Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клинико-диагностическое значение аутоиммунных и генетических факторов при "бедном" овариальном ответе на стимуляцию суперовуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий

ВАНЯН Роза Эдуардовна

И а правах рукописи

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АУТОИММУННЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ «БЕДНОМ» ОВАРИАЛЬНОМ ОТВЕТЕ НА СТИМУЛЯЦИЮ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

14.01.01 — акушерство н гинекология

з о CFH 2015

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2015

005562650

005562650

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент Долгушина Наталия Витальевна

кандидат медицинских наук Менжинская Ирина Владимировна

Официальные оппоненты:

Назаренко Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО "Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии", отделение репродуктологии, главный научный сотрудник

Серебренникова Клара Георгиевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра семейной медицины, профессор

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «20» октября 2015 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdf/Avtoref VanvanRE.pdf

Автореферат разослан« » 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

«Бедный» овариальный ответ (БОО) - это созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции суперовуляции большими дозами гонадотропинов (более 300 ME/сутки) (ESHRE, 2011). В программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) распространенность БОО составляет 9-24% (Badawy А., 2011). У пациенток с «бедным» ответом получают мало ооцитов, мало эмбрионов, что снижает шансы наступления беременности и эффективность программ ВРТ (Назаренко Т.А., Краснопольская К.В., 2012).

Этиология развития БОО на стимуляцию суперовуляции неизвестна. Доказанными факторами риска являются состояния, приводящие к снижению фолликулярного пула: возраст женщины более 40 лет, операции на яичниках в анамнезе, ожирение, химио- и рентгенотерапия и т.д. (Kamble L., 2011). Однако «бедный» овариальный ответ часто наблюдается у пациенток без наличия этих факторов риска с нормальным овариальным резервом. Предполагаемыми патогенетическими факторами развития БОО у этих женщин могут быть некоторые численные и структурные аномалии X-хромосомы, или аутоиммунное поражение тканей яичников (Kokcu А., 2012; Gleicher N., 2012).

Была отмечена связь неслучайной инактивации Х-хромосомы, а также структурных изменений в области ее длинного плеча (Xq) с развитием преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) (Lleo А., 2008; Gleicher N., 2012). Ген FMR1, расположенный на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27.8, может содержать различное число тринуклеотидных CGG-повторов. Было установлено, что число CGG-повторов, равное 26-34, характерно для половины женского населения (Persani L., 2009; Gustin S., 2014). Более высокое или более низкое число CGG-повторов часто связано с развитием ПНЯ, снижением овариального резерва и коррелирует с уровнем

фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и антимюллерова гормона (АМГ) (Gleicher N., 2012).

Ген ВМР15, расположенный в локусе Хр11.2, ингибирует мРНК, участвующую в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках. Вследствие этого подавляется поздняя ФСГ-зависимая стадия развития фолликулов и ФСГ-зависимая продукция прогестерона, в результате чего предотвращается преждевременная лютеинизация фолликулов. Мутации в гене ВМР15, выявляемые у 4-10% больных с ПНЯ, могут приводить к повышению чувствительности гранулезных клеток к ФСГ и преждевременной лютеинизации фолликулов, а также влиять на число кумулюсных клеток и качество ооцитов (Moore R., 2005; Gilchrist R., 2008). Роль генов FMR1 и ВМР15 в генезе ПНЯ является доказанной, однако данные об их значении в развитии БОО и эффективности программ ЭКО практически отсутствуют в мировой научной литературе.

Иммунологические факторы играют существенную роль в развитии БОО наряду с генетическими причинами. До 30% случаев ПНЯ являются следствием аутоиммунных нарушений и, в основном, обусловлены повреждающим действием различных антител на ткани яичников. В группе анти-овариальных антител (АОА) различают антитела к блестящей оболочке ооцита, антитела к ФСГ, а также антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника. Данные по влиянию этих антител на развитие БОО противоречивы (Zou S.H., 2008; Haller-Kikkatalo К., 2012).

Изучение патогенеза развития «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах ЭКО способствует поиску предикторов этого состояния. Возможность раннего прогноза ответа яичников при лечении бесплодия с помощью ВРТ представляет возможность своевременного планирования семьи и выбора оптимального метода стимуляции суперовуляции в группах риска развития БОО.

Цель исследования

Повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции на основании изучения диагностической значимости аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния.

Задачи исследования

1. Изучить клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариапьного ответа у пациенток программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

2. Проанализировать влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариапьного ответа и исходы программ ВРТ (параметры фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, частоту наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре).

3. Определить связь между наличием различных видов аутоантител, в том числе к тканям яичника, и снижением овариапьного ответа в программах ВРТ.

4. Оценить влияние генетических факторов (числа тринуклеотидных СвС-повторов в гене FMД^ и полиморфизмов гена ВМР15) на овариальный ответ пациенток в программах ВРТ.

5. Разработать алгоритм ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом в клинике ВРТ на основании оценки диагностической значимости клинико-анамнестических, аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния.

Научная новизна

На основании использования современных молекулярно-генетических и иммунологических методов были расширены представления о генезе истощения фолликулярного аппарата и развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ и получены следующие новые знания:

•Выявлены клинико-анамнестические факторы риска и определено влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа в программах ВРТ.

•Исследована зависимость развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ от уровня различных аутоантител к тканям яичника, корреляции содержания различных аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости, и установлены пороговые уровни аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО в программах ВРТ.

•Изучено влияние числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмов гена ВМР15 на овариальный ответ при стимуляции суперовуляции в программах ВРТ. Определено число CGG повторов в гене FMRL влияющее на нормальную функцию яичников, и число повторов в зависимости от наличия или отсутствия аутоиммунного поражения яичников в этой группе пациенток.

Практическая значимость Были выявлены аутоиммунные факторы, коррелирующие с развитием БОО, а также пороговые уровни различных аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО и, как следствие, эффективностью программ ВРТ. Также были выявлены молекулярно-генетические предикторы развития БОО, такие как число CGG повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена ВМР15, которые могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических критериев на этапе подготовки к программам ВРТ у пациенток с риском развития БОО.

На основании выявленных клинико-анамнестических, иммунных и молекулярно-генетических факторов риска был разработан алгоритм обследования пациенток, планирующих беременность путем ЭКО, для своевременного выявления групп риска развития БОО. В результате определения влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом был разработан алгоритм ведения пациенток групп риска развития БОО с выбором оптимальных схем стимуляции суперовуляции.

Положения, выносимые на защиту

1. «Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от клинико-анамнестических факторов риска за исключением возраста пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. При этом сниженный овариальный резерв не является абсолютным прогностическим фактором ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и выявляется лишь у 81,5% женщин с «бедным» ответом.

2. Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом, однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона может оказывать позитивное влияние на число полученных фолликулов и ооцитов в данной группе пациенток.

3. «Бедный» овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции следует рассматривать как доклинический вариант преждевременной недостаточности яичников, в генезе которого задействованы иммунные и генетические механизмы. У пациенток программ ВРТ при наличии числа CGG-повторов в гене FMR1 более 34 «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции наблюдается в 6 раз чаще, а при наличии полиморфизмов гена ВМР15 - в 2,5 раз чаще. У пациенток с «бедным» ответом определяются более высокие уровни аутоиммунных антител, в том числе антител к тканям

яичника, среди которых особое значение в реализации овариальной функции имеют антитела к блестящей оболочке ооцита.

4. При числе С ОС-повторов в гене РМЯ1 от 26 до 34 у пациенток с «бедным» ответом можно предположить наличие аутоиммунного поражения тканей яичников, тогда как при нормальном уровне антиовариальных антител «бедный» овариальный ответ может быть ассоциирован с генетическими нарушениями (повышением числа ССС-повторов более 34, наличием полиморфизмов гена ВМР15). При наличии аутоиммунного фактора БОО характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула по сравнению с генетически обусловленным «бедным» ответом.

Личный вклад автора Автор непосредственно участвовал в выборе научного направления исследования, разработке цели и задач исследования, обобщении, анализе, статистической обработке полученных данных. Автор лично принимал участие в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ПЭ), в анализе и научной интерпретации результатов иммунологического и молекулярно-генетического исследования пациенток.

Соответствие диссертации паспорту полученной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация материалов диссертации Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на XIV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2013), 9-м Международном конгрессе по аутоиммунологии (Ницца, 2014), 7-м

Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), XV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (23.04.2015) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (18.05.2015, протокол № 5).

Внедрение результатов исследования в практику Разработанный на основании полученных результатов алгоритм проведения программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции с учетом иммунологических и молекулярно-генетических маркеров внедрен в практическую деятельность отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из которых 5 входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из оглавления, списка принятых сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 29 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 197 литературных источника, из них 9 работ отечественных авторов, 188 -зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования В соответствии с целью и задачами исследования на базе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия, лаборатории клинической иммунологии и лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России было проведено проспективное исследование случай-контроль, включавшее 150 пациенток, обратившихся для проведения программы ЭКО в связи с бесплодием в период с 2012 по 2014 гг.

Согласно критериям ESHRE (2011 г.) была сформирована группа случаев из 65 пациенток с БОО и группа контроля из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом. Пациентки обеих групп были стратифицированы на подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия снижения овариального резерва. Индукция суперовуляции осуществлялась с помощью гонадотропинов (Гн) и агонистов гонадотропин-рилизинг гормона (а-ГнРГ) в «длинном» протоколе, или Гн и антагонистов гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРг). В каждой группе производилась оценка параметров оогенеза, эмбриогенеза, частоты наступления беременности и живорождения.

Критериями включения в исследование были отсутствие противопоказаний к ВРТ, пороков развития внутренних половых органов, воздействия радиации и химиотерапии в анамнезе у женщин; наличие нормозооспермии у мужчин; нормальный кариотип у обоих супругов; информированное согласие на включение в исследование. Критериями исключения были любые состояния и осложнения, требующие отмены ПЭ в изучаемом цикле.

Всем пациенткам, включенным в исследование, проводилось определение различных видов аутоантител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Определялись антитела классов IgM и

IgG к тканям яичника [антитела к блестящей оболочке ооцита (англ. - zona pellucida, анти-ZP), общие антиовариальные антитела (АОА), антитела к ФСГ (анти-ФСГ), и антитела к ГнРГ (анти-ГнРГ)], а также другие виды аутоиммунных антител [антикардиолипиновые антитела (АКЛ), антитела к Р2-гликопротеину-1 (анти-р2-ГП), антитела к хорионическому гонадотропину (анти-ХГ)]. Также у пациенток с БОО проводилось определение соответствующих аутоантител классов IgA и IgG в фолликулярной жидкости.

Генетическое исследование включало детектирование гена ВМР15 в трех позициях: С.2020Т (Arg68Trp, rsl04894763), c.538G>A (А180Т, rs 104894767) и c.328+905A>G (rs3897937) методом ПЦР с анализом кривых плавления, а также секвенирование обоих экзонов данного гена. Оценка числа CGG-повторов в гене FMR1 производилась методом стандартной ПЦР с рядом модификаций, повышающих качество амплификации и позволяющих оценить количество повторов как в случае коротких, так и длинных аллелей.

Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета статистических программ STATISTICA 10 (США), «SAS V8» (США) и «SPSS Statistics V17» (США).

Результаты собственных исследований и их обсуждение При анализе клинико-анамнестических факторов риска развития БОО было выявлено, что пациентки с БОО были старше, а менопауза у их матерей наступала раньше по сравнению с контрольной группой женщин. Также у пациенток с БОО было больше попыток ЭКО и абортов в анамнезе, и большая продолжительность бесплодия. Уровень ФСГ был значимо выше, а АМГ - ниже, чем у пациенток контрольной группы. Другие клинико-анамнестические и лабораторные параметры не отличались значимого между группами пациенток (Таблица 1).

Таблица 1

Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального _ответа у участниц исследования_

Факторы риска Группа 1 п=65 Группа 2 п=85 Р- уровень**

Возраст пациенток, лет* 34,7±3,9 31,9±3,9 <0,0001

Возраст менопаузы у матери, лет* 48,2±2,1 49,7±2,2 <0,0001

ИМТ* 23,7±4,4 23,4±4,2 0,7064

Продолжительность бесплодия, лет 7,06±3,8 5,4±3,6 0,0078

Эндометриоз/аденомиоз, % 9(13,8%) 5 (5,9%) 0,0966

Перенесенные ВЗОМТ, % 45 (69,2%) 58 (68,2%) 0,8963

Операции на гениталиях в анамнезе, % 36 (55,4%) 46 (54,1%) 0,8772

Число попыток ЭКО в анамнезе* 2,2±1,1 1,7±1,04 0,0131

Число беременностей в анамнезе 82 73 0,2114

Число родов в анамнезе, % от числа беременностей 18 (21,9%) 18(24,6%) 0,8019

Число искусственных абортов на 1 пациентку* 0,4±0,8 0,2±0,5 0,0301

Число самопроизвольных выкидышей на 1 пациентку* 0,4±0,6 0,2±0,5 0,0387

Краснуха в анамнезе, % 19(29,2%) 17 (20%) 0,1896

Паротит в анамнезе, % 4(6,1%) 7 (8,2%) 0,6279

Аутоиммунные и ревматические заболевания, % 6 (9,2%) 7 (8,2%) 0,6842

♦данные представлены как среднее ± стандартное отклонение; **Ьтест или з^-тест; ВЗОМТ - воспалительные заболевания органов малого таза

У большинства пациенток с «бедным» ответом был сниженный фолликулярный резерв, однако у 18,5% пациенток был выявлен нормальный овариальный резерв. У пациенток с нормальным овариальным ответом в большинстве случаев был нормальный овариальный резерв, однако у 9,4% пациенток был выявлен сниженный фолликулярный резерв.

При проведении многофакторного анализа для оценки шансов развития БОО значимыми факторами риска явились лишь возраст пациенток и возраст менопаузы у их матерей. Указанные переменные были представлены в виде бинарных данных с определением порогов отсечки, при которых созданная модель была максимально достоверной. Скорректированное отношение шансов (ОШкор) БОО при возрасте пациентки более 34 лет и возрасте менопаузы у матери менее 48 лет составило 6,2 (95% ДИ=2,4; 15,7). Остальные факторы риска явились конфаундерами в созданной модели (площадь под кривой - АиС=75%).

«Длинный» протокол с а-ГнРГ был назначен 13,3% пациенток (10 из 65 пациенток с БОО, и 10 из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом). Число полученных фолликулов и ооцитов было выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ, составив (2,0±0,1) и (1,9±0,3) фолликулов и (1,9±0,3) и (1,6±0,6) ооцитов соответственно, что, однако, не было статистически значимо (р>0,05). У пациенток группы контроля, наоборот, при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ было получено меньшее число фолликулов и ооцитов, составив (6,4±3,1) и (8,1±3,0) фолликулов, и (5,8±2,6) и (6,3±2,5) ооцитов соответственно (р>0,05). Все полученные ооциты были оплодотворены путем инсеминации или с помощью ИКСИ. Из них было получено 450 эмбрионов: 81 эмбрион в группе БОО (в среднем (1,2±0,8) эмбриона на 1 пару) и 369 эмбрионов в группе с нормальным ответом яичников (в среднем (4,3±2,6) эмбриона на 1 пару) (р<0,0001). В основном все полученные эмбрионы были хорошего качества (А и В): 93,8% и 94,3% в группах сравнения соответственно.

На 14-15-й день после ПЭ в полость матки в 49 случаях была диагностирована биохимическая беременность: 15 в группе БОО (23,1%) и 34 в группе сравнения (40,0%) (р=0,0285). Клинически было диагностировано 43 беременности: 12 - в группе БОО (18,5%), 31 - в группе нормального ответа яичников (36,5%) (р=0,0156). С учетом выявленных конфаундеров (возраст, характер менструального цикла, длительность бесплодия, уровни ФСГ и АМГ, число полученных ооцитов и эмбрионов) ОШкор наступления беременности составило 1,48 (95% ДИ=0,57; 3,85). Частота живорождения была выше в контрольной группе, составив 12,3% (8 из 65) у пациенток с БОО, и 29,4% (25 из 85) у пациенток с нормальным ответом яичников (р=0,0122) (Рисунок 1). При этом протокол стимуляции овуляции не оказывал значимого значения на исходы программ ВРТ в обеих группах пациенток.

36,5%

23,1%

18,5%

29,4%

12,3%

Биохимические Клинические беременности Живоровдения беременности

И Группа 1 □ Группа2 Рисунок 1. Исходы программ ВРТ у пациенток, включенных в исследование.

Уровень общих АО А 1§М, анти-2Р ^М и анти-ГнРГ и анти-[}2-ГП-1 1§С в крови был значимо выше у женщин с БОО (р<0,05) (Рисунок 2).

0,50 0,45 0,40 0,35

с

о о.зо

э

0,25 0,20 0,15 0,10

Среднее значение±СО

Н АО А 1§М I ЛОМ «О £ анта-7Р 1{>М Ж анта-гР ДО § анта-ГнРГ 1{*М 1 анти-ГнРГ ДО

0 1

Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ

Рисунок 2. Коробочный график, отражающий средний уровень различных аутоантител в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным

ответом.

Другие виды аутоантител не отличались значимо в группах пациенток. Была выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем антител к блестящей оболочке и числом полученных фолликулов и ооцитов (г=-0,19, р=0,02), и уровнем антител к (32-ГП-1 IgG и числом полученных фолликулов и ооцитов (г=-0,16, р=0,042). Самые высокие уровни аутоантител были выявлены у женщин с БОО и нормальным овариальным резервом (п=12) по сравнению с пациентками с БОО и сниженным овариальным резервом (п=53), а также у женщин с нормальным ответом и нормальным овариальным резервом (п=77) по сравнению с пациентками с нормальным ответом и сниженным резервом яичников (п=8). Отмечалась значимая корреляционная зависимость между уровнем анти-ZP IgG и анти-ФСГ IgG в крови и фолликулярной жидкости (г=0,3929 и г=0,4695 соответственно, р<0,05).

С помощью регрессионного анализа с построением ROC-кривых был определен пороговый уровень антител к блестящей оболочке ооцита при развитии БОО, который составил для IgM 0,140 ед. ОП, для IgG - 0,152 ед. ОП. При построении ROC-кривой для анти-Zp IgM чувствительность модели составила 87,7%, специфичность - 65,9%, AUC - 60,9%. ОШ БОО при выявлении уровня анти-ZP IgM более 0,140 ед. ОП составило 3,7 (95% ДИ=1,5; 8,8). При построении ROC-кривой для анти-Zp IgG чувствительность модели составила 86,2%, специфичность - 62,4%, AUC -61,9%. При выявлении уровня анти-ZP IgG более 0,152 ед. ОП ОШ БОО составило 3,7 (95% ДИ=1,6; 8,6).

При определении числа CGG-повторов в гене FMR1 было установлено, что среднее число повторов в аллеле I в группе женщин с БОО составило 25,9±4,2 (от 16 до 36), в группе с нормальным ответом - 26,1±3,5 (от 19 до 31) (р=0,8401). Среднее число повторов в аллеле 2 в группе женщин с БОО составило 32,1±5,1 (от 22 до 49), в группе с нормальным ответом - 29,6±2,3 (от 22 до 38) (р<0,0001) (Рисунок 3). Фолликулярный резерв не был статистически значимо связан с числом CGG-повторов в обеих аллелях.

