Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КОЛЛАГЕНОВ УРЕТРЫ ПРИ ГИПОСПАДИИ У ДЕТЕЙ

На правах рукописи

МАРЧЕНКО Александр Сергеевич

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ КОЛЛАГЕНОВ УРЕТРЫ ПРИ ГИПОСПАДИИ У ДЕТЕЙ

14.01.08 — Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2013

15 АВГ 2013

005532109

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр здоровья детей» Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Смирнов Иван Евгеньевич Зоркин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник отделения нефрологии ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН

Сергеева Тамара Васильевна

доктор медицинских наук, профессор, Рудин Юрий Эдвартович

зав. отделом детской урологии

ФГБУ «Научно исследовательский институт

Урологии» Минздрава РФ

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава РФ.

Защита диссертации состоится « 10 » сентября 2013 года в 15:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.023.01 при ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН по адресу: 119296, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, стр.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН по адресу: 119296, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2, стр. 1.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук

А. Г. Тимофеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Гипоспадии являются актуальной проблемой педиатрии, поскольку частота этих форм патологии в последние годы значительно увеличилась, а их клинические проявления характеризуются тяжестью течения, нарушением качества жизни, ранней инвалидизацией больных (Файзулин А.К. и соавт. 2011; Leung А.К., 2007). Осложнения после оперативной коррекции гипоспадий представляют серьезную проблему здравоохранения (Володько Е.А. и соавт., 2011; Tuygun С. et al., 2009).

В настоящее время основным методом лечения гипоспадии является метод тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением (метод TIP) (Snodgrass W. et al., 1994). Однако после оперативного лечения гипоспадий по данной методике были отмечены отклонения от нормы показателей урофлоуметрии (УФ) при отсутствии механического стеноза (Tuygun С. et al., 2009). Больные с нарушениями показателей потока мочи испытывают серьезные трудности в отдаленном послеоперационном периоде (Baskin L.E. et al., 2006). В связи с этим в последующем была предложена операция тубуляризации уретральной пластинки с добавлением в месте продольного ее рассечения свободного лоскута внутреннего листка крайней плоти (TIPG). Но, несмотря на это, до сих пор неясна природа тканевых перестроек в зоне вновь создаваемого уретрального сегмента, не определены изменения коллагена и эластина в ткани уретральной пластинки. Полагают, что после проведения оперативного лечения гипоспадии данные белки, имеющие неспецифическую структуру и распределение в тканях, могут определять биофизические изменения в уретре. Пока нет данных о специфических типах коллагена и его архитектонике после проведения оперативного вмешательства по методике TIP на экспериментальных моделях и у больных с гипоспадией.

Нарушения баланса между синтезом, разрушением и распределением белков экстрацеллюлярного матрикса могут приводить к снижению эластичности и пластичности неоуретры (Taneli F. et al., 2004; Sabatelli P. et al., 2012). Однако диагностическая значимость экспрессии данных белков и их функций в тканях

уретры в послеоперационном периоде при гипоспадии у детей недостаточно изучены, что определило цель настоящей работы.

Цель исследования: установить особенности экспрессии коллагенов уретры при различных методах ее реконструкции для оптимизации выбора методики оперативной коррекции и прогнозирования функциональных результатов лечения гипоспадии у детей.

Задачи исследования:

1. Определить изменения показателей урофлоуметрии в послеоперационном периоде у больных гипоспадией, оперированных методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и методом с использованием аутоимплантации внутреннего листка крайней плоти.

2. Моделировать оперативные методики тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и методику с использованием имплантированного лоскута внутреннего листка крайней плоти в эксперименте на кроликах.

3. Установить гистологические, биохимические и биофизические свойства неоуретры при использовании оперативных моделей коррекции гипоспадии: тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и с использованием имплантированного лоскута внутреннего листка крайней плоти.

4. Определить концентрации различных типов коллагена в образцах уретры, взятых во время оперативного лечения у детей.

5. Установить влияние современных методов хирургической коррекции гипоспадий на биофизические свойства уретры.

6. Определить молекулярные критерии оценки эффективности коррекции гипоспадии у детей.

Научная новизна:

Впервые выявлено, что обструктивный тип урофлоуметрии формируется через год после операции методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным

ее рассечением у 75% больных с проксимальными формами гипоспадии и у 43% - с дистальными; а через 7 лет после операции у 75% детей с проксимальными формами гипоспадии и у 21% - с дистальными.

Впервые установлено функциональное улучшение изученных параметров урофлоуметрии с увеличением времени после коррекции гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением.

Впервые разработана экспериментальная модель гипоспадии для исследования биофизических свойств уретры после проведения уретропластики путем прямого измерения давления в изолированном уретральном сегменте.

Впервые на модели уретропластики показано, что коррекция гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением существенно не влияет на растяжимость уретры, в то время как использование имплантированного лоскута внутреннего листка крайней плоти на месте рассеченной уретральной пластинки сопровождается увеличением внутриуретрального давления в 2 раза, но не изменяет растяжимости уретры.

Впервые выявлено, что уровень экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) коллагена IV типа при коррекции гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением увеличивается в 1,6 раза, а при дополнительной имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти - более чем в 2 раза по сравнению с контролем. При этом экспрессия коллагена VI типа уменьшается незначительно, а экспрессия VIII типа коллагена уменьшается более чем в 2 раза при использовании метода тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и более чем в пять раз — при использовании лоскута внутреннего листка крайней плоти.

Впервые показано, что вновь созданный вентральный уретральный сегмент регенерирует без признаков фиброзирования при оперативном лечении методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением, таким образом, регенерация после данного метода оперативной коррекции проходит без структурных изменений ткани. Однако признаки рубцевания отмечаются в области

имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти, что ведет к ухудшению эластичности уретрального сегмента.

Впервые установлено отсутствие коллагена III типа во всех образцах биоптатов гипоспадийной уретральной пластинки у детей, что приводит к нарушению формирования эластичных белковых волокон и влияет на нарушение показателей потока мочи в послеоперационном периоде.

Установление закономерностей патологического тканевого ответа на повреждение при оперативном лечении гипоспадии является основанием для разработки новых средств регенерации тканей уретры.

Практическая значимость:

Полученные данные о частоте выявления изменений урофлоуметрических параметров после оперативной коррекции гипоспадии указывают на необходимость длительного наблюдения за больными для оптимизации функциональных результатов лечения такого порока уретры у детей.

Обоснована целесообразность молекулярно-биологического анализа матриксных белков уретры при различных методах коррекции гипоспадии у детей.

Доказана эффективность коррекции гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением, позволяющая улучшить отдаленные функциональные результаты лечения этого порока и уменьшить частоту осложнений.

Внедрение результатов в практику:

Результаты работы внедрены в клиническую практику урологического, нефрологического отделений и лаборатории патофизиологии с блоком радионуклидных исследований НИИ педиатрии ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Основные положения диссертации используются при проведении учебных циклов для ординаторов, аспирантов и врачей в центре обучения ФГБУ «НЦЗД» РАМН и рекомендованы для использования в системе высшего и последипломного профессионального образования на педиатрических факультетах при подготовке педиатров, детских урологов, а также специалистов других специальностей.

Апробация диссертации:

Материалы диссертации доложены и обсуждены на IV Европейском Конгрессе педиатров «ЕигораесПаМсз 2009» (Москва, 2009), XIV Конгрессе детских урологов Бразилии (Рио-де-Женейро, 2011), на IV Международном Конгрессе по гипоспадии и нарушению половой дифференцировки (Лондон, 2011), XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012), XVII съезде Союза педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2013), III съезде детских урологов-андрологов (Москва, 2013).

Личное участие диссертанта:

Автор принимал непосредственное участие в исследовательской работе, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при получении первичных данных путем непосредственного проведения исследований, обработке, анализе и интерпретации полученных результатов.

По теме диссертации опубликовано:

8 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в иностранном медицинском журнале.

Объем и структура диссертации:

Общий объем работы составляет 116 страниц машинописного текста. Диссертация состоит из введения, 5 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 27 рисунками и 2 клиническими примерами. Библиографический указатель содержит 187 источников, включающих 83 отечественных и 104 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования:

Работа выполнена в урологическом отделении (зав. отд. — д.м.н., проф. С.Н. Зоркин) и лаборатории патофизиологии с блоком радионуклидных исследований (зав. д.м.н., проф. И.Е. Смирнов) НИИ педиатрии ФГБУ «НЦЗД» РАМН (директор — академик РАН и РАМН, проф. А.А.Баранов), а также в отделении урологии (зав. -проф. Ж.Л. Пиппи-Салле) и лаборатории патологической физиологии (зав. проф. Глен Тэйлор) центра СикКидс, г. Торонто (Канада). На проведение исследований

было получено согласие локального этического комитета и информированное согласие больных детей или их родителей.

В основу работы положены результаты обследования и лечения 95 детей, в возрасте от 3 до 17 лет с различными формами гипоспадии. Все дети были комплексно обследованы. У 50 больных нами были проанализированы данные урофлоуметрии, выполненные при катамнестическом наблюдении после проведенных операций по методам TIP и TIPG в урологическом отделении ФГБУ «НЦЗД» РАМН. Урофлоуметрию проводили с использованием урофлоуметров Medtronic Duet Encompass (Дания) и Urocap III Laborie Medical Technologies (Канада).

