Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Клеточные механизмы эмбрионального развития сердечной мышечной ткани в норме и при воздействии физических факторов

РГЗ од

2 1\ ноя 'С07

На правах рукописи

СКВОРЦОВ ОЛЕГ ИГОРЕВИЧ

КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ В НОРМЕ И ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ.

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1997

Работа выполнена на кафедре гистологии и эмбрполен ни Самарского государственного медицинского университета п в отделе морфолопш и электронной мокроскопнн Российского государственного медицинского университета.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Н. В. Ямщиков.

доктор медицинских наук, профессор В. 13. Банин.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. С. Пыласв.

доктор медицинских наук, профессор С. Л. Кузнецов.

Ведущая организации - Российская Военно-медицинская академия

Защита диссертации состоится '¿л [997 г в »_» час

на заседании диссертационного согёгта Д 084.14.04 при Российском государственном медицинском университете (117869, Москва, ул. Островитянова, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан -е^^г \ 997 г.

Ученый секретарь днсссртацпонпго совета доктор медицинских наук,

профессор А. 11 .Тихомиров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Гистогенез сердечной мышечной ткани и ее адаптивные свойства в условиях различных воздействий являются предметом ряда фундаментальных исследовании (Д. С. Саркисов н соавт., 1970-1987; П. П. Румянцев, 1982; J1. А. Семенова и соавт., 1985; JI. М. Непомнящих и соавт., 1986-1994; В. И. Швалев и соавт., 1992; И. А. Хлопонин, 1988; II. В. Ямщиков, 1991, 1996; R. De Haan, 1963, С. Challice, 1974, F. Manasek, 1973). Достаточно определенно установлены источники происхождения кар;щомиобластов, их последовательные изменения в ходе специфической диффереицировкн, влияние различных условии па мнокардио1 енсз.

Традиционной и очень удобной моделью является сердечная мышечная ткань цьшлейка (И. В. Ямщшсов, 1973). При ее изучении удается вполне точно koiизолировать сроки эмбрионального развития и оценивать динамику морфолошческих изменений ткани. Однако, несмотря па кажущееся обилие исследовании, выполненных на этой и подобных моделях, ряд существенных моментов гистогенеза миокарда остается неясным. Среди конкретных вопросов, нуждающихся в в дальнейшей разработке, следует обратить внимание на ту роль роль, которую шрает программированная клеточная смерть (апоптоз) в процессах развития мышечной ткани па различных этапах эмбриогенеза (II. В. Ямщиков, 1991). До енх пор не очень четко очерчены критерии, которые характеризуют процессы клеточной дпфферешшровкп. Неясна, в частности, последовательность внутриклеточных траиформаций кардиомпобластов в типичные кардиомпоцпты. Остается непонятным, каким образом изменение морфологии самих клеток соотносится с развитием специфических связей между ними. Представляется важным, в частности, выяснить, как рано возникают межклеточные контакты и образуются лп они вообще в процессе эмбрионального развития сердечной мышечной ткани (В. В. Баннн, Г. А. Алимов, 1993).

С точки зрения возможных модулирующих эффектов п тератоген-ноетп заслуживает шшмання тление влияния некоторых физических фнхторов на развивающиеся миокард. Исследования, проводимые в рамках этой проблемы многочисленны (Л. М. Непомнящих н соавт., 1986-1994). Однако в большинстве из них акцептируется внимание на повреждающем действии агентов и не очень очерчены возможные последствия на процесс дафференцировки клеток. Возможно, что это обстоятельство связано с использованием заведомо сильных влияний.

Среди всей совокупности возможных нерешенных вопросов в сложной проблеме кар;цюмиогенеза мы попытались выделить лишь некоторые, в решении которых могуг быть полезными современные морфологические подходы.

Цель исследования: Морфологический анализ процессов днфференцпровкн сердечной мышечной ткани при эмбриональном развитии цыпленка.

Задачл исследовании:

-изучение тонкого строения сократительных ¡слеток сердца п их связей на протяжении всего периода эмбрионального развития цыпленка,

-сопоставление динамики пролиферации и клеточной шбели в эмбриональном гистогенезе миокарда.

-анализ изменений сердечной мышечной ткани эмбриона цыпленка при воздействии некоторых физических факторов.

Научная новизна. Результаты диссертационной работы позволяют представить сердечную мышечную ткань, как клеточный дпффероп, возникающий в результате дивергентной дифференцировкн стволовой клетки. Устаноалено, что в ходе специфической дифференцировкн сократительные кардномпоциты проходят стадии кардиомиобластов, дифференцирующихся и дифференцированных мышечных клеток. Дифференцнровка сократительных клеток миокарда включает зри обязательных и взаимосвязанных компонента: внукриклеточную специализацию, установление характерных межклеточных связен и епптопии органелл.

Установлена взаимосвязь клеточной гибели с процессами пролиферации и ;п1фференцпровки кардиомиоцитов. В работе подчеркнуто значение про1раммировашюй клеточной гибели, как одного из важных механизмов контроля процесса клеточной дифференцпровки кардиомиоцитов.

Воздействие па эмбрион постоянным мапштным полем II нпзконнтенспвным лазерным излучением приводит к реактивным изменениям и повреждениям оргапедт, однако в целом специфическая дифференцировка кардно.мпоцнтов сохраняется. Это воздействие изменяет интенсивность программированной клеточной смерти.

Научно-практическая значимость. Установление закономерных соотношений процессов пролиферации, дифференцпровкп и клеточной гибели в развитии сердечной мышечной ткани могут служить основой в разработке проблем возрастной дпнамшш тканей. \ (орфометрнчеекпе и электронно-микроскопические характеристики кардпомпоцнтов различных стадий развития мо1уг быть использованы в изложении соответствующих разделов гистоло1 нн и эмбриологии.

Результаты псследовапня, свидетельствующие о способности постоянного магнитного поля и пнзкопптененвного лазерного излучения усиливать клеточную гибель в эмбриональном миокарде расширяет существующие представления об апоптозе, как об одном из базисных процессов эмбриогенеза.

Основные положении, выносимые на защиту.

-дифференцировка мышечной ткани сердца куриного эмбриона включает процессы внутриклеточной специализации кардиомиоцитов п установления характерных межклеточных связен;

-соотношение процессов клеточной пролиферации и гибели (апоптоза) в эмбржл енезе ре1улпрует массу клеток сердечной мынпцы п пх диффереицнровку.

-умеренные воздействия физических факторов (ма1 пптпо1 о поля и лазерного излучения) изменяет соотношение пролиферации и клеточной гибели в пользу последней.

Апробации работы. Материалы диссертационного исследования доложены п обсуждены на па XXVII научной конференции военно-

ме;цщнпского факультета (Самара, 1994), на научной конференции "Математическое моделирование в теоретической н практической медицине" (Самара, 1994), научной конференции "Гистогенез и регенерация тканей" (С-Пстербург, 1995), на научной конференции "Антропогенные воздействия и здоровье человека" (Калуга, 1995), на научной конференции "Гпсто1 снетнчсскнн анализ изменчивости н регенерация тканей" (С-Пстербург, 1997). В целом, материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедр гистологии, нормальной анатомии СГМУ (Самара, 1997) п на заседании отдела морфологии п электронной микроскопии РГМУ (Москва, 1997).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 7 печатных работах.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего источника. Работа иллюстрирована таблицами, микрофотографиями.

Внедрение. Результаты работы внедрены в учебную программу при изложении материала по темам "Мышечные ткани", "Сердечнососудистая система", "Аномалии развития" на кафедре гистологии и патологической анатомии Самарского государственного медицинского университета п в научно- исследовательскую работу Российского государственного медицинского университета.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были пепользовалн куриные эмбрионы и цыплята породы Леггорн чистой лшшн "-Янтарь - кросс", полученных с Жигулевской птицефабрики г. Самара. Для инкубации отбпратп яйца весом 50 - 60 г., которые помещали в лабораторный инкубатор, сконструированный на основе лабораторного термостата. (II. В. Ямщиков., 1984). В вентиляционной камере поддерживали

температуру 37,8 ± 0,1е С н относительную влажность 60 - 65° о. К концу ннкубнровання температуру снижали до 37,4° С. Для изучения влияния физических факторов применяли постоянное магнитное поле, напряженностью 7,5 мТл, в течении 60 минут и ннзконнтеиспвное лазерное излучение с длиной волны 0,89 мкм, в течении 10 минут. Воздействие производили на куриные эмбрионы 7-8 ср ок ннкубащш, в одно н тоже время между 12 и 13 часами. После воздействия яйца продолжали инкубировать. Миокард желудочков забирали через 12, 24 часа после воздействия и далее с интервалом в 1-3 суток. Контролем служил миокард ннтактных зарыдышей. Исследовали миокард желудочков, межжелудочковой перегородки и предсердий.

В работе изучен материал, полученный от 150 объектов. Распределение материала приведено в таблице 1.

Т а б л и ц а 1.

Распределение Maiepmi.ia в зависимое!н от меюдов исследования

Метод исследовании и воздействие Возраст Число объектов

Гнстоло1нческне 2-21 сутки инкубации 1-10 сутки постэмбрнональног о развития 21

Методика щелочной днссоцпацп i 23

Морфометрнческая оценка изолированных миоцнтон о 25

Метод полутопких срезов к 12

Электронная микроскопия м 19

11остоянпое магнитное поле 7-8 сутки инкубации 50

Нпзкоинтенсивное лазерное излучение 7-8 сутки инкубации 50

Характеристика методов исследования

Гистологические методы. Обзорные гпстоло! нческне препараты

.. .'0!ларда получали путем окраски парафиновых срезов железным iематоксилпном по Ясвопну, гематоксилином по Геиденганну и ï сматоксилииом и эозином. Фиксацшо материала проводили в жидкости Карнуа и Бродского (формалнн-спнрг-уксусная кислота в соотношении 3 : I : 0,3), а также в 10 % формалине на 0,1 M фосфатном буфере (pli = 7,4).

Метод щелочной диссоциации кардномноцитов. После остановки сердца в фазе диастолы ;шссоциацшо миокарда левого н правого желудочков проводили по методике В. Я. Бродского и соавт. (1983). Кусочки миокарда желудочков фиксировали в холодном 10% формалине на фосфатном буфере (рН-7,0). После фиксации в течение 10 - 14 дней, производили поперечные срезы толщиной 1 - 2 мм, длиной 2-3 мм н помещали в холодильник в 50 % КОН на двое суток. Затем пипеткой отсасывали КОН, помещали в дистилнрованную воду на одни суткп в холодильник. После 2 - часовой экспозиции при комнатной температуре воду осторожно сливали, добавляли свежей днетилнровашюн воды из расчета 1 мл на 2 мг миокарда. С помощью магнитной мешалки в течение 5-10 минут производили окончательное разделение кардномпоцнтов. Полученную суспензшо наносили на предметное стекло и окрашивали гематоксилином Коуля, гематоксилином и эозином.

Измерения линейных размеров кардиомиоцнтов и их ядер производились с помощью установки "Телевизионный микрометр", разработанной в IIIIIIBT г. Саратова. Вычисляли объемы ядер, цитоплазмы и цитоплазмеиио- ядерные отношения кардномноцитов. В мазках изолированных кардномноцитов определяли мнтотнческнн индекс, просчитывая 2000 - 3000 ядер.

Электронная микроскопия. В качестве фиксатора использовали 2,5% раствор глютаральдегнда на фосфатном буфере с pli 7,2 - 7,4. Далее следовала дофнксацня в 1% 0s04 растворе. После этого обезвоживали в этаноле возрастающей крепости, с контрастированием 1% спиртовом растворе уранилацетата в течение 12 часов. Фиксация и обезвоживание проводились при 4 °С. Материал заливали в аралдпт. Ульгратонкпе срезы получали па микротоме LKB, контрастировали

азотнокислым свинцом по ЯепоксЬ (1963) и исследовали в электронном микроскопе 1ШасЫ-1Ш-12.

Сташстичсская обработка результатов. С та тис тическую обрабо тку результатов исследования проводили по программам для ПМК Б3-34 (М. В. Углова, 1982:1994). Оценка различии сравниваемых показателен проводилась с помощью критерия Сгыодента при заданном уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что источником сердечной мышечной гканн служат клетки прекардпалыюй зоