Автореферат и диссертация по медицине (14.01.29) на тему:Клиническое значение определения матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в ткани почки и моче при хроническом гломерулонефрите

На правах рукописи

ЛИ

ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛЛОПРОТЕИНАЗ И ИХ ИНГИБИТОРОВ В ТКАНИ ПОЧКИ И МОЧЕ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТЕ

14.01.29- НЕФРОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 МАЙ 2011

Москва-2011

4847540

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ирина Николаевна Бобкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Алексей Юрьевич Николаев

доктор медицинских наук, профессор Игорь Анатольевич Борисов

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф.Владимирского

Защита состоится <г^>> 11 года в & час.

на заседании диссертационного совета Д 208.040.05. при ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, Москва, М.Трубецкая ул., д.8, строение 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан \ года

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор медицинских наук, профессор

Елена Васильевна Волчкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Прогрессирование хронической болезни почек любой природы, в том числе и хронического гломерулонефрита (ХГН), определяется развитием тубуло-интерстициального фиброза (ТИФ), который сегодня рассматривают как патоморфологический субстрат почечной недостаточности (ПН) [Козловская Л.В. 2005, Eddy A.A. et al. 2004]. В этой связи особую актуальность приобретают изучение механизмов формирования ТИФ и разработка новых методов его торможения с целью пролонгирования додиализного этапа течения ХГН.

В последние годы убедительно показано, что в основе формирования ТИФ лежит дисбаланс между синтезом и деградацией (протеолизом) компонентов экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ). Главную роль в процессах расщепления компонентов ЭЦМ играют матриксные металлопротеиназы (ММП), протеолитическая активность которых регулируется системой ингибиторов, включающей тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП) и ингибитор активатора плазминогена I типа (ПАИ-I) [Ahmed А.К. 2009, Eddy А.А. et al. 2006]. Субстратом действия ММП, помимо матриксных белков, являются цитокины, в том числе факторы роста и их рецепторы, молекулы клеточной адгезии, что обусловливает важную функцию ММП в процессах воспаления, в межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействиях на территории нефрона [Ronco Р. et al. 2008, Van Lint P. et al. 2007].

В ряде, главным образом, экспериментальных работ было выявлено нарушение экспрессии факторов протеолиза при различных морфологических вариантах ХГН [Catania J.M. et al. 2007, Sanders J.F. et a!. 2004], однако в клинических условиях характер и степень выраженности изменений в системе ММП/ТИМП, их взаимосвязь с воспалительными и фиброзными изменениями в тубулоинтерстиции почки на разных этапах течения ХГН не до конца изучены. Между тем, оценка нарушений функционирования системы ММП/ТИМП, в том числе по уровню экскреции ее компонентов с мочой, в

сопоставлении с клиническими признаками активности ХГН имеет важное значение для понимания механизмов прогрессирования заболевания, определения критериев прогноза и выбора тактики лечения.

Цель исследования Оценить механизмы локально-почечного протеолиза у больных ХГН на основе определения экскреции с мочой и экспрессии в ткани почки матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов, уточнить значение этих факторов как показателей активности и критериев прогноза ХГН.

Задачи исследования У больных ХГН с разными клиническими вариантами течения:

1. Исследовать экскрецию с мочой основных компонентов системы протеолиза - матриксных металлопротеиназ 2 и 9 типов (ММП-2 и ММП-9) и факторов, регулирующих их активность - тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ 2 типа (ТИМП-2) и ингибитора активатора плазминогена I типа (ПАИ-1);

2. Изучить локализацию и степень экспрессии ММП-2, ММП-9 и ТИМП-2 в различных структурах почки;

3. Сопоставить уровень экскреции с мочой и экспрессии в ткани почки изучаемых биомаркеров с выраженностью воспалительной клеточной инфильтрации и площадью фиброза в интерстиции почки, оцененных с помощью морфометрии;

4. На основании проведенных клинико-морфологических сопоставлений уточнить значение выявляемых в моче ММП и их ингибиторов как показателей активности и критериев прогноза ХГН.

Научная новизна исследования Впервые в клинических условиях на разных стадиях течения ХГН у больных с умеренной протеинурией (ПУ), нефротическим синдромом (НС), преходящим нарушением функции почек и стойкой ПН проведена комплексная оценка механизмов локально-почечного протеолиза на основе

определения в моче матриксных металлопротеиназ и регулирующих их активность ингибиторов.

Впервые мочевые показатели системы протеолиза сопоставлены с признаками клинической активности ХГН и особенностями экспрессии этих факторов в ткани почки в зависимости от выраженности интерстициального воспаления и фиброза. Подтверждено локально-почечное происхождение экскретируемых с мочой ММП, ТИМП и ПАИ-1 и показана возможность использования этих биомаркеров для оценки ТИФ в почке при ХГН и определения прогноза заболевания.

Практическая значимость На основании полученных результатов исследования разработан неинвазивный метод мониторирования тубулоинтерстициального воспаления и фиброза в почке с использованием доступного материала - мочи, по уровню содержания в ней компонентов системы протеолиза - ММП, ТИМП и ПАИ-1.

Выявлен спектр мочевых биомаркеров, отражающий активность воспалительной реакции и интенсивность процессов фиброзирования в интерстиции почек, позволяющий выделять среди больных ХГН группу высокого риска формирования ТИФ и прогрессирования ПН и в зависимости от предполагаемой степени фиброза определять тактику лечения.

Внедрение результатов работы в практику Разработанный на основе результатов настоящего исследования метод оценки выраженности воспаления и фиброза в почке с помощью изученных мочевых биомаркеров апробирован в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева (Университетская клиническая больница №3) Первого МГМУ имени И.М. Сеченова; основные положения диссертации включены в лекционный курс на кафедре нефрологии и гемодиализа ФППОВ Первого МГМУ имени И.М.Сеченова.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 5 в

рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы Апробация работы проведена 8 декабря 2010 года на совместном заседании кафедры нефрологии и гемодиализа ФППОВ, отдела нефрологии НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, кафедры терапии и профессиональных заболеваний медико-профилактического факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова, кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова. Материалы работы доложены и обсуждены на VI конференции Российского диализного общества (РДО) с международным участием (г.Москва, июнь 2009 г.), на ХЬУШ и ХПХ международных конгрессах Европейского общества нефрологов и Европейской ассоциации диализа и трансплантации (ЕЯА-ЕОТА) (Милан, июнь 2009г., Мюнхен, июнь 2010г.), на итоговой научной конференции молодых исследователей с международным участием «Татьянин день» (Москва, январь 2010 г.), VII съезде научного общества нефрологов России (НОНР) (октябрь 2010г.), на ежегодной конференции Первого МГМУ имени И.М. Сеченова «Декабрьские чтения в клинике имени Е.М. Тареева» (декабрь 2010г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных активными протеинурическими формами ХГН отмечается увеличение экскреции с мочой и экспрессии в ткани почки (преимущественно в тубулоинтерстиции) всех изученных компонентов системы протеолиза — ММП-2, ММП-9, ТИМП-2 и ПАИ-1, коррелирующее с уровнем протеинурии и величиной клеточно-воспалительной инфильтрации интерстиция почки.

2. При прогрессирующем течении ХГН с развитием стойкой почечной недостаточности уровень экскреции с мочой и экспрессии в ткани почки ММП-2 и ММП-9 снижается пропорционально степени креатининемии и

площади ТИФ, и одновременно значительно повышается уровень в моче ПАИ-1, обладающего профиброгенным эффектом.

3. Определение уровня «мочевых биомаркеров» - ММП, ТИМП, ПАИ-1, является информативным неинвазивным тестом, отражающим выраженность протеинурического ремоделирования тубуло-интерстициальной ткани почек, и может применяться для оценки прогноза течения и выбора тактики лечения ХГН.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы исследования», «результаты собственного исследования и их обсуждение», заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы содержит 236 источников, из которых 29 отечественных и 207 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком, 7 таблицами.

База проведения исследования

Исследование проведено в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний имени Е.М. Тареева (Университетская клиническая больница №3) Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (директор -академик РАМН, профессор H.A. Мухин). Общеклинические и специальные исследования проведены в подразделениях ПМГМУ имени И.М.Сеченова: в межклинической иммунологической лаборатории (зав.- А.Г.Серова), в межклинической биохимической лаборатории (зав.- Т.Н. Александровская), в лаборатории электронной микроскопии и иммуногистохимии ЦПАО, изучение биопсийного материала выполнено профессором В.А. Варшавским на кафедре патологической анатомии.

Глубокую благодарность автор выражает своему научному руководителю д.м.н. И.Н. Бобковой за поддержку и повседневную помощь на всех этапах выполнения диссертации. Глубокое уважение и искреннюю признательность

автор выражает профессору JI.B. Козловской за неоценимую помощь при выполнении работы. Искренне признательна академику РАМН, профессору Н.А. Мухину за предоставленную возможность выполнения диссертации в одной из ведущих отечественных клиник, сохраняющей лучшие традиции школы академика Е.М. Тареева. Особую благодарность выражаю профессору кафедры патологической анатомии В.А.Варшавскому за ценную консультативную помощь и возможность проведения морфологической части работы на кафедре. Автор искренне благодарит к.м.н. Ю.В. Горбачеву за практическую помощь в проведении иммуногистохимических исследований, а также заведующую межклинической иммунологической лабораторией ПМГМУ имени И.М.Сеченова А.Г.Серову за помощь в проведении иммуноферментного анализа.

Автор признателен всем сотрудникам кафедры нефрологии и гемодиализа ФППОВ во главе с профессором Е.М. Шиловым, отдела нефрологии НИИ Уронефрологии и репродуктивного здоровья и коллективу нефрологического отделения клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней имени Е.М. Тареева во главе с заведующей C.B. Рощупкиной и главным врачом клиники - к.м.н., заслуженным врачом РФ В.В. Панасюком.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Обследовано 124 больных ХГН - 48 женщин и 76 мужчин в возрасте от 15 до 74 лет (в среднем 37 [26-49] лет), наблюдавшихся в клинике имени Тареева Е.М. с 2005 г. по 2008 г. Контрольную группу составили 12 практически здоровых лиц, сопоставимых с больными ХГН по полу и возрасту. У 76 пациентов диагноз был подтвержден морфологически: у 33 выявлен мезангиопролиферативный ГН, у 10- мезангиокапиллярный ГН, у 17-мембранозный ГН, у 4 - нефрит с минимальными изменениями, у 3 -фокально-сегментарный гломерулосклероз, у 9 - нефросклероз в исходе ХГН.

Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в четырех группах больных ХГН, различающихся по степени выраженности ПУ и ПН (табл.1).

Группу I составили 29 пациентов с выраженным мочевым синдромом (MC), у которых наблюдалось обострение заболевания (нарастание ПУ, усиление гематурии): ПУ в среднем 0,87 [0,26-2,12] г/сут; у 7 из них выявлялась изолированная ПУ субнефротического уровня, у 6 (21%) - в сочетании с умеренной эритроцитурией и у 16 (54%) - с выраженной эритроцитурией. Функция почек у всех больных ХГН группы I была в пределах нормы. У 8 пациентов наблюдалась артериальная гипертония (АГ) (АД максимально до ¡80/110 мм рт.ст.).

В группу II были включены 48 пациентов с НС (ПУ - 5,60 [3,95-6,98] г/сут; гипоальбуминемия - 2,52 [2,10-3,15] г/дл, отеки различной степени и локализации) и сохранной функцией почек. У 27 больных НС был изолированным, у 21 сочетался с гематурией разной степени выраженности. АГ наблюдалась у 15 пациентов (АД максимально до 190/110 мм рт.ст.). Систолическое АД в среднем 130 [120-150] мм рт.ст., диастолическое АД - 82,5 [80-92,5] мм рт.ст.

В группу III вошли 17 больных с НС, у которых было выявлено преходящее нарушение функции почек (креатинин 2,0 [1,70-2,60] мг/дл) как проявление высокой активности ХГН. У 5 пациентов из этой группы отмечался остронефритический синдром (высокая ПУ с выраженными отеками, гематурией, тяжелой АГ до 200/100 мм рт.ст., нарушением функции почек, в том числе у 3-х больных с быстропрогрессирующей ПН).

В группу IV вошли 30 пациентов с сохраняющейся высокой ПУ (1,25 [0,62-2,10]) и уже стойким нарушением функции почек (креатинин крови 2,10 [1,80-2,40]). У 15 пациентов регистрировалась АГ (АД максимально до 200/120 мм рт.ст.). При морфологическом исследовании ткани почки у 73% больных этой группы выявлен значительный фиброз.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных ХГН (Ме[25-75%1), п=124

I группа 11 группа III группа IV группа

(MC без ПН) (НС без ПН) (НС + ПН) (стойкая ПН)

Показатели N=29 N=48 N=17 N=30

Суточная ПУ, г 0,87 5,60 5,30 1,25

[0,26-2,12] [3,95-6,98] [4,40-5,82] [0,62-2,10]

Альбумин 4,00 2,52 3,10 4,05

сыворотки, г/дл [3,80-4,50] [2,10-3,15] [2,10-3,50] [3,70-4,30]

Эритроцитурия:

-до 10-15 в п/зр, (%) 21 25 18 37

-сплошь в п/зр, (%) 54 21 35 43

Креатинин 1,0 1,10 2,00 2,10

сыворотки, мг/дл [0,80-1,20] [0,90-1,22] [1,70-2,60] [1,80-2,40]

СКФ по Кокрофту- 93,18 93,00 45,00 47,83

Гоулту, мл/мин [74,00-118,751 [69,00-113,76] [35,00-55,00] [37,00-58,19]

АД сист., 130,00 130,00 150 140

мм рт. ст. [120,0-140,0] [120,00-150,00] [140-160] [140-160]

АД диаст., 80 82,50 90 90

мм рт. ст. [80-90] [80,00-92,50] [80-100] [80-100]

У большинства (71%) больных ХГН исследование молекулярных медиаторов проводили до начала иммуносупрессивной терапии. У остальных (29%) больных - на фоне продолжения начатой ранее стандартной иммуносупрессивной терапии преднизолоном (ПЗ) per os, у части - в сочетании с «пульсами» ПЗ внутривенно и «пульсами» циклофосфана (у этих больных сбор мочи для исследования проводили в интервалах между «пульсами»).

Специальные методы исследования

В моче больных ХГН и в контрольной группе методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) была исследована экскреция: ММП-2 и ММП-9 - протеаз, расщепляющих основные компоненты ЭЦМ (коллагены, фибронектин, ламинин, протеогликаны и неколлагеновые белки); ингибиторов матриксных металлопротеиназ - ТИМП-2 и ПАИ-1 (табл.2).

Таблица 2. Изученные в моче факторы протеолиза

Факторы Метод определения / наборы реактивов Кол-во больных

ММП-2 ELISA/R&D Systems Quantikine, США 79

ММП-9 ELISA/R&D Systems Quantikine, США 77

ТИМП-2 ELISA/R&D Systems Quantikine, США 79

ПАИ-1 ELISA/Technozim PAI-1 Antigen, Австрия 67

В ткани почек больных ХГН была изучена экспрессия ММП-2, ММП-9 и ТИМП-2 иммуногистохимическим пероксидазным методом (табл.3).

Таблица 3. Изученные в ткани почки факторы протеолиза

Факторы Метод определения/наборы реактивов n

ММП-2 Иммуногистохимический метод/ моноклональные антитела человека к ММП-2 (клон 36006, R&D Sistems, США), система детекции (Dako Citomation EnVision+Dual Link System-HRP (DAB+), Дания) 60

ММП-9 Иммуногистохимический метод/ поликлональные антитела кролика к ММП-9 (А 0150, Dako, Дания), система детекции (Dako Citomation EnVision+Dual Link System-HRP (DAB+), Дания) 55

ТИМП-2 Иммуногистохимический метод/, моноклональные антитела человека к ТИМП-2 (клон 89025, R&D Sistems, США), система детекции (Dako Citomation EnVision+Dual Link System-HRP (DAB+), Дания) 46

Для оценки выраженности воспаления и фиброза в интерстиции почки мы провели морфометрическое исследование. В биоптатах почки у 62 больных ХГН измеряли площадь (относительный объем) интерстиция коркового слоя почки (в 10-12 полях зрения при увеличении><400, окраска гематоксилин-эозином) и степень его клеточной воспалительной инфильтраци с использованием программ для морфометрии (ДиаМОРФ, ADOBE PHOTOSHOP CS).

Методы статистической обработки

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных статистических методик с помощью программы STAT1STICA 6,0. При анализе уровней медиаторов в моче, имеющих отличное от нормального распределение, оценивали медиану, разброс величин по отношению к медиане

по показателю интерквартильного размаха [25%, 75% процентили], куда входят 50% всех полученных показателей. При сравнении групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование экскреции ММП и ТИМП в моче больных ХГН

У больных ХГН выявлены изменения экскреции с мочой компонентов системы протеолиза, направленность и выраженность которых зависела от степени активности нефрита и выраженности воспалительных и фиброзных изменений в почке.

В отличие от здоровых лиц и пациентов с умеренной ПУ (гр.1), при высокоактивных формах ХГН выявлялось значимое увеличение уровня в моче ММП-2 - у пациентов с НС (rp.II), особенно в сочетании с преходящей ПН (гр. III), ММП-9 - у больных с НС (гр. II) (табл.4, рис.1).

Рисунок 1. Экскреция ММП-2 и ММП-9 с мочой больных ХГН

п=79 п=77

Мочевые показатели как ММП-2, так и ММП-9 прямо коррелировали с величиной суточной ПУ (для ММП-2 11=0,37 р=0,0009; для ММП-9 Я=0,36 р=0,002), причем сила этой взаимосвязи была наибольшей в группе II (для ММП-2 11=0,76 р=0,04), и установлены обратные корреляции между уровнями

ММП в моче и альбумина в сыворотке крови (для ММП-2 R=-0,51 р=0,01; для ММП-9 R=-0,26 р=0,02). У больных с НС (гр. II и III) степень увеличения экскреции с мочой ММП-2 зависела от наличия преходящей ПН (проявление наиболее высокой активности нефрита) (R=0,39 р=0,002).