50 мальчикам урофлоуметрия проводилась через 1 год после оперативного лечения, из них 40 детей были прооперированы по поводу дистальных форм и 10 больных - проксимальных форм гипоспадии (табл.1). Урофлоуметрия была проведена повторно через 6 лет (7 лет после оперативного лечения) у 37 детей из 50 при очередном катамнестическом обследовании. В период между обследованиями детям не проводилось никаких других лечебно-диагностических процедур на органах мочеполовой системы. Два-три мочеиспускания были документированы и одно с наибольшими значениями максимальной объемной скорости потока (Qmax) было принято для верхней границы базовой оценки. Кривые мочеиспускания были оценены по форме и объему мочеиспускания.

Таблица 1

Распределение детей с гипоспадией по возрасту, форме заболевания и методу

оперативной коррекции

Форма гипоспадии Число и возраст больных Всего Метод проведенной операции

3-9 лет 10-12 Лет 13-17 лет

Дистальная 31 6 3 40 TIP

Проксимальная 8 1 1 10 TIPG

Итого 39 (78%) 7 (14%) 4 (8%) 50 (100%)

Остаточный объем мочи оценивался посредством ультразвукового исследования и значения более 5 мл принимались как значимые. Для оценки Qmax использовались стандартизированные возрастные номограммы. Qmax ниже 5 перцентиля считался обструктивным, выше 25 перцентиля нормальным, промежуток между 5 и 25 перцентилем считался условно-обструктивным.

Для статистического анализа перцентильная шкала была преобразована в Z-значения и оценена с использованием ранжированного теста Уилкинсона и ранжированного корреляционного теста Спирмена.

Наряду с этим нами была создана модель оперативного лечения гипоспадии TIP и TIPG на лабораторных кроликах. Все исследования проводились в соответствии с этическими принципами, изложенными в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Стандартизованные уретральные сегменты (уретра и кавернозные тела) были получены после проведения оперативного вмешательства. Прямое измерение внутриуретрального давления проводили у 25 взрослых самцов новозеландских кроликов, которые были разделены на три группы: I группа контрольная (Gl) -неоперированные животные (n=9); II группа (G2) — оперированные животные по методике тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением TIP (п=8) и III группа (G3) оперированные животные методом использования имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти TIPG (п=8). В этих же группах определяли экспрессию коллагенов I, III, IV, VII и XIII методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) через 6 недель после операции.

Тензитометр (модель 207В, Dynatec Nevada Inc.) подсоединяли к трехразъемному блоку. Измерения внутриуретрального давления были стандартизованы путем последовательно расположенных катетеров на строго одинаковом расстоянии от дистальной лигатуры в изолированном уретральном сегменте у каждого животного. Тензитометр был калиброван к нулевому значению давления с 3 открытыми каналами. Уретральное давление измеряли после каждой инъекции посредством открытия канала между уретральным катетером и тензитометром. Давления регистрировали после единичной инъекции для каждого

объема, с проведением короткого стабилизационного интервала для того, чтобы избежать изменения эластичности, индуцированной посредством повторяющегося растяжения.

Для определения экспрессии белков уретры на модели проводилось исследование с помощью полимеразной цепной реакции и трансмиссионной электронной микроскопии. Для гистологической оценки образцов использовали селективное окрашивание элементов соединительной ткани и коллагена по Маллори, муватом пиктохромом, пикросириусом красным.

Полнмеразная цепная реакция. Перед проведением ПЦР образец промывали, замораживали и помещали для хранения в морозильную камеру с температурой -8°С. Затем проводили оценку коллагенов I, III, IV, VI, VIII и XIII типов. По каждому из типов коллагена выделяли РНК с использованием oligoDT праймеров и обратной транскриптазы (Imitrogen®) (табл. 2). Праймеры были собраны и оттестированы перед применением. ДНК выделяли с помощью раствора TRIzol®.

Таблица 2

Праймеры, использованные в полимеразной цепной реакции (отмечены как 5'к 3')

ГЕНЫ FW ПРАИМЕР RV ПРАИМЕР Температура отжига (oC)

Со11а2 ATG GAT GAG GAA ACT GGC AACT GCC АТС GAC AAG AAC AGT GTA AGT 63

Со13 AAG CCC CAG CAG AAA ATT G TGG TGG AAC AGC AAA AAT CA 52

Со14а1 CAA GGC CCC CAA GGC GAC AG CTC CAG GAG GTC CGG GGT CG 68

Coló CCC CGA CCG ACATCACCA TCC TAC CTT GGC GAA GCG CTT CGT GGT GT 68

Со18а1 CCT CTC TGC CCG ACC TTA CGTGC AGG ACC AGT GTC CCT GCT TGTGT 68

Со113 CCC GGG CTG GGA CAG AA TCC CCG GCT CAC CCT TGG AG 60

GAPDH GGA GAA AGC TGC TAA GTA ACG ACC TGG TCC TCG GTG TA 54

Beta Actin CGG СТА CAG CTT CAC CAC CA CGG GCA GCT CGT AGC TCT TC 63

Стандартизация результатов использовалась для референсных генов b-actin и HPRT. Амплификация проводилась методом флюоресценции (SYBRgreen) с 90-110% эффективностью.

Сравнительный и дескриптивный анализы проводили с использованием статистического программного обеспечения (XLSTAT-Pro®, Addinsoft USA, New York). Статистический анализ проводился с использованием Kruskall-Walis теста и считался значимым при значениях р< 0.05.

После анализа показателей урофлоуметрии и результатов, полученных на экспериментальной модели, проводили исследования ткани уретральной пластинки, взятой при оперативной коррекции гипоспадии у 45 детей.

Наряду с общепринятыми методами клинического и инструментального исследования, детям выполнялось иммуногистохимическое исследование и вестерн-блоттинг биоптатов уретральной пластинки с подлежащей тканью, граничащей с кавернозным телом, взятым во время оперативного лечения. Пункционные биопсии проводились проф. Ж. JI. Пиппи-Салле в отделении урологии Центра СикКидс в период с 2010-2013 гг. Биоптаты помещались в 10% раствор формалина фосфатно-буферного раствора, затем проводилась очистка и дегидратация ткани этанолом и ее парафинизация. Размер срезов составлял 4мм, которые окрашивались гематоксиллин-эозином и предварительно оценивались при помощи светового микроскопа. Для иммуногистохимического исследования и вестерн-блоттинга ткань замораживалась при помощи жидкого азота.

Иммуногистохимические исследования:

Использовались мышиные поликлональные антитела к субтипам человеческого коллагена I (#МАВ1340), III (#МАВ1343) и IV (#МАВ1910) произведенные (Chemicon International, Temecula, CA, USA). Срезы (5 мм) свежезамороженных тканей фиксировались на предметных стеклах, высушивались и предварительно обрабатывались ацетоном при -20 С в течение 5 мин. Затем срезы инкубировались с титрированным раствором антител I, III и IV (1:500) 0,15 mol/L NaCl трихлорного буфера ph 7,6 во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре и промывались несколько раз в фосфат-буферном 0,9% физиологическом растворе.

После чего, в течение 30 мин, производилась инкубация со вторичными антителами (Vector Laboratories, Burlingame, СА, USA). Затем слайды заново промывались в фосфат-буферном физиологическом растворе и окрашивались гематоксиллин-эозином в течение минуты и накрывались предметным стеклом.

Гибридизация разделённых электрофорезом белков с меченым зондом:

Замороженные образцы (20 мг) были помещены в охлажденный буферный расствор 1 (20 mmol/L Tris НС1, 5 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 10 mmol/L p-меркаптоэтанола, 1 mmol/L р-амвдинофенилметансульфунилфторида, 0,15 mmol/L физраствора, ph 7,5). Супернатанты были получены путем центрифугирования, гомогенаты (20 mL) были перемешаны с тем же количеством загрузочного буфера (Laemmli Sample Buffer; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). После десятиминутного кипячения при 100°С образцы были помещены в додецилсульфат поликриламидный гель (SDS). Для электрофореза использовались заданные параметры электрического тока 200V и 80 тА. Перенос осуществлялся на мембраны PDVF (Immobilon; Millipore, Bedford, MA, USA). Блокировка мембран осуществлялась в трибуферном физрастворе (рН 7.5) - Tween20 при комнатной температуре в течении часа и затем производилась инкубация с поликлональными антителами к субтипам коллагена I (#МАВ1340, 10 mg/mL), III (#МАВ1343, разведение 1:200) и IV (#МАВ1910, разведение 1:500) в течение двух часов при температуре 4°С с мягким встряхиванием на вибрационной платформе. Затем три раза фильтр промывался фосфатным буфером и инкубировался со вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре. Блоттинговый белок визуализировался при помощи смеси 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата нитросинего тетразолия при комнатной температуре со встряхиванием. Конечные результаты были получены путем сканирования насыщенности белковых зон. В качестве контроля были использованы мембраны с антителами к бета-актину (А 5316; Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA).

Трансмиссионная электронная микроскопия:

Образцы были фиксированы в 2,5% глютальдегиде и 2% параформальдегиде в 0,15 mmol/L буфере какодилата натрия ph 7,4. После постфиксации в 2% тетраксиде осмия производилась дегидратация ткани этанолом и оксидом пропилена и помещена в контейнер Ероп 812 (ТААВ Laboratories Equipment, Berks, England). Насыщенные срезы (1мм) были произведены на микротоме и окрашены 1% метиленовым синим, и оценены при помощи светового микроскопа Leitz Laborlux-S (Leica Microsystems K.K., Tokyo, Japan). Тонкие срезы приблизительно 900 E были помещены на 200 медной сетчатой решетке и окрашены 10% уранилацетатом и цитратом свинца. Ультраструктурная оценка производилась трансмиссионным электронным микроскопом (JEM-1210; JEOL, Tokyo, Japan).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования методом урофлоуметрии были выполнены при катамнестическом наблюдении после оперативной коррекции гипоспадии по методу TIP и TIPG в урологическом отделении ФГБУ «НЦЗД» РАМН и отделении урологии центра СикКидс.

У 13 мальчиков (26%) при послеоперационном обследовании были выявлены признаки обструкции и была проведена дилятационная меатотомия. Результаты коррекции у 37 мальчиков были признаны удовлетворительными и данные урофлоуметрии анализировались через год после операции. При этом установлено, что средние значения Qmax составляли 13,6 мл/сек (медиана 100, диапазон 27-254, стандартное отклонение 43). У 49% больных Qmax был ниже 5-ого перцентиля (Рис. 1) У тех же больных через 7 лет после оперативного лечения средние значения Qmax составляли 19,0 мл/сек (медиана 16.7, диапазон 6.7-35.6, стандартное отклонение 8.1) и средний объем мочеиспускания 235 мл (медиана 215, диапазон 73544, стандартное отклонение 112).

мл

Рис. 1. Изменения урофлоуметрии через год после коррекции гипоспадии по методу TIP и TIPG (средний возраст детей 3-6 лет)

У 32% больных показатели УФ были ниже 5 перцентиля (рис. 2). Отмечалось значительное улучшение данных УФ с возрастом (Р Z 0.00022). В группе с измененным потоком, отмечалось лишь небольшое улучшение параметров УФ (ниже 5 перцентиля), однако данные у 28% обследуемых улучшились значительно и достигли 25 перцентиля и выше.

мл

Рис. 2. Изменения урофлоуметрии через 7 лет после оперативного лечения по методу TIP и TIPG (средний возраст детей 8-13 лет)

Через 1 год после оперативной коррекции гипоспадии у мальчиков с проксимальными формами гипоспадии обструктивный тип потока мочи отмечался у 75% обследуемых, находящихся ниже 5 перцентиля, в сравнении с больными с дистальной формой гипоспадии, у которых обструктивный тип потока наблюдался в 43% случаях. Через 7 лет после оперативного лечения обструктивный тип потока мочи был у 75% пациентов с проксимальной формой гипоспадии и у 21% обследованных с дистальной формой. Хотя эти мальчики с дистальными и проксимальными формами гипоспадии имели обструктивный характер потока через 7 лет после оперативной коррекции, небольшое улучшение отмечалось в большинстве случаев (рис. 1 и рис. 2).

Изменения потока мочи нами были исследованы в широком временном промежутке после оперативной коррекции. Для доказательства тенденции к улучшению потока мочи с возрастом мы построили Ъ шкалу (перцентили) результатов урофлоуметрии ко времени в годах после проведенной оперативной коррекции. Нами была обнаружена закономерность (Р Ъ 0.08) к небольшому улучшению данных урофлоуметрии с увеличением времени после оперативного вмешательства.

Изменения внутриуретрального давления экспериментальной модели характеризовались пропорциональным увеличением давления в зависимости от количества воздушных инъекций во всех группах. При этом значения давления были выше в а для 1 мл инъекции в сравнении с (р<0,05) и значения ОЗ для любых объемов инъекций были выше в сравнении с другими двумя группами (р<0,05) (табл. 3). Несмотря на тенденцию к увеличению давления у оперированных животных, некоторые измерения были одинаковыми у животных в различных группах, но отличались в пределах своей группы, по всей видимости, вследствие индивидуальных особенностей уретры и разной реакцией на хирургическое вмешательство.

Таблица 3

Средние уровни внутриуретрального давления в группах контроля (01), Т1Р(С2),

ПРО(ОЗ)

Объем воздуха (мл) Показатели внутриуретрального давления (мм.рт.ст.)

01 С 2 вз

1 59.7 79.6* 110*

2 233.1 241 324.2*

3 457.9 423.1 538.2*

Примечание: звездочкой обозначены уровни значимости различий * - р<0.05

Гистологические исследования биоптатов уретральной пластинки больных детей и в экспериментальной модели выявили хорошо окрашенные переплетенные коллагеновые волокна, между которыми визуализировалось множество фиброцитов.

