Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Клинико-биологические параллели диспластического невуса и меланомы

4840406

Арутюнян Лилит Саркисовна

КЛИНИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАЛЛЕЛИ ДИСПЛАСТИЧЕСКОГО НЕВУСА И МЕЛАНОМЫ

14.01.10 — Кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 мдр 2011

Москва, 2010

4840406

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова Росздрава

Научные руководители:

Доктор медицинских наук,

профессор Потекаев Николай Николаевич

Член-корр. РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Решетов Игорь Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Короткий Николай Гаврилович доктор медицинских наук, профессор Львов Андрей Николаевич

Ведущая организация: Российский Университет дружбы народов

Защита диссертации состоится « 2/ » . ^ 7£> 201 Дг. в.......часов на

заседании диссертационного совета Д- 208.040.Ю.при ГОУ ВПО Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, дом 8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета Д208.040.10,

доктор медицинских наук, профессор Эрдес Светлана Ильинична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Меланома кожи (МК) является одним из агрессивных злокачественных новообразований кожи. В последние годы наметилась тенденция к росту заболеваемости МК. Среднегодовой прирост заболеваемости МК в мире составляет 3-7% среди белокожего населения (Diepgen TL 2002). Вместе с тем, в экономически развитых странах отмечается снижение смертности от этого заболевания. Так, выживаемость больных с МК в США составляет 91%, в Европе — 81%, и в развивающихся странах приблизительно — 40% (Parkin DM, 2002).

Прогноз заболевания во многом определяет своевременная диагностика и лечение. Отмечено, что при выявлении опухоли на ранних стадиях (рТ1, рТ2) путём хирургического лечения можно достигнуть 10-летнего безрецидивного периода в 80-90% случаев (Демидов JI.B. 2002). Снижение смертности от МК в развитых странах связано с ранней диагностикой, своевременным лечением, выявлением лиц входящих в группу риска и лечением новообразований, являющихся предшественниками МК. К таким новообразованиям относится, в частности, диспластический невус (ДН). В 1978 г. это заболевание детально описали Reimer R.R, Clark W.H с соавторами, дав ему название FAMMM (familial atypical multiple mole melanoma syndrome) — синдром семейных атипических множественных невусов и меланомы.

По данным ВОЗ около половины случаев МК развивается на фоне меланоцитарных невусов (Avril M.F., 1994), в 20—40% случаев МК возникает на фоне ДН (Benova G., 2003; Rhodes A.R., 1983). В связи с этим выявление пациентов с ДН и их диспансерное наблюдение приобретает важное значение для ранней диагностики и профилактики МК.

Семейная или наследственная предрасположенность — один из главных факторов возникновения ДН, но встречаются и спорадические формы, которые, как правило, имеют менее высокий коэффициент перерождения в МК. Так, риск возникновения МК у пациента, имеющего ДН, в семье которого хотя бы один близкий родственник болен МК, составляет 100%, а в случаях, не ассоциированных с синдромом диспластических невусов (СДН) — 50-60% (Щетинина Л.Н.,1992). При изучении гистологических данных установлено, что в 36% процентах случаев МК возникает на фоне спорадического ДН (Skender-Kalnenas Т.М., 1995). По данным Friedman R.J., МК из ДН развивается в 6 раз чаще, чем из простого невуса (Friedman R.J., 1985).

Молекулярно-генетические механизмы, приводящие к озлокачествлению клетки, разнообразны. К ним относятся делеции, потеря гетерозиготности определенных хромосомных районов, аномальное метилирование регуляторных участков и мутации в различных генах. Благодаря последним достижениям молекулярной биологии многое стало понятным в механизмах трансформации нормальной клетки в злокачественную. Тем не менее, причины перерождения доброкачественных невусов в МК до сих пор остаются неясными, что определяет актуальность исследования молекулярно-генетических механизмов трансформации доброкачественных невусов.

В этой связи были определены цели и задачи исследования.

Цель исследования:

Усовершенствовать диагностику и прогнозирование течения диспластического невуса и меланомы кожи на основе молекулярно-генетических исследований.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку особенностей клинической картины диспластического невуса и меланомы кожи;

2. Провести комплексный молекулярно-генетический анализ структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи;

3. Определить диагностическую и прогностическую значимость выявленных онкомаркёров (ВИАР, р16, р53) при диспластическом невусе;

4. Разработать диагностические и прогностические алгоритмы при ведении больных с диспластическим невусом и меланомой кожи.

Научная новизна:

Впервые проведено исследование клинико-биологических параллелей диспластического невуса и меланомы кожи.

Впервые проведен комплексный молекулярно-генетический анализ структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи, включающий поиск делеций короткого плеча хромосомы 9р21 (район расположения гена р16/СЭКМ2А), мутаций и аномального метилирования гена р16/СОКЫ2А, активирующих мутаций протоонкогена ВЯАР и делеций гена р53.

Практическая значимость работы:

Выявлены особенности клинического проявления ДН и МК, что позволяет совершенствовать дифференциальную диагностику, проводить адекватное лечение и прогнозировать течение заболевания.

По результатам определения метилирования и делеций гена р16 для меланом и активирующих мутаций протоонкогена ВЯАР при

диспластическом невусе разработан подход ведения больных при ДН и МК.

5

Мутации гена р16 необходимо определять в семейных случаях меланомы кожи и диспластического невуса, а также при раннем возникновении и распространенной форме заболевания с другими типами злокачественных новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выявлены клинические особенности ДН и МК, позволяют улучшить диагностику этих заболеваний, выявить группу риска и провести адекватное лечение.

2. Исследование образцов опухолевой ткани выделенных у пациентов с ДН и МК выявило молекулярную патологию гена р16 в 62,5% случаев МК и в 25,8% — ДН. Таким образом, нарушения р16 более характерны для МК.

3. Мутации ВЯАР были обнаружены в 25,8% случаев в образцах ДН и лишь в 6,25% случаев МК, что подтверждает характерность мутаций ВИАР для ДН.

4. Рекомендуется определение мутаций ВЯАР при ДН для оценки риска малигнизации и диспансерного наблюдения. Целесообразно определение структурных нарушений р16 при МК, особенно в семейных случаях заболевания.

Внедрение работы

Результаты работы внедрены в практику на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ Первого МГМУ им И.М. Сеченова, Научно-исследовательского Центра Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, МНИОИ им. П.А. Герцена, кафедра онкологии ИПК ФМБА.

Апробация диссертации:

Материалы диссертации доложены на научно-практических конференциях: «IV международный конгресс эстетической медицины»

(Москва, 2004); «V международный конгресс эстетической медицины» (Москва, 2005); «I международное научное собрание Индонезийского Общества Хирургической Онкологии» (Джакарта, 2005), «Международный конгресс по онкохирургии» (Сочи, 2008), I международный форум «Медицины и красоты» (Москва, 2008), международный конгресс «Индустрия красоты: от прикладной эстетики до коррекции патологии» (Москва 2008), «Международное собрание эстетической и реконструктивной хирургии лица» (Миконос, 2009), III конгресс с международным участием «Опухоли головы и шеи» (Сочи, 2009), научно-практическая конференция «Инновации в дерматологии, косметологии и эстетической медицины» (Уфа, 2009).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста. Содержит: введение, 4 главы, выводы, практические рекомендации и список литературы. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 15 рисунками.

Библиография включает 17 отечественных и 137 зарубежных источников.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Было исследовано 99 пигментных новообразований у 60 пациентов с ДН и МК (36 женщины и 24 мужчины).

Средний возраст больных с МК составил 51,07±3,627, с ДН — 33,7±2,864(рис. 1).

14 12 10

8

6 4

2 ^щщ |

-«ДН ■МК

Рис. 1. Возраст больных при ДН и МК.

Пациенты были разделены на две группы:

I группа — пациенты с диспластическими невусами (30 больных),

II группа — пациенты с меланомой кожи (30 больных).

Распределение больных проводилось по возрасту, полу и локализации новообразований. Оценивали фототип кожи пациентов (по Т.Б. Фицпатрику), общее количество невусов. В анамнезе учитывались давность заболевания, связь с наследственностью, динамика изменений в новообразовании.

При исследовании клинических особенностей новообразований | рассматривали следующие признаки: форма, симметричность, края, границы, окраска, количество цветов (черный, коричневый, красный и т.д.), ^ поверхность (выраженность или сглажанность кожного рисунка), диаметр, количество изменений. Лишь у одного пациента невозможно было оценить

I

симметричность, границы и края новообразования в связи с возникновением | МК на фоне гигантского врожденного невуса. |

После гистологического исследования биоптата был проведен анализ структурных изменений и мутаций гена СВКША/ГЫК4а/р16 (картированного в области 9р21), ВЯАР (в области 7ц34) и р53 в 47 образцах опухолевой ткани и в 30 образцах венозной крови.

Молекулярно-генетические исследования.

Забор крови и операционного материала.

Для получения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали венозную кровь пациентов и членов их семей. В качестве консерванта был использован 0.5М раствор ЭДТА. Операционный материал, охарактеризованный патоморфологически, транспортировали в жидком азоте и хранили при -70°С.

Выделение геномной ДНК.

Для получения ДНК из лимфоцитов периферической крови и ткани опухоли использовали метод выделения ДНК, предложенный ЗатЬгоок .1. и соавторами (БашЬгоок I. е1 а1.1989).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Полимеразную цепную реакцию проводили по стандартной схеме (8а1к1 Я.К., 1989) при помощи программируемого термоциклера «Терцик», («ДНК-технология», Россия) с использованием термофильной ДНК-полимеразы (НПО «Ферментас» Литва, Вильнюс).

Определение делеций гена р53.

Чтобы определить делеции гена р53 в исследуемом материале использовали два маркера — пентануклеотидный повтор, расположенный в первом интроне этого гена, а также микросателлитный повтор 01781353.

Исследование гена р16/11УК4а.

В качестве механизмов инактивации гена р16/1МК4а исследовали делеции локуса 9р21, мутации самого гена и метилирование цитозинов промоторной области гена, что также приводит к его функциональной инактивации и отсутствию белкового продукта.

