умственная отсталость (УО) является одним из наиболее распространенных во всем мире психических расстройств, в этиопатогенезе которого, несмотря на изучение этой патологии на протяжении многих лет, остается много неясного.

Актуальность проблемы связана с высокой распространенностью и значительным ростом данного психического расстройства за последние годы. По данным ВОЗ, распространенность умственной отсталости в мире характеризуется пораженностью 3% населения всех возрастов. Больные с умственной отсталостью составляют треть лиц, признанных инвалидами по психическому заболеванию. Данные контингенты в большей степени подвержены алкоголизации, чаще становятся жертвами эксплуатации, физических и сексуальных оскорблений, совершают противоправные действия, что определяет важное социально-экономическое значение этой проблемы.

Почти четверть всех форм УО в популяциях человека обусловлена генетическими факторами. Наследственная УО в большинстве случаев является Х-сцепленной. В настоящее время известно более 40 генов синдромапьной и 23 гена неспецифической Х-сцепленной умственной отсталости (Mandel J. et al., 2004). Самой распространенной причиной умственной отсталости, сцепленной с X хромосомой, является синдром ломкой хромосомы X (СЛХ). По данным эпидемиологических исследований, частота СЛХ в популяциях Европы составляет 1 на 4 000-6 000 мужчин и 1 на 7000-10000 женщин (Crawford D. et al., 2001). Заболевание ассоциировано с ломким участком Х-хромосомы FRAXA (Fragile site, X chromosome, A site), локализованным в области Xq27.3. Основной причиной развития СЛХ является экспансия CGG-повторов в 5-нетранслируемой области (5'-UTR) гена FMRI (Fragile X Mental Retardation-l) (Jin P et al., 2000). Трудность постановки клинического диагноза и отсутствие эффективных средств для лечения больных с СЛХ определяет особую значимость выявления больных с данной патологией и медико-генетического консультирования родственников.

Второй по частоте после СЛХ формой Х-сцепленной УО является FRAXE-ассоциированная УО. Молекулярная основа данного расстройства связана с расширением CCG-повторов в промоторной области гена FMR2 (Fragile X Mental

Retardation-2). —----.—„_ .

РОС. НАЦИОНАЛЬНА :

i библиотека

i

В генез наследственно обусловленной УО существенный вклад вносят также множество аутосомных генов-кандидатов, белковые продукты которых вовлечены, в основном, в развитие и созревание нервной системы. Причины мутаций, приводящих к наиболее распространённым наследственно обусловленным формам УО, изучены недостаточно, а существующие методы лабораторной диагностики трудоемки, дорогостоящи и не могут быть использованы для широкого скрининга. Молекулярная диагностика мутаций, приводящих к наследственным формам УО, в отечественной лабораторной практике в настоящее время используется недостаточно и малоэффективно.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: эпидемиологическое, клинико-параклиническое и молекулярно-генетическое изучение умственной отсталости в Республике Башкортостан.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по умственной отсталости в Республике Башкортостан и проанализировать клинические особенности больных умственной отсталостью.

2. Провести анализ метилирования CpG островков гена синдрома ломкой хромосомы X (FMR1) и гена /<7?ЛЖ-сцепленной УО (FMR2) у больных с умственной отсталостью.

3. Провести анализ CGG-повторов в гене FMR1 у больных умственной отсталостью и здоровых доноров.

4. Провести исследование полиморфных ДНК-локусов DXS998, DXS548, FRAXAC1, сцепленных с геном синдрома ломкой хромосомы X (FMR1), и анализ гаплотипов по локусам DXS548, FRAXAC1 у больных синдромом ломкой хромосомы X и здоровых доноров.

5. Проанализировать клинические особенности больных синдромом ломкой хромосомы X и оценить частоту данного расстройства в Республике Башкортостан.

6. Провести анализ ассоциаций Л/и-инсерционных полиморфных локусов, сцепленных с генами DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule), LAMA2 (Laminin) и FACL4 (Fatty Acid-CoA Ligase 4), с умственной отсталостью.

7. Провести анализ ассоциаций полиморфизма генов аполипопротеина Е (АроЕ), STR-полиморфизма гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата (GluRS) и 586С>Т полиморфизма в гене субъединицы -у2 рецептора ГАМК (GABRG2) с развитием умственной отсталости.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые проведен анализ метилирования CpG-островков гена синдрома ломкой хромосомы X (FMR1) и гена FRAXE-сцепленной У О (FMR2) у больных с умственной отсталостью из РБ. Впервые проведен анализ полиморфизма CGG-повторов в гене FMR1 у здоровых доноров русской и татарской этнической принадлежности, проживающих в РБ. Впервые в Республике Башкортостан проведено исследование полиморфных микросателлитных маркёров DXS998, DXS548, FRAXAC1 и гаплотипов DXS548-FRAXAC1 у больных с CJIX и здоровых доноров, что позволит использовать их в косвенной диагностике синдрома ломкой хромосомы X. С помощью комплекса молекулярно-генетических методов исследования определена частота встречаемости СЛХ среди лиц с УО и распространенность CJIX в целом по Республике Башкортостан. Впервые выявлена ассоциация УО с AIu-инсерционными ДНК-локусами, сцепленными с генами DSCAM, LAMA2 и полиморфными вариантами генов АроЕ, GluR5.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В результате выполненного исследования разработан протокол диагностики и скрининга СЛХ двумя методами, включающими молекулярно-генетический анализ числа CGG-повторов и степени метилирования CpG-островка промоторной области гена FMR1. Данный протокол успешно реализуется при диагностике СЛХ в ПЦР-лаборатории на базе Республиканской психиатрической больницы МЗ РБ и медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра РБ. Подробно представлены материалы комплексного клинико-параклинического обследования больных с синдромом ломкой хромосомы X, ранее не описанных в Республике Башкортостан. Выявлены клинические особенности у больных с СЛХ, что позволяет расширить представление о фенотипических вариациях и дифференцировать синдром ломкой хромосомы X на клиническом уровне. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с внедрением в общеклиническую практику молекулярно-генетических методов, используемых в пренатальной, ранней диагностике и скрининге наследственных форм умственной отсталости. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Неравномерность территориального распространения умственной отсталости в Республике Башкортостан и рост заболеваемости данного расстройства в 2,5 раза за последние 5 лет среди детского населения сельской местности республики.

2. Существенные различия в распределении частот аллелей полиморфных локусов DXS998, DXS548, FRAXAC1, сцепленных с геном FMR1, и гаплотипов DXS548-FRAXACI между больными с синдромом ломкой хромосомы X и здоровыми донорами.

3. Эффективный протокол молекулярно-генетической диагностики синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, заключающийся в предварительном выявлении индивидов, не имеющих нормального аллеля гена FMR], с последующей оценкой у них статуса метилирования CpG-островка данного гена.

4. Частота синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, составляющая 4,2% среди больных умственной отсталостью.

5. Характерные клинические особенности у больных с синдромом ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии.

6. Ассоциация умственной отсталости с аллелями */ и генотипами *//*/ по

Alu-инсерционным полиморфным локусам: Yb8106, сцепленному с геном DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule), - у русских и Ya5 491, сцепленному с геном LAMA2 (Laminin), - у башкир.

7. Генетические маркеры повышенного риска развития умственной отсталости у татар: аллель АроЕ*2 гена аполипопротеина Е и аллель GluR5*I гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата GluR5.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационного исследования доложены 27 сентября 2005 года на совместном заседании Ученого совета Института биохимии и генетики УНЦ РАН и кафедры психиатрии и наркологии с курсом ИПО Башкирского государственного медицинского университета и 24 октября 2005 года на совместном заседании кафедры психиатрии, наркологии и психотерапии ФПДО МГМСУ и кафедры наркологии и психиатрии МГМСУ.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литера!уры, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 187 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для исследования была отобрана группа неродственных больных мальчиков (N=214) с диагнозом умственная отсталость (Р70-Р73) в возрасте от 3 до 17 лет русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в РБ. Диагноз верифицировался на основании данных клинико-анамнестического обследования, катамнеза, результатов инстументального обследования (ЭЭГ, РЭГ), заключения клинического психолога, логопеда, невролога и офтальмолога. Исследованные больные находились на стационарном лечении и/или обследовании в детском отделении №14 Республиканской психиатрической больницы Министерства Здравоохранения Республики Башкортостан города Уфы и в Серафимовском детском доме.

В контрольную группу вошли интеллектуально сохранные мальчики (N=217) соответствующего возраста, обучающиеся в средне-образовательной школе. Сбор материала производился в период с 2003 по 2004 год. Для проведения молекулярно-генетической части работы были использованы образцы геномной ДНК вышеуказанных лиц'.

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (МаШеду С .С., 1984). Анализ полиморфных ДНК-локусов проводили методом полимеразной цепной реакции (ГТЦР) синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик-21» производства компании «ДНК-технология» с использованием ДНК-полимеразы Тегтш ациайсш производства фирмы «Силекс».

Оценку статуса метилирования Срв-островков генов РМЯ1 и РМЕ12 проводили с помощью метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР) (Стрельников В. с соавт., 2000). Амплификацию полиморфных ССС-повторов в гене РМШ проводили с использованием 7-(1еа2аОТР. Результаты амплификации оценивали в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием

1 Забор крови производился с соблюдением юридических норм

s

или азотнокислым серебром. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica ver. 6.0 (StatSoft, Inc., 2001), программы "RxC" (Rows x Columns), GenePop ver. 3.3 (Rousset F., 2001).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Эпидемиология умственной отсталости в Республике Башкортостан

Существенные различия в показателях распространенности умственной отсталости отмечаются при рассмотрении разных возрастных групп населения и форм заболевания по глубине интеллектуального дефекта. Нами проведен анализ эпидемиологической ситуации по УО в Республике Башкортостан с использованием данных статистической отчетности, представленных отделом статистики Республиканского психоневрологического диспансера. Установлена неравномерность распространения данного расстройства по районам и городам Республики Башкортостан (рис. 1).

Рис. 1. Болезненность умственной отсталости в Республике Башкортостан (на 100 000 населения) на 2003 г.

Наиболее высокие показатели болезненности УО отмечены в северозападной и северо-восточной зонах республики. Обнаруженные различия, по данным проведенного регрессионного анализа, обусловлены в 13,37% случаев влиянием социально-экономических факторов, остальные различия можно объяснить комбинированным действием фоновых экологических факторов и демографическими процессами. Установлен рост заболеваемости УО в сельской местности, особенно, среди детского населения (в 2,5 раза за последние 5 лет). Сложившаяся в Республике Башкортостан неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по заболеваемости УО среди детей в сельской местности еще раз подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования здравоохранения и создания благоприятных условий для профилактики, выявления, лечения и социальной адаптации больных с УО

2. Комплексная клинико-параклиническая характеристика выборки

больных с умственной отсталостью из Республики Башкортостан

Клинико-параклинический анализ всех пациентов проведен ретроспективно на основании данных историй болезней. При разделении общей группы больных по степени тяжести расстройства на легкую форму (К) 50-69) пришлось 26,54%, на умеренную (10 35-49) - 35,19% и на тяжелую (10 20-34) -38,27%. По результатам анализа этиологии умственной отсталости в исследуемой группе было выявлено, что у 42,42% детей УО была сложного генеза, сочетание двух причинных факторов описывались у 78,5%, более трех -у 21,05% больных умственной отсталостью. Наиболее частой этиологической причиной УО было раннее органическое поражение головного мозга (53,33%), гипоксическое поражение головного мозга было причиной в 13,33% случаев УО, недоношенность - 13,33%, нейроинфекция - 10,01% УО, нейротоксикоз -8,33%, билирубиновая энцефалопатия - 1,67%. При сравнительном анализе жалобы на отставание в психоречевом и интеллектуальном развитии составили 23,4% от всех жалоб, на трудности в обучении - 15,15%, на ухудшение памяти - 14,39%, на энурез - 13,64%, нарушения поведения - 12,12%, сомнабулизм -6,06%, головную боль - 6,06%, двигательные расстройства - 4,55%, речевые нарушения - 3,03%, прочие - 1,52%. При анализе анамнестических данных было выявлено, что у детей с УО наследственность была отягощена психоневрологическими заболеваниями в 19,44% случаев. Наличие больных родственников со стороны матери наблюдалось чаще (в 13,89% случаев), по сравнению с отягощенностью по отцовской линии (5,56%). Полученные

результаты согласуются с литературными данными, указывающими на преобладание среди наследственной УО удельного веса Х-сцепленных форм (Raymond F., 2005). В ходе проведенного анализа встречаемости больных сибсов среди мальчиков с УО выявлено, что ожидаемый риск развития УО у сибсов составляет 6,21%, что несколько ниже показателей, полученных в результате широкомасштабных исследований, проведенных в США.

При анализе акушерского анамнеза большинство детей родилось от повторной беременности (62,5%): от первой беременности 37,5%, от 2-ой -31,25%, 3-ей - 15,62%, 4-ой 12,5%, 5-ой - 3,12%. В 12,5% случаев предыдущие беременности прерывались абортом, в 6,25% выкидышем. В 87% случаев беременность имела патологическое течение (гестозы, угроза прерывания). Патологическая беременность у матерей больных УО определялась в 84,62% случаев (61,54% сочетанного генеза). При сравнительном анализе беременность была отягощена гестозами 1-ой и 2-ой половины в 49,02% случаев, анемией -23,53%, угрозой прерывания - 19,61%, ОРВИ - 7,84%. Обнаружена статистически значимая корреляция между числом сочетания факторов, отягощающих протекание беременности и степенью тяжести УО (R=0,562, р=0,0003).

При анализе психического статуса у 31,82% больных была выявлена глубокая степень интеллектуального дефекта, у 27,27% - выраженная, 18,18% -умеренная, легкая степень определялась у 22,73% больных УО. Речевые нарушения выявлялись в 12,5% случаев, гипердинамический синдром - в 7,3% случаев. Нарушения когнитивных функций встречались у 67,24% пациентов с У О, эмоционально-волевые расстройства определялись с частотой 21,9%. При неврологическом обследовании у 25,93% пациентов выявлены последствия резидуально-органического поражения головного мозга, у 51,85% -энцефалопатия сложного генеза и у 22,22% - органическое поражение головного мозга. При логопедическом обследовании общее недоразвитие речи выявлено у 45,95% обследуемой выборки УО больных (общее недоразвитие речи (ОНР) I - 44,45%, ОНР II - 38,899%, ОНР III - 16,67%), заикание - 5,41%, псевдобульбарная дизартрия - 2,7%, дислексия - 2,3% пациентов.

При ЭЭГ обследовании на общие изменения биопотенциалов мозга приходилось 49,23% случаев, эпилептоидные компоненты - 15,38%, снижение порога судорожной готовности - 9,23%, дисфункция неспецифических срединных образований составляла 26,15%. При изучении состояния мозгового кровотока у 78,26% зарегистрированы патологические типы РЭГ. Более чем в

половине случаев констатировался гипертонический тип РЭГ (56,52%), у 13,04% больных выявлялось нарушение венозного оттока и лишь у 8,7% -гипотонический тип РЭГ.

Таким образом, в ходе клинико-параклинического анализа в выборке больных УО выявлены превалирующие этиологические причины расстройства, основной спектр клинических проявлений, определен риск развития УО у сибсов больного пробанда (6,21%). Полученные данные могут служить основой для дальнейшего изучения гено-фенотипических корреляций расстройств, сопровождающихся УО.

3. Анализ метилирования СрС островков генов ЕМЯ1 и FMA2 методом метил-чувствительной ПЦР

Учитывая то, что СЛХ является одной из самых распространенных причин наследственной УО, а также невозможность постановки диагноза заболевания только на основании клинических данных в связи с вариабельностью и неопределённостью фенотипических проявлений, актуальным на первом этапе исследования УО является молекулярная диагностика СЛХ с целью выявления больных данной патологией из общей выборки больных с УО. Для обнаружения лиц с СЛХ мы провели анализ метилирования СрС-островка промоторной области гена РМЙ/ методом метил-чувствительной ПЦР у 214 мальчиков с умственной отсталостью из РБ.

В результате исследования у 9 (4,2%) больных (4 русских, 4 татар и 1 башкира) обнаружено метилирование СрО-островка гена FA/ЛД что выражалось в появлении продукта амплификации. При скрининге больных с УО из РБ не удалось выявить ни одного больного с метилированным промотором гена FAf^^2, что косвенно подтверждает данные о низкой распространенности (1 на 50 000-100 000 мужчин) сцепленной УО.

4. Анализ ССв-повторов в гене ПИШ у больных детей умственной отсталостью и здоровых доноров

Для выявления больных СЛХ в группе индивидов с умственной отсталостью, проживающих в РБ, было проведено прямое определение ССС-повторов в гене РМШ При анализе образцов ДНК 214 лиц с УО, у 9 индивидов с ранее обнаруженным метилированием СрС островка не удалось выявить продукта амплификации, что указывало на наличие мутационного массива неамплифицируемых ССС-триплетов.

Таким образом, в результате проведенного анализа метилирования Срв-островка гена РМК/ и исследования СвО-повторов в данном гене у 9 больных с У О из РБ был установлен диагноз: синдром ломкой хромосомы X. У матери одного из пробандов удалось проамплифицировать премутационный аллель с числом ССЮ-повторов ~140.

У остальных 205 индивидов с УО из РБ количество СвО-повторов варьировало в диапазоне от 21 до 38 копий. В обследованной нами группе пациентов с УО не выявлено случаев носительства ни промежуточных аллелей (45-54 СОО-повторов), ни аллелей, соответствующих состоянию премутации (55-200 триплетов). При анализе распределения частот СОО-повторов в гене РМЯ1 в контрольной группе выявлено 18 аллельных вариантов данного локуса, размер СОО-повторов в которых варьировал в диапазоне 20-45 копий у лиц татарской этнической принадлежности и 20-38 копий у русских (рис. 2).

35%,-

30%

25%

20%

15%

10%

20 21 22 23 24 25 2С 27 28 2» 30 31 32 33 34 35 3( 37 38 39 40

Рис. 2. Распределение частот аллелей СОО-повторов в гене ИМИЛ у здоровых доноров русской и татарской этнической принадлежности

У татар выявлен один случай носительства промежуточного аллеля, содержащего 45 CGG-повторов (1:47 или 2128 на 100 000 населения). Аллелей, соответствующих состоянию премутации, идентифицировано не было. Статистически значимых различий в распределении частот CGG-повторов в гене FMR1 между здоровыми индивидами татарской и русской этнической принадлежности не выявлено. Распределение частот аллелей данного локуса было бимодальным: основной модальный класс аллелей был представлен 29 и 30 копиями CGG-повтора с частотой 24,5% и 32,7% среди русских, 17,8% и 22,2% - у татар. Второй модальный пик в распределении частот аллелей

данного локуса соответствовал 23 копиям CGG-повтора с частотой 8,2% у русских и 8,8% - у татар. Распределение частот аллелей CGG-повторов в исследуемых группах обнаруживало сходство с европейскими популяциями (Fu et а!., 1991; Dawson et al., 1995; Kunst et al., 1996)

Таким образом, в ходе молекулярно-генетического анализа гена FMR1 у больных с УО из РБ у 9 (4,2%) больных было выявлено метилирование CpG-островка гена FMR1, что позволило установить диагноз СЛХ. При амплификации CGG-повторов у этих же больных не удалось выявить продукта ПЦР, что подтверждало наличие мутационных неамплифицируемых аллелей гена FMR1. Это указывает на большую чувствительность применяемых методик, и взаимоисключение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

В последние годы, благодаря развитию методов молекулярно-генетической диагностики, была произведена существенная коррекция частоты СЛХ как в общей популяции, так и в различных группах риска этого заболевания (Jacobs et al., 1993; Turner et al., 1996; Haddad et al., 1998). Частота СЛХ среди мужчин с трудностями в обучении в разных исследованиях колебалась от 0,3 до 16 %, со средним числом 2,3% (Song F. et. al., 2003). Учитывая, что распространенность УО на 2003 г. в РБ составила 612,8 на 100 000 населения или 1 на 163 (0,6%), а СЛХ, по результатам нашего исследования, представляет 4,2% лиц с УО, то распространенность СЛХ в РБ составляет примерно 1 на 3795 населения (или 26,4 на 100 000).

5. Анализ полиморфных ДНК-локусов DXS998, DXSS48, FRAXAC1, сцепленных с геном FMR1, у больных детей синдромом ломкой хромосомы X и здоровых доноров

Для определения возможности проведения косвенной ДНК-диагностики синдрома ломкой хромосомы X в РБ с использованием полиморфных ДНК-локусов DXS548, FRAXAC1, DXS998, сцепленных с геном FMR1, нами проведено изучение этих маркеров у больных СЛХ и здоровых доноров русской и татарской этнической принадлежности.

При анализе распределения частот аллелей полиморфного ДНК-локуса DXS548 выявлено, что у больных СЛХ чаще, чем в контрольной группе, встречались аллели DXS548*42 и DXS548*50 (на 22,2% и 11,1% хромосом по сравнению с 14,8% и 4,96%, соответственно).

Проведенный анализ распределения частот аллелей полиморфного ДНК-локуса ПЫХАС/ показал, что у больных синдромом ломкой хромосомы X была выше, чем в контрольной выборке, частота встречаемости аллеля РЯАХАС! *40 (22,2% и 3,3%, соответственно). По локусу ОХЯ998 у пациентов с СЛХ почти в два раза чаще, по сравнению со здоровыми донорами, идентифицировался аллель ОХБ988*42 (22,2% и 10,7%, соответственно).

С целью определения степени ассоциации аллелей изученных полиморфных ДНК-локусов с геном РМШ мы определили стандартный коэффициент неравновесия по сцеплению - (Кгалтсгак М. е! а1., 1988). Его величина была максимальна для аллеля РЯАХАС1*40 маркера РЯАХАС! (0,652) и достаточно высока для аллелей маркеров ЭХК998*42 (-0,333) и 0X3548*50 (-0,282), что согласуется с тем, что локусы ОХБ998 и ОХ.3548 находятся на большем генетическом расстоянии от гена РМЮ, чем локус ПИХАС!. Выраженная неравновесность сцепления данных ДНК-локусов с геном /*М?/ позволяет использовать их для проведения косвенной ДНК-диагностики и определения носительства мутантного аллеля в популяции РБ.

Учитывая достаточно низкую гетерозиготность изучаемых полиморфных локусов, сцепленных с геном РМШ, наиболее информативным является анализ гаплотипов по нескольким локусам. Проведенный нами анализ гаплотипов по локусам йХБ548, ПЫХАС!, который, по данным литературы, проводится в различных странах для диагностики СЛХ (Ре1хо1о е1 а!., 1998), показал, что гаплотип 42-36 у больных СЛХ из РБ встречался с частотой 11,1% по сравнению с 5,7% в контрольной группе (рис. 3).

Рис. 3. Распределение частот гаплотипов ПХБ548-РЯАХАС1 у детей с синдромом ломкой хромосомы X и здоровых доноров

Гаплотип 42-34 выявлялся с частотой 11,1% у больных с СЛХ, но не определялся в контрольной группе. Этот гаплотип, в свете данных по мейотической нестабильности йХ8548 и РМХАС] (Ре1хого й а!., 1998), можно рассматривать как производное от гаплотипа 42-36, тогда суммарная частота этих гаплотипов составляет 22,2% у больных с СЛХ из РБ, а в контрольной группе всего 5,31%.

Таким образом, гаплотип 42-36, являющийся, по данным литературы, основным предковым гаплотипом у европеоидов, ассоциирован с мутантной хромосомой X у больных СЛХ из РБ.

6. Стратегия диагностики и скрининга на синдром ломкой хромосомы X

В настоящей работе разработан протокол диагностики СЛХ в РБ двумя методами, включающими молекулярно-генетический анализ ССКЗ-повторов и метилирования СрС-островка промоторной области гена FA/^?/. Прямая детекция размера ССЮ-повторов методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ГТЦР) позволяет выявлять нормальные аллели гена РМЯ1 (содержащие от 5 до 44 ССЮ-копий повтора), промежуточные аллели (имеющие от 45 до 54 триплетов), небольшие премутационные аллели (включают от 55 до 200 СйО-повторов) и косвенно мутационные (более 200 триплетов). Второй метод, метил-чувствительная ПЦР, дает оценку статуса метилирования СрС-островка промотора гена /<М?/ и дифференцирует большие премутации от мутаций по функциональному состоянию.

Полученные положительные результаты использования разработанного протокола позволяют с уверенностью предложить его для диагностики СЛХ в Республике Башкортостан по следующей схеме:

1. Исследование кариотипа пробанда для исключения хромосомной патологии, не имеющей отношения к синдрому ломкой хромосомы X.

2. Амплификация области С ОС-повторов в гене FMR/. Наличие продукта амплификации, соответствующего нормальному аллелю данного ДНК-локуса, рассматривается как достоверный признак отсутствия мутации гена РММ с исключением диагноза СЛХ.

3. В случае отсутствия продукта амплификации области СОО-повторов в гене ГМЯ1, проводится анализ статуса метилирования Срв-островка гена FM?^. Диагноз СЛХ подтверждается при выявлении метилирования промоторной области этого гена.

Применение комплексного взаимодополняемого теста с использованием ПЦР-анализа СОв-триплетов и метилирования Срв островка гена Р'МЯ!

является надежным диагностическим методом и применение его в диагностике СЛХ у мальчиков не требует привлечения других методов ДНК-диагностики. Однако для гетерозиготных носительниц мутантного гена РМЯ1 молекулярно-генетическая диагностика с помощью приведенной выше схемы затруднена из-за наличия у них второй нормальной Х-хромосомы. Методом прямой диагностики СЛХ для них является метод блот-гибридизации по Саузерну или бисульфитная методика. Тем не менее, наличие в семье пробанда лиц мужского пола с точным диагнозом СЛХ позволяет обойтись без этих дорогостоящих, сложных методик в связи с возможностью провести косвенную ДНК-диагностику заболевания путем анализа сегрегации мутантного гена с использованием сцепленных с ним полиморфных динуклеотидных ДНК-локусов /Ж998, ИХ8548, ГЯАХАС!.

7. Комплексная клинико-параклиническая характеристика больных с синдромом ломкой хромосомы X

Кпинико-параклинический анализ проведен ретроспективно на основании данных историй болезней. У детей с СЛХ статистически значимо чаще встречались речевые нарушения (в 44,4% случаев), гипердинамический синдром - у 33,3% больных, по сравнению с общей выборкой УО (12,5% и 7,3%, соответственно) (*®=4,67, р=0,021; ^=4,67, р=0,035). Эмоционально-волевые нарушения выявлены у 22,2% пациентов. По поводу макроорхизма двое больных СЛХ были проконсультированы урологом, даны рекомендации: лечение у эндокринолога. Кроме того, у детей выявлялись характерные лицевые аномалии: большая голова с высоким и широким лбом, большие «оттопыренные» уши, удлиненное лицо с увеличенным подбородком. Наблюдался доброкачественный судорожный синдром, гипердинамический синдром. В личностной структуре больных с СЛХ превалировали черты сенситивности, повышенной чувствительности, смущаемости с быстрым отказом от любого общения, с избеганием визуального контакта. Полученные результаты преобладания среди лиц с СЛХ речевых нарушений, гипердинамического синдрома и макроорхизма согласуются с литературными данными (Hagerman Я. & а1., 1996).

При анализе анамнестических данных было выявлено, что у детей с СЛХ чаще наследственность была отягощена психоневрологическими заболеваниями со стороны матери (33,4%), по сравнению с общей выборкой УО больных (13,9% детей) (Хг=14,67, р=0,0004).

Таким образом, выявлена более высокая частота встречаемости отягощенной наследственности психоневрологическими заболеваниями со стороны матери и характерные клинические признаки СЛХ (речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии у лиц с СЛХ.

Фенотип больных с СЛХ может быть весьма вариабелен и укладываться в общую клиническую картину УО без каких-то четких специфических проявлений, что ставит для врача клинициста невыполнимую задачу по дифференциации синдрома. Это делает весьма актуальным использование молекулярно-генетических диагностических процедур при подозрении на СЛХ.

8. Анализ AIu-инсерционных полиморфных локусов, сцепленных с генами DSCAM, LAMA2 и FACL4, у детей с умственной отсталостью и здоровых доноров из Республики Башкоротостан

С целью выяснения возможной роли аутосомньгх кандидатных генов DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule), LAMA2 (laminin) и X-сцепленного гена FACL4 (Fatty acid-CoA ligase 4) в развитии УО, проведен анализ Ahi-инсерционных полиморфизмов, сцепленных с ними, в выборке из 208 больных УО с исключением из исследования 9 лиц с установленным диагнозом СЛХ. Принимая во внимание генетическую гетерогенность популяций, проживающих в РБ, мы разделили контрольную группу и пациентов с УО на подгруппы по этнической принадлежности (русских, татар, башкир).

В ходе анализа Alu-инсерционного полиморфизма УЬ8 106, сцепленного с геном DSCAM, было установлено, что аллель */ и генотип, гомозиготный по */ (*//*/), выступают как факторы риска развития УО у русских в РБ (OR=l,79, С1% 1,05-3,03, OR=3,Oó С1% 1,03-4,02, соответственно) (рис. 4).

Кроме того, были обнаружены статистически значимые различия в распределении частот аллелей данного полиморфного ДНК-локуса в зависимости от степени выраженности умственной отсталости: между больными с легкой и тяжелой степенью УО. Частота аллеля *1 была выше у больных с тяжелой УО, чем у пациентов с легкими формами УО и составила 42,96% и 27,38%, соответственно 0(2=5,48, р=0,026) (рис. 5).

Данные проведенного исследования свидетельствуют о роли гена DSCAM, предположительно ответственного за развитие УО при синдроме Дауна, в развитии неспецифической У О в Республике Башкортостан.

OR=1.79

OR=3.06

50V,ftl.03-4.02) 40%

Рис. 4. Распределение частот А1и-инсерционных генотипов и аллелей ДНК-локуса УЬ8106, сцепленного с геном ИБСАМ, у детей с УО и здоровых доноров русской этнической принадлежности

II ID DD I D

□ Легкая УО О Умеренная УО ■ Тяжелая УО

Рис. 5. Распределение Alu-инсерционных аллелей и генотипов ДНК-локуса Yb8106, сцепленного с геном DSCAM, у детей с умственной отсталостью в зависимости от степени тяжести заболевания

При сравнении распределения частот генотипов и аллелей Alu-инсерционного полиморфизма Ya5 491, сцепленного с геном LAMA2, у больных УО с контрольной группой выявлены статистически значимые различия в группе башкир ($=4,99, р=0,025; $=6,34, р=0,042). Так, *! аллель идентифицировался на 46,39% хромосом у больных УО по сравнению с 38,24% у здорового контроля (OR=l,34, С1% 1,03-1,89).

Частота генотипа *1/*1 была выше в группе больных УО (25,9%), чем в здоровом котроле (8,33%) (011=2,85, С1% 0,47-22,2). Установлено, что аллель *1 и генотип *//*/ являются факторами риска развития УО. Аллель и генотип Ю/Ю являются генетическими маркерами пониженного риска для развития УО (рис. 6).

70%1 60%

50% Í3R=2.85 40.^0.47-22.2)

И *

ОЯ=1Л4

□ Контроль ИУО

Рис. 6. Распределение частот Alu-инсерционных генотипов и аллелей ДНК-локуса Ya5 491, сцепленного с геном LAMA2, у детей с УО и здоровых доноров башкирской этнической принадлежности

Кроме того, проведен анализ Л/м-инсерционного полиморфизма УЬ8МВС578, сцепленного с геном РАСЫ, локализованным на Х-хромосоме у больных УО и здоровых доноров из РБ. Статистически значимых различий в распределении частот аллелей Л/и-инсерционного полиморфизма, сцепленного с геном РАС 14, между сравниваемыми группами в результате анализа не выявлено (р>0,05). Частота Аллеля */ была почти фиксированной и составляла 95,9% в контроле и 95,12% у больных УО, что указывает на неинформативность данного локуса в этнических группах РБ.

Таким образом, выявленная нами ассоциация по А1и-инсерционным полиморфным ДНК-локусам УЬ8 106, сцепленному с геном ИБСАМ, с развитием УО у русских и Уа5 491, сцепленному с геном 1АМА2, - у башкир подтверждает, что вышеуказанные гены являются аутосомными кандидатными генами УО и играют существенную роль в патогенезе данного расстройства.

9. Анализ ассоциаций полиморфизма гена аполипопротеина Б, 5ТЛ-полиморфизма гена С/нй5 и 5860Т полиморфизма в гене САВНС2 с развитием умственной отсталости

При сравнительном анализе распределения частот аллелей полиморфизма гена аполипопротеина Е между выборками больных УО и здоровых лиц в зависимости от этнического происхождения были обнаружены статистически значимые различия между больными УО и контрольной группой татарской этнической принадлежности (х2=7,75, р=0,016). Аллель АроЕ*2 чаще встречался у больных УО (на 11,82% хромосом) по сравнению с контрольной выборкой татар (на 4,04%) (011=3,18, С1% 1,8-8,74) (рис. 7).

*2 '3 *4

□ Контроль ■ Больные

Рис. 7. Распределение частот аллелей полиморфизма гена АроЕ у детей с УО и здоровых доноров татарской этнической принадлежности

Проведен анализ БТЯ-полиморфизма гена Я5 субъединицы каинатного рецептора глутамата 01иЯ5. Выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей между больными УО татарской этнической принадлежности и соответствующим контролем (х2=11,8, Р=0,020). Аллель С1иЯ5*1 встречался чаще у больных с УО - в 17,65% случаев, в отличие от 8,33% в контрольной группе (ОЯ=2,36, С1% 1,07-5,22). На основе анализа полученных данных можно заключить, что присутствие аплеля С1иЯ5*1 БТО-полиморфизма гена ЫиЯ5 в этнической группе татар ассоциировано с повышенным риском развития УО (рис. 8).

'1 *2 *3 *4 *5

О Контроль ■ Больные УО

Рис. 8. Распределение частот аллелей ¿ТЯ-полиморфизма гена 01иЯ5 у детей с УО и здоровых доноров татарской этнической принадлежности

При сравнении распределения частот аллелей и генотипов 586С>Т полиморфизма в гене 0АВЯ02 между больными с УО и контрольной группой в целом, а также при разделении их по этнической принадлежности статистически значимых отличий не выявлено (р>0,05).

Обнаруженные в результате проведенного исследования генетические ассоциации при умственной отсталости могут не только применяться для прогноза типа течения, тяжести и риска развития заболевания в различных этнических группах, но и послужить основой для дальнейшего изучения кандидатных генов УО.

ВЫВОДЫ:

1. Установлена неравномерность территориального распространения умственной отсталости в Республике Башкортостан и рост заболеваемости данного расстройства за последние 5 лет среди детского населения в сельской местности республики в 2,5 раза.

2. Обнаружено 18 вариантов аллелей СвО-повторов в гене РМШ с бимодальным распределением их частот в этнических группах русских и татар, что соответствует таковому в большинстве изученных европейских популяций.

3. Выявлены существенные различия в распределении частот аллелей динуклеотидных полиморфизмов ВХ$998, ОХБ548, РЯАХАС!, сцепленных с

геном FMR1, и гаплотипов DXS548-FRAXAC1 между больными с синдромом ломкой хромосомы X и здоровыми донорами.

4. Разработан эффективный протокол молекулярно-генетической диагностики синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, заключающийся в предварительном выявлении индивидов, не имеющих нормального аллеля гена FMR1, с последующей оценкой у них статуса метилирования CpG-островка.

5. Установлено, что частота синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан составляет 4,2% среди больных умственной отсталостью.

6. Выявлены характерные клинические особенности у больных с синдромом ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии.

7. Обнаружена ассоциация умственной отсталости с аллелями *1 и генотипами *!/*/ по Alu-инсерционным полиморфным локусам: Yb8106, сцепленному с геном DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule), - у русских и Ya5 491, сцепленному с геном LAMA2 (Laminin), - у башкир.

8. Показано, что генетическими маркерами повышенного риска развития умственной отсталости у татар является аллель АроЕ*2 гена аполипопротеина Е и аллель GluR5*l гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата GluR5.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. На основании результатов проведенного исследования СЛХ разработан протокол диагностики СЛХ, по которому на первом этапе цитогенетическими методами исключаются численные хромосомные аномалии, после чего проводится анализ CGG-повторов в гене FMR1. У лиц с отсутствием продукта амплификации, косвенно указывающим на носительство мутантного аллеля, проводится анализ метилирования CpG-островка данного гена. Вышеуказанный протокол может быть рекомендован для медико-генетического консультирования.

2 Выраженная ассоциация аллеля DXS548*50 полиморфного локуса DXS548, аллеля FRAXAC1*40 полиморфного локуса FRAXAC1, аллеля DXS988*36 полиморфного локуса DXS988 и гаплотипа 42-36 (DXS548-

FRAXAC1) с экспансией CGG-повторов в гене FMR1 позволяет использовать данные маркеры для косвенной диагностики CJIX.

3. Выявлены генетические маркеры риска развития тяжелой УО: аллели */ и генотипы *!/*! по Alu-инсерционному полиморфизму, сцепленному с геном DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule). Результаты проведенного исследования могут быть использованы для прогноза тяжести течения заболевания у больных УО из Республики Башкортостан.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Исламгулов Д. В., Карунас А. В., Валинуров Р. Г., Хуснутдинова Э. К. Х-сцепленная умственная отсталость // Труды научно-практического семинара «Состояние и перспективы развития психиатрической, психиотерапевтической и социально-психологической службы Республики Башкортостан»,- 2003.- с.28-29.

2. Исламгулов Д. В., Карунас А. В., Валинуров Р. Г., Хуснутдинова Э. К. Клинико-генетические аспекты синдрома ломкой Х-хромосомы // Журнал неврологии и психиатрии им. А.С.Корсакова. - 2005. - Т.8. - с. 69-74.

3. Islamgulov D., Karunas A., Valinurov R., Khusnutdinova E. Analysis of alu-insertion polymorphism of the DSCAM gene in children with non-specific mental retardation in Volgo-Ural region of Russia (Анализ Alu-инсерционного полиморфизма гена DSCAM у детей с неспецифической умственной отсталостью в Волго-Уральском регионе России) // Human Genome Meeting. Berlin. - 2004.- P.112

4 Islamgulov D., Karunas A., Valinurov R., Khusnutdinova E. Molecular analysis of the Fragile X mental retardation syndrome in Volga-Ural region of Russia (Молекулярный анализ синдрома ломкой хромосомы X в Волго-Уральском регионе России) // European J of Human Genetics. - 2004.- V.12. - P.124

5. Хуснутдинова Э. К., Хидиятова И. М., Викторова Т.В., Хусаинова Р.И., Карунас А.С., Корытина Г.Ф., Ахметова В.Л., Гилязова И.Р., Джемилева Л.У., Исламгулов Д.В., Валиев P.P., Кутуев И.А. Молекулярно-генетическое изучение наследственной патологии в Волго-Уральском регионе // Вестник ВОГИС. -2005. - Т.6. - с.37- 41.

6. Исламгулов Д. В., Карунас А. В., Валинуров Р. Г., Хуснутдинова Э. К. Генетика синдрома ломкой Х-хромосомы II Труды конференции «Н.И. Вавилов

и современная генетика», посвященная 115-летию со дня рождения и 65-летию со дня смерти академика Н.И. Вавилова.- 2005. - с.25 - 38.