§ 34

Ь,

о 28 О

и 26

о

5 24

К !Г

22 20

П CGG-повторы аллель 1 О CGG-повторы аллель 2

'ШЖ

Ящик: Среднее значение±ошибка средней; Усы: стандартное отклонение 0 1

Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ

Рисунок 3. Коробочный график, отражающий среднее число СвС-повторов в РШ1 -гене у женщин с «бедным» и нормальным овариальным ответом

Gleicher N. et al. (2010) и другие исследователи (Chen L.S. et al., 2003) определили, что число CGG-повторов в диапазоне от 26 до 34 связано с нормальной функцией яичников. Всего в аллеле 1 число повторов менее 26 и/или более 34 было выявлено у 26 женщин из группы 1 (40%) и 29 - из группы 2 (34,1%) (р=0,4587). В аллеле 2 число повторов менее 26 и/или более 34 было выявлено у 18 женщин из группы 1 (27,7%) и у 7 из группы 2 (8,2%) (р=0,0015). Из них более 34 повторов было выявлено у 16 пациенток в группе 1 (24,6%) и 4 пациенток из группы 2 (4,7%) (р=0,0020). У женщин с наличием большого числа CGG-повторов (более 34) в каком-либо из аллелей гена FMR1 шансы развития БОО был в 6 раз выше, чем при нормальном числе повторов (ОШ=6,1; 95% ДИ=1,8; 26,3). При наличии числа CGG-повторов менее 26 высокого риска развитии БОО обнаружено не было. Фолликулярный резерв не был статистически значимо связан с числом CGG-повторов в обоих аллелях.

Анализ аллелей гена ВМР15 показал, что почти все выявленные полиморфизмы гена (англ. - single nucleotide polymorphism, SNP) находились в гетерозиготном состоянии. Частота минорного аллеля колебалась от 0,007 до 0,526. Взаиморасположение выявленных полиморфных локусов представлено на рисунке 4. Результаты генотипирования представлены в таблице 2. При оценке распространенности аллеля использовали фенотипическую частоту.

c.-8delC

_

[ J exon 1

rsl04894763 Arg68Trp

~3.5 Kb

c.607C>T Leu203Leu

exon 2

rsl38281369 Vall6Met

rs41308602 Asnl03Ser

rs3897937

rsl04894767 Alal80Met

1 Kb

Рисунок 4. Схематичное изображение геномной структуры ВМР15 с локализацией выявленных полиморфных локусов.

Таблица 2

Выявленные SNP в гене ВМР15

SNP Позиция* Расположение Замена аминокислоты Замена (транскрибция) Частота минорного аллеля

rs41308602 50911091 Экзон 1 Asnl03Ser c.308A>G 0,020

rsl38281369 50910829 Экзон 1 Vall6Met с.46 G>A 0,020

rs 104894767 50915966 Экзон2 Alal80Thr с.538 G>A 0,013

rs 104894763 50910985 Экзон 1 Arg68Trp C.2020T 0,007

rs3897937 50912016 Интрон 1 c.328+905A>G 0,526

50916035 Экзон2 c.607 C>T 0,020

50910775 Экзон 1 c.-8delC 0,040

"Положение гена согласно NCBI Build 38.1.

При анализе известных аллелей гена ВМР15 была определена ассоциация между БОО и полиморфизмом гена в экзоне1 «41308602 (с.308 А>С) с более частым выявлением аллеля в у пациенток с БОО по сравнению с контрольной группой (0,046 уб. 0,0; р=0,0454). Частота «3897937 (с.328+905А>0) в интроне гена также погранично значимо отличалась между группами с более частым выявлением аллеля О в группе с БОО (0,615 уб. 0,458; р=0,0570). Частота других известных полиморфизмов не отличалась значимо между группами.

При секвенировании гена в экзоне 2 была обнаружена новая вариация в положении 656 мРНК с заменой с.607 ОТ, которая выявлялась только у пациенток с нормальным ответом яичников, что может быть связано с защитной ролью этого ЯЫР в развитии БОО. Также в кодирующей последовательности гена ВМР15 была выявлена не описанная ранее однонуклеотидная делеция с.-8с!е1С в позиции 42. Эта делеция в 3 раза чаще выявлялась у пациенток с БОО. В мРНК такая делеция не нарушает рамки считывания, поскольку находится в 5' - нетранслируемой области, однако может мешать инициации трансляции белка, то есть нарушать работу гена, что, возможно, приводит к снижению яичникового резерва и количеству полученных ооцитов (Таблица 3).

Таблица 3

Частота выявления мутаций гена ВМР15 у пациенток с «бедным» и

нормальным ответом яичников на стимуляцию

5ЫР Число пациентов Частота минорного аллеля Аллельный х2 р-уровень

Группа 1 п=65 Группа 2 п=85

ге41308602 150 0,046 (п=3) 0 4,003 0,0454

ге138281369 150 0,015 (п=1) 0,023 (п=2) 0,124 0,7240

гэ 104894767 150 0,015(п=1) 0,011(п=1) 0,036 0,8481

гэ 104894763 150 0,015(п=1) 0 1,316 0,2512

ге3897937 150 0,615 (п=40) 0,459 (п=39) 3,621 0,0570

с.607 ОТ 150 0 0,035 (п=3) 2,340 0,1260

с.-8(1е1С 150 0,061 (п=4) 0,023 (п=2) 1,385 0,2391

При оценке разницы в суммарном выявлении изученных гаплотипов гена ВМР15 в группах сравнения было выявлено, что у пациенток с БОО в

2,7 раз чаще выявлялись изученные БЫР по сравнению с группой контроля. При анализе суммарного выявления 8ЫР, расположенных в экзоне 1 и областью рядом с экзоном 1 (с.308А>С; с.202С>Т; с.328+905А>С), которые по данным литературы ассоциируются с овариальным ответом яичников на стимуляцию овуляции, было выявлено, что у пациенток с БОО данные БИР встречались в 2,5 раз чаще (Таблица 4).

Таблица 4

Суммарная частота выявления вариантов гена ВМР15 у пациенток с

«бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию

Сочетание редких генотипов Группа 1 n=65 Группа 2 n=85 ОШ (95% ДИ)

c.308A>G; с.46 G>A; с.538 G>A; с.202С>Т; c.328+905A>G; с.607 С>Т 0,767 0,550 2,7 (1,25; 5,96)

c.308A>G; с.202С>Т; c.328+905A>G 0,676 0,458 2,47 (1,20;5,14)

Для проведения анализа наличия взимосвязи между уровнем антител к ткани яичника и числом CGG-повторов пациентки с БОО были разделены на 2 группы: группа 1а - пациентки, у которых число CGG-повторов по обеим аллелям было в пределах референсных значений (26-34) (п=31), и группа 16 -пациентки, у которых число CGG-повторов было больше или меньше референсных значений по хотя бы одному из аллелей (п=34). Распределение уровня антител к ткани яичника (АОА и анти-ZP) и антител к гонадотропинам (анти-ФСГ и анти-ГнРГ) классов IgM и IgG представлено в таблице 5. Было выявлено, что у пациенток с БОО и нормальным числом CGG-повторов средний уровень антител к тканям яичника (IgM к ZP) был выше, чем у пациенток с числом GGG-повторов, выходящим за пределы нормального диапазона (р=0,0411). Уровень АМГ отличался в группах с нормальным и повышенным уровнем антител к ZP (IgM или IgG). У пациенток с уровнем анти-ZP более 75-ой перцентили содержание АМГ было выше и составило [0,77 (0,40-1,50)] нг/мл по сравнению с [0,44(0,30-0,69)] нг/мл у женщин с уровнем анти-ZP менее 75-ой перцентили (р=0,0013).

Отмечалась прямая корреляционная связь между уровнем АМГ и уровнем анти-гР кМ (г=0,28, р=0,0218).

Таблица 5

Уровни аутоантител (ед. ОП) в зависимости от числа CGG-повторов FMRl-vcua у пациенток с «бедным» овариальным ответом

Антитела Группа la n=31 Группа 16 n=34 Тест Манна-Уитни, р-уровень

ZP-IgM 0,178 (0,156-0,193) 0,163 (0,147-0,176) 0,0411

ZP-IgG 0,206 (0,164-0,263) 0,192 (0,161-0,232) 0,3969

AOA-IgM 0,192 (0,146-0,226) 0,177 (0,148-0,199) 0,2371

AOA-IgG 0,150(0,134-0,174) 0,142 (0,124-0,181) 0,4904

Анти-ФСГ IgM 0,303 (0,230-0,370) 0,292 (0,235-0,402) 0,8695

Анти-ФСГ IgG 0,269 (0,233-0,363) 0,274 (0,227-0,358) 1,0000

Анти-ГнРГ IgM 0,181 (0,146-0,256) 0,226 (0,166-0,307) 0,0841

Анти-ГнРГ IgG 0,316 (0,265-0,365) 0,292 (0,256-0,319) 0,0612

Данные представлены как медианы с интерквартильным размахом.

У пациенток с числом CGG-повторов менее 26 и/или более 34 по какому-либо из аллелей FMR1 гена уровень АМГ был ниже по сравнению с пациентками, у которых число CGG-повторов находилось в пределах 26-34, и составил соответственно (0,67±0,49) нг/мл и (0,74±0,63) нг/мл (р=0,6322). Это может быть связано с менее значительным повреждением ткани яичника аутоиммунными антителами по сравнению с генетически обусловленным поражением яичников и, как следствие, повышением уровня АМГ.

Выявленные в ходе исследования клинико-анамнестические, генетические и иммунологические предикторы были включены в модель прогноза БОО в программах ВРТ, созданной с помощью метода логистической регрессии. Модель была разработана на основании включения в модель бинарных предикторов с применением разделения и калибровки и использованием теста Хошмера-Лемешева (р=0,9362). Достоверность модели была проверена путем построения ROC-кривой. AUC составила 89,6% (Формула 1).

