Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клинико-генетические особенности бронхиальной астмы у больных с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей

На правах рукописи 0

Наумов Денис Евгеньевич

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У БОЛЬНЫХ С ХОЛОДОВОЙ ГИПЕРРЕАКТИВНОСТЬЮ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ

14.01.04 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

2 8 НОЯ 2013

Владивосток - 2013

005540642

005540642

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Колосов Виктор Павлович

Официальные оппоненты:

Гельцер Борис Израилевич - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального обрщования «Владивостокский государственный университет экономики и сервиса», первый проректор.

Шакирова Ольга Викторовна - доктор медицинских наук, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный федеральный университет», Школа искусства, культуры и спорта, кафедра теории и методики адаптивной физической культуры, заведующая кафедрой.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «26» декабря 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.04 при ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (690002, г. Владивосток, пр-т Острякова, 2).

■ Автореферат разослан « /е » ноября 2013 года.

Учёный секретарь лЛР

диссертационного совета (¡^ИпШм Кондрашова Надежда Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время в мире отмечается практически повсеместный рост заболеваемости бронхиальной астмой (БА), вместе с тем, проблема терапии заболевания решена далеко не полностью. Это подтверждается сообщениями о недостаточном уровне контроля более чем у 50% больных (A.C. Белевский и соавт., 2007; Н.М. Ненашева, 2007; В.В. Архипов и соавт., 2011; Е.А. Собко и соавт., 2011; J.L. Desfougeres et al., 2007). Плохой контроль, в свою очередь, не только отягощает текущее состояние здоровья больного и существенно снижает качество жизни, но и является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении будущих обострений БА (Н. Chen et al., 2007; E.D. Bateman et al., 2010). Контролируемое течение заболевания означает не только внешнее благополучие пациента, связанное с отсутствием симптомов, но также контроль воспаления и реактивности дыхательных путей.

Феномен гиперреактивности рассматривается как фактор риска развития и прогрессирования БА, поскольку является одним из основных патогенетических механизмов формирования флюктуирующей бронхиальной обструкции. Холодный воздух, как один из естественных триггеров, способен провоцировать появление симптомов у значительной части больных БА (А.Г. Приходько, A.B. Колосов, 2008). Учитывая неблагоприятный климатический фон, характерный для регионов Сибири, Крайнего Севера и Дальнего Востока, проблему холодовой гиперреактивности дыхательных путей (ХГДП) необходимо признать актуальной и клинически значимой. Несмотря на то, что этиология и патогенез ХГДП во многом остаются еще не изученными, достигнутые успехи в этом направлении указывают на гетерогенность причинных факторов и механизмов ее формирования (А.Г. Приходько, Ю.М. Перельман, В.П. Колосов, 2011). Известно, что наследственная предрасположенность может играть достаточно важную роль в формировании гиперреактивности дыхательных путей (ГДП). По данным близнецовых исследований и исследований среди семей больных БА, наследуемость ГДП как признака составляет от 30 до 66% (R.J. Hopp et al., 1984; L.J. Palmer et al., 2000). В связи с этим, представляется вероятным, что в качестве причинного фактора ХГДП может выступать ряд врожденных генетических детерминант. Среди них можно особо выделить ген ADRB2, кодирующий белок ß2-адренорецепторов, и ген TRPM8, несущий информацию о структуре восьмого представителя меластатинового семейства катионных каналов с транзиторным рецепторным потенциалом.

Дефекты структуры или экспрессии белка р2-адренорецептора, как прави-

ло, приводят к изменению нормального контроля бронхиального тонуса, что сопровождается изменением ответа на терапевтические и бронхоконстрикторные воздействия. Нарушения в гене ТЯРМ8, вероятно, могут способствовать модуляции холодовой чувствительности, повышая или снижая её. В литературе отсутствуют данные о связи генов АОЯВ2 и ТЯРМ8 с клинико-функциональными особенностями БА у больных, проживающих в условиях холодного климата. Остаются также нераскрытыми генетические предпосылки к формированию ХГДП.

Таким образом, выяснение взаимоотношений молекулярно-генетических, клинических и функциональных параметров у больных БА с ХГДП является важной задачей, решение которой позволит лучше понимать механизмы патологического процесса, а также разработать новые диагностические методы и оптимизировать фармакотерапию у этой категории пациентов.

Цель исследования состояла в изучении клинико-функциональных, молекулярных и генетических особенностей у больных БА с ХГДП, и определении их роли в прогнозировании формирования ХГДП и клинического течения заболевания.

Задачи исследования

1. Изучить особенности клинического течения и показателей вентиляционной функции легких у больных БА во взаимосвязи с характером и выраженностью ХГДП.

2. Исследовать изменения функциональной активности (Зг-адренорецеп-ции у больных БА с ХГДП.

3. Изучить вклад однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов АВЯВ2 и ТЯРМ8 в формирование особенностей клинического течения заболевания и развитие ХГДП у больных БА,

4. Установить роль полиморфизма А^16С1у гена АВЯВ2 в развитии функциональной недостаточности Рг-адренорецепции у больных БА с ХГДП.

5. Разработать способы прогнозирования формирования ХГДП и течения БА с использованием клинических, молекулярно-генетических и функциональных предикторов.

Научная новизна. Получены данные о характерных клинических особенностях БА у больных с ХГДП, свидетельствующих о её негативном влиянии на клиническую картину заболевания. Впервые проведен ассоциативный анализ и описано влияние изменчивости генов АБКВ2 и ТЯРМ8 на фенотипические проявления ХГДП при БА: выявлена ассоциация А^16А^ гомозиготного генотипа

и гетерозиготного носительства по ОНП с.75(Ю>С с выраженным снижением бронхиальной проходимости в ответ на бронхопровокацию с изокапнической гипервентиляцией холодным воздухом (ИГХВ). Установлен вклад генетической детерминации в формирование нарушений функциональной активности р2-адренорецепторного комплекса у больных БА с ХГДП. Описана взаимосвязь Аг§16А^ полиморфного варианта гена АОКВ2 с более тяжелым клиническим течением БА, что использовано в разработке способов прогнозирования ХГДП и течения БА в условиях низких сезонных температур с учётом клинико-функциональных предикторов.

Практическая значимость. Генотипирование ОНП /Ш&В2:р.А^16С1у и ТЯРМ8:сЛ500>С представляет метод, доступный любой генетической лаборатории и может использоваться для определения групп риска по развитию ХГДП и неконтролируемому течению БА. Разработанные комплексные математические модели, включающие дополнительные клинико-функциональные предикторы, позволяют осуществлять прогнозирование ХГДП и клинического течения БА с высокой эффективностью. Получен патент РФ на изобретение №2489086 «Способ прогнозирования риска формирования холодовой гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой».

Положения, выносимые на защиту

1. ХГДП у больных БА является фактором, отягощающим течение заболевания в неблагоприятных условиях холодного климата, что находит отражение в большей частоте неконтролируемого течения, большей частоте и выраженности респираторных симптомов, а также снижении показателей функции внешнего дыхания.

2. Генотип Аг§16Аг§ и аллель Аг§16 гена А ОКБ2 значимо ассоциированы с ХГДП вне зависимости от пола и возраста.

3. Особенности функциональных нарушений р2-адренорецепторного комплекса при ХГДП имеют генетическую детерминацию. Генотип Ащ16А^ предрасполагает к снижению активности р2-адренорецепторов (по динамике стимулированной концентрации циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)), что сопровождается выраженными вентиляционными нарушениями в ответ на ИГХВ.

4. ОНП с.7500С гена ТЯРМ8 - генетический фактор, предрасполагающий к формированию ХГДП у больных БА. Носительство ОС гетерозиготного генотипа связано с ХГДП и сопровождается значительным снижением функции внешнего дыхания при ИГХВ.

5. Разработанная математическая модель, использующая информацию о молекулярно-генетических особенностях, влиянии ингаляционных глюкокорти-костероидов (ИГКС) и обратимости бронхиальной обструкции позволяет прогнозировать вероятность формирования ХГДП у больных БА.

6. Данные о генотипе по ОНП ADRB2:p.ArglôGly в сочетании с клиническими предикторами дают возможность прогнозировать динамику контроля БА на протяжении 6 месяцев.

Личный вклад соискателя. Автором диссертационного исследования были разработаны протокол исследования и тематическая карта пациента, проведено собеседование с больными и осмотр обследованного контингента; выполнены клинические, функциональные и молекулярно-генетические исследования, включая генотипирование ОНП генов ADRB2 и TRPM8. Единолично проведена статистическая обработка материала. Доля участия автора в сборе материала-90%, в анализе и систематизации полученных данных - 100%.

. Апробация работы. Материалы, основные положения и выводы диссертации были представлены и обсуждены на заседании Ученого совета ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН (2011), научной конференции «Молодые ученые -науке» (Благовещенск, 2011), IV Съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока (Благовещенск, 2011), XXI Ежегодном Конгрессе Европейского респираторного общества (Амстердам, 2011), XXI Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Уфа, 2011), научной конференции «Молодые ученые - науке» (Благовещенск, 2012), молодежной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (Благовещенск, 2012), XXII Ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Вена, 2012), XXII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2012).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 56 таблиц и 8 рисунков. Состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, материалы и методы исследования, 2 главы собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, содержащего 31 работу отечественных и 248 работ зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследование больных проводилось на базе пульмонологического отделения клиники ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН. Все исследования были проведены в соответствии с «Правилами клинической практики в Российской Федерации», с учетом требований Хельсинской декларации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов», и одобрены комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «ДНЦ ФПД» СО РАМН. Диагноз Б А выставлялся согласно Международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) в соответствии с критериями Глобальной инициативы по бронхиальной астме (GINA, 2010).

При поступлении в стационар всем больным производился сбор жалоб, анамнеза заболевания и жизни, а также объективный осмотр. Информация о жалобах и анамнезе заносилась в специально подготовленную анкету. Для оценки контроля над заболеванием больным предлагалось заполнить валидизированный тест по контролю над астмой - Asthma Control Test (Quality Metric Inc., 2002). Производился сбор данных о получаемой фармакотерапии: тип, длительность приема и суточные дозы препаратов базисной терапии (в том числе, ИГКС и длительнодействующих Рг-агонистов (ДЦБА)) и частота использования бронхо-литиков (р2-адреномиметиков) короткого действия. Объективный осмотр включал оценку общего состояния, осмотр кожных покровов и слизистых оболочек рта и носа, визуальную оценку формы грудной клетки, оценку участия вспомогательной мускулатуры в акте дыхания. Методами пальпации, перкуссии и аускультации проводилась диагностика состояния органов дыхания и сердечнососудистой системы: подсчитывалась частота дыхания и сердечных сокращений, определялись границы легких и сердца, выслушивались дыхательные шумы и сердечные тоны. Оценка функции внешнего дыхания проводилась методом спирографии на аппарате «FlowScreen» (Erich-Jaeger, Германия) исходно, а также в динамике, после проведения бронходилатационной пробы с фенотеролом и бронхопровокационной пробы с 3-минутной ИГХВ (5% С02, -20°С). Проба считалась положительной, если сразу после ингаляции холодного воздуха объём форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ,) уменьшался на 10% и более от исходной величины.

С целью изучения функциональной активности (Зг-адренорецепторов была использована модель лимфоцитов периферической крови. Оценка функциональной активности Рг-адренорецепторов осуществлялась по уровню прироста концентрации цАМФ в лимфоцитах после их стимуляции адреналином. Количество

стимулированного цАМФ определяли радиоиммунологическим методом с использованием наборов Cyclic AMP Assay kit («Amersham», Великобритания).