7. Исламгулов Д. В., Карунас А. В., Валинуров Р. Г., Хуснутдинова Э. К. Молекулярно-генетическое изучение синдрома ломкой Х-хромосомы в Башкортостане // Медицинская генетика. - 2005. - Т.5. - 197с.

8. Исламгулов Д. В., Карунас А. В., Валинуров Р. Г., Хуснутдинова Э. К. Изучение умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X, в Башкортостане // Труды научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспирементальной медицины» СПб. -2005. -С.452- 454.

9. Islamgulov D., Karunas A., Valinurov R., Khusnutdinova E. Frequency of the Fragile X syndrome in mentally retarded children of Bashkortostan (Частота синдрома ломкой хромосомы X среди умственно отсталых детей в Башкортостостане) // XHIth World congress of psychiatry. - 2005. - P. 238.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

РБ - Республика Башкортостан

СЛХ - синдром ломкой хромосомы X

УО - умственная отсталость

7-deazaGTP - 7-деаза-гуанидин трифосфат

FMR1 - (fragile mental retardation 1) - ген синдрома ломкой хромосомы X FRAXA - фолатчувствительный ломкий участок А на Х-хромосоме

у"

т

I,

г

Исламгулов Денис Владимирович

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОН ИССЛЕДОВАНИЕ УМСТВЕННОЙ ОТСТАЛОСТИ В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН

14.00.18 - «Психиатрия» 03 00.15 - «Генетика» (медицинская)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КС «ПроКОПИй». г. Уфа, ул. Ленина, 174 Св-во № 304027802800031.

Подписано в печать 17.11.2005. Формат 84x1081/32- Гарнитура Тайме Объем 2,2 усл. печ л Уч.-изд. л. 2,35 Тираж 150 экз Заказ №386

Р2429 f

РНБ Русский фонд

2006-4 26730

Умственная отсталость (УО) является одним из наиболее распространенных во всем мире психических расстройств, в этиопатогенезе которого, несмотря на изучение этой патологии на протяжении многих лет, остается много неясного.

Актуальность проблемы связана с высокой распространенностью и значительным ростом данного психического расстройства за последние годы. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, распространенность умственной отсталости в мире характеризуется пораженностью 3% населения всех возрастов. Высок процент инвалидизации больных с данной патологией. Больные с умственной отсталостью составляют треть лиц, признанных инвалидами по психическому заболеванию. Данные контингенты в большей степени подвержены алкоголизации, чаще становятся жертвами эксплуатации, физических и сексуальных оскорблений, совершают противоправные действия, что определяет важное социально-экономическое значение этой проблемы.

Умственная отсталость (УО) отличается выраженной генетической и клинической гетерогенностью и может быть следствием влияния многих факторов, нарушающих развитие и созревание мозга. Эти факторы многочисленны - как внешнесредовые экзогенные, так и эндогенные, наследственно обусловленные. Почти четверть всех форм УО в популяциях человека обусловлена генетическими факторами. Наследственная УО в большинстве случаев является Х-сцепленной. В настоящее время известно более 40 генов синдромальной и 23 гена неспецифической Х-сцепленной умственной отсталости [Mandel J. et al., 2004]. Самой распространенной причиной умственной отсталости, сцепленной с X хромосомой, является синдром ломкой хромосомы X (CJIX). По данным эпидемиологических исследований, частота CJIX в популяциях Европы составляет 1 на 4 000-6 000 мужчин и 1 на 7000-10000 женщин [Crawford D. et al., 2001]. Для данного синдрома характерна варьирующая экспрессивность и неполная пенетрантность (80% у мужчин и 30% у женщин) [Warren S. et al., 2000].

Заболевание ассоциировано с ломким участком Х-хромосомы FRAXA (Fragile site, X chromosome, A site), локализованным в области Xq27.3. Основной причиной развития CJIX является экспансия CGG-повторов, располагающихся в 5'-нетранслируемой области (5-UTR) гена FMR1 (Fragile X Mental Retardation-1) [Jin P et al., 2000]. Изучение данной патологии активно проводится как в нашей стране, так и за рубежом, что связано не только с ее большой распространенностью, но и с тем, что исследование молекулярных основ подобного заболевания, вызванного мутациями в одном гене, может помочь в раскрытии механизмов развития умственной отсталости в целом [Стрельников В. с соавт., 2000; Толмачева Е. с соавт., 2001; Curlis Y et al., 2005].

Трудность постановки клинического диагноза и отсутствие эффективных средств для лечения больных с CJIX определяет особую значимость выявления больных и медико-генетического консультирования родственников. Очевидна также необходимость разработки эффективного протокола диагностики и скрининга, который позволит снизить распространённость синдрома ломкой хромосомы X в популяциях.

Второй по частоте после CJ1X формой Х-сцепленной УО является F-K/ОЖ-ассоциированная УО. Молекулярная основа данного расстройства связана с расширением CCG-повторов в промоторной области гена FMR2 (Fragile X Mental Retardation-2).

В генез наследственно обусловленной УО существенный вклад вносят таюке множество аутосомных генов-кандидатов. Белковые продукты которых вовлечены, в основном, в развитие и созревание нервной системы. Причины мутаций, приводящих к наиболее распространённым наследственно обусловленным формам УО, изучены недостаточно, а существующие методы лабораторной диагностики трудоемки, дорогостоящи и не могут быть использованы для широкого скрининга. Молекулярная диагностика мутаций, приводящих к наследственным формам УО, в лабораторной практике нашей страны в настоящее время используется недостаточно и малоэффективно.

Обнаружение всех генов, а вернее генных сетей, вовлеченных в патогенез умственной отсталости, должно пролить свет на молекулярные и клеточные механизмы нормального умственного развития у человека и способствовать разработке современных методов диагностики, профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся умственной отсталостью.

В связи с вышесказанным целью настоящего исследования явилось эпидемиологическое, клинико-параклиническое и молекулярно-генетическое изучение умственной отсталости в Республике Башкортостан.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать эпидемиологическую ситуацию по умственной отсталости в Республике Башкортостан и проанализировать клинические особенности больных умственной отсталостью.

2. Провести анализ метилирования CpG островков гена синдрома ломкой хромосомы X (FMR1) и гена Т^&^Ж-сцепленной УО (FMR2 ) у больных с умственной отсталостью.

3. Провести анализ CGG-повторов в гене FMR1 у больных умственной отсталостью и здоровых доноров.

4. Провести исследование полиморфных ДНК-локусов DXS998, DXS548, FRAXA С1, сцепленных с геном синдрома ломкой хромосомы X (FMR1), и анализ гаплотипов по локусам DXS548-FRAXAC1 у больных синдромом ломкой хромосомы X и здоровых доноров.

