Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клиническая значимость полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез, у детей, больных бронхиальной астмой

На правах рукописи

РАМАЗАНОВА НАШШ НАЗЫФОВНА

КЛИНИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНА ИНДУЦИБЕЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА И ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ЕЕ СИНТЕЗ, У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

14.00.09 — педиатрия 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени канд идата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» и лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Эткина Эсфирь Исааковна

доктор биологических наук, профессор Хуснутдинова Эльза Камилевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Мазур Лилия Ильинична

доктор медицинских наук, профессор Викторова Татьяна Викторовна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (117437 г Москва, ул Островитянова 1).

Защита диссертации состоится

с/^ 2008 года

в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 006 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» по адресу: 450000, г. Уфа, ул Ленина, 3.

¿Пре^ра-и^оо

Автореферат разослан ¿£-^1-3008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Мирсаева Г X

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность

Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных заболеваний детского возраста. По данным эпидемиологических исследований ею страдают от 3 до 10% детского населения [Johansson S.G.O., 2004] До настоящего времени вопросы этиопатогенеза являются предметом дискуссий.

БА является классическим примером мультифакториального заболевания, при котором реализация патологического процесса осуществляется взаимодействием средовых и генетических факторов [Cookson W., 1999, Фрейдин М.Б., 2000].

В настоящее время наиболее применяемым методом изучения генетических основ БА является поиск ассоциации заболевания с полиморфизмом генов-кандидатов [Пузырев В.П., Степанов В.А, 1997; Фрейдин МБ. и др., 2006]. Наличие определенных полиморфных вариантов может приводить к изменению уровня экспрессии данных генов и изменению структуры кодируемых ими белков [Пузырев В.П., Степанов В.А., 1997, Carole О. et al., 1998; Palmer L J et al., 2000].

При изучении патогенеза БА представляет интерес исследование возможного участия полиморфизма тех генов-кандидатов, которые отвечают за синтез белков, участвующих в реализации атопического воспаления и бронхиальной гиперреактивности [Dizier M. et al, 2000].

Результатом научных изысканий последних лет стало понимание важной роли оксида азота (NO) в развитии воспалительного процесса при БА. Исследования ряда авторов показали, что у пациентов с БА уровень NO в выдыхаемом воздухе превышает аналогичный параметр у здоровых людей [С.Э. Цыпленкова, ЮЛ. Мизерницкий, 2006; Deykin А, 1998]. Кроме того, доказано участие NO в формировании атопии и гиперреактивности бронхов [Barnes P.J., 1996; Asbutosb К., 2000; Berlyne G., 2000]. При данном заболевании синтез NO контролируется индуцибельной формой синтазы оксида азота (iNOS), активность которой отчасти обусловлена взаимодействием ряда цитокинов, принимающих самое активное участие в иммунопатологическом воспалительном процессе при БА. Учитывая вышесказанное, в качестве генетических маркеров заболевания нами избраны полиморфные варианты гена iNOS и генов цитокинов, белковые продукты которых участвуют в регуляции синтеза фермента.

Цель исследования: установить значимость полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, участвующих в регуляции ее синтеза, в риске возникновения и развития основных фенотипических проявлений бронхиальной астмы у детей. Задачи исследования: 1 Оценить состояние здоровья детей, больных бронхиальной астмой различной тяжести, с помощью клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования;

2. Изучить полиморфные варианты гена индуцибельной синтезы оксида азота Ы082А и провести анализ их ассоциаций с основными клинико-лабораторными и функциональными параметрами детей, больных бронхиальной астмой;

3 Провести анализ ассоциаций основных клинико-лабораторных и функциональных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с полиморфными вариантами генов цитокинов, стимулирующих синтез индуцибельной синтазы оксвда азота И082А (динуклеотидный полиморфизм (СА)„ гена ШРй, полиморфные лотосы -511 ОТ и 3953С>Т гена 1ЫВ, УИТЯ-полиморфизм гена 1ЫЕА, полиморфный локус -308А>в гена 77УЕ4);

4. Провести анализ ассоциаций основных клинико-лабораторных и функциональных параметров заболевания у детей, больных бронхиальной астмой с полиморфными вариантами генов цитокинов, угнетающих синтез индуцибельной синтазы оксида азота Ы082А (полиморфные локусы -5900Т гена 1Ь4, Пе50Уа1 гена 1Ь4Яа, -6270А гена 1110),

5. Оценить риск возникновения бронхиальной астмы у детей по изучаемым полиморфным локусам.

Научная новизна исследования

Впервые показано участие микросателлитного полиморфизма (ССТП)„ гена индуцибельной синтазы оксида азота N082А, динуклеотидного полиморфизма (СА)„ гена интерферона-? ШРО, полиморфных локусов -511С>Т и 39530Т гена интерлейкина-1 р 1ЫВ, УШИ-полиморфизма гена рецепторного антагониста интерлейкина-1Р 1ЫИА, полиморфных локусов -308А>0 гена фактора некроза опухоли-а ШЕЛ, -5900Т гена интерлейкина-4 1Ь4, Не50Уа1 гена а-цепи рецептора интерлейкина-4 1Ь4К в возникновении и развитии основных фенотипических признаков бронхиальной астмы у детей, проживающих в Республике Башкортостан.

Обнаружена ассоциация полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез, с такими фенотипическими проявлениями бронхиальной астмы у детей, как тяжесть заболевания и ее ранний дебют, эпизоды экспираторного удушья в ночное время, гиперпродукция общего сывороточного иммуноглобулина Е, наличие бытовой сенсибилизации, аллергический ринит и атопический дерматит в качестве сопутствующей патологии, экссудативно-катаральный диатез и пищевая сенсибилизация в анамнезе.

Установлены генетические маркеры повышенного и пониженного риска возникновения бронхиальной астмы у детей Республики Башкортостан Научно-практическая значимость работы

Показана ассоциация тяжести бронхиальной астмы с возрастом ребенка, воздействием ряда триггеров, ранним введением прикорма. Кроме того, установлено значение перинатального неблагополучия и неблагоприятных жилищных условий в возникновении заболевания.

Получены новые данные о влиянии полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез, на фенотипические проявления количественных и качественных, патогенетически важных для бронхиальной астмы признаков.

Установленные ассоциации клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с полиморфными вариантами изученных генов, позволят индивидуализировать терапевтические подходы.

Полученные результаты позволят прогнозировать течение бронхиальной астмы. Учет риска возникновения заболевания среди родственников больного даст возможность осуществлять превентивные (первичная профилактика) и планировать адекватные лечебные мероприятия по контролю над симптомами болезни.

Внедрение в прястнку. Результаты исследования внедрены в работу муниципальных учреждений городского округа г. Уфа детской поликлиники № 4, детской поликлиники № 8, детского отделения Клиники БГМУ. Кроме того, полученные результаты используются в программе обучения студентов, врачей-интернов и клинических ординаторов на кафедре детских болезней ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Положения, выносимые на защиту

1. Ассоциация тяжести бронхиальной астмы с возрастом ребенка, воздействием некоторых триггеров (физическая нагрузка, эмоциональный стресс, изменение метеоситуации, пыльца), с ранним введением прикорма.

2. Ассоциация ряда клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (общий уровень сывороточного легкое течение и возраст дебюта заболевания, сочетание бронхиальной астмы с аллергическим ринитом), с полиморфными вариантами гена индуцибельной синтазы оксида азота N082А

3. Асоциация некоторых клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (общий уровень сывороточного ^Е, бытовая сенсибилизация, эозинофилия периферической крови, экссудативно-катаральный диатез в анамнезе, сочетание БА с атоническим дерматитом) с полиморфными вариантами генов цитокинов, стимулирующих синтез индуцибельной синтазы оксида азота (интерферон-у ЮТв, интерлейкин 1РII1 В, рецепторный антагонист интерлейкина 1$/ИЯА, фактор некроза опухоли а ШГА)

4. Ассоциация ряда клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (эозинофилия периферической крови, селективная 1£А-недостаточность, пищевая сенсибилизация в анамнезе) с полиморфными вариантами генов цитокинов, угнетающих синтез индуцибельной синтазы оксида азота (интерлейкин 4 1Ь4 и а-цепь его рецептора 1ЫЯа).

5 Генетическим маркером повышенного риска развития и тяжелого течения бронхиальной астмы у детей является аллель IL4*T полиморфного локуса -5900Т гена Маркерами пониженного риска развития заболевания являются аллель IL4*C и генотип IL4*C/*C полиморфного локуса -590С> Т гена IL4.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Здоровье и безопасность жизнедеятельности молодежи: проблемы и пути решения» (Уфа, 2006), Международной научно-практической конференции «Третьи тульские педиатрические чтения» (Тула, 2007), Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2007), Общероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» (Москва, 2007), школе-семинаре молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа,

2007), межкафедральном заседании кафедр госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, факультетской педиатрии с пропедевтикой, педиатрии ИПО, биологии, лаборатории молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН совместно с Проблемной комиссией «Новые технологии в диагностике, лечении и профилактике заболеваний у детей и подростков» (Уфа,

2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них 1 - в центральной печати

Структура н объем диссертации Работа изложена на 124 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 181 источников, из них 133 работы зарубежных авторов и 48 публикаций отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками, 15 таблицами. Материалы и методы исследования

Нами проведено обследование 213 детей в возрасте от 4 до 18 лет, находившихся на лечении в детском отделении Клиники Башкирского государственного медицинского университета в 2005-2007 г.г. Из них основную группу наблюдения составило 150 детей, больных БА (средний возраст 9,76+0,27 лет). Диагноз БА устанавливался в соответствии с критериями GINA [2002, 2006] и критериями отечественных программных документов по диагностике, лечению и профилактике БА. Степень выраженности одышки и кашля оценивалась с помощью шкалы диспное Medical Research Council Dyspnoea Scale (в модификации Флетчера) и визуальной аналоговой шкалы (в модификации Борг), а также балльной шкалы оценки кашля и модификационной шкалы Борга, оценивающей выраженность силы, побуждающей к кашлю.

Группа контроля представлена 63 практически здоровыми детьми (средний возраст 10,24+0,38 лет), не имевшими аллергических заболеваний, в

том числе в анамнезе, как со стороны самого ребенка, так и его ближайших родственников У детей группы контроля уровень общего IgE в сыворотке крови не превышал 60 МЕ/мл.

При обследовании детей нами использовались анамнестический и общеклинический (общие анализы мочи и крови, электрокардиография, рентгенологическое исследование органов грудной клетки и при необходимости околоносовых пазух) методы, оценка функции внешнего дыхания (ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОФВь МОС25.5о) и иммунного статуса (IgA, IgM, IgG, показатели активности фагоцитоза, содержание ЦИК в сыворотке).

Исследование обследуемых детей включало сбор аллергологического анамнеза, определение уровня общего IgE, специфических IgE-антител в сыворотке крови с помощью метода иммуноферментного анализа, проведение внутрикожного тестирования с бытовыми, пыльцевыми, эпидермальными аллергенами

Материалом для молекулярно-генетического исследования служили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови детей, больных Б А, и детей группы контроля. ДНК выделяли из периферической крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [Malhew et al., 1984] Анализ полиморфных ДНК-локусов осуществляли методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе «Терцик». Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном геле После окончания электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и фотографировали при ультрафиолетовом освещени.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием параметрической и непараметрической статистики в зависимости от шкал и характера распределения переменных. Дня корреляционного анализа использовался коэффициент корреляции Спирмена (R,). Все расчеты проводились с использованием пакета статистических программ «Statistica for Windows 6,0» [StatSoft], программного обеспечения MS Excel (Microsoft). При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах наблюдения использовался критерий х2 (Р) для таблиц сопряженности 2x2 с поправкой Йетса на непрерывность [Леонов, 1998]. Силу ассоциаций оценивали в значениях показателя отношения шансов Odds Ratio (OR) [Schlesselman J., 1982].

Результаты исследований я их обсуждение

1. Клнннко-анамнесгнчесюш характеристика детей, больных БА

Две трети обследованных детей в возрасте от 4 до 18 лет (средний возраст 9,76+0,27 лет) представлены мальчиками (70,67%), остальные - девочками (29,33%) Доминировала возрастная группа мальчиков от 8 до 12 лет, составившая треть (36,67%) обследованных.

Почти две трети детей (64,67%) родилось в мононациональных семьях, треть (34,67%) - от смешанных браков

Половина (50,67%) обследованных рождена от первой беременности В основной группе детей патологическое течение беременности наблюдалось чаще, чем в группе контроля (86% в сравнении с 74,6%, р=0,0528). Ранний гестоз отмечался у половины (52%) будущих матерей, поздний - у двух пятых (41,33% в сравнении с 23,81% в группе контроля, р=0,0232) женщин, причем последний ассоциировался с возникновением впоследствии у детей атопического дерматита (1^=0,213, р=0,010). Кроме того, во время беременности треть женщин перенесла острое респираторное заболевание (32%) и угрозу прерывания беременности (36% по сравнению с 20,63% в группе контроля, р=0,0491), у каждой четвертой-пятой (23,33%) женщины выявлялась хроническая внутриутробная гипоксия плода, у каждой пятой -многоводие (19,33% в сравнении с 6,35% в группе контроля, р=0,0387), у каждой восьмой (12%) - хроническая фетоплацентарная недостаточность, у 2,67% женщин - маловодие. Следует отметить, что при наличии в анамнезе у беременной женщины многоводия наибольшее значение среди триггеров БА у ребенка имела острая респираторная инфекция (1^=0,170, р=0,041).

В большинстве случаев (80%) дети были рождены от срочных родов, каждый десятый ребенок - от преждевременных (10,67%) или запоздалых (9,33%). При рождении оценка по шкале Апгар 7-10 баллов отмечалась у двух третей (68%) обследованных детей, 4-6 баллов - почти у трети (29,33% в сравнении с 19,05% в группе контроля, р=0,0455), 1-3 балла - лишь у 2,67%. Значительная часть (78,67%) обследованных детей родилась с нормальной массой тела. При рождении средний рост детей составил 52,78+0,34 см.

Чуть более половины (54%) детей прикладывалось к груди по истечении первых суток, 40,67% - после первых «уток, 5,33% детей не были приложены к груди вообще. В подавляющем большинстве случаев (82,67%) блюда прикорма вводились до 6 месяцев, что, вероятно, способствовало развитию у ребенка более тяжелого течения БА (^=-0,176, р=0,033).

По данным анамнеза каждому пятому (19,59%) ребенку в роддоме назначались антибиотики, треть детей получала сосудистые препараты (30,41%) и витамины (34,46%), каждый пятнадцатый ребенок -противосудорожные средства (6,76%) и пробиотики (6,08%).

У большинства (72,79%) обследованных детей диагностировалось перинатальное повреждение центральной нервной системы, у каждого десятого (9,52%) - синдром дыхательных расстройств, у каждого седьмого (13,61%) ребенка — внутриутробное инфицирование.

В целом физическое развитие большинства (76,67%) обследованных детей в раннем возрасте соответствовало возрастным нормативам. На первом году жизни низкие прибавки массы тела ассоциировались с более тяжелым течением заболевания (^=-0,166, р=0,045).

Профилактическая вакцинация в полном объеме проводилась у 59,33%) обследованных детей.

Чуть более половины (59,33%) обследованных детей проживало вблизи автомобильных дорог, каждый четвертый-пятый (23,33%) ребенок - недалеко от промышленной зоны. Наличие в жилище повышенной влажности отмечено у пятой части (19,33%) детей, больных Б А, что превышало аналогичный показатель в группе контроля (6,35%, р=0,0314). Кроме того, у каждого одиннадцатого-двенадцатого больного ребенка в жилище отмечено наличие плесени (8,67% в сравнении с 1,59% в группе контроля, р=0,0534). Установлено, что неудовлетворительные условия проживания, которые в основной группе встречались достоверно чаще (54% в сравнении с 34,92% в группе контроля, р=0,0159), ассоциировались с ранним дебютом заболевания (^=-0,186, р=0,025)

В группе детей, больных БА, профессиональные вредности матери встречались достоверно чаще, чем в группе контроля (23,33% в сравнении с 11,11%, р=0,0486). Профессиональные вредности отца отмечались у четвертой части (26,67%) больных детей Пассивное курение, воздействию которого подвергалась почти половина (48,67%) детей основной группы, ассоциировалось с возникновением обострения БА (1^=0,184, р=0,024)

Нами отмечено, что часто болеющие дети достоверно чаще встречались в основной группе, нежели в группе контроля (49,33% в сравнении с 23,81%, р=0,0005). Также установлено, что ЛОР-патология отмечалась почти у двух третей (68%) детей, больных БА, что в 2 раза превышало соответствующий показатель контрольной группы (31,75%, р<0,001) У детей основной группы ветряная оспа диагностировалась гораздо реже, чем в группе контроля (32% в сравнении с 52,38%, р=0,0042). Патология со стороны желудочно-кишечного тракта в виде дисбактериоза отмечалась у половины детей, больных БА (49,33% в сравнении с 22,22%, р=0,0004). Среди детей, больных БА, каждый четветрый-пятый (23,33%) страдал лямблиозом, каждый десятый (10,67%) - гельминтозом. Нами показана достоверная ассоциация возникновения у ребенка экссудативно-катарального диатеза и аллергического ринита с дисбактериозом кишечника (1*5=0,224, р=0,006 и 1^=0,214, р=0,009), а наличие лямблиоза положительно коррелировало с проявлениями атопического дерматита 0^=0,167, р=0,042).

Данные аллерголошческого анамнеза обследованных больных подтверждают сведения о роли наследственности в развитии атопических заболеваний, в частности БА. Так, почти у каждого одиннадцатого (13,33%) ребенка с БА один или оба родителя страдали тем же заболеванием Аллергические заболевания матери ребенка отмечались почти в половине (42%) случаев, отца - у третьей (33,33%) части обследованных детей. Установлено, что в структуре семейной отягощенности по атопическим заболеваниям первое место принадлежало БА (40%), второе - острым аллергическим реакциям (33,33%), третье - пыльцевой сенсибилизации (26%), четвертое - аллергическому риниту (22,67%), пятое - атопическому дерматиту (16,67%).

У большей части детей аллергические заболевания кожных покровов предвосхищали развитие БА. Так, в трех четвертях случаев в анамнезе детей,

больных БА, имелись указания на экссудативно-катарапьный диатез (73,33% в сравнении с 15,87%, р<0,001). У половины больных детей наблюдался атопический дерматит (44%) и аллергический ринит (53,33%), у каждого третьего-четвергого (28,67%) ребенка - острые аллергические реакции, в единичных случаях (3,33%) — поллиноз.

Практически у всех обследованных детей установлено наличие связи обострений БА с причинно-значимым фактором. В качестве таких факторов выступала острая респираторная вирусная инфекция (81,33%), контакт с бытовыми аллергенами (83,33%), физическая нагрузка (78%), почти у половины (43,33%) обследованных - контакт с домашними животными, у трети (34,67%) детей - изменение метеоусловий, у каждого четвертого (25,33%) ребенка - эмоциональный стресс и контакт с пыльцевыми аллергенами. Среди триггеров БА, имеющих отношение к более тяжелому течению заболевания, на главные роли претендовали физическая нагрузка (1^=0,268, р=0,001), эмоциональный стресс (1^=0,179, р=0,028), пыльцевые аллергены (1^=0,178, р=0,031) и изменение метеоситуации (Д,=0,171, р=0,036).

Изучение суточных колебаний проходимости бронхиального дерева показало, что в анамнезе подавляющего большинства (98%) детей имелись дневные приступы, в двух трети (66%) случаев - приступы наблюдались и в ночное время. Нами установлена прямая связь между эпизодами затрудненного дыхания в ночное время и тяжестью БА (1^=0,333, р<0,001).

Средний возраст дебюта заболевания в группе мальчиков составил 3,07+2,67 года, в группе девочек - 4,70+3,12 года (р=0,0014). Средний возраст постановки диагноза БА - 6,07+0,28 года, а средняя продолжительность заболевания к моменту обследования - 5,93+0,29 года. Нами обнаружена обратная связь между возрастом постановки диагноза и степенью тяжести заболевания: чем в более раннем возрасте диагностировалась БА, тем тяжелее оказывалось ее течение (Я,=-0,174, р=0,033).

Две трети (70,67%) обследованных детей обратились в клинику в период обострения заболевания, почти каждый третий (29,33%) ребенок - в период ремиссии. Среди обратившихся в период обострения почти половина (44,34%) детей имела легкое течение заболевания, половина (50%) — среднетяжелое, 5,66% детей - тяжелое.

Острая респираторная инфекция (81,13%) и физическая нагрузка (80,19%) являлись основными факторами, провоцировавшими обострение БА. В качестве триггеров в трети (34,91%) случаев выступало изменение погодных условий или эмоциональный стресс (27,36%) Кроме того, среди причинно-значимых факторов 81,13% детей отмечали контакт с бытовыми аллергенами, 39,81% - с аллергенами животных, 23,30% - с пыльцевыми аллергенами.

При поступлении в клинику практически все (99,06%) дети основной группы предъявляли жалобы на эпизоды экспираторного удушья в ночное время, три четверти (74,53%) обследованных - на дневные одышки.

Снижение физической активности наблюдалось более чем у половины (59%) детей, каждый четвертый (26,5%) ребенок испытывал ограничения во

время разговора, у каждого десятого (10%) отмечалось небольшое возбуждение. Более чем у половины (60%) детей наблюдалось участие вспомогательной мускулатуры в акте дыхания, у трети - дистанционные хрипы (33%) и резко выраженное свистящее дыхание (36%), у половины (50%) -свистящее дыхание, у 14% — свистящее дыхание в конце выдоха.

У подавляющего большинства (73,58%) детей диагностировалось среднетяжелое обострение, у каждого четвертого (24,53%) - легкое, у 1,89% детей - тяжелое.

У каждого четвертого (28,67%) ребенка основной группы физическое развитие было дисгармоничным, причем у каждого пятого (20%) из них темпы физического развития были замедленными, у каждого десятого (10,67%) -ускоренными.

У всех детей основной группы отмечались значительно превосходящие возрастные нормы показатели уровня общего сывороточного независимо от тяжести БА и фазы болезни.

По данным ^Е-специфического тестирования у всех детей, больных БА, установлена поливалентная сенсибилизация. Так, у большинства детей, больных БА, обнаружена сенсибилизация к пищевым (88,67%), бытовым (80%), пыльцевым (78,67%) и эпидермальным (74%) аллергенам. Сенсибилизация к грибковым и бактериальным аллергенам встречалась значительно реже и составила 9,33% и 5,33% соответственно

У детей с тяжелым обострением БА средняя концентрация в сыворотке крови значительно превышала показатели детей с легким (р=0,0209) и среднетяжелым (р=0,0011) обострением. В то же время среди детей с тяжелым обострением данный показатель был намного выше, чем соответствующий параметр детей группы контроля (р=0,0011)

В группах детей с легким (р=0,0418) и среднетяжелым (р=0,0003) течением БА значения ЦИК превышали соответствующий показатель детей группы контроля. Кроме того, в группах с легким (р=0,0019) и среднетяжелым (р=0,0229) обострением содержание ЦИК также превышало аналогичные параметры в группе контроля. Нами отмечено, что изучаемый показатель даже в фазу ремиссии БА оставался высоким

В то же время у детей контрольной группы показатели фагоцитоза значительно превышали аналогичные как в общей выборке больных детей (р=0,0349), так и в группах детей с легким (р=0,0155) и тяжелым (р=0,0152) течением заболевания. Установлено, что в группе детей с легким (р=0,0019) и тяжелым обострением (р=0,0411), а также в фазу ремиссии (р=0,0445) показатель фагоцитоза был значительно ниже такового у детей группы контроля.

В группе детей с легким обострением БА фагоцитарный индекс был статистически значимо ниже, чем соответствующий параметр у детей контрольной группы (р=0,0486).

Независимо от тяжести заболевания у всех детей, больных БА, количество эозинофилов в периферической крови было повышенным Так,

среднее количество эозинофилов в периферической крови, определенное у детей с легким, среднетяжелым и тяжелым течением БА, значительно превышало аналогичный параметр в группе контроля (р<0,001).

Нами показано, что более высокие показатели ЖЕЛ наблюдались в группе детей с легким обострением БА по сравнению с показателями в группе детей с обострением средней тяжести (р=0,0393). В свою очередь в группе детей со среднетяжелым обострением значение ЖЕЛ превышало аналогичный параметр в группе с тяжелым обострением (р=0,0732)

У детей с легким обострением БА отмечались более высокие значения ФЖЕЛ по сравнению с детьми со среднетяжелым (р=0,0265) и тяжелым (р=0,0889) обострением заболевания.

У детей с легким обострением показатель ОФВ1 превышал аналогичные показатели больных со среднетяжелым (р=0,0420) и тяжелым обострением БА (р=0,0736). Наряду с этим у детей со среднетяжелым обострением показатель ОФВ, превышал аналогичный параметр детей с тяжелым обострением (р=0,0716)

У детей с легким обострением БА показатель МОСи был значительно выше, чем у детей со среднетяжелым обострением (р=0,0200) У детей с легким обострением показатель МОС» превышал аналогичный показатель детей с тяжелым обострением (р=0,0436).

Кроме того, показано, что более низкие показатели индекса Тиффно ассоциировались с более тяжелым течением БА (1*,=-0,210, [>=0,018).

По данным рентгенологического обследования органов грудной клетки почти у половины (42,37%) детей, больных БА, определялось усиление легочного рисунка. Деформация легочного рисунка отмечалась у каждого пятого (19,49%) ребенка. У двух третей детей (69,23%) воздушность легочных полей оказалась повышенной. Нами обнаружена прямая зависимость усиления и деформации легочного рисунка и его повышенной воздушности от тяжести заболевания (1^=0,268, р=0,003 и К,=0,395, р<0,001 соответственно). Отмечено, что те же параметры напрямую связаны с фазой болезни, а именно с обострением БА (К,=0,412, р<0,001 и 1^=0,581, р<0,001).

При анализе данных рентгенологического исследования околоносовых пазух у двух пятых (40,32%) обследованных детей выявлены изменения в виде пристеночного утолщения слизистой оболочки верхнечелюстных пазух, у каждого шестого-седьмого (15,32%) ребенка - отек слизистой оболочки носовых раковин, у каждого седьмого (13,71%) - затенение верхнечелюстных пазух.

2. Изучение полиморфных вариантов гена иидуднбельиой синтезы оксида азота ■ генов цитокшов, регулирующих ее синтез

Исследование микросатсллитного полиморфизма (ССТТПе гена А'082А

Известно, что ¡ЫОБ, влияя на количество продуцируемого N0, поддерживает и усиливает воспалительный процесс в дыхательных путях

[Barnes PJ., 1996]. Рядом авторов отмечена прямая зависимость между тяжестью БА и активностью ¡NOS, которая опосредует бронхоконстриктивное действие, используя различные клеточные и гуморальные механизмы [Невзорова В А. и др., 1998]. Являясь одним из кандидатов на участие в развитии БА, ген iNOS требует всестороннего исследования

При изучении микросателлитного полиморфизма (ССТП)п в промоторной области гена NOS2A нами идентифицировано 11 аплельных вариантов с количеством повторов от 8 до 18. В обеих группах наблюдения с большей частотой обнаруживались аллеяьные варианты NOS*ll, NOS* 12, NOS*13 Из 38 идентифицированных нами генотипов в обеих группах наблюдения чаще других встречались генотипы NOS2A*ll/*12, NOS2A*12/*12 и NOS2A*12/*13 Статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов микросателлитного полиморфизма (ССТП)„ гена NOS2A между общей выборкой детей, больных БА, и детей группы контроля не обнаружено.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов микросателлита (ССТП)П гена NOS2A, проведенный в зависимости от тяжести БА, показал, что, у больных с легким течением БА частота аллеля NOS2A*13 почти вдвое превышала таковую среди больных со среднетяжелым течением заболевания (18,83% в сравнении с 10,16%, ^=4,15, р=0,0416). Также была обнаружена тенденция к увеличению частоты встречаемости аллеля NOS2A*ll у больных с БА средней степени тяжести в сравнении с больными с легким течением заболевания (24,22% в сравнении с 14,28%, -¿=4,52, р=0,0335). Помимо этого, нами установлено, что в группе детей с легким течением заболевания генотип NOS2A*12/*13 встречался в 4 раза чаще, чем в группе с БА средней степени тяжести (19,48% по сравнению с 4,69%, 3^=5,60, р=0,0179).

В проведенном нами исследовании у больных БА установлена положительная зависимость между уровнем общего сывороточного IgE и наличием аллеля NOS2A*12 (1^=0,176, р=0,036) и генотипа NOS2A*12/*13 (R,=0,206, р=0,014). Найденная нами корреляционная зависимость уровня IgE в сыворотке крови и аллельного варианта NOS2A*12 подтверждает результаты исследования, проведенного в Индии [I. Batra, Т P. Singh, U. Mabalirajan et al., 2007] Кроме того в нашем исследовании аллель NOS2A*12 и генотип NOS2A*12/*12 ассоциировались с наличием у ребенка аллергического ринита (Rs=0,210, р=0,010 и 1*4=0,192, р=0,019 соответственно). Нами обнаружена обратная ассоциация генотипа NOS2A *12/*13 со степенью тяжести заболевания (Rs—0,238, р=0,003).

Исследование дннуклеотидного полиморфизм» ССА)^ ген» INFG

Являясь одной из важнейших регулирующих систем организма, система интерферона играет значительную роль в развитии иммунных и воспалительных реакций, в том числе и при бронхиальной астме [Балаболкин И.И., 1985; Гущин И.С, 1998, Ершов Ф.И., 1996, Ruggiero V. et al, 1998] Некоторыми авторами доказан взаиморегулирующий характер связей системы

интерферона с иммунной системой организма [Ершов Ф.И., 1996, Намазов JI.C., Ревякина В А., Балаболкин И.И., 1998; Maeyer E.,Maeyer-Guignard J., 1998], одним из проявлений которого является способность тормозить иммунный ответ через снижение гиперпродукции IgE при атопическом воспалении [Тузанкина И А. и др., 1998]. Ассоциацию динуклеотидного (СА)„ полиморфизма гена INFG с мультифакториальными иммунологическими заболеваниями, к которым можно отнести и БА, подтверждают ряд исследований [Awata T. et al., 1994: Miyake К. et al., 2002]

В процессе изучения динуклеотидного полиморфизма (СА)п гена INFG нами идентифицировано 6 аллелей с количеством повторов от 11 до 16 и 13 генотипов.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса (СА)„ гена INFG показал, что в обеих группах наблюдения с наибольшей частотой встречались аллели INFG*12 и INFG*13, генотипы INFG*12/*12 и INFG* 12/* 13 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса (СА)п гена INFG в общей выборке детей и в группах с различным течением заболевания не отличалось от такового в группе контроля.

Нами показана ассоциация генотипа INFG* 12/* 13 с повышенным уровнем сывороточного IgE (R,=0,172, р=0,028), аллеля INFG*12 и генотипа INFG*12/*12 с наличием бытовой сенсибилизации (R»=0,202, р=0,048 и R,=0,249, р=0,014), генотипа INFG*I2/*I2 - с эпизодами экспираторного удушья в ночное время 0^=0,163, р=0,046), что вероятно свидетельствует о том, что данные маркеры ассоциированы с клинико-лабораторными характеристиками БА.

Установлено, что аллель INFG*13 и генотип INFG*13/*13 ассоциировались с экссудативно-катаральным диатезом (R,=0,249, р=0,002 и R,=0,257, р=0,002) и атопическим дерматитом (1^=0,271, р=0,001 и 1^=0,206, р=0,012).

Исследование полиморфны» локусов -5НОТ и 39S30T гена ILÎB и VWTR-iroMwoiiéiB>a гена ILJRA

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов промоторного полиморфизма -511С>Т гена IL1B не обнаружил статистически значимых различий в группах наблюдения. При этом установлено, что аллель IL1B*C и генотип IL1B*C/*C отрицательно коррелировали с наличием у ребенка атопического дерматита (к,=-0Д06, р=0,012 и Rs=-0,189, p=0,02l), а эозинофилия в периферической крови ассоциировалась с генотипом IL1B*C/*C (Rs=0,176, р=0,032)

Изучение полиморфизма 3953С>Т гена IL1B позволило выявить положительную зависимость между уровнем общего IgE в сыворотке крови, бытовой сенсибилизацией и наличием генотипа IL1B*C/*T (3^=0,191, р=0,022 и Rs=0,293, р=0,004) и аллеля IL1B*T (1^=0,209, р=0,012 и R,=0,245, р=0,015) Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 3953С>Тгена

IL IB в группе детей, больных БА и в группе контроля не имело достоверных различий.

Изучение РЛТД-полиморфизма гена /LIRA позволило установить ассоциацию между наличием у ребенка экссудативно-катарального диатеза и генотипом ILIRA*I/*2 (R,=0,205, р=0,013). Анализ распределения частот аллелей и генотипов КЛТЛ-полиморфизма гена IL1RA между группами наблюдения не выявил статистически значимых различий.

Изучение полиморфного локуса -308G>A ген« TN F А

Анализ полиморфного локуса -308G>A гена TNFA, проведенный в группах наблюдения, обнаружил положительную зависимость между уровнем бытовой сенсибилизации и наличием аллеля TNFA*G (Rs=0.340, р=0,001) и генотипа TNFA *G/*G (R^O.332 р=0,001).

Анализ распределения частот аллелей и генотипов изучаемого локуса в общей выборке детей, больных БА и в группах с различным течением заболевания не отличалось от такового в группе контроля. Однако, нами обнаружено, что среднетяжелое течение БА ассоциировалось с генотипом TNFA *G/*A (39,06% в сравнении с 20,64% в группе контроля, х2=5,14, р=0,0234, OR=2,46, CI 95%=1,12-5,43) (рис. 1).

jo Легкая БА ■ Сред нетяжелая БА □ Тяжелая БА ■ Группа контроля |

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%

0%

Рис. 1. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -308G>A гена фактора некроза опухоли a TNFA у детей гр;шш контроля и больных БА в зависимости от тяжести болезни.

Полученные нами результаты подтверждаются исследованиями данного полиморфного локуса, проведенными ранее [Moffatt M.F., Cookson W.O., 1997; Chagani T. et al., 1999; Li Kam Wa T.C. et al., 1999; Winchester E.C. et al., 2000; Witte J.S. et al., 2000; Sandford A.J. et al., 2004; Wang T.N. et al., 2004].

TNFA'A TNFA*G TNFA'A/'A TNFA'GTA TNFA*G/*G

Изучение полиморфного локуса =590С>Тгева Ш и полиморфного локуса Пе50Уа1 гена ¡'Ь4Яа

Анализ полиморфного локуса -590С> Т гена интерлейкина-4 ¡14 позволил выявить достоверные различия по частотам аллелей и генотипов в наблюдаемых группах. Так, частота аллеля И4*Т в группе детей, больных БА, была достоверно выше, чем в группе контроля (46% в сравнении с 33,33%, -/2=5,83, р=0,0157, <Ж=1,70, С 1=1,10-2,63). В группе контроля чаще встречались аллель 114*С (66,67% в сравнении с 54% в группе детей, больных БА, х2==5,83, р=0,0157, (Ж=0,59, С1=0,38-0,91) и генотип И4*С/*С (42,86% в сравнении с 25,33% в общей выборке детей, больных БА, х2=5,14, р=0,0234, (Ж=0,45, С195%=0,24-0,84) (рис. 2).

011=0,59

С195%=0,38-0,91

а БА и Группа контроля

И4*С 1ЫТ М'СГС Ы*С/*Т ИТ/Т

Рис. 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -5900Т гена ннтерлейювна-41Ь4 у детей, больших БА, а группы контроля.

При сравнении частот аллелей и генотипов данного локуса в зависимости от тяжести БА также получены достоверные различия (рис. 3). Нами показало, что в группе детей, больных БА, независимо от тяжести болезни, доминировал аллель 1Ь4*Т, а в группах с легким и тяжелым течением заболевания его частота имела достоверные отличия от таковой в группе контроля и составила 45,45% (х2=4,24, р=0,0394) и 61,11% (х2=5,22, р=0,0222) в сравнении с 33,33%. Показатель соотношения шансов развития тяжелого течения БА у носителей аллеля К4*Т составил 3,14 (С1=1,14-8,69). Кроме того, в группе детей с тяжелым течением болезни отмечалась тенденция к увеличению встречаемости генотипа 1Ь4*Т/*Т (44,45% в сравнении с 9,52% в группе контроля, х2=5,37, р=0,0204, СЖ=7,6, С1=1,60-36,19).

[о Легкая БА и Сред нет*жопая БА р Тяжелая БА и Группа контроля]

во%

50% 40% 30% 20% 10% 0%

Рве. 3. Распределение частот аллелей н генотипов полиморфного л о кус« -5900Т гена интерлейкина-4 IL4 у детей группы контроля н больных БА в зависимости от тяжести болезни.

Полученные нами данные подтверждают результаты изучения данного полиморфного локуса, проведенные в различных популяциях [А.Р. Шалухина, 2006; E.G. Burchard, E.K. Silverman, L.J. Rosenwasser et al., 1999; A.J. Sandford, T. Chagani, S. Zhu et al., 2000].

Установлена ассоциация аллеля IL4*T с повышенным уровнем эозинофилов в периферической крови и пониженной концентрацией сывороточного IgA (¿5=0,207, р=0,011 и R,=-0,201, р=0,016).

Нами установлена ассоциация пищевой сенсибилизации с наличием генотипа IL4RA*He50/*Val50 (R,=0,261, р=0,033) по полиморфному локусу IleSOVal гена а-цепи рецептора IL4. В группах наблюдения статистически значимых различий в распределении частот аллелей и генотипов изучаемого локуса получено не было.

Исследование про моторного полиморфизма -627С> А гена ILIO позволило сделать вывод об отсутствии ассоциации данного полиморфного локуса с БА у детей, больных БА, проживающих в РБ.

Таким образом, проведенное нами исследование позволило установить значимость полиморфных маркеров гена iNOS и генов цитокинов (интерферона-у, интерлейкина-lß и его рецепторного антагониста, фактора некроза опухоли а, интерлейкина-4 и а-цепи его рецептора), регулирующих ее синтез, в риске возникновения и развития основных фенотипических проявлений БА у детей и выявить ассоциации клинико-лабораторных признаков заболевания с полиморфными вариантами изученных локусов. Кроме того, выявлены маркеры повышенного и пониженного риска развития БА.

IL4-C И.4Т IL4*C/*C К-4-С/Т IL4T/T

Выводы

1. У детей тяжесть бронхиальной астмы ассоциируется с возрастом ребенка, воздействием ряда триггеров (физическая нагрузка, эмоциональный стресс, изменение метеоситуации, пыльца), ранним введением прикорма.

2. Показана ассоциация некоторых фенотипических признаков бронхиальной астмы у детей с микросателлитным полиморфизмом (ССТТТ)п гена индуцибельной синтезы оксида азота. Так, повышенный уровень общего сывороточного IgE ассоциируется с аллелем NOS2A *12 и генотипом NOS2A *12/*13, наличие сопутствующего аллергического ринита - с аллелем NOS2A*12 и генотипом NOS2A*12/*I2, легкое течение заболевания - с генотипом NOS2A*12/*13, ранний дебют бронхиальной астмы (до 2-х лет) - с генотипом NOS2A*ll/*ll.

3. Установлена ассоциация наличия бытовой сенсибилизации с аллелем INFG*12 и генотипом INFG*12/*12 динуклеотидного полиморфизма (СА)п гена INFG, эпизодов экспираторного удушья в ночное время - с генотипом INFG* 12/* 12 , гиперпродукции сывороточного IgE - с генотипом INFG*I2/*13 , наличие экссудативно-катарального диатеза в анамнезе и сочетание бронхиальной астмы с атоническим дерматитом - с аллелем INFG*13 и генотипом 1NFG*13/*13

4 Выявлена ассоциация эозинофилии периферической крови с генотипом ILIB*C/*C полиморфного локуса -SHOT гена IL1B Повышенный уровень IgE-антител в сыворотке крови и бытовая сенсибилизация ассоциируются с аллелем IL1B*T и генотипом IL IB *С/*Т полиморфного локуса 395ЗО Т гена IL1B, экссудативно-катаральный диатез в анамнезе -с генотипом ILlRA*l/*2 ЮТЖ-полиморфизма гена ¡LIRA Обнаружена ассоциация генотипа TNFA*G/*A полиморфного локуса -308G>A гена TNFA со среднетяжелым течением заболевания, бытовая сенсибилизация ассоциировалась с наличием аллеля TNFA*G и генотипа TNFA*G/*G.

5 Генетическим маркером повышенного риска возникновения и тяжелого течения бронхиальной астмы у детей является аллель IL4*T полиморфного локуса -590С>Т гена 1L4, пониженного риска - аллель IL4*C и генотип 1L4*C/*C полиморфного локуса -590С>Тгена IL4

Практические рекомендации

1. У детей, больных бронхиальной астмой, рекомендуется проводить генотипирование маркера тяжести заболевания (аллель IL4*T полиморфного локуса -590С>Т гена IL4) для прогнозирования течения заболевания и достижения адекватного контроля над его симптомами

2. Рекомендуется учитывать ассоциации клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с микросателлитами (ССТТГ)п гена NOS2A и (СА)п гена INFG, полиморфными локусами -5ПОТ и 39530Т гена IL 1В, гена IL IRA, -308G>A гена TNFA, -590C>T гена IL4, IleSOVal гена а-цепи рецептора IL4 для индивидуализации терапевтического подхода.

3. Лицам из групп риска по возникновению бронхиальной астмы целесообразно проводить тестирование генетического маркера предрасположенности к заболеванию (аллель IL4 *Т полиморфного локуса -590С>Т гена IL4) для осуществления комплекса мероприятий по первичной профилактике.

Список публикаций по теме диссертации

1. Полиморфизм генов IL4(-590C>T) и IL4Ra(Ile50Val) у детей, больных бронхиальной астмой, проживающих в республике Башкортостан / Н Н. Рамазанова, Э.И. Эткина, А.Х Хузина, А.С Карунас, JIJI. Гурьева, H.A. Орлова, Э К. Хуснутдинова // Казанский медицинский журнал. - 2007. - Т 8. - № 6. - С 574-576.

2. Полиморфизм гена IL4(-590C>T) у детей с бронхиальной астмой, проживающих в Республике Башкортостан / Н.Н Рамазанова, A.C. Карунас,

3.И Эткина, JIЛ Гурьева, Н.А Орлова, Л.И Бабенкова // Научно-теоретический журнал «Фундаментальные исследования». - 2007 - № 12. - С. 95

3 Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов с атопической бронхиальной астмой в Республике Башкортостан / Ю.Ю Федорова, А С. Карунас, Н.Н Рамазанова, Э.И Эткина, Э К. Хуснутдинова // Биомика - наука XXI века* материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии. - Уфа. - 2007 - С. 126-127.

4. Метеозависимость симптомов у детей с атопической бронхиальной астмой, проживающих в республике Башкортостан / Л.Л Гурьева, Э.И. Эткина, НА. Орлова, H.H. Рамазанова, Т.П Васильева // Научно-теоретический журнал «Фундаментальные исследования». - 2007. - № 12 - С 94-95

5. Факторы, снижающие уровень контроля над бронхиальной астмой у детей / Л Л. Гурьева, НН Рамазанова, H.A. Орлова, А А. Фазылова, Г.Д Сакаева, С Э. Якута // Третьи Тульские педиатрические чтения- материалы международной научно-практической конференции. — Тула. - 2007. — С 25-26.

6. Наследственность как фактор риска развития бронхиальной астмы у детей / H.H. Рамазанова, Н.И. Поликарпова, А.Д. Гибадуллина, И.М Тимербулатова // Материалы Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых. - Уфа. — 2007. - С. 220-221

7. Бронхиальная астма - проблема, требующая решения / Л.И. Бабенкова, Э.И. Эткина, Л.Я Данилова, H.H. Рамазанова, H.A. Орлова, С.ЭЛкута, А.Е Казан // Здоровье и безопасность жизнедеятельности молодежи. Проблемы и пути решения- материалы международной научно-практической конференции. -Уфа.-2006 -С. 82-86.

Подписано в печать 25 02 2008 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать ризографическая Тираж 100 экз Заказ 149 Гарнитура «ТгпкяМешНотап» Отпечатано с готовых оригинал-макетов в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ»ИПВЕРКО Объем 1,1 пл Уфа, Карла Маркса 12 корп 4, т/ф 27-27-600, 27-29-123

Бронхиальная астма (БА) относится к числу наиболее распространенных заболеваний детского возраста, представляя серьезную медицинскую и социальную проблему [Коростовцев Д.С., Макарова И.В., 2001; Дрожжев М.Е. и др., 2002] По данным эпидемиологических исследований БА страдают от 3 до 10% детского населения всего мира [Балаболкин И.И., 1985; Богданова А.В. и др., 1998; Чучалин А.Г., 2005; Asher M.I. et al., 1995; ISAAC, 1998]. До настоящего времени вопросы этиопатогенеза БА являются предметом дискуссий.

БА является классическим примером мультифакториального заболевания, при котором реализация патологического процесса осуществляется взаимодействием средовых и генетических факторов [Фрейдин М.Б., 2001; Фрейдин М.Б. и др., 2006].

В настоящее время наиболее применяемым методом изучения генетических основ БА является поиск ассоциации заболевания с полиморфными вариантами так называемых генов-кандидатов [Пузырев В.П. и др., 2000; Фрейдин М.Б. и др., 2006; Мазурина С.А., Казначеев В.А., 2006]. Наличие определенных полиморфных вариантов генов может приводить к изменению уровня экспрессии данных генов и изменению структуры кодируемых ими белков [Carole О. et al., 1998; Palmer L.J., William O.C.M., 2000].

При изучении патогенеза БА представляет интерес исследование возможного участия полиморфизма тех генов-кандидатов, которые отвечают за синтез белков, участвующих в реализации атопического воспаления и бронхиальной гиперреактивности [Фрейдин М.Б. и др., 2006].

Результатом исследований последних лет стало понимание важной роли оксида азота (NO) в развитии воспалительного процесса при БА. Доказано участие NO в формировании атопии и гиперреактивности бронхов [Barnes Р.J.,

1996; Asbutosb К., 2000]. В связи с этим большое распространение приобрел метод определения уровня N0 в выдыхаемом воздухе, нарастание которого в большинстве работ трактуется как один из показателей, свидетельствующий об активности аллергического воспаления у больных БА [Харитонов С.А. и др., 1997; Вознесенский Н.А., 2000; Цыпленкова С.Э, Мизерницкий Ю.Л., 2006; Byrnes С. et al., 1997]. При данном заболевании синтез NO контролируется индуцибельной формой синтазы оксида азота (iNOS), активность которой отчасти обусловлена взаимодействием ряда цитокинов, принимающих самое активное участие в иммунопатологическом воспалительном процессе при БА. Учитывая вышесказанное, в качестве генетических маркеров заболевания нами избраны полиморфные варианты гена iNOS и генов цитокинов, белковые продукты которых участвуют в регуляции синтеза фермента.

Цель исследования: установить значимость полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез, в риске возникновения и развития основных фенотипических проявлений бронхиальной астмы у детей.

Задачи исследования:

1. Оценить состояние здоровья детей, больных бронхиальной астмой различной тяжести, с помощью клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования;

2. Изучить полиморфные варианты гена индуцибельной синтазы оксида азота NOS2A и провести анализ их ассоциаций с основными клинико-лабораторными и функциональными параметрами детей, больных бронхиальной астмой;

3. Провести анализ ассоциаций основных клинико-лабораторных и функциональных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с полиморфными вариантами генов цитокинов, стимулирующих синтез индуцибельной синтазы оксида азота NOS2A (динуклеотидный полиморфизм (СА)п TemL-INFG;полиморфные локусы -5ПС>Ти 3953С>Т гена IL1B, VNTR-полиморфизмгена IL1RA, полиморфный локус -308A>G гена TNFA)\

4. Провести анализ ассоциаций основных клинико-лабораторных и функциональных параметров' заболевания у детей; больных бронхиальной астмой с полиморфными вариантами генов цитокинов, угнетающих синтез индуцибельной синтазы оксида азота NOS2A (полиморфные локусы, -590С>Т' гена IL4, Ile50Val гена IL4Ra, -627С>А гена/£70);

5. Оценить риск возникновения бронхиальной?астмы, у детей по;; изучаемым? полиморфным локусам. ; .

Научная новизна исследования

Впервые показано участие микросателлитного полиморфизма (ССТТТ)П гена индуцибельной синтазы; оксида азота: NOS2A, динуклеотидного полиморфизма (СА)„ гена интерферона-уполиморфных локусов -511С>Т и 3953С>Т гена интерлейкина-1 р IL1B, VNTR-полиморфизма гена рецепторного антагониста; интерлейкина-1Р IL1RA, полиморфных локусов -308А> G гена фактора некроза опухоли a TNFA, -590С> Т гена- интерлейкина-41 IL4, Ile50Val гена а-цепи рецептора интерлейкина-4 IL4R в возникновении и развитии основных фенотипических признаков бронхиальной', астмы у детей, проживающих в Республике Башкортостан.

Обнаружены ассоциации полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез; с такими фенотйпическими; проявлениями4 бронхиальной- астмы у детей, как тяжесть заболевания и ее ранний дебют, эпизоды экспираторного удушья в ночное время, гиперпродукция* общего сывороточного иммуноглобулина Е, наличие бытовой сенсибилизации, аллергический ринит и атопический дерматит в качестве сопутствующей патологии, экссудативно-катаральный диатез и пищевая сенсибилизация в анамнезе.

Установлены генетические маркеры повышенного и пониженного риска возникновения бронхиальной астмы у детей Республики Башкортостан.

Научно-практическая значимость работы

Показана ассоциация тяжести бронхиальной астмы с возрастом ребенка, воздействием ряда триггеров, ранним введением прикорма. Кроме того, установлено значение перинатального неблагополучия и неблагоприятных жилищных условий в возникновении заболевания.

Получены новые данные о влиянии полиморфных вариантов гена индуцибельной синтазы оксида азота и генов цитокинов, регулирующих ее синтез, на фенотипические проявления количественных и качественных, патогенетически важных для бронхиальной астмы признаков.

Установленные ассоциации клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с полиморфными вариантами изученных генов, позволят индивидуализировать терапевтические подходы.

Полученные результаты позволят прогнозировать течение бронхиальной астмы. Учет риска возникновения заболевания среди родственников больного даст возможность осуществлять превентивные (первичная профилактика) и планировать адекватные лечебные мероприятия по контролю над симптомами болезни.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в работу муниципальных учреждений городского округа г. Уфа детской поликлиники № 4, детской поликлиники № 8, детского отделения Клиники БГМУ. Кроме того, полученные результаты используются в программе обучения студентов, врачей-интернов и клинических ординаторов на кафедре детских болезней ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Положения, выносимые на защиту

1. Ассоциация тяжести бронхиальной астмы с возрастом ребенка, воздействием некоторых триггеров (физическая нагрузка, эмоциональный стресс, изменение метеоситуации, пыльца), с ранним введением прикорма.

2. Ассоциация ряда клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (общий уровень сывороточного IgE, легкое течение и возраст дебюта заболевания, сочетание бронхиальной астмы с аллергическим ринитом), с полиморфными вариантами гена индуцибельной синтазы оксида азота NOS2A.

3. Ассоциация некоторых клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (общий уровень сывороточного IgE, бытовая сенсибилизация, эозинофилия периферической крови, экссудативно-катаральный диатез в анамнезе, сочетание БА с атопическим дерматитом) с полиморфными вариантами генов цитокинов, стимулирующих синтез индуцибельной синтазы оксида азота (интерферон-у INFG, интерлейкйн ip IL1B, рецепторный антагонист интерлейкина 1 р IL1RA, фактор некроза опухоли a TNFA).

4. Ассоциация ряда клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой (эозинофилия периферической крови, селективная IgA-недостаточность, пищевая сенсибилизация в анамнезе) с полиморфными вариантами генов цитокинов, угнетающих синтез индуцибельной синтазы оксида азота (интерлейкин 4 IL4 и а-цепь его рецептора IL4Ra).

5. Генетическим маркером повышенного риска развития и тяжелого течения бронхиальной астмы у детей является аллель IL4*Tполиморфного локуса -590С>Т гена IL4. Маркерами пониженного риска развития заболевания являются аллель IL4*C и генотип IL4*C/*C полиморфного локуса -5900Т гена IL4.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международной научно-практической конференции «Здоровье и безопасность жизнедеятельности молодежи: проблемы и пути решения» (Уфа, 2006), Международной научно-практической конференции «Третьи тульские педиатрические чтения» (Тула, 2007), Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых (Уфа, 2007), Общероссийской конференции «Фундаментальные и* прикладные исследования» (Москва, 2007), школе-семинаре молодых ученых Уфимского научного центра РАН и Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии (Уфа,

2007), межкафедральном заседании кафедр госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, факультетской педиатрии с' пропедевтикой, педиатрии ИПО, биологии и лаборатории молекулярной генетики человека-ИБГ УНЦ РАН совместно с Проблемной комиссией «Новые технологии в диагностике, лечении и профилактике заболеваний у детей и подростков» (Уфа,

2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них 1 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает 181 источников, из них 133 работа зарубежных авторов и 48 публикаций отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 8 рисунками, 16 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. У детей тяжесть бронхиальной астмы ассоциируется с возрастом ребенка, воздействием ряда триггеров (физическая нагрузка, эмоциональный стресс, изменение метеоситуации, пыльца), ранним введением прикорма.

2. Показана ассоциация некоторых фенотипических признаков бронхиальной астмы у детей с микросателлитным полиморфизмом (ССТТТ)п гена индуцибельной синтазы оксида азота. Так, повышенный уровень общего сывороточного IgE ассоциируется с аллелем NOS2A *12 и генотипом NOS2A*12/*13, наличие сопутствующего аллергического ринита - с аллелем NOS2A*12 и генотипом NOS2A*12/*12, легкое течение заболевания - с генотипом NOS2A*12/*13, ранний дебют бронхиальной астмы (до 2-х лет) - с генотипом NOS2A*] 1/*11.

3. Установлена ассоциация наличия бытовой сенсибилизации с аллелем INFG*12 и генотипом INFG*12/*12 динуклеотидного полиморфизма (СА)п гена INFG, эпизодов экспираторного удушья в ночное время — с генотипом INFG*12/*12, гиперпродукции сывороточного IgE — с генотипом INFG*12/*13 , наличие экссудативно-катарального диатеза в анамнезе и сочетание бронхиальной астмы с атопическим дерматитом — с аллелем INFG* 13 и генотипом INFG* 13/* 13.

4. Выявлена ассоциация эозинофилии периферической крови с генотипом IL1B*C/*C полиморфного локуса -511С>Т гена IL1B. Повышенный уровень IgE-антител в сыворотке крови и бытовая сенсибилизация ассоциируются с аллелем IL1B*Tи генотипом IL1B*C/*Tполиморфного локуса 3953С>Тгена IL1 В, экссудативно-катаральный диатез в анамнезе -с генотипом ILlRA*l/*2 РТУТК-полиморфизма гена IL1RA. Обнаружена ассоциация генотипа TNFA*G/*A полиморфного локуса -308G>A гена TNFA со среднетяжелым течением заболевания, бытовая сенсибилизация ассоциировалась с наличием аллеля TNFA *G и генотипа TNFA *G/*G.

5. Генетическим маркером повышенного риска возникновения и тяжелого течения бронхиальной астмы у детей является аллель IL4*T полиморфного локуса -590С>Т гена IL4, пониженного риска - аллель IL4*C и генотип IL4*C/*C полиморфного локуса -590С> Т гена IL4.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У детей, больных бронхиальной астмой, при необходимости уточнения степени тяжести рекомендуется проводить генотипирование маркера тяжести заболевания (аллель IL4*T полиморфного локуса -590С>!Г гена IL4) для прогнозирования течения заболевания и достижения адекватного контроля над его симптомами.

2. Рекомендуется учитывать ассоциации клинико-лабораторных параметров детей, больных бронхиальной астмой, с микросателлитами (CCTTTJn гена NOS2A и (СА)п гена INFG, полиморфными локусами

-511С>Ти 395ЗС>ТгенаIL1B, ven&ILlRA, -308G>A гена TNFA, -590С>Т гена IL4, Ile50Val гена а-цепи рецептора IL4 для индивидуализации терапевтического подхода.

3. Лицам из групп риска по возникновению бронхиальной астмы целесообразно проводить тестирование генетического маркера предрасположенности к заболеванию (аллель IL4* Т полиморфного локуса -590С>Т гена IL4) для осуществления комплекса мероприятий по первичной профилактике.