На основании полученных результатов был разработан алгоритм проведения программ ВРТ у пациенток с риском развития БОО с учетом

аутоиммунных и молекулярно-генетических предикторов данного состояния (Приложение).

Exp(-8,4+l,l*B+2,6*M+3,8*AMr+l,8*CGG +3,7*Zp_IgM+l,8*Zp_lgG)

Р(БОО)=-------------------------------------------------------------------------------------

1 +Ехр(-8,4+1,1 *В+2,6*М+3,8*АМГ+1,8*CGG +3,7*Zp_IgM+l,8*Zp_IgG)

Р(БОО) - вероятность БОО в программах ВРТ, Ехр - экспонента, В - возраст пациентки более 34 лет, М - возраст менопаузы у матери пациентки менее 48 лет, АМГ - уровень АМГ менее 1,0 нг/мл, CGG - число CGG-повторов в гене FMR1 более 34 в любом из аллелей гена, ZpIgM -уровень IgM к ZP более 0,140 ед. ОП, ZpIgG - уровень IgG к ZP более 0,152 ед. ОП.

Формула 1. Модель прогноза «бедного» овариалыюго ответа в программах

ВРТ.

ВЫВОДЫ

1. Показатели овариального резерва не являются абсолютными прогностическими маркерами ответа яичников на стимуляцию суперовуляции. У 18,5 % женщин с «бедным» ответом выявляется сохранный яичниковый резерв, тогда как в 9,4% случаев снижения овариального резерва отмечается нормальный ответ яичников на стимуляцию суперовуляции.

2. «Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от клинико-анамнестических факторов риска за исключением возраста пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. У пациенток в возрасте менее 34 лет при наступлении менопаузы у их матерей в возрасте более 48 лет шансы развития «бедного» ответа на стимуляцию суперовуляции уменьшаются в 6,2 раза.

3. Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом. Однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона по

сравнению с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона в протоколах стимуляции суперовуляции позволяет получить более высокое число фолликулов и ооцитов в этой группе пациенток.

4. У пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ в сыворотке крови определяется более высокий уровень аутоантител к тканям яичника (антител к блестящей оболочке ооцита, общих антиовариальных антител), а также аутоантител к ФСГ, ГнРГ и Р2-ГП1. Уровень аутоантител к тканям яичника в фолликулярной жидкости значимо коррелирует с уровнем аутоантител в сыворотке крови. Наиболее высокий уровень аутоантител ассоциируется с «бедным» ответом и нормальным овариальным резервом, что может свидетельствовать о ранней фазе аутоиммунного поражения яичников в этой группе женщин.

5. Особое значение в реализации овариальной функции имеют аутоантитела к блестящей оболочке ооцита. У пациенток с уровнем аутоантител выше порогового значения (0,140 ед. ОП для 1§М и 0,152 ед. ОП для шансы развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ увеличиваются в 3,7 раза.

6. Численные и структурные аномалии Х-хромосомы, такие как изменение числа ССО-повторов в гене ГМК! и полиморфизмы гена ВМР15, относятся к возможным патогенетическим факторам развития «бедного» овариального ответа. Увеличение числа ССО-повторов более 34 в любом из аллелей гена FM?^ повышает шансы развития «бедного» ответа в предстоящем протоколе ЭКО в 6,1 раз, что не наблюдается при уменьшении числа ССО-повторов менее 26.

7. Полиморфизмы гена ВМР15 являются значимыми маркерами овариального ответа в программах ВРТ. Для пациенток с «бедным» ответом характерно более частое выявление аллеля в в позиции с.308 А>С (АБпЮЗБег) и в позиции с.328+905А>0. Суммарно, у пациенток с «бедным» ответом полиморфизмы гена ВМР15, ассоциированные с овариальной функцией (с.308А>0; с.202С>Т; и с.328+905А>С), выявляются в 2,5 раза

чаще по сравнению с пациентками с нормальным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции.

8. Развитие «бедного» овариального ответа на фоне повышенной продукции аутоиммунных антител характеризуется менее выраженными клиническими проявлениями и лучшей сохранностью фолликулярного пула по сравнению с «бедным» ответом на фоне генетических нарушений (удлинение числа СвС-повторов в гене РМН1, наличие полиморфизмов гена ВМР15).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Генетическое исследование играет важную роль в предикции «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах ВРТ и должно быть рекомендовано пациенткам группы риска развития преждевременной недостаточности и «бедного» ответа яичников (ранний возраст менопаузы у матерей, преждевременная недостаточность яичников у родственниц). Генетическое исследование должно включать определение числа ССО-повторов в гене ИМК1 и генотипирование ВМР15.

2. При отсутствии генетических нарушений (число ССв-повторов в гене РМЯ1 менее 34 и отсутствие полиморфизмов гена ВМР15) у пациенток группы риска развития «бедного» овариального ответа и у пациенток с развившимся «бедным» овариальным ответом, а также при наличии сочетанной аутоиммунной патологии можно предположить аутоиммунное поражение тканей яичников. Таким пациенткам рекомендовано проведение иммунологического исследования с определением уровня антиовариальных аутоантител и аутоантител к блестящей оболочке ооцита в сыворотке крови.

3. Для расчета индивидуального риска развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ может быть предложена математическая модель, включающая оценку анамнестических данных,

определение уровня АМГ и ФСГ, числа ССО-повторов в гене РМЯ1, и уровня аутоантител к блестящей оболочке ооцита классов 1§М и ^О.

4. В случае определения высокого риска развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ пациенткам должна быть рекомендована ранняя реализация репродуктивной функции, или банкирование ооцитов, а также лечение сопутствующей аутоиммунной патологии при ее наличии.

5. Пациенткам с высоким риском развития «бедного» овариального ответа следует персонифицированно подбирать протоколы стимуляции суперовуляции и более высокие стартовые дозы гонадотропинов с целью получения максимального числа фолликулов и ооцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. «Бедный» овариальный ответ в программах ЭКО / И.В. Тетерина, Р.Э. Ванян, Е.А. Калинина, Н.В. Долгушина // Акушерство и гинекология. - 2013. - № 9. - С. 4-12.

2. Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) / Р.Э. Ванян , И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина // Проблемы репродукции. - 2014. - № 3. - С. 53-57.

3. «Бедный» овариальный ответ в программах вспомогательных репродуктивных технологий: связь с аутоиммунным поражением яичников // Р.Э. Ваняи, И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина // Акушерство и гинекология. - 2014. - № 9. - С. 51-58.

4. Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Р.Э. Ванян, Н.В. Долгушина // Гинекология. - 2014. - № 5. - С. 73-77.

5. Спектр аутоантител к гормонам и фосфолипидам у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программе экстракорпорального оплодотворения / Р.Э. Ванян, И.В. Менжинская, JI.B. Ванько, Н.В. Долгушина, Е.А.Калинина// Иммунология- 2015. - № 3. - С. 167-172.

6. Роль аутоиммунной патологии в генезе «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий Роль аутоиммунной патологии в генезе «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Р.Э. Ванян, Н.В. Долгушина, И.В. Менжинская, Е.А. Калинина // Мать и дитя: материалы XIV научного форума. - Москва, 2013. - С. 530-531.

7. Аутоантитела к гормонам и фосфолипидам у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Р.Э. Ванян, И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина // Мать и дитя: материалы XV научного форума. - Москва, 2014. -С. 460-461.

8. «Бедный» овариальный ответ в программах вспомогательных репродуктивных технологий: связь с аутоиммунным поражением яичников / Р.Э. Ванян, И.В. Менжинская, Н.В. Долгушина //Мать и дитя: материалы VII регионального научного форума. - Геленджик, 2014. - С. 138.

9. Autoimmune antibodies in infertile patients with poor ovarian response / r.E. Vanyan , I.V. Menzhinskaya, N.V. Dolgushina // 9th International Congress on Autoimmunity, Nice, France, March 26-30, 2014.-P. 832.

10. Determination of antibodies against FSH in infertile patients with poor ovarian response / r.E. Vanyan, I.V. Menzhinskaya, N.V. Dolgushina // 9th International Congress on Autoimmunity, Nice, France, March 26-30, 2014.-P. 835.

Алгоритм ведения пациенток с бесплодием в программах ВРТ

Приложение

Наличие аутоиммунной патологии

Ранний возраст менопаузы у матерей (менее 48 лет), ПНЯ у родственников

Иммунологические исследования: определение АОА, антн-ZP, анти-ГнРГ, анти-Р2-ГП-1 в сыворотке крови

ч

Уровень анти-ZP IgM>0,140efl.On и/или анти-ZP IgG>0,152 ед.ОП, и/или другие аутоантитела выше референсных значений

Прогностически более легкая аутоиммунная форма «бедного» ответа

Уровень анти-ZP IgMO.MOcfl.On и анти-ZP IgG<0,152 ед.ОП,

и/или другие аутоантитела ниже референсных значений

Лечение сопутствующей аутоиммунной патологии,

ранняя реализация репродуктивной функции, применение а-ГнРГ в программах ВРТ

Генетические исследования: определение CGG- повторов гена FMR1, исследование полиморфизмов гена BMP 15

Длина CGG повторов FMR1 гена

<34

Отсутствие SNP BMP! 5: c.328+905A>G, с.308 A>G, C.2020T

г

Ранняя реализация репродуктивной функции, банк ооцитов, применение а-ГнРГ в программах ЭКО

Длина CGG повторов FMR1 гена >34

3

Выявление SNP

ВМР15: c.328+905A>G, с.308 A>G, с.202С>Т

f

Прогностически более тяжелая генетическая форма «бедного» ответа

Подписано в печать 14.08.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 3560-15-КЦ Объем 1,0 печ. лист Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39