Генотипирование полиморфизма Argl6Gly (c.46A>G, rsl042713) гена ADRB2 осуществлялось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с анализом полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов. Генотипирование гена TRPM8 проводилось по четырем полиморфным сайтам. Анализ ОНП c.750G>C (rsl 1562975), c,1256G>A (rs7593557) и c.3174C>G (rsll563071) проводили с помощью аллель-специфической ПЦР. Детекцию ОНП с.3048С>Т (rsl 1563208) осуществляли с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с рестриктазой TaqI («Сибэнзим», г. Новосибирск).

Статистическая обработка производилась с использованием параметрических и непараметрических статистических методов в программных пакетах Statistica 6.1 (StatSoft, Inc. 2003), NCSS (Hintze. J. 2007), SPSS for Windows версия 17.0.0 (SPSS Inc. 2008). Данные представлены в виде M±m для нормально распределенных величин (где М - среднее арифметическое, ш - стандартная ошибка среднего), либо Me (ql; q3) для величин, распределение которых не подчинялось нормальному закону (где Me - медиана, ql и q3 - нижний и верхний квартили соответственно).

Было обследовано 136 больных персистирующей БА легкой и средней степени тяжести, из них 42 мужчин (31%) и 94 женщин (69%) европеоидной расы от 19 до 63 лет (средний возраст 37,8±0,89 лет). Преобладали больные смешанной формой БА (51,5% - 70 человек), больных аллергической и неаллергической БА было соответственно 44 (32,3%) и 22 (16,2%). 48 человек (35% обследованных) имели легкую персистирующую БА, 88 (65%) - среднюю степень тяжести заболевания. Большинство больных исследуемой выборки имели неконтролируемое течение БА - 106 (77,9%), гораздо меньшее число пациентов демонстрировали частичный (24 человека - 17,6%) или полный контроль (6 человек - 4,5%). Средний уровень контроля среди больных неконтролируемой БА составил, по данным ACT, 13,9±0,34 баллов. Для больных с частичным контролем соответствующий показатель достигал 22,0±0,29 баллов. 60 пациентам проводилась динамическая оценка клинико-функциональных показателей на фоне шестимесячного курса стандартной комбинированной базисной терапии. Первичное обследование проводилось в осенне-зимний период. В качестве базисной терапии использовались ИГКС (бекламетазона дипропионат, будесонид) и ДДБА (формотерол), в рекомендуемых дозах, соответствующих тяжести заболе-. вания. Средние дозы для пациентов с легкой персистирующей БА составили 250

мкг (в пересчете на бекламетазон), а при средней степени БА - 500-750 мкг. Суточная доза формотерола составляла 18 мкг. Среди других 60 больных, выделенных в отдельную подгруппу, проводилась оценка функционального состояния р2-адренорецепторов на модели лимфоцитов периферической крови.

По результатам пробы с ИГХВ формировались основные группы: в группу 1 были включены больные с положительной, а в группу II — с отрицательной реакцией на холодовую бронхопровокацию. В результате в I группу вошли 50 больных БА (37%) с ХГДП, а во II группу - 86 больных (63%) без объективных признаков ХГДП. Анализ уровня контроля заболевания, оцененный согласно критериям вопросника АСТ, показал существенные различия в соотношении контролируемого, частично-контролируемого и неконтролируемого течения БА у пациентов двух групп. Больные группы I были представлены неконтролируемой БА в 92% случаев, в то время как в группе И их было около 70%. Кроме того, во второй группе также присутствовали пациенты с контролируемым течением заболевания (6 человек), полностью отсутствовавшие в группе I. Средний балл АСТ также отличался более низким значением для первой группы больных, чем для второй: 14 (10; 15) и 18 (14; 21), соответственно (р<0,001). Обнаруженные ассоциации свидетельствуют о предрасположенности больных с ХГДП к неконтролируемому течению БА, поскольку сама ХГДП является фактором, затрудняющим контроль заболевания.

Низкие показатели контроля БА в группе I находили свое отражение в большей частоте и выраженности симптомов у данных пациентов. Половина больных первой группы испытывали дневные приступы удушья, по крайней мере, один раз в день ежедневно, тогда как во II группе этот показатель приближался лишь к 20%. Аналогичная картина наблюдалась с ночными приступами -по 24 % больных группы I испытывали приступы удушья каждую ночь или от 3 до 6 ночей в неделю; для второй группы доля таких пациентов составила около 7% и 11% соответственно. Среднее число дневных и ночных приступов также значимо отличалось, с преобладанием большей их частоты в группе I (р<0,01). Кроме этого, достоверные отличия в интенсивности симптомов, с преобладанием в первой группе, были выявлены для дневного кашля (х2=33,19, р<0,001), хрипов (^=18,61, р<0,001) и одышки (^=12,52, р<0,01).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среди обследованных больных для генотипов Аг§16Аг§, А^1601у и С1у1601у частоты составили соответственно 20,6%, 45,6% и 33,8%. А^16 и С1у16 аллели были представлены в 43,4% и 56,6% случаев.

Генотип Arg 16Arg был существенно чаще представлен в группе I (36%), в то же время частота встречаемости генотипа Glyl6Gly в первой группе была в 2 раза ниже в сравнении с группой [I (20% и 41,9%, соответственно); найденные различия были высоко значимы (р=0,001). Кроме этого, были обнаружены достоверные изменения в распределении частоты аллелей между основными группами - Arg 16 аллель был преимущественно представлен в группе с положительной реакцией на холодовую гипервентиляцию (58% больных группы I), в то время как..р1у16 аллель преобладал в группе II (65%) (табл. 1). Отношение шансов для аллелей составило 2,6 (1,55; 4,28), р<0,001; таким образом, носители Arg 16 аллеля имели в 2,6 раз больший шанс формирования ХГДП, по сравнению с носителями аллеля Glyl6. При сравнении частоты положительной реакции на ИГХВ между носителями генотипа Argl6Arg и объединенной группой пациен-тов-гетерозигот и Gly 16-гомозигот, расчёт отношения шансов показал значение 4,27 (1,78; 10,3), р=0,001. Логистический регрессионный анализ не выявил влияния половозрастных различий на обнаруженные ассоциации.

Таблица 1

Распределение генотипов и аллелей по полиморфизму ЛГ)ЛЯ2:р.А^1601у в основных группах больных БА, разделенных по характеру ответа на холодовую бронхопровокацию

Генотипы Группа І Группа II Значимость

Arg 16 Arg 18(36%) 10(12%) Х2=13,63, р=0,001

Argl6Gly 22 (44%) 40 (47%)

GlylöGly 10(20%) 36 (42%)

Аллели

. Arg 16 58 (58%) 60 (35%) f=13,75, р<0,001

Gly 16 42 (42%) 112(65%)

Среди А^16-гомозигот отмечалась более выраженная реакция, заключавшаяся в существенном снижении спирометрических показателей форсированного выдоха по сравнению с гетерозиготами и носителями С1у16-гомозиготного генотипа (рис. 1).

Так, снижение ОФВ, составило -12% (-24; -4,4), -7,5% (-11,9; -3,5) и -3,8% (-6,8; -1,2) для больных с генотипами А^ІбА^, АщІбОу и ОІуІбОІу соответственно (р<0,001). Кроме этого, существенно изменялась проходимость на уровне дыхательных путей среднего калибра, о чем свидетельствовало падение МОС50 у А^ 16-гомозигот на -21,5% (-39; -11), что было существенно ниже

по сравнению с гетерозиготными и Gly 16-гомозиготными пациентами (р<0,001).

ОФВ1 ФЖЕЛ МОС50 МОС75 ПОС ИТ

х

U

-25

аЛг£16Аг§ «А^1601у » 01у 16С1у

Рис. 1 Снижение спирометрических показателей форсированного выдоха в ответ на пробу с ИГХВ у носителей различных генотипов по ОНП /ШЛ52:р.А^16С1у

Амплитуда реакции дистальных бронхов на холодовую бронхопровока-цию также была более выраженной у Arg 16Arg носителей (падение МОС7<; составило в среднем ~ 15,8% (-30,2; -6,5)), однако достоверность отличий подтверждалась только при сравнении с группой Gly 16-гомозигот (р<0,01), но не с носителями гетерозиготного генотипа (р>0,05).

В целом, можно отметить градиент динамики изменений проходимости дыхательных путей на ИГХВ в зависимости от генотипических особенностей, с наибольшей реакцией у представителей группы Argl6Arg, наименьшей -Glyl6Gly, и умеренной - у гетерозигот.

Несмотря на то, что изучался только одиночный полиморфизм, полученные результаты согласуются с данными некоторых работ (М. Ulbrecht et al., 2000; A.A. Litonjua et al., 2004; ME. Wechsler et al., 2009), авторы которых также нашли похожие связи, но в ходе анализа гаплотипов. Исходя из проанализированной литературы, можно заключить, что участие полиморфизмов ß2-адренорецепторов в формировании бронхиальной гиперреактивности может изменяться в зависимости от ряда факторов: этнический состав исследуемой популяции, анамнез курения, пол, режим и длительность получаемой фармакотерапии. Кроме того, влияние могут оказывать и другие полиморфизмы, как изучаемого гена, так и генов, расположенных в соседних локусах. Таким образом, кро-

ме прямого эффекта. ОНП А^ІбОу, нельзя исключить, что наблюдаемые результаты обусловлены влиянием другого ОНП либо комплекса нескольких ОНП гена АОИВ2 или соседних генов.

Для оценки влияния генотипических особенностей на функциональную активность (^-адренорецепторов и раскрытия ее роли в формировании ХГДП измерялась концентрация цАМФ в динамике на фоне проведения бронхопрово-кационной пробы. Уровень цАМФ во второй группе как до, так и после пробы существенно превышал аналогичную концентрацию в группе больных с ХГДП. Более выраженная динамика цАМФ в ответ на холодовую бронхопровокацию отмечалась у пациентов первой группы: 63,3 (49,9; 72,5) и 53,3 (31,4; 70,1) пмоль/106 кл. до и после пробы соответственно (р<0,01). В группе II происходившие изменения были несущественны и незначимы статистически, таким образом, у этих пациентов величина цАМФ оставалась практически стабильной, несмотря на холодовое воздействие. Была найдена слабая корреляционная связь между снижением ДОФВ, и цАМФ в I группе (г=0,38; р<0,05). В группе больных без холодовой бронхиальной гиперреактивности такой связи обнаружено не было. Концентрация цАМФ до проведения бронхопровокационной пробы не зависела от генотипа (р>0,05). Однако через 30 минут после проведения пробы у больных с генотипом Аг§16Аг§ уровень цАМФ был существенно ниже, чем у лиц, гомозиготных по Єіуіб (А^16АГ£ - 48 (32,8; 61,6), ОІуІбОІу - 78 (59,9; 81,3) пмоль/10 кл.; р<0,01). При этом изменение концентрации было достоверно только у больных с Аг§16 аллелем в генотипе, в группе вІуІбОІу концентрация цАМФ до и после пробы существенно не менялась (табл. 2).

Таблица 2

Различия в уровне цАМФ до и после бронхопровокационной пробы среди носителей различных генотипов по ОНП Аг§16С1у

Генотип цАМФ (до пробы) цАМФ (после пробы) Значимость (динамика)

63,9 (59,4; 70,4) 48,0 (32,8; 61,6) р<0,01

А^ібвіу 69,4 (54,4; 85,5) 70,2 (39,9; 79,8) р<0,05

Єіу І.бОІу 73,3 (68,1; 85) 78,8 (59,9; 81,3) р>0,05

Значимость (ранговый дисперсионный анализ) р>0,05 р<0,05

Отмечалась тенденция к большему снижению цАМФ у А^16 гомозигот, а к наименьшему - у носителей 01у1601у генотипа; гетерозиготы занимали промежуточное положение (табл. 3).

Таблица 3

Различия показателя ДцАМФ среди носителей различных генотипов по ОНП ArglöGly

Генотип ДцАМФ

ArglöArg -13,9 (-38,27; -4,84)

ArglöGly -8,7 (-19,43; -3,5)

Gly 16Gly -4,4 (-15,17; 16,3)

Значимость (ранговый дисперсионный анализ) р>0,05

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о неблагоприятном влиянии аллеля Argl6 и генотипа ArglöArg на ХГДП у исследованной группы больных. При этом известно, что у здоровых лиц носительство Argl6Arg генотипа может сопровождаться снижением плотности р2-адренорецепторов на мембране лимфоцитов (Е.М. Snyder et al., 2006). Вероятно, что этот механизм принимает участие в опосредовании найденных функционально-генетических связей и у больных БА. Стоит заметить, что снижение чувствительности ß2-адренорецепторов в зависимости от генотипа выявлялось только через 30 минут после проведения бронхопровокационной пробы, хотя незначимая тенденция к пониженной концентрации цАМФ у больных с генотипом Argl6Arg была заметна и до проведения бронхопровокации. Это можно связать с особенностями самого показателя, являющегося общим индикатором функциональной активности рецепторов и недостаточно точно отражающим информацию об их плотности. Известно, что сигнальное событие с рецептора многократно усиливается в' процессе его внутриклеточной трансдукции. Такой механизм каскадной амплификации обеспечивает достаточную концентрацию цАМФ даже при относительно сниженном количестве р2-адренорецепторов. Однако, в условиях развития холодового бронхоспазма, сопровождающегося выбросом медиаторов воспаления, способных вызывать быструю десенситизацию, существующий дефицит рецепторов в группе больных Arg 16Arg функционально усугубляется и начинает прослеживаться на уровне концентрации цАМФ. В одном из проведенных исследований холодовая гиперреактивность была ассоциирована с более высокими уровнями интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-4 и ИЛ-5, дальнейшее повышение концен-

трации которых происходило при развитии холодового бронхоспазма (М.Ю. Щеглова, 2009). При этом ранее было доказано, что как Thl, так и Th2 цитокины способны вызывать гетерологичную десенситизацию ß-адренорецепторов, сопровождаемую снижением способности гладкомышечных клеток к синтезу цАМФ (S.A. Shore, 2002).

Таким образом, формирование ХГДП у больных БА ассоциировано с изменением структуры гена ADRB2. Полиморфизм Argl6Gly оказывает влияние на динамику бронхомоторного тонуса и функциональную активность ß2-адренорецепторного комплекса на фоне бронхопровокационной пробы с ИГХВ, вероятно, изменяя количество Рз-адренорецепторов, экспрессируемых гладкой мускулатурой дыхательных путей, либо, модулируя чувствительность ß2-адренореиепторов и их способность к десенситизации при воздействии воспалительных медиаторов.

С целью определения возможности прогнозировать ХГДП по молекуляр-но-генетическим данным, наряду с клиническими и функциональными параметрами, была сформирована когорта больных персистирующей неконтролируем-мой БА легкой и средней степени тяжести, численностью 94 человека. Для построения математической модели, положенной в основу способа прогнозирования, использовался биномиальный логистический регрессионный анализ с подбором предикторов на основе метода максимального правдоподобия с пошаговым включением. В результате получено уравнение линейной регрессии: F=-0.5-1.86xGLY+0.58*ARG -l.67*BAS+2.87><BDL,

включающее переменные GLY (носительство Glyl6 аллеля), ARG (носи-тельство Arg 16 аллеля), BAS (отражающая прием ИГКС в предшествующие 12 недель) и BDL (отражающая спирометрически измеренный ответ на ингаляцию фенотерола). Все переменные имели бинарный характер, то есть принимали значение «1» - при наличии и «0» - при отсутствии признака.

Вероятность формирования ХГДП (Р) рассчитывалась по формуле:

P=l/(l+<fF),

где е - константа (основание натурального логарифма, равное 2,718); F -значение, полученное вычислением по формуле линейной регрессии.

Полученную вероятность Р соотносят с граничным значением 0,3. При Р>0,3 прогнозируют повышенный риск формирования ХГДП у индивида. Максимальная точность прогнозирования составила 78,7%, чувствительность - 87%; специфичность - 71%. Полученные значения операционных характеристик можно в целом охарактеризовать как хорошие, а сам метод считать достаточно

эффективным.

Анализ ассоциаций гена ТКРМ8 был проведен среди 123 человек основной группы, больных персистирующей БА легкой и средней степени. Для выявления зависимости реакции дыхательных путей на холод от генотипа был проведен качественный и количественный анализ. Из анализа были исключены гомозиготные по редкому аллелю индивиды с частотой встречаемости ниже 5%, таким образом, расчет производился только среди оставшихся гомо- и гетерозигот.

Высоко значимый результат был получен для ОНП С.7500С. Гетерозигота ОС чаще положительно реагировали на холодовую гипервентиляцию (34% всех случаев положительных реакций против 12% отрицательных, р<0,01) (табл. 4).

Таблица 4

Реакция на холодовую гипервентиляцию в зависимости от генотипа

и носительства отдельных аллелей

ОНП Генотип/ Аллель Группа I Группа II Значимость

с.75СЮ>С се 31 (66%) 65 (88%) Х2=8,39 р<0,01

ее 16 (34%) 9 (12%)

в 78 (83%) 137(91%) Х"=3,85 р<0,05

С 16(17%) 13 (9%)

Сходный, но менее выраженный эффект наблюдался при сравнении частот аллелей - С аллель оказался ассоциирован с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей и был представлен а группе I у 17% пациентов, тогда как во второй группе лишь у 8,7% (р<0,05). Отношение шансов для генотипов составило 3,7; 95%ДИ (1,48; 9,4); р<0,01. Для прочих ОНП достоверных ассоциаций получено не было.

Для носителей гетерозиготного генотипа ОНП С.7500С была установлена значительно более выраженная реакция на холодовую гипервентиляцию. Больные гетерозиготы демонстрировали снижение ОФВ, после бронхопровокацион-ной пробы на -12% (-16; -8,1%) в то время как СЮ-гомозиготы только на -6,5% (-11; -2,1%), р<0,001. Наряду с ОФВь у гетерозигот значимо снижались и другие спирометрические характеристики форсированного выдоха, за исключением ФЖЕЛ (табл. 5).

Таблица 5

Изменение параметров кривой «поток-объем» форсированного выдоха (в %) в ответ на холодовую гипервентиляцию в зависимости от генотипа по ОНП ТЯРМ8:с.7500С

Генотип GG GC Значимость

ДОФВ, -6,5 (-11;-2,1) -12 (-16; -8,1) р<0,001

ДФЖЕЛ -4,3 (-9; -1,3) -6,1 (-10; —3,4) р>0,05

ДМОС50 -10 (-19; -2) -22 (-36;-9,8) р<0,01

ДМОС75 -9,4 (-20; 0,01) -22,7 (-43; -12,9) р=0,001

ДПОС -7,4 (-11;-1,4) -14 (-23; -6,8) р<0,001

ДИТ -2,5 (-7,1; 0,5) -6,2 (-11;-2,6) р<0,01

Таким образом, впервые показана важность индивидуальных особенностей структуры гена катионных каналов TRPM8 в обеспечении нормальной регуляции температурного гомеостаза дыхательной системы у больных БА. ОНП в 7 экзоне, проявляющийся заменой 750 нуклеотида кодирующей последовательности с гуанина на цитозин, но не приводящий к изменению аминокислотной структуры белка вследствие вырожденности генетического кода, в настоящем исследовании оказался ассоциирован с ХГДП.

Данные по изучению влияния изменчивости гена TRPM8 на реактивность дыхательных путей приведены впервые, однако согласно имеющейся информации по влиянию генетических факторов на температурную чувствительность кожи, здоровые гетерозиготы (GC) по полиморфизму c.750G>C гена TRPM8 имеют большую чувствительность к холоду, по отношению к носителям генотипа GG (Т.В. Козырева и соавт., 2011), что согласуется с полученными фактами для больных БА. При одинаковой продолжительности холодовой гипервентиляции, субъекты, генотип которых предрасполагает к холодовой гиперчувствительности, демонстрируют более выраженный бронхоспазм в ответ на более интенсивную афферентацию, в случае предполагаемого рефлекторного механизма реагирования.

Для оценки динамики контроля и влияния на нее ОНП исследуемых генов было проведено наблюдение 60 человек персистирующей БА легкой и средней тяжести. На момент включения все обследуемые имели неконтролируемое течение БА, средний уровень контроля согласно стандартизированному опроснику ACT составил 14,4±0,42 баллов, что было обусловлено нерегулярным приемом или отсутствием базисной терапии. После завершения курса терапии контроли-

руемое и частично контролируемое течение БА было отмечено у 45% пациентов. Больные с ХГДП достигали частичного и полного контроля в 35% случаев; среди пациентов с неизмененной реактивностью на холод их доля составила 50%. До начала лечения различия АОФВ] в ответ на холодовую бронхопровокацию были значимы между носителями АА и вв генотипов по ОНП АОКВ2:сА6А>С (р<0,01) и больными, имеющими вв и вС генотип по ОНП ТКРМ8\с.1500>С (р<0,05). Пациенты, носители генотипов АА или ОС (по ОНП ЛОЯ.В2\сА6А>С и ТЯРМ8:с.750С>С, соответственно), демонстрировали большую амплитуду брон-хоконстрикции с более низкими значениями ДОФВ(. На фоне лечения ответ дыхательных путей холод со временем изменялся в различной степени в зависимости от первоначальной выраженности ХГДП, обусловленной генотипически. При этом значимое ослабление реакции происходило у всех обследованных пациентов, и после лечения существенных отличий не наблюдалось, хотя тенденция к более выраженному снижению бронхиальной проходимости на холодовую гипервентиляцию все еще сохранялась среди больных носителей генотипов АА и ОС (табл. 6, 7).

Таблица 6

Снижение ОФВ] в ответ на холодовую гипервентиляцию у носителей

различных генотипов по ОНП гена АОКВ2 в динамике

Генотип АБЯВ2 ДОФВ| до лечения АОФВ, после лечения Значимость

АА -13,65±3,28 -6,85±1,99 р<0,05

АО -8,42±1,49 -4,48±0,82 р<0,05

во -3,64±1,19 -2,95±1,02 р>0,05

р,>0,05 р,>0,05

Значимость р2<0,01 р2>0,05

р3>0,05 р3>0,05

Примечание: р! - значимость критерия при сравнении групп носителей АА и АО, р2 — значимость критерия при сравнении групп носителей АА и вО, рз -значимость критерия при сравнении групп носителей АО и ОО

Таблица 7

Снижение ОФВ( в ответ на холодовую гипервентиляцию у носителей различных генотипов по ОНП гена ТЯРМ8 в динамике

Генотип ТЯРМ8 ДОФВ; до лечения ДОФВ1 после лечения Значимость

се -6,93±1,13 -4,23±0,70 р<0,05

ОС -13,17±3,68 -5,73±2,10 р<0,05

Значимость р<0,05 р>0,05

К концу периода терапии отмечались различия в показателе контроля среди больных носителей различных генотипов по ОНП гена АОЯВ2 (рис. 2).

25 ................................................................—........—........—.....-.....................

*** ***

*

Рис. 2. Зависимость динамики контроля на фоне лечения от генотипа по ОНП ADRB2: p.Argl6Gly

Носительство генотипа АА сопровождалось более низкими значениями контроля БА по сравнению с GG гомозиготным генотипом (17,07±1,07 и 20,00±0,54 баллов, соответственно; р<0,05). Тем не менее, для всех генотипов положительная динамика показателя контроля была значимой. Аналогичная ситуация прослеживалась в динамике и для генотипов по ОНП гена TRPM8, однако значимых межгрупповых различий уровня контроля после лечения найдено не было (18,59±0,56 и 18,70±1,54 баллов для генотипов GG и GC, соответственно; р>0,05). Больные с генотипом GG по ОНП ADRB2:cA6A>G демонстрировали более существенный прирост ACT (5 баллов и более), при этом только 2 пациента с АА генотипом имели аналогичный прирост. То же было справедливо и для анализа частот аллелей - носительство аллеля G предрасполагало к лучшей динамике контроля БА (71% среди пациентов с приростом ACT 5 и более баллов), тогда как больные, имевшие А аллель, составляли более половины лиц с приростом ACT менее 5 (ОШ 3,12 95%ДИ(1,44; 6,7), р<0,01) (рис. 3).

А 60 г

t 50 г

40 1

£ 30 -i-

20 •

10 —

0 -

Ж

t i'Sf •

АСТ>5

ш...

АСТ<5

■ АА AG

'GG

3 80

70 60 50 £ 40 30 20 10 0

«А G

Рис. 3. Распределение частот генотипов (А) и аллелей (В) ОНП АВ11В2:р. Ащ\бау в группах больных Б А по динамики контроля

Учитывая установленный факт влияния генотипических особенностей на контроль заболевания, была предпринята попытка использовать эти сведения для разработки способа прогнозирования контроля БА. Для построения математической модели, положенной в основу способа прогнозирования, использовался биномиальный логистический регрессионный анализ с подбором предикторов на основе метода максимального правдоподобия с пошаговым включением.

В результате, в модель были включены переменные носительства Arg 16 (ARG) и Glyl6 (GLY) аллелей, уровня контроля заболевания, оцененного в баллах согласно вопроснику ACT перед началом наблюдения (ACT), и качественная переменная, отражающая частоту обострений за прошедший год (ЕХС) - при частоте обострений большей или равной 2, переменная принимает значение «1», иначе — «0». С учетом полученных коэффициентов для каждого члена модели, уравнение линейной регрессии приняло вид:

F=-5,31+0,36xACT+l,52xARG+l,15xEXC-l,47xGLY.

Вычислив значение F, рассчитывают вероятность Р по формуле:

P=l/(l+iTF),

где е - константа (основание натурального логарифма, равное 2,718); F -значение, полученное вычислением по формуле линейной регрессии. Полученная вероятность показывает возможность затруднений в достижении положительной динамики контроля БА у больных с легкой персистирующей и средней тяжестью заболевания, в 6-месячный период, включающий в себя холодный сезон года. При значении Р большем 0,45 ожидается недостаточная динамика контроля БА на фоне проведения 6-месячного курса стандартной базисной терапии. Операционные характеристики модели составили: точность прогнозирования -83%, чувствительность - 91%, специфичность - 73%.

ВЫВОДЫ

1. Наличие ХГДП у больных БА является фактором, утяжеляющим течение заболевания, что проявляется большей склонностью к неконтролируемому течению заболевания, большей частотой и выраженностью респираторных симптомов и более существенным нарушением проходимости дыхательных путей.

2. Изменчивость гена ADRB2 служит фактором, предрасполагающим к формированию ХГДП. Выявлено неблагоприятное влияние гомозиготного носи-тельства аллеля Arglö по ОНП ArglöGly гена ADRB2 на клинико-функциональные показатели больных БА, что наиболее ярко проявлялось в предрасположенности к избыточной бронхоконстрикторной реакции в ответ на холодовую гипервентиляцию.

3. Снижение концентрации цАМФ после пробы с ИГХВ у больных с генотипом Arg 16Arg и отсутствие соответствующей динамики среди носителей генотипа GlylöGIy свидетельствует об ассоциации Argl6Arg варианта с ускоренной десенситизацией Рг-адренорецепторов.

4. Гетерозиготный генотип GC по синонимичному ОНП c.750G>C гена TRPM8 ассоциирован с большей выраженностью и частотой бронхоконстрикторной реакции в ответ на пробу с ИГХВ.

5. Носительство генотипа Arg 16Arg в условиях холодного климата является неблагоприятным фактором в отношении достижения контроля заболевания. Базисная терапия ИГКС частично нивелирует влияние данного ОНП на клини-ко-функциональные проявления БА и холодовой гиперреактивности дыхательных путей.

6. Выявление ОНП ArglöGly гена ADRB2 может быть использовано для прогнозирования формирования холодовой гиперреактивности дыхательных путей и контроля БА после 6-месячного курса базисной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендуется к внедрению в клиническую практику определение мо-лекулярно-генетических маркеров - полиморфизмов /lD/?S2:p.Argl6Gly и TRPM8:c.750G>C с целью выделения групп риска по ХГДП и неконтролируемому течению БА в условиях холодного климата.

2. Для расширения возможностей прогнозирования формирования ХГДП предлагается использовать регрессионное уравнение:

F=-0.5-1.86xGLY+0.58xARG-1.67xBAS+2.87xBDL,

где GLY - переменная, отражающая носительство Glylö аллеля, и прини-

мающая значение «1» при наличии Gly lö аллеля в генотипе и «О» - при его отсутствии; ARG - переменная, отражающая носительство Argl6 аллеля, и принимающая значение «1» при наличии Arglö аллеля в генотипе и «О» - при его отсутствии; BAS - переменная, отражающая статус предшествующего приема ИГКС на протяжении 12 недель, и принимающая значение «1» при предшествующем приеме ИГКС и «О» - при его отсутствии; BDL - переменная, отражающая спирометрически измеренный ответ на ингаляцию фенотерола, и принимающая значение «1» в случае положительной пробы и «О» - в случае отрицательной;

Расчет вероятности (Р) формирования ХГДП осуществляется по формуле:

P=l/(l+<fF),

где е - константа (основание натурального логарифма, приближенно равное 2,718); F — значение, полученное вычислением по формуле, приведенной выше. Полученную вероятность Р соотносят с граничным значением 0,3. При Р>0,3 прогнозируют повышенный риск формирования ХГДП у индивида.