Таблица 4. Уровень матриксных металл опротенназ и их ингибиторов в моче больных ХГН (Ме125-75%)), п=86

Группа обследованных ММП-2 (нг/мл) ММП-9 (нг/мл) ТИМП-2 (нг/мл) ПАИ-1 (Ед/мл)

I. с MC без ПН п=23 0,387 (0,205 -0,603) п= 22 0,212 (0,182-0,229) п— 17 174,88 * (82,93-258,45) п=21 3,00* (1,99-3,71) п=8

II. с НС п=26 0,797» (0,569-1,229) п=21 0,282 *° (0,216-0,321) п= 22 263,27*° (140,24-328,36) п= 20 3,55* (2,91-4,48) п=22

III. с НС и ПН п= 22 1,274*" (0,911-1,617) п=17 0,195 • (0,191-0,260) п=16 98,30» (52,64-158,57) п=16 4,75*" (4,14-5,85) п=19

IV. стойкая ПН п=15 0,444 ° (0,160-0,864) п= 12 0,186« (0,126-0,229) п= 11 52,33°« (36,64-114,93) п= 14 5,98*"° (4,48 - 7,62) п=14

Здоровые п= 12" 0,626 (0,273-0,717) п= 12 0,216 (0,165-0,234) п= 12 42,54 (29,03-92,87) п= 12 1,877 (1,586-2,429) п= 12

* р<0,05 по сравнению со здоровыми, 0 р<0,05 по сравнению с I группой,

• р<0,05 по сравнению со II группой, 0 р<0,05 по сравнению с III группой

Наряду с этим, у пациентов с НС (rp.II и III), независимо от морфологического варианта нефрита, выявлялась прямая взаимосвязь мочевого показателя ММП-2 с выраженностью клеточной воспалительной инфильтрации в интерстиции почек (R=0,79 р=0,02). Полученные результаты согласуются с современными представлениями об участии ММП в механизмах воспаления в почке, в том числе интерстициального, индуцированного протеинурией [Ronco Р. el al. 2008, Sanders J.F. et al. 2004, Uchio К. et al. 2000].

При прогрессирующем течении ХГН с формированием стойкой ПН (гр. IV) уровень в моче ММП-2 и ММП-9 достоверно снижался, достигая значений, выявляемых у здоровых лиц, а у отдельных пациентов - даже ниже этого уровня (рис.1, табл. 4).

У пациентов со стойкой ПН нами выявлены обратные взаимосвязи уровней в моче обоих протеаз с величиной креатинина сыворотки крови (для

ММП-2 R=-0,83 р=0,04; для ММП-9 R=-0,31 р=0,02) и площадью интерстиция (фиброза) (для ММП-9 у пациентов с HC R=-0,55 р=0,004), что указывает на важную роль нарушений механизмов протеолиза в формировании интерстициального фиброза в почке.

Наши результаты согласуются с данными экспериментальных исследований на различных моделях тубулоинтерстициального фиброза о последовательности прохождения этапов воспаления в почке и усиленного накопления ЭЦМ с формированием ПН [Eddy A.A. 2001,2004].

Подобно ММП изменялась экскреция с мочой ТИМП-2: отмечалось увеличение мочевого показателя ТИМП-2 у больных с НС (гр. II), по сравнению с больными с менее выраженной ПУ, и его прогрессирующее снижение по мере формирования ПН (рис.2, табл. 4).

Рисунок 1. Экскреция ТИМП-2 с мочой больных ХГН (п=79)

Величина экскреции ТИМП-2 с мочой больных ХГН прямо коррелировала с уровнем ПУ, сила этой взаимосвязи была больше у пациентов с НС (rp.II - Я=0,60 р=0,000001), чем у больных с выраженным мочевым синдромом (гр. 1 - Я=0,42 р=0,0001). У пациентов со стойкой ПН (rp.IV) связь с ПУ сохранялась, и была выявлена положительная корреляция между уровнем экскреции с мочой ТИМП-2 и площадью тубулоинтерстиция (фиброза) (Я=0,90 р=0,04), что подтверждает важный вклад в формирование ТИФ в почке ингибиторного звена протеолиза.

Исследование экспрессии ММП и ТИМП в ткани почек больных ХГН

При иммуногистохимическом исследовании ММП и ТИМП выявлялись, главным образом, в тубулоинтерстиции, где они экспрессировались эпителиальными клетками канальцев, клетками лимфогистиоцитарного инфильтрата в перитубулярной зоне и перигломерулярно, также обнаружена значимая их экспрессия в клубочках.

В нашем исследовании локализация и интенсивность экспрессии факторов протеолиза, независимо от морфологического варианта нефрита, коррелировали как с клинической картиной заболевания, так и с выраженностью воспалительных и фиброзных изменений в ткани почки.