Детекция точковых мутаций методом SSCP.

Поиск мутаций проводили с помощью регистрации конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP) (Orita M, 1989).

Анализ потери гетерозиготности в опухолевом материале

Для анализа потери гетерозиготности использовали праймеры, фланкирующие микросателлитные районы, расположенные в коротких плечах хромосом 9 и 17:

Для определения аллельных делеций гена pl6/INK4a использовали микросателлитный анализ полиморфных повторов D9S157, D9S169 D9S942 и D9S2136, которые расположены в локусе 9р21. Расстояние между повторами D9S169 и D9S157 достаточно большое, область между ними также включает гены р15 и pl4(ARF), а маркер D9S1236 находится рядом с геном pl6/INK4a.

Метил-чувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР)

Гиперметилирование промоторной области гена pl6/INK4 исследовали методом МЧ-ПЦР, используя рестриктазу Hpall. В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции использовали ДНК из опухолевой ткани, предварительно гидролизованную метил-чувствительными рестриктазами Hpall (CCGG) либо Hhal (GCGC). Для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в ходе исследования были разработаны многолокусные ПЦР для двух пар праймеров, один фрагмент принадлежал исследуемому гену, а другой служил положительным контролем реакции ПЦР. В качестве контроля ПЦР был выбран фрагмент гена XL, не содержащий сайтов узнавания указанных рестриктаз.

Аллель-специфическая амплификация мутантного аллеля BRAF.

Для выявления стандартной мутации Т1796А в 599 кодоне гена BRAF был использован метод специфической амплификации мутантного аллеля,

называемый также ARMS (Amplification Refractory Mutation System) (Newton C.R, 1989).

Программное обеспечение

Полноразмерные нуклеотидные последовательности генов CDKN2A, BRAF, р53 и микросателлитных ДНК-маркеров были получены из геномной базы данных Genbank NCBI.

Подбор олигонуклеотидных праймеров и условий для проведения ПЦР производился с использованием программы Oligo 4.0.

Поиск сайтов рестрикции необходимых ферментов осуществлялся с помощью программ Genepro и WIN-SUN.

Анализ мутаций проводился с использованием программы Exequter.

Статистическая обработка

При статистической обработке данных для определения достоверности частот использовали критерий %2 (Ддя таблиц 2 на 2 - в точном решении Фишера). Достоверность различия средних по группам определяли при помощи дисперсионного анализа. Корректность использования параметрических методов определяли на основании расчета коэффициентов асимметрии и эксцентриситета.

Связи между числовыми переменными исследовали при помощи корреляционного анализа. Доверительные границы для частот определяли на основании биномиального распределения. Прогноз диагноза определяли на основании многомерной линейной регрессии. Точность полученного прогностического правила определяли при помощи расчета и анализа ROC-кривой.

Результаты исследования

Анализ клинических особенностей диспластического невуса и меланомы кожи.

При анализе клинической картины ДН и МК больных распределяли по полу, возрасту, фототипу кожи, общему количеству невусов, локализации новообразований на коже и наличию МК в семейном анамнезе.

Из обследованных 60 пациентов 30 страдали ДН и 30 - МК.

Согласно полученным результатам заболеваемость ДН и МК у мужчин и женщин не имела достоверных различий.

При изучении возрастных особенностей выявили достоверные различия р < 0,001(Рис.1). Показано, что ДН наблюдался в более молодом возрасте, чем МК.

В настоящем исследовании наиболее часто встречался второй фототип кожи, составляя 48%. Третий фототип был отмечен у 45% пациентов, первый — у 5%.Четвертый фототип встречался только в 1,7% случаев.

При изучении общего количества невусов выявлены достоверные различия: среднее количество невусов при ДН составило 48,33 ± 9,576, при МК - 20,73 ± 5,388, (р < 0,015).

Наличие МК в семейном анамнезе у пациентов первой группы было выявлено в 10% случаев.

Исследование локализаций новообразований при ДН и МК показало достоверные различия с р < 0,001 (рис.2).

При ДН доля новообразований, локализованных на голове и шее, составила 4,3%, при МК — 50% случаев.

При ДН новообразования наиболее часто располагались на туловище — 89,8%, при МК — у 26,7%. МК встречалась в 6,7% случаев на верхних конечностях, на бёдрах и голенях — 13,3%. Локализация новообразований на стопе при ДН наблюдалась 5,8%, при МК — 3,3%.

Голова и шея Туловище Верхние Бедра.голени Стопа конечности

Рис. 2. Локализация новообразований при ДН и МК.

Обследованные новообразования различались по форме и были представлены следующими первичными морфологическими элементами: пятнами, папулами, бляшками, узлами, сочетанием пятен с папулой или узлом (таб.1).

Таблица 1. Первичные морфологические элементы при ДН и МК.

Диагноз Первичные морфологические элементы в числах Всего

Пятно Папула Сочетание пятна с папулой или узлом Бляшка Узел

ДН 45 3 13 5 3 69

МК 5 4 6 9 6 30

Всего 50 7 19 14 9 99

Р 0,00001 0,108 0,892 0,0028 0,01

Как видно из таблицы различие достоверно для пятен, бляшек и узлов.