В экспериментальной модели у группы в2 ткани уретры демонстрировали большую коллагенизацию с вентральной части (вблизи швов), наблюдалась также дезорганизация мышечных волокон и меньшее количество эластиновых волокон по сравнении с контролем. Кроме этих особенностей в ткани уретры группы СЗ отмечалась гиперплазия эпителия. В ткани уретры модели 02 не было выявлено признаков фиброзирования, что являлось свидетельством течения регенерации тканей без рубцевания на месте вентрального разреза, в то время как, применение имплантируемого внутреннего листка крайней плоти приводило к гиперплазии эпителия, что было одним из признаков рубцевания. Морфологический анализ эластиновых волокон продемонстрировал их меньшее содержание в контрольной группе, особенно на границе с кавернозным телом (область 1) (рис. 3). Наибольшее их количество было обнаружено в области 4. Доминантное вентральное расположение волокон в контрольной группе не было таким же явным как в группах оперированных животных. Несколько большее количество эластиновых волокон было выявлено в области 1 в группе вЗ. Ткани в группах в1 и С2 демонстрировали обратную корреляцию между количеством эластиновых волокон и величинами сопротивления воздуху при инсуфляции. Для группы ОЗ между ними была выявлена прямая корреляция. Эти данные свидетельствуют, что концентрация

эластиновых волокон в ткани уретры не является основной детерминантой для уретральной растяжимости.

Исследования экспрессии коллагенов:

С помощью ПЦР нами было выявлено, что в экспериментальных группах отмечаются более низкие уровни экспрессии мРНК для VI, VIII, XIII типов коллагена и более высокие уровни для коллагена IV типа, по сравнению с контролем.

'ЩШШ

¿HZ-*'-1***

ж

' Щ г' ' .sJ

Ш-'шт у-

Рис. 3. Гистологическая картина биоптата и схема его описания Эти различия особенно проявлялись при использовании методики TIPG (р<0,01). Были установлены также статистически значимые различия по коллагену VIII типа в оперированных группах по сравнению с контролем (р<0,05). Особенно это проявлялось при методе TIPG (р<0,01). Уровни экспрессии коллагена I и III типов были примерно одинаковыми в трех группах (рис. 4).

Рис.4. Изменения типов коллагенов при разных методах коррекции

Иммуногистохимические исследования биоптатов уретральной пластинки у детей с гипоспадией были проведены для оценки распределения различных типов коллагена. Коллаген I типа располагался на всем протяжении ткани. Коллаген III типа не окрашивался ни в одном из образцов биоптатов! Коллаген IV типа располагался на базальной мембране капилляров. Все образцы уретральной пластинки демонстрировали подобные результаты.

Гибридизация разделённых электрофорезом белков с меченым зондом

коллагенов I, III и IV типов показала, что в образцах гипоспадийной уретральной пластинки у детей присутствуют коллагены I и IV типов, но отсутствует коллаген III типа (рис 5).

Case #1 Case #2

Collagen -1 Collagen - III

140kDa

140kDa

Collagen - IV

170kDa

р-асйп

Рис. 5. Идентификация коллагенов методом вестерн-блоттинга Наряду с этим при помощи трансмиссионной электронной микроскопии отчетливо определялись коллагеновые волокна в одинаковых интервальных полосках (рис.6).

Рис. 6. Микроструктура уретральной пластинки (коллагеновые волокна отмечены звездочками)

В результате исследования было выявлено, что показатели Qmax только в одной трети мальчиков с очень низкими значениями максимальной объемной скорости потока мочи улучшились спонтанно к уровню близкому к норме в течение семи лет после оперативного вмешательства. Следует также отметить, что данные урофлоуметрии у оперированных больных, достигших пубертата, пока не опубликованы. Соответственно, по прежнему, не получен ответ о влиянии полового созревания на изменения потока мочи у пациентов, оперированных по поводу гипоспадии методом TIP и TIPG.

С биофизической точки зрения натяжение уретры напрямую связано с резистентностью к потоку жидкости, растяжимостью и эластичностью. Эти изменения являются фундаментальными для модуляции уринального потока, независимо от нормального диаметра отверстия уретры. Изменения эластичности и/или растяжимости уретрального сегмента могут быть объяснением отклонения от нормы показателей урофлоуметрии, наблюдаемых у больных с нормальным диаметром уретры после уретропластики. В нашей модели мы измеряли давление, воспроизводимое воздушной инъекцией фиксированного объема, соблюдая другие переменные константы. Поэтому можно заключить, что полученные результаты отражают свойства эластичности тестируемого уретрального сегмента.

Очевидно, что для оценки тканевой растяжимости необходимо исследование разных типов коллагена, которые ответственны за функции, связанные со структурой и податливостью тканей, реконструкцией, репарацией, процессами ремоделирования и ангиогенеза. Эти функции запрограммированы комплексом взаимодействий с рецепторами клеток и экстрацеллюлярным матриксом, включая биологический сигналлинг. Твердость и трехмерная пространственная группировка архитектоники коллагенов влияет на механические свойства тканей.