5. Проанализировать клинические особенности больных синдромом ломкой хромосомы X и оценить частоту данного расстройства в Республике Башкортостан.

6. Провести анализ ассоциаций ^/м-инсерционных полиморфных локусов, сцепленных с генами DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule), LAMA2 (Laminin) и FACL4, с умственной отсталостью.

7. Провести анализ ассоциаций полиморфизма генов аполипопротеина Е (АроЕ), STR-полиморфизма гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата (GluR5) и 586С>Т полиморфизма в гене субъединицы у2 рецептора ГАМК (GABRG2') с развитием умственной отсталости.

Научная новизна

Впервые проведен анализ метилирования CpG-островков гена синдрома ломкой хромосомы X (FMR1) и гена Т^/^ЛХБ-сцепленной УО (FMR2 ) у больных с умственной отсталостью из РБ. Впервые проведен анализ полиморфизма CGG-повторов в гене FMR1 у здоровых доноров русского и татарского происхождения, проживающих в РБ. Впервые в Республике Башкортостан проведено исследование полиморфных микросателлитных маркёров DXS998, DXS548, FRAXAC1 и гаплотипов DXS548-FRAXAС1 у больных с СЛХ и здоровых доноров, что позволит использовать их в косвенной диагностике синдрома ломкой хромосомы X. С помощью комплекса молекулярно-генетических методов исследования определена частота встречаемости СЛХ среди лиц с УО и распространенность СЛХ в целом по Республике Башкортостан. Впервые выявлена ассоциация УО с полиморфными вариантами генов DSCAM, Laminin, АроЕ, GluR5.

Практическая значимость работы.

В результате выполненного исследования разработан протокол диагностики и скрининга СЛХ двумя методами, включающими молекулярно-генетический анализ числа CGG-повторов и степени метилирования CpG-островка промоторной области гена FMR1. Данный протокол успешно реализуется при диагностике СЛХ в ПЦР-лаборатории на базе Республиканской психиатрической больницы МЗ РБ и медико-генетической консультации Республиканского перинатального центра РБ. Подробно представлены материалы комплексного клинико-параклинического обследования больных с синдромом ломкой хромосомы X, ранее не описанных в Республике Башкортостан. Установлен ряд особенностей клинической картины у больных с СЛХ. Выявленные клинические особенности у больных с СЛХ позволяют расширить представление о фенотипических вариациях и помогут дифференцировать синдром ломкой хромосомы X на клиническом уровне. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с внедрением в общеклиническую практику молекулярно-генетических методов, используемых в пренатальной, ранней диагностике и скрининге наследственных форм умственной отсталости. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов медицинской генетики на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Положения, выносимые на защиту.

1. Неравномерность территориального распространения умственной отсталости в Республике Башкортостан и рост заболеваемости данного расстройства в 2,5 раза за последние 5 лет среди детского населения сельской местности республики.

2. Существенные различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфных локусов DXS998, DXS548, FRAXA С1, сцепленных с геном FMR1, и гаплотипов DXS548-FRAXAC1 между больными с синдромом ломкой хромосомы X и здоровыми донорами.

3. Эффективный протокол молекулярно-генетической диагностики синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, заключающийся в предварительном выявлении индивидов, не имеющих нормального аллеля гена FMR1, с последующей оценкой у них статуса метилирования CpG-островка данного гена.

4. Частота синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, составляющая 4,2% среди больных умственной отсталостью.

5. Характерные клинические особенности у больных с синдромом ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии.

6. Ассоциация аллелей *1 и генотипов *//*/ по Alu-инсерционным полиморфизмам, сцепленным с генами DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule) и LAMA2 (Laminin), с развитием умственной отсталости.

7. Генетические маркеры повышенного риска развития умственной отсталости у татар: аллель АроЕ*2 гена аполипопротеина Е и аллель GluR5*l гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата GlnR5.

Публикаиии

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Выводы

1. Установлена неравномерность территориального распространения умственной отсталости в Республике Башкортостан и рост заболеваемости данного расстройства за последние 5 лет среди детского населения в сельской местности республики в 2,5 раза.

2. Обнаружено 18 вариантов аллелей CGG-повторов в гене FMR1 с бимодальным распределением их частот в этнических группах русских и татар, что соответствует таковому в большинстве изученных европейских популяций.

3. Выявлены существенные различия в распределении частот аллелей и генотипов динуклеотидных полиморфизмов DXS998, DXS548, FRAXAC1, сцепленных с геном FMR1, и гаплотипов DXS548-FRAXAC1 между больными с синдромом ломкой хромосомы X и здоровыми донороми.

4. Разработан эффективный протокол молекулярно-генетической диагностики синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан, заключающийся в предварительном выявлении индивидов, не имеющих нормального аллеля гена FMR1, с последующей оценкой у них статуса метилирования CpG-островка.

5. Установлено, что частота синдрома ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан составляет 4,3% среди больных умственной отсталостью.

6. Выявлены характерные клинические особенности у больных с синдромом ломкой хромосомы X в Республике Башкортостан: речевые нарушения (общее недоразвитие речи, дизартрия, персеверации), лицевые аномалии.

7. Обнаружена ассоциация аллелей */ и генотипов *//*/ по Alu-инсерционным полиморфизмам, сцепленным с генами DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule) и LAMA2 (Laminin), с развитием умственной отсталости.

8. Показано, что генетическими маркерами риска развития умственной отсталости у татар является аллель АроЕ*2 гена аполипопротеина Е и аллель GluR5*l гена субъединицы R5 каинатного рецептора глутамата GluR5.

Практические рекомендации

1. На основании результатов проведенного исследования СЛХ разработан протокол диагностики СЛХ, по которому на первом этапе цитогенетическими методами исключаются численные хромосомные аномалии, после чего проводится анализ CGG-повторов в гене FMR1. У лиц с отсутствием продукта амплификации, косвенно указывающим на носительство мутантного аллеля, проводится анализ метилирования CpG-островка данного гена. Вышеуказанный протокол может быть рекомендован для медико-генетического консультирования.

2. Выраженная ассоциация аллеля DXS548*50 полиморфного локуса DXS548, аллеля FRAXAC1*40 полиморфного локуса FRAXAC1, аллеля DXS988*36 полиморфного локуса DXS988 и гаплотипа DXS548-FRAXAC1 4236 с экспансией CGG-повторов в гене FMR1 позволяет использовать данные маркеры для косвенной диагностики СЛХ.

3. Выявлены генетические маркеры риска развития тяжелой УО: аллели */ и генотипы *//*/ по Alu-инсерционному полиморфизму, сцепленному с геном DSCAM (Down syndrome cell adhesion molecule). Результаты проведенного исследования могут быть использованы для прогноза тяжести течения заболевания у больных УО из Республики Башкортостан.