Интенсивность интерстициальной экспрессии ММП и ТИМП, оцененная нами полуколичественно, увеличивалась по мере нарастания активности ХГН от группы I к III (рис.3), и именно в этих группах она прямо коррелировала с выраженностью клеточной воспалительной инфильтрации интерстиция (рис.4). У пациентов со стойкой ПН (гр. IV) интенсивность экспрессии ММП и ТИМП в интерстиции уменьшалась (рис.3).

Рисунок 3. Интенсивность экспрессии ММП и ТИМП в интерстициальной ткани почки у больных ХГН

Рисунок 4. Взаимосвязь между экспрессией ММП, ТИМП и воспалительной инфильтрацией в интерстиции почек у больных ХГН

Мы установили, что площадь интерстиция (фиброза) была достоверно больше у тех больных ХГН, в эпителиальных клетках которых выявлялась значимая экспрессия ММП-2, и именно у этих пациентов отмечался более высокий уровень протеинурии (рис. 5). По нашему мнению, это подтверждает установленное в эксперименте участие ММП-2 в индуцированных протеинурией механизмах трансдифференциации тубулярного эпителия в основные продуценты фиброза - миофибробласты с последующим развитием ТИФ И ПН [Liu Y. At all. 2004, Liu Y. At all. 2011].

Рисунок 5. Площадь интерстиция в зависимости от экспрессии ММП-2 в эпителии канальцев у больных ХГН

НС без ПН НС с преходящей ПН ХПН

(МПГН) (МПГН) (МПГН) (нефросклероз)

В целом, изменения тканевых и мочевых показателей ММП и ТИМП у больных ХГН были однотипны: выявлялась интенсивная экспрессия этих факторов в почке (особенно в интерстиции) и усиленная их экскреция с мочой при нефротических формах ХГН, а у больных с ХПН и нефросклерозом отмечалось снижение этих показателей (рис.6).

Рисунок 6. Изменение экспрессии ММП и ТИМП в ткани почки по мере прогрессирования ХГН

Экспрессия ММП-9 (коричневая окраска) (х200)

Экспрессия ТИМП-2 (коричневая окраска) (х200)

Полученные нами данные еще раз подтверждают локально-почечное происхождение факторов протеолиза, выявляемых в моче, и указывают на возможность использования «мочевых биомаркеров» ММП и ТИМП для оценки процессов, происходящих в ткани почки.

Исследование экскреции ПАИ-1 с мочой больных ХГН

Учитывая признанную роль ПАИ-1 не только как регулятора протеолиза, но и как важного профиброгенного цитокина, мы оценили его изменения на разных этапах течения ХГН.

У всех больных ХГН уровень ПАИ-1 в моче был достоверно выше, чем у здоровых лиц, причем степень его увеличения зависела от активности/тяжести заболевания (табл.4, рис.7). Этот показатель достоверно не отличался у больных с выраженным мочевым и нефротическим синдромами (I и II групп), но был значимо выше у пациентов III группы с НС и преходящей ПН (табл.4, рис.7). Выявлена прямая зависимость между наличием преходящей ПН и уровнем экскреции ПАИ-1 с мочой (11=0,46 р=0,003). При прогрессирующем течении ХГН с формированием стойкой ПН (гр. IV) отмечен дальнейший рост мочевого показателя ПАИ-1, именно в этой группе он был наиболее высоким (табл.4, рис.7).

Рисунок 7. Экскреция ПАИ-1 с мочой больных ХГН (п=67)

Величина экскреции ПАИ-1 с мочой зависела от выраженности клеточной воспалительной инфильтрации в интерстиции, причем в большей степени в группе больных с НС (rp.II Я=0,94 р=0,05). Наши данные подтверждают установленные в эксперименте провоспалительные эффекты

ПАИ-I, реализуемые через связь с рецепторами к урокиназе, активацию процессов адгезии и миграции клеток в интерстиций с формированием интерстициального инфильтрата и в последующем - фиброза [Oda Т at all. 2001, Eddy A.A. 2001]. На это указывают полученные нами корреляции мочевого показателя ПАИ-I с нарушением функции почек: прямая - с величиной сывороточного креатинина (R=0,68 р=0,002) и обратная - с СКФ, рассчитанной по формуле Кокрофта-Гоулта (R=-0,57 р=0,01).

В пользу профиброгенного эффекта ПАИ-I свидетельствуют и результаты проведенной нами морфометрии. У больных с площадью интерстиция более 20% экскреция с мочой ПАИ-I была достоверно выше, чем у больных с меньшей площадью интерстиция (фиброза). Между показателями ПАИ-I и площадью фиброза отмечена сильная прямая корреляция (рис.8).