При исследовании новообразований на предмет симметричности были выявлены достоверные различия. Симметричные новообразования чаще

встречались у пациентов с ДН 95,6%, а при МК всего — 27,5% (р < 0,001). Асимметричность очертаний новообразований при ДН наблюдалась в 4,3%, при МК — в 72,4%,(р < 0,001).

Доля новообразований с ровными краями при ДН составила 60,8%, при МК — 17,2%. Неровные края при ДН встречались реже, составляя 39,1%. Этот признак при МК наблюдался в 82,7% случаев. Различия оказались достоверными (р < 0,0001).

При изучении границ новообразований оценивали плавность их перехода в здоровую кожу.

Доля новообразований с резкими границами при ДН составила 23,1%, при МК — 68,9%. Плавные границы при ДН наблюдались у 76,9% новообразований, при МК — в 31,1% случаев. Таким образом, выявлены достоверные различия (р< 0,00016).

Оценка окраски показала её неравномерность в обеих группах. При этом было отмечено, что при ДН в новообразованиях обычно сочетается 2 цвета (коричневый и чёрный, либо их оттенки) и только в 4,3% случаев была выявлена полихромия — по 3 цвета в каждом очаге поражения. При МК полихромия составила 56,7%. (р <0,001).

Диаметр новообразований при ДН и МК также достоверно отличался (р < 0,001). Средний размер при ДН 0,793 ± 0,0610, а при МК — 1,633 ± 0,2086 (Рис.3).

1

-

Ш ' ш ' тл л- "

до0,5см от 0,5 до от 1 до 2,5см до отЗ,5см болпе 4,5 1см 2см Зсм до 4см

Рис» Зо Диаметр новообразований.

14

При рассмотрении поверхности новообразований на предмет выраженности кожного рисунка найдены достоверные различия (р < 0,0001).

При ДН кожный рисунок выражен в 66,6%, а при МК — в 20% случаев. Сглаженность кожного рисунка вплоть до его полного отсутствия характерна для МК и встречалась в 80% случаев, при ДН — 33,4%.

Также оценивали появление изменений в новообразовании в течение 6 месяцев до момента обращения. При этом учитывали изменение размеров, окраски, поверхности (появление папул или узлов, воспаления, корочек), а также совокупность вышеуказанных изменений в новообразовании.

В I группе обследованных изменение наблюдалось в 1,4% случаев, при МК — в 93,3%. Таким образом, исследование изменений в новообразованиях выявило достоверно значимые различия (р < 0,001).

Клинико - гистологические особенности ДН.

По результатам исследования выявлена прямая взаимосвязь между средним количеством невусов на коже с наличием МК в семейном анамнезе у пациентов с ДН.

У больных с неотягощенным семейным анамнезом среднее количество меланоцитарных невусов достигало 37,04 ± 9,62, тогда как у больных с отягощенным семейным анамнезом их количество достоверно возрастало — 104,8 ± 15,94 (р < 0,006).

Также были выявлены достоверно значимые различия между общим количеством меланоцитарных невусов и фототипом. У пациентов со вторым фототипом среднее количество невусов составило 74,67 ± 14,27, с третьим фототипом — 22,00 ± 8,779 (р < 0,004).

Результаты проведенного гистологического исследования новообразований показали, что дисплазия первой степени встречалась в

47,8% случаев, дисплазия второй степени — в 53,2% новообразований. Реже встречалась дисплазия третьей степени, составляя 13%.

Особенностями гистологической картины при дисплазии первой степени явились: пролиферация меланоцитов, которые цепочкой располагались в базальном слое эпидермиса, в акантотических тяжах и в наружных слоях эпидермиса волосяных фолликулов. Атипичные меланоциты увеличены в размерах, имеют крупные гиперхромные ядра со слабо выраженными признаками дисплазии.

Вторая степень дисплазии характеризовалась более выраженной атипичностью и пролиферацией меланоцитов, образующих неравномерные гнезда, а также удлиненностью акантотических тяжей.

При третьей степени дисплазии была отмечена наиболее существенная атипия меланоцитов, гнезда которых имели тенденцию к слиянию, занимая акантотические тяжи и нижние отделы эпидермо-дермального соединения.

Клинико - гистологические особенности МК.

В зависимости от клинико-морфологических особенностей МК данные новообразования были разделены по фазам роста опухоли (горизонтальная и вертикальная).

В настоящем исследовании меланома кожи в фазе горизонтального роста была выявлена у 6 пациентов, составляя 20% наблюдений, в фазе вертикального роста — у 24 больных, что составило 80%.

По данным настоящего исследования видно, что при горизонтальной фазе роста чаще встречаются новообразования в виде пятна или папулы и в редких случаях — уплощенной бляшки, тогда как в вертикальной фазе роста чаще встречаются новообразования в форме бляшки или узла.

Была отмечена разница в изменении диаметра новообразований в зависимости от фазы роста. Так, диаметр МК в фазе горизонтального роста составил 0,917 ± 0,199 см, в фазе вертикального роста— 1,813 ± 0,2439 см.

Диагностическая ценность используемых в настоящем исследовании клинических признаков.

С целью проведения дифференциальной диагностики МК и ДН по используемым в работе показателям был проведен однофакторный анализ, и на основании линейной многофакторной регрессионной модели построен диагностический алгоритм таб. 2.

Таблица 2. Коэффициенты линейной регрессионной прогностической модели для определения дифференциального диагноза МК и ДН.

Переменная (признак) Нестандартизо ванный коэффициент В Стат. Погрешность Стандартизованный коэффициент В Р

Постоянная 1,038 0,182 0,000

Симметричность -0,456 0,091 -0,441 0,000

Границы 0,145 0,077 0,145 0,067

Количество изменений -0,113 0,025 -0,416 0,000

Поверхность 0,095 0,082 0,092 0,253

При статистической обработке результатов исследования полученное в качестве прогноза 0-е (нулевое) значение означает наличие «МК», а 1 (единичное) значение — «ДН».

На основании данных таблицы построен диагностический алгоритм, который выглядит следующим образом:

Диагноз = 1,038 - 0,456 * (симметричность) — 0,113 х (изменения) + 0,095х (поверхность) + 0,145 х (границы)

Где:

— симметричное новообразование обозначено цифрой 1, асимметричное образование - 2,

— изменения в новообразовании отражено в числах, в зависимости от их количества — от 0 и более,

— при оценке поверхности оценивается наличие кожного рисунка или ее отсутствие: 1 — наличие кожного рисунка, 2 — отсутствие кожного рисунка,

— четкие границы образования отмечены 1, нечеткие — 2,

— для перевода числового значения диагноза в вероятностный была использована таблица, полученная в рамках регрессионной модели, на основании ретроспективного исследования:

Таблица 3. Соотношение величины прогноза и вероятности МК.

Величина прогноза МК (в числах) ДН (в числах) Всего МК%

Менее 0,4 24 0 24 100,0%

От 0,4-0,7 3 1 4 75,0%

От 0,7-0,8 1 5 6 16,7%

От 0,8-0,9 1 14 15 6,7%

Более 0,9 0 10 10 0,0%

Точность полученного прогностического метода отражена в Рисунке 4, где представлена рассчитанная для данного правила ROC - кривая. Площадь под кривой в 98,3% показывает высокую точность и клиническую значимость полученного прогноза.

1 - Специфичность

Рисунок 4.1ЮС - кривая.

При ретроспективном сравнении полученного прогноза с диагнозом было получено следующее: если полученная по приведенной выше формуле величина менее 0,4, то вероятный диагноз — МК, если больше 0,8, то — ДН. При промежуточном значении данной величины от 0,4 до 0,8 нельзя исключить МК. Пациенты этой группы представляют группу риска развития МК и подлежат тщательному обследованию и динамическому наблюдению.

Комплексный анализ молекулярно-генетической патологии меланом кожи и диспластического невуса

Результаты исследования гена р53.

При исследовании гена р53 в образцах крови (15 пациентов с МК, 15 пациентов с ДН) и опухолевой ткани меланомы кожи (16 проб) и диспластического невуса (31 проба) делеций выявлено не было.

Делеции локуса 9р21.

Молекулярные делеции локуса 9р21при ДН выявили в 6,4% и в 31,25% случаев при МК, при этом в 2 наблюдениях делеция затрагивала маркеры 09Б169 и 098157, что позволило предположить протяженную делецию с

потерей трех генов р15 и р14(АИР) и р1б/1ЫК4а; в одном случае делеция затрагивала только ген р16/1ЫК4а.

Гиперметилирование промоторной области р!6.

Гиперметилирование промоторной области р16/1ЫК4а в первой группе выявлено в 16,1% образцов, во второй группе-в 31,25% случаев.

У одного пациента в материале меланомы обнаружили аллельную делецию и гиперметилирование промоторной области, что может свидетельствовать об инактивации гена на обеих хромосомах. В остальных случаях было определено только гиперметилирование гена в опухоли.

Точковые мутации гена р!6.

При скрининге таких мутаций в исследуемом материале была обнаружена аномальная электрофоретическая подвижность фрагментов в одном образце ДН.

При последующем прямом секвенировании было установлено, что произошла замена в—>А в сайте сплайсинга 3 экзона гена р16, что приводит к потере этого экзона и образованию укороченного аномального белкового продукта. Мутация оказалась соматической, т.к. в ДНК лимфоцитов периферической крови она не была выявлена

Частота соматических мутаций гена В11АР.

В 25,8% ДН и 6,25% МК обследованных образцов выявлена мутация Т1796А, приводящая к замене аминокислоты У599Е в белке ВИАР. Наличие этой мутации статистически достоверно подтверждено (р < 0,018) прямым секвенированием 15 экзона В11АР.

Учитывая данные исследования, можно предположить, что мутации ВЯАР характерны для ДН.

Выводы

1. Установлены отличительные клинические признаки, позволяющие дифференцировать диспластический невус и меланому кожи: асимметрия (ДН 4,3%, МК 72,4%), резкие границы (ДН 23,1%, МК 68,9), динамические изменения (ДН 1,4%, МК 93,3%), стертость кожного рисунка (ДН 33,4%, МК 80%)

2. В результате комплексного молекулярно-генетического анализа структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи выявлены делеции короткого плеча 9 хромосомы, аномальное метилирование гена р16, точечные мутации гена ВЯАР, как наиболее значимые прогностические факторы.

3 Определение активирующей мутации протоонкогена ВЛАР при диспластическом невусе, особенно в сочетании с другими молекулярно-генетическими нарушениями, свидетельствует о высоком риске его малигнизации.

4. Оптимальным прогностическим алгоритмом в плане развития меланомы кожи является выявление у больных с диспластическими невусами молекулярно-генетических нарушений с последующим динамическим клинико-инструментальным наблюдением.

Практические рекомендации

1. Отличительные признаки ДН и МК позволяют использовать их в качестве дифференциально-диагностических критериев, что ведет к улучшению диагностики этих заболеваний, выбору оптимальных методов лечения и более точному прогнозированию их течения.

2. Предложенный дифференциально-диагностический алгоритм можно рекомендовать в качестве скрининга среди населения.

3. При меланоме кожи целесообразно определение делеций хромосомы

9р22 и метилирования гена р16 для прогноза течения заболевания, а при

21

диспластическом невусе — определение активирующих мутаций протоонкогена BRAF для оценки риска малигнизации.

4. В семейных случаях меланомы кожи при раннем возникновении и распространенной форме заболевания, нередко сочетающегося с другими злокачественными новообразованиями, у пациента информативно определение мутации гена р16.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Потекаев Н.Н., Вавилов A.M., Лагунова З.В., Арутюнян JI.C. Диспластический невус. // Клиническая дерматология и венерология 2003, №4, с. 6-9.

2. Решетов И.В., Потекаев Н.Н., Спиридонов И.Н., Маторин О.В., Кудрин К.Г., Арутюнян JI.C. Современные методы диагностики и лечения злокачественных опухолей кожи. // IV Международный конгресс эстетической медицины. Вестник эстетической медицины, 2004, с 13.

3. Решетов И.В., Соколов В.В., Потекаев Н.Н., Маторин О.В., Кудрин К.Г., Арутюнян JI.C. Диагностика и первичная профилактика пигментных опухолей кожи. // V Международный конгресс эстетической медицины. Вестник эстетической медицины №3, 2005, с 38 - 39.

4. Reshetov I.V., Potekaev N.N., Matorin O.V., Harutyunyan L. S, Kudrin K.G. Diagnosis and treatment of dysplastic nevi syndrome and early melanoma using optico - electrical system. // Adstracts 1st International scientific meeting of Indonesian Society of Surgical Oncology (ISSO/PERABOI), Indonesia, March 2527, 2005, p. 79.

5. Решетов И.В., Маторин O.B., Арутюнян JI.C., Корицкий A.B. Меланома полости рта. // Онкохирургия №1, Сочи, 2008, с. 93.

6. Решетов И.В., Маторин О.В., Арутюнян Л.С., Корицкий A.B. Меланома слизистой полости рта, полости носа. // Онкохирургия №2 2009. III Международный конгресс «Опухоли головы и шеи», Сочи, 2009, с. 46.

7. Потекаев H.H., Арутюнян Л.С., Шугинина Е.А., Кузьмина Т.С. Дерматоскопия в ранней диагностике меланомы кожи. // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2008, № 6, с.43^48.

8. Потекаев Н., Решетов И., Шугинина Е., Арутюнян Л., Маторин О., Кузьмина Т. Меланома кожи: от подозрения к диагнозу. // Врач, 2009, № 1, с. 2-4.

9. Reshetov I.V., Matorin O.V., Koritskiy A.V., Arutyunyan L.S. Clinical experience of the treatment of the melanoma oral cavity // Abstracts Aesthetic and Reconstructive facial surgery, Greece, 2009, p. 140-141.

10. Арутюнян Л.С. Синдром диспластического невуса как противопоказание к физиотерапевтическому лечению.//Международный конгресс «Индустрия красоты: от прикладной эстетики до коррекции патологии»,Москва, 14-16 декабрь 2008, с. 25.

11. Шугинина Е. А., Арутюнян Л.С. Дерматоскопия в ранней диагностике меланомы кожи // Международный конгресс «Индустрия красоты: от прикладной эстетики до коррекции патологии», Москва, 14—16 декабрь 2008, с. 92-93.

12. Решетов И.В., Потекаев H.H., Арутюнян Л.С., Залетаев Д.В., Маторин О.В., Кудрин К.Г. Диспластический невус как предшественник меланомы кожи. // Российский онкологический журнал, 2009, №5, с. 54-56.

13. Потекаев H.H.,Потекаев Н.С., Демидов Л.В., Шугинина Е.А., Решетов И.Д., Арутюнян Л.С., Гаджигароева А.Г., Кузьмина Т.С., Соколов Д.В., Маторин О.В., Колобяков A.A., Белышева Т.С., Дорошенко М.Б., Синельников И.Е. Дерматоскопия в клинической практике. Глава 4, Глава 6. // Руководство для врачей, (монография) 2010, с 89-103.

14. Кузьмина Т.С., Арутюнян Л.С.,Ткаченко С.Б., Возможности конфокальной микроскопии для изучения меланоцитарных новообразований

23

. // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология, 2010, № 5, с.27-31.

Принятые в тексте сокращения

ДН - Диспластический невус

МК - Меланома кожи

ПЦР - Полимеразная цепная реакция ().

МЧ-ПЦР - Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция

ARMS - Amplification Refractory Mutation System

FAMMM - Familial atypical multiple mole melanoma syndrome

Подписано в печать 22.12.2010г. Формат 60*84.1/16. Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Зак.116 Типография «Реглет» 125315, г. Москва, Ленинградский проспект, д.74, корп.1

Актуальность темы

Меланома кожи (МК) является одним из агрессивных злокачественных новообразований кожи. В последние годы наблюдается» тенденция к росту заболеваемости МК. Среднегодовой прирост заболеваемости МК в мире составляет 3-7% среди белокожего населения Diepgen TL, 2002 [50]. Вместе с тем, в экономически развитых странах отмечается снижение смертности от этого заболевания. Так, выживаемость больных с МК в США составляет 91%, в Европе - 81% и приблизительно 40% в развивающихся странах Parkin DM,2002 [114].

Прогноз заболевания определяет своевременная диагностика и лечение заболевания. Отмечено, что при выявлении опухоли на ранних стадиях (рТ1, рТ2) можно достигнуть 10-летнего безрецидивного периода в 80-90% случаев путём хирургического лечения Демидов JI.B. 2002 [6]. Несмотря на высокий уровень заболеваемости, в развитых странах отмечается снижение смертности, что связана с ранней диагностикой заболевания, своевременным лечением, выявлением лиц входящих в группу риска, и лечением новообразований являющихся предшественниками МК, одним из которых является диспластический невус (ДН). Позже в 1968 г. Lynch и Krush первыми описали два случая этого заболевания, отметив при этом ряд его особенностей [93].

В 1974г. Munro описал наличие взаимосвязи между пигментными образованиями и семейной МК [107]. Официально, этот синдром был представлен в 1978г. Clark, Reimer, и соавторами, назвав его FAMMM (familial atypical multiple mole melanoma syndrome) - синдром семейных атипических множественных невусов и меланомы [40].

По данным ВОЗ около половины случаев МК развивается на фоне предшествующих меланоцитарных невусов Avril M. F. 1994 [21], в 20 - 40% случаев МК возникает на фоне ДН Benova G.2003, Rhodes A.R 1983[27, 125].

По данным Таскег и соавторов 1997, относительный риск возникновения МК из ДН имеет прямую связь с его количеством и, в зависимости от этого колеблется.от 1 до12 раз [147]. В связи с этим выявление пациентов с ДН и их диспансерное наблюдение приобретает важное значение и определяет актуальность ранней диагностики МК.

Семейная или наследственная предрасположенность является одним из главных факторов возникновения ДН, но встречаются и спорадические формы, которые, как правило, имеют менее высокий коэффициент перерождаемости в МК. Так, риск возникновения МК у пациента, имеющего ДН, в семье которого, хотя бы один близкий родственник болен МК, составляет 100%, а в случаях, не ассоциированных с синдромом диспластических невусов (СДН) — 50-60% Щетинина Л.Н.,1992[17]. При изучении гистологических данных установлено, что 36% процентов МК возникает на фоне спорадического ДН Skender-Kalnenas TM., 1995[135]. По данным Friedman, 1985 МК из ДН развивается в 6 раз чаще, чем из простого невуса. Однако надо отметить, что прогноз МК развивающейся на фоне меланоцитарных невусов благоприятнее, чем у пациентов с развитием опухоли на не измененной коже[57].

Механизмы, приводящие к озлокачествлению клетки разнообразны. К ним относятся делеции определенных хромосомных районов, аномальное метилирование регуляторных районов генов-супрессоров и мутации в различных генах. При этом надо отметить, что к образованию опухоли могут приводить как мутации в протоонкогенах (гены, способствующие клеточному делению), так и в генах-супрессорах опухолевого роста. Несмотря на имеющиеся научные данные в литературе, механизмы малигнизации ДН в МК до сих пор недостаточно ясны, что определяет актуальность данного исследования.

Последние достижения в молекулярной биологии раскрыли механизмы злокачественной трансформации нормальной клетки в злокачественную.

Однако, причины перерождения доброкачественных невусов- в МК до сих 6 пор остаются неясными, что определяет необходимость исследования молекулярно - генетических механизмов трансформации доброкачественных невусов.

В этой связи были определены цели и задачи исследования.

Цель исследования:

Усовершенствовать диагностику и прогнозирование течения диспластического невуса и меланомы кожи на основе молекулярно-генетических исследований.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку особенностей клинической картины диспластического невуса и меланомы кожи;

2. Провести комплексный молекулярно-генетический анализ структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи;

3. Определить диагностическую и прогностическую значимость выявленных онкомаркёров (ВКАБ, р16, р53) при диспластическом невусе;

4. Разработать диагностические и прогностические алгоритмы при ведении больных с диспластическим невусом и меланомой кожи.

Научная новизна:

Впервые проведено исследование клинико-биологических параллелей диспластического невуса и меланомы кожи.

Впервые проведен комплексный молекулярно-генетический анализ структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи, включающий поиск делеций короткого плеча хромосомы 9р21 (район расположения гена р16/ОЖША), мутаций и аномального метилирования гена р16/СОКЫ2А, активирующих мутаций протоонкогена ВКАР и делеций гена р53.

Практическая значимость работы:

Выявлены особенности? клинического проявления ДН и МК, что позволяет совершенствовать дифференциальную диагностику, проводить адекватное лечение и прогнозировать течение заболевания.

По результатам определения? метилирования и делеций гена р16 для; меланом и активирующих мутаций протоонкогена ВЯАР при диспластическом невусе разработан подход ведения больных; при ДН и МК. Мутации: гена р16 необходимо определять- в семейных случаях меланомы. кожи и диспластического невуса, а также при раннем возникновении и распространенной форме заболевания с другими типами злокачественных новообразований.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выявлены, клинические особенности ДН и МК, позволяющие улучшить диагностику этих заболеваний, выявить группу риска и провести адекватное лечение.

2. Исследование образцов опухолевой ткани выделенных у пациентов с ДН и МК выявило молекулярную патологию гена р1б в 62,5% случаев МК и в 25,8% - ДН. Таким образом, нарушения р16 более характерны для МК.

3. Мутации ВРАБ были обнаружены в 25,8% случаев*в образцах ДН и лишь в 6,25% случаев МК, что подтверждает характерность мутаций ВКАР дляДН.

4. Рекомендуется определение мутаций ВКАБ при ДН для оценки риска малигнизации и диспансерного наблюдения. Целесообразно определение структурных нарушений р16 при МК, особенно в семейных случаях заболевания.

Внедрение работы

Результаты работы внедрены в практику на кафедре кожных и венерических болезней Ф] 1110В им И.М. Сеченова, Научно Исследовательского Центра Первого МГМУ им. И.М; Сеченова, МНИОИ им.

П. А. Герцена, кафедра онкологии ИПК ФМБА. 8

Апробация диссертации:

Материалы диссертации доложены на научно - практических конференциях: «IV международный конгресс эстетической медицины» (Москва, 2004); «V международный конгресс эстетической медицины» (Москва 2005); «I международное научное собрание Индонезского Общества Хирургисекой Онкологии» (Джакарта 2005), «Международный конгресс по онкохирургии» (Сочи 2008), I международный форум «Медицины и красоты» (Москва 2008), международный конгресс « Индустрия красоты: от прикладной эстетики до коррекции патологии» (Москва 2008), «Международное собрание эстетической и реконструтивной хирургии лица» (Миконас 2009), III конгресс с международным участием «Опухоли головы и шеи» (Сочи 2009), научно - практическая конференция « Инновации в дерматологии, косметологии и эстетической медицины» (Уфа 2009).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста. Содержит: введение, 4 главы, выводы, практические рекомендации и список литературы. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 15 рисунками.

Выводы

1. Установлены отличительные клинические признаки, позволяющие дифференцировать диспластический невус и меланому кожи: асимметрия (ДН 4,3%, МК 72,4%), резкие границы (ДН 23,1%, МК 68,9), динамические изменения (ДН 1,4%, МК 93,3%), стертость кожного рисунка (ДН 33,4%, МК 80%)

2. В результате комплексного молекулярно-генетического анализа структурных и функциональных нарушений при диспластическом невусе и меланоме кожи выявлены делеции короткого плеча 9 хромосомы, аномальное метилирование гена р16, точечные мутации гена ВКАТ, как наиболее значимые прогностические факторы.

3 Определение активирующей мутации протоонкогена ВКА!7 при диспластическом невусе, особенно в сочетании с другими молекулярно-генетическими нарушениями, свидетельствует о высоком риске его малигнизации.

4. Оптимальным прогностическим алгоритмом в плане развития меланомы кожи является выявление у больных с диспластическими невусами молекулярно-генетических нарушений с последующим динамическим клинико-инструментальным наблюдением.

Практические рекомендации

1. Отличительные признаки ДН и МК позволяют использовать их в качестве дифференциально-диагностических критериев, что ведет к улучшению диагностики этих заболевании, выбору оптимальных методов лечения и более точному прогнозированию их течения.

2. Предложенный дифференциально-диагностический алгоритм можно рекомендовать в качестве скрининга среди населения.

3. При меланоме кожи целесообразно определение делеций хромосомы 9р22 и метилирования гена р16 для прогноза течения заболевания, а при диспластическом невусе - определение активирующих мутаций протоонкогена ВЯАР для оценки риска малигнизации.

4. В семейных случаях меланомы кожи при раннем возникновении и распространенной форме заболевания, нередко сочетающегося с другими злокачественными новообразованиями, у пациента информативно определение мутации гена р16.