Нами были изучены структурные коллагены (фибрилл образующие - I и III типы, микрофибриллярные - VI и коротких цепей - VIII), базальной мембраны (коллаген IV) и транс мембран регуляторные (коллаген XIII). Коллагены I и III типов напрямую влияют на биофизические свойства ткани. Коллагены VI и VIII

выполняют фиброобразующую функцию посредством рекрута фибробластов; коллаген IV является наиболее важным структурным компонентом базальных мембран; коллаген XIII типа осуществляет регенеративную и регулирующую рост функции (Hayashi Y. et al, 2011). Фибрилл формирующие коллагены (I-II-III-V-XI типов) составляют 90% всех коллагенов.

В нашем исследовании экспрессия м-РНК коллагена VI типа была снижена в экспериментальных группах. Отсутствие коллагена VI типа снижает тканевой фиброгенез, что ранее было отмечено при аневризме аорты, и указывает на непосредственную роль коллагена VI типа в процессе фиброгенеза. Снижение экспрессии коллагена VI типа в экспериментальных группах может быть связано с ингибированием апоптоза в связи с повышенной пролиферацией клеток во время процесса заживления.

Коллаген VIII типа формирует гексагональные сети, и может быть связан со стабилизацией внеклеточного матрикса и активным ремоделированием (MacBeath J. 1996). Мы не предполагали, что количество коллагена VIII типа окажется сниженным в экспериментальных группах, особенно в TIPG модели, учитывая роль импланта в ремоделировании и активации фибробластов. Возможно, наша модель, с одной стороны, связана с более низким уровнем синтеза VIII типа коллагена или с, другой стороны, более низким количеством миоцитов, ответственных за синтез коллагена VIII, которые могут модифицировать ремоделирование ткани после травмы.

Коллаген XIII экспрессируется в основном в растущих, незрелых тканях. В нашем исследовании, наблюдалась тенденция к снижению уровня данного типа коллагена у оперированных животных. Более низкий уровень коллагенов VI, VIII, и XIII типов м-РНК в наших моделях объясняется низким уровнем фиброзирования ткани после проведения операции TIP, как уже отмечалось ранее (Taneli F., et al 2004). Это может указывать на сложные тканевые механизмы уретрального заживления, чем фиброгенез (Hiekkinen A. et al 2012). Следует отметить, что до

наших исследований данные об экспрессии коллагенов уретры в литературе представлены не были.

Baskin L.S. et al (2001) предположили, что в состав ткани нормальной человеческой уретры входит 75% коллагена I типа и 25% коллагена III типа, в сравнении со стенозированными уретрами, где 83% составляет коллаген I типа и лишь 16% коллаген III. Нами впервые установлено, что в уретральной пластинке при гипоспадии не выявляется повышенного содержания общего коллагена, но содержится коллаген I типа и отсутствует коллаген III типа.

Ранее сообщалось, что общее количество коллагена уретральной пластинки при гипоспадии не отличается от аналогичного в здоровой ткани уретры (Erol А. et al, 2000). В нашем исследовании было выявлено наличие коллагена I типа во всех образцах ткани. В отличие от коллагена I типа, III тип в тканях гипоспадийной уретральной пластинки обнаружен не был, что приводит к нарушению формирования эластичных белковых волокон и на микроуровне влияет на свойства уретры. Таким образом, нарушения растяжимости уретры в послеоперационном периоде являются следствием изменений синтеза и/или распределения коллагена III типа, как одного из функционально значимых типов коллагена.

На основании этих комплексных исследований нами рекомендовано длительное наблюдение за больными и проведение уродинамической оценки эффективности оперативной коррекции гипоспадии у детей. Обнаружение патологического тканевого ответа на механическое повреждение при оперативном лечении гипоспадии является основанием для разработки новых средств регенерации тканей уретры.

ВЫВОДЫ:

1. Обструктивный тип урофлоуметрии формируется через год после операции методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением (у 75% больных с проксимальными формами гипоспадии и у 43% - с дистальными);

через 6 лет - при повторном обследовании (у 75% детей с проксимальными формами гипоспадии и у 21% - с дистальными).

2. Улучшение основных параметров урофлоуметрии непосредственно определяется увеличением времени после проведения коррекции гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением.

3. Предложенный экспериментальный способ изучения растяжимости уретры является эффективной моделью прямого измерения давления в изолированном уретральном сегменте и позволяет оценивать биофизические свойства уретры при выборе оптимального метода проведения уретропластики.

4. Коррекция гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением существенно не влияет на растяжимость уретры, в то время как, использование при пластике имплантированного лоскута внутреннего листка крайней плоти сопровождается увеличением внутриуретрального давления в 2 раза, но не изменяет растяжимости уретры.

5. Уровень экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты коллагена IV типа при коррекции гипоспадии методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением увеличивается в 1,6 раза, а при дополнительной имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти - более чем в 2 раза по сравнению с контролем. При этом экспрессия коллагена VI типа уменьшается незначительно, а экспрессия VIII типа коллагена уменьшается более чем в 2 раза при методе тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и более чем в пять раз — при дополнительной имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти.

6. Вновь созданный вентральный уретральный сегмент регенерирует без признаков фиброзирования при оперативном лечении методом тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением, что является свидетельством регенерации без структурных изменений ткани после применения этого способа оперативной коррекции. Признаки рубцевания отмечаются лишь в области имплантации лоскута внутреннего листка крайней плоти, что ведет к ухудшению эластических свойств уретрального сегмента.

7. Отсутствие коллагена III типа во всех образцах биоптатов гипоспадийной уретральной пластинки у детей приводит к нарушению формирования эластичных белковых волокон и определяет изменения показателей потока мочи в послеоперационном периоде, что является молекулярным критерием эффективности коррекции гипоспадии у детей.

8. Установление закономерностей патологического тканевого ответа на повреждение при оперативном лечении гипоспадии является основанием для разработки новых средств регенерации тканей уретры.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. У детей с врожденным пороком уретры оптимальным методом оперативного лечения является тубуляризация уретральной пластинки с продольным ее рассечением. Использование при этом лоскута внутреннего листка крайней плоти не ведет к улучшению механических свойств уретры, а, напротив, ухудшает таковые за счет процесса фиброзирования ткани.

2. Рекомендовано минимизировать использование метода тубуляризации уретральной пластинки с продольным ее рассечением и метода с дополнительным использованием лоскута внутреннего листка крайней плоти при тяжелых проксимальных формах гипоспадии в связи с тенденцией к обструктивному типу показателей урофлоуметрии у данных больных.

3. Рекомендовано длительное наблюдение больных с гипоспадией после проведения оперативного лечения с осуществлением уродинамической оценки в отдаленном катамнезе.

4. Для положительной динамики белкового состава тканей уретральной пластинки при гипоспадии целесообразным является применение различных адъювантов, влияющих на коллагеновый состав в дооперационном периоде и во время регенерации тканей уретры после оперативного лечения.

Публикации по теме диссертации:

1. Марченко A.C. Оценка натяжения уретры с использованием модели неоуретропластики при гипоспадии/ Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус JI.E.,

Пиппи-Салле Ж.Л.// Сборник материалов XIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя»,- Москва,- 2012,- С.307.

2. Марченко A.C. Клиническое значение экспрессии коллагенов уретры после проведения уретропластики на модели гипоспадии / Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус JI.E., Пиппи-Салле Ж.Л.// Сборник материалов XVII конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии»,- Москва,- 2013,- С.373.

3. Марченко A.C. Экспрессия различных типов коллагена при создании неоуретры / Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус Л.Е., Пиппи-Салле Ж.Л.// Материалы III съезда детских урологов-андрологов. -Москва.- 2013.- С. 201.

4. Марченко A.C. Новая методика прямого измерения степени растяжения и эластичности уретры с использованием модели неоуретропластики / Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус Л.Е., Пиппи-Салле Ж.Л.// Детская хирургия. -2012. -№ 5.- С.41-44.

5. Марченко A.C. Факторы, определяющие механические свойства уретры после проведения уретропластики на модели гипоспадии / Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус Л.Е., Пиппи-Салле Ж.Л.// Детская хирургия.- 2013.- №2.- С. 32-36.

6. Марченко A.C. Зависимость эластических свойств неоуретры от экспрессии различных тппов коллагена / Марченко A.C., Зоркин С.Н., Жезус Л.Е., Пиппи-Салле Ж.Л.//Детская хирургия.- 2013.- №3.- С. 6-11.

7. Марченко A.C. Inova^äo instrumental para mensura?äo da complacencia da uretra apös neouretroplastia em coelhos / Марченко A.C., Жезус Л.Е., Зоркин C.H., Пиппи-Салле Ж.Л.// Материалы XIV конгрессе детских урологов Бразилии. Рио-де-Женейро,- 2011.- С. 12.

8. Марченко A.C. Urethral compliance in hypospadias operated by tubularized incised urethral plate (TIP) with and without a dorsal inlay graft: an experimental controlled study./ Марченко A.C., Шнайдер A.H., Жезус Л.Е., Пиппи-Салле Ж.Л.// World Journal of Urology. 2012. №12 PMID: 23224038.

Подписано в печать 22 июля 2013 г.

Формат 60x90/16

Объём 1,5 п л.

Тираж 120 экз.

Заказ № 240713475

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт»

ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: г. Москва, улица Ивана Бабушкина, д. 19/1.

Тел. 740-76-47, 989-15-83.

http: //www. univerprint. ru