R=0, 61 р=0,006

Рисунок 8. Взаимосвязь уровня ПАИ-I в моче с площадью интерстиция у больных .ХГН

<10 10-20 >20 Ппощадь интерстиция, %

10 15 20 15 3« Площадь интерстиция, %

Комплексный анализ взаимоотношения компонентов системы протеолиза на разных стадиях течения ХГН показал, что с нарастанием активности заболевания от I к III группе отмечается однонаправленный характер изменений всех факторов - увеличение в моче ММП, ТИМП и ПАИ-1, отличающееся только количественно (рис.9). Можно полагать, что такие однонаправленные изменения носят адаптационный характер в условиях

активного воспаления в почке, сопровождающегося усиленным накоплением ЭЦМ.

Рисунок 9. Соотношение компонентов системы протеолиза в моче больных ХГН в зависимости от активности/тяжести заболевания

У больных со стойкой ПН (rp.IV) отмечен дисбаланс в системе протеолиза, характеризующийся резким снижением уровня в моче ММП-2, ММП-9, ТИМП-2 и непропорционально высокой активностью ПАИ-1 (рис.9). Эти нарушения отражают дезадаптационные изменения в почке с интенсивным накоплением ЭЦМ и могут рассматриваться как критерий неблагоприятного прогноза, указывающий на высокий риск формирования ТИФ и развития ПН.

Таким образом, подтверждена возможность оценки воспалительных и фиброзных изменений в почке (преимущественно в тубулоинтерстиции) у больных ХГН с помощью изучения системы матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в моче. Доступность материала исследования позволяет оценивать в динамике выраженность этих изменений в почечной ткани, и таким образом мониторировать активность ХГН, выявлять группы высокого риска развития ПН (определять прогноз), что важно для выбора тактики лечения больных.

ВЫВОДЫ

1. У больных активными протеинурическими формами ХГН отмечается увеличение экскреции с мочой компонентов системы протеолиза: матриксных металлопротеиназ (ММП-2 и ММП-9) и регулирующих их активность ингибиторов - тканевого ингибитора металлопротеиназ (ТИМП-2) и ингибитора активатора плазминогена I типа (ПАИ-1). Степень увеличения этих показателей определяется особенностями клинического течения заболевания - уровнем суточной протеинурии (для ММП-2 11=0,76 р=0,04; для ММП-9 11=0,36 р=0,01; для ТИМП-2 11=0,60 р=0,000001), наличием преходящей почечной недостаточности (для ММП-2 11=0,39 р=0,002; для ПАИ-1 11=0,46 р=0,003), и не зависит от морфологического варианта ХГН

2. При иммуногистохимическом исследовании ткани почки у больных активными формами ХГН выявляется преимущественно в тубулоинтерстиции экспрессия ММП-2, ММП-9 и ТИМП-2, интенсивность которой прямо коррелирует с клинической активностью ХГН и выраженностью клеточной воспалительной инфильтрации интерстициальной ткани (для ММП-9 - 11=0,60 р=0,00005; для ТИМП-2 -11=0,77 р=0,00007)

3. При прогрессирующем течении ХГН с развитием стойкой почечной недостаточности характер нарушений протеолиза изменяется: экскреция с мочой и экспрессия в ткани почки ММП-2, ММП-9, ТИМП-2 снижается, в то же время уровень ПАИ-1 в моче продолжает расти пропорционально увеличению площади тубулоинтерстициального фиброза (для ММП-9 Л=-0,55 р=0,004, для ПАИ-1 11=0,61 р=0,006 ) и степени гиперкреатининемии (для ММП-2 Я=-0,83 р=0,04; для ММП-9 Я=-0,31 р=0,02; для ПАИ-111=0,68 р=0,002)

4. Сходство характера изменений молекулярных медиаторов ММП, ТИМП и ПАИ-1 в моче и ткани почки на разных стадиях течения ХГН

подтверждает значение мочевых показателей как биомаркеров локально-почечных нарушений в системе протеолиза, отражающих выраженность воспалительной реакции и интенсивность накопления экстрацеллюлярного матрикса в тубулоинтерстициальной ткани почки.

5. Об активности воспалительной реакции в почке у больных ХГН свидетельствует однонаправленное увеличение уровня всех компонентов протеолитической системы в моче, тогда как на формирование ТИФ и риск развития у больных почечной недостаточности указывают разнонаправленные изменения - падение ММП, ТИМП при резком росте ПАИ-1. Прогрессирующий характер этих нарушений является неблагоприятным прогностическим признаком и обосновывает усиление нефропротективной терапии с применением лекарственных средств, воздействующих на механизмы фиброгенеза.