3. С целью прогнозирования динамики контроля Б А рекомендуется использовать уравнение:

F=-5,31+0,36xACT+l,52*ARG+l,15xEXC-l,47xGLY,

где ACT - значение контроля БА в баллах, оцененное по тесту ACT перед началом периода терапии; ARG - бинарная переменная, принимающая значение «1» при наличии Argl6 аллеля в генотипе и «0» - при его отсутствии; GLY - бинарная переменная, принимающая значение «1» при наличии Glyl6 аллеля в генотипе и «0» — при его отсутствии; ЕХС - качественная переменная, принимающая значение «1», если у больного было 2 и более обострения Б А за прошедший год, и «0» - если обострений было меньше двух.

Вычислив значение F, рассчитывают вероятность Р по формуле:

P=l/(l+e"F),

где е - константа (основание натурального логарифма, приближенно равное 2,718); F - значение, полученное вычислением по формуле, приведённой выше. Полученную вероятность Р соотносят с граничным значением 0,45. При Р>0,45 прогнозируют риск низкой динамики контроля БА.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

l.Naumov, D. Е. Effect of ADRB2 polymorphism on the airway response to cold air in asthmatics / D. E. Naumov, J. M. Perelman, V. N. Maksimov, V. P. Ko-losov, X. D. Zhou, Q. Li // Eur. Respir. J. - 2011. - Vol.38. Suppl.55. - P.56s.

2. Наумов, Д. Е. Термочувствительные ионные каналы TRPM8 (обзор литературы) / Д. Е. Наумов // Бюлл. физиол. и патол. дыхания. - 2011. -№42. - С.89-96.

3. Наумов, Д. Е. Роль полиморфизма гена р2-адренорецепторов в формировании холодовой гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой / Д. Е. Наумов, Ю. М. Перельман, В. Н. Максимов, В. П. Колосов, М. И. Воевода, С. Д. Чжоу, Ц. Ли // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2012.

- №7. - С.83-87.

4. Naumov, D. Е. Influence of ADRB2 gene polymorphism on cold airway hy-perresponsiveness and asthma control depending on inhaled glucocorticoids use / D. E. Naumov, J. M. Perelman, V. P. Kolosov, V. N. Maksimov, X. D. Zhou, Q. Li // Eur. Respir. J. -2012. - Vol.40. Suppl.56. - P.67s.

5. Наумов, Д. E. Эффект мутации гена ADRB2 на кпинико-функциональные показатели больных бронхиальной астмой в аспекте фармако-терапевтического влияния ингаляционных глюкокортикоидов / Д. Е. Наумов // Материалы XIII региональной научно-практической конференции «Молодёжь XXI века: шаг в будущее». -Благовещенск. -2012. -Т.4. -С.50-52.

6. Наумов, Д. Е. Ассоциация полиморфизма гена катионных каналов TRPM8 с особенностями реакции дыхательных путей на холод у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких / Д. Е. Наумов, В. П. Колосов, Т. А. Потапова, В. Н. Максимов, М. И. Воевода, Ю. М. Перельман // Сборник трудов XXII Национального конгресса по болезням органов дыхания. -Москва. -2012. - С.101-102.

7. Наумов, Д. Е. Генетический полиморфизм термочувствительных катионных каналов TRPM8 как фактор предрасположенности к холодовой гиперреактивности дыхательных путей у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких / Д. Е. Наумов, Ю. М. Перельман, В. П. Колосов, В. Н. Максимов, М. И. Воевода, А. В. Колосов, С. Д. Чжоу, Ц. Ли // Бюлл. физиол. и патол. дыхания. - 2012. - №45. - С.8-14.

8. Способ прогнозирования риска формирования холодовой гиперреактивности дыхательных путей у больных бронхиальной астмой: пат. 2489086 Рос. Федерация: МПК А61В5/087 / Д.Е. Наумов, В.П. Колосов, Ю.М. Перельман, В.Н. Максимов, М.И. Воевода; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

- № 2012118173/14; заявл. 03.05.2012; опубл. 10.08.2013, Бюл. №22. - 6 с.

Список основных сокращений

БА - бронхиальная астма

гдп - гиперреактивность дыхательных путей

ДДБА - длительнодействующие р2-агонисты

ДИ - доверительный интервал

ИГКС - ингаляционные глюкокортикостероиды

ИГХВ - изокапническая гипервентиляция холодным воздухом

ИЛ - интерлейкин

ИТ - индекс Тиффно

MOCso - мгновенная объёмная скорость на уровне 50% ФЖЕЛ

МОС75 - мгновенная объёмная скорость на уровне 75% ФЖЕЛ

онп - однонуклеотидный полиморфизм

ОФВ, - объём форсированного выдоха за 1 секунду

Olli - отношение шансов

ПОС - пиковая объёмная скорость

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФЖЕЛ - форсированная жизненная ёмкость легких

хгдп - холодовая гиперреактивность дыхательных путей

цАМФ - 3',5'-циклический аденозинмонофосфат

Наумов Д.Н. Клинико-генетические особенности бронхиальной астмы у больных с холодовой гиперреактивностью дыхательных путей: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Владивосток, 2013. 23 с.

Подписано к печати 14.11.2013 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ №858. Отпечатано ИП Сажинов A.A. 675000, Благовещенск, ул. Калинина, 127-45. тел. 54-91-60