Практические рекомендации

Величина экскреции с мочой ММП-2, ММП-9, ТИМП-2, ПАИ-1 может быть использована в качестве информативного неинвазивного метода определения активности, прогноза ХГН и выбора тактики лечения:

1. однонаправленное увеличение экскреции с мочой больных ХГН ММП и их ингибиторов, коррелирующее с уровнем ПУ, отражает выраженность клеточно-воспалительной инфильтрации в тубулоинтерстиции почки у больных ХГН и может служить дополнительным критерием активности заболевания и показанием для активной иммуносупрессивной терапии

2. снижение экскреции с мочой ММП-2, ММП-9 при значительном увеличении уровня ПАИ-1 свидетельствует о нарушении механизмов локально-почечного протеолиза и ускорении формирования ТИФ, указывает на высокий риск развития почечной недостаточности и обосновывает усиление

нефропротективной терапии с применением ингибиторов АПФ, блокаторов рецепторов ангиотензина II и других средств, воздействующих на механизмы фиброза 3. мониторирование уровня изученных биомаркеров- ММП/ТИМП и ПАИ-1 в моче больных ХГН может применяться для оценки эффективности результатов лечения

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Ли O.A. Матриксные металлопротеиназы в патогенезе острых и хронических заболеваний почек. Нефрология и диализ 2008; 2(10):105-111.

2. Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Ли O.A. Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе заболеваний почек. Терапевтический архив 2008; 6: 86-90. .

3. Ли O.A., Бобкова И.Н., Козловская Л.В. Клиническое значение определения матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в моче больных хроническим гломерулонефритом. Терапевтический архив 2009; 8:10-14.

4. Ли O.A., Бобкова И.Н., Козловская Л.В. Концентрация в моче матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов как показатель, характеризующий течение хронического гломерулонефрита. Клиническая нефрология 2009; 1:50-54.

5. Ли O.A., Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Варшавский В.А. Исследование матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в моче и ткани почки больных хроническим гломерулонефритом: оценка активности и прогноза заболевания. Тезисы VI конференции РДО. Нефрология и диализ 2009; 4(11): 328.

6. Ли O.A., Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Варшавский В.А. Экскреция с мочой матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в оценке прогноза

хронического гломерулонефрита. Всероссийский конгресс нефрологов: материалы конгресса. - Нефрология 2009; 3(3): 69.

7. Li О., Bobkova I., Kozlovskaya L., Varshavskiy V. Clinical significance of matrix metalloproteinases (MMPs) and its inhibitors assessment in the urine and renal tissue in patients with chronic glomerulonephritis (CGN). Abstracts of World Congress of Nephrology in collaboration with ISN May 22-26. 2009; Milan, Italy: Su 303.

8. Ли О.А., Бобкова И.Н. Клиническое значение определения в моче и ткани почек матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов при хроническом гломерулонефрите. Итоговая научная конференция молодых исследователей с международным участием «Татьянин день»: тезисы М., 2010; 99-100.

9. Ли О.А., Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Варшавский В.А. Матриксные металлопротеиназы и их ингибиторы у больных хроническим гломерулонефритом: связь с клинической активностью и протеинурическим ремоделированием почечного тубулоинтерстиця. Сборник тезисов VII съезда научного общества нефрологов России. М. 2010; с. 64-66.

10. Li О., Bobkova I., Kozlovskaya L., Varshavskiy V. Matrix metalloproteinases (MMP) and its inhibitors in chronic glomerulonephritis (CGN): association with clinical activity and proteinuric remodeling of renal tubulointerrstitium. XLVII ERA-EDTA congress -II DGfN cjngress. June 25-28, 2010, Munich, Germany. Nephrology Dialysis Transplantation Plus 2010 1 (Supplement 3): iii 375.

11. Чеботарева H.B., Бобкова И.Н., Козловская Л.В., Ли О.А. Значение нарушений механизмов самозащиты почки при хроническом гломерулонефрите. Клиническая нефрология 2011; 1:8-14.

Список сокращений

АГ - артериальная гипертония

АД - артериальное давление

ММП- матриксные металлопротеиназы

МС - мочевой синдром

НС - нефротический синдром

ПАИ-1- ингибитор активатора плазминогена I типа

ПН - почечная недостаточность

ПУ - протеинурия

СКФ - скорость клубочковой фильтрации СПУ - суточная протеинурия

ТИМП - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ ТИФ -тубулоинтерстициальный фиброз ХГН - хронический гломерулонефрит ЭЦМ- экстрацеллюлярный матрикс

Для заметок

Подписано в печать: 02.03.2011 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д. 74, корп.1 (495) 790-47-77; www.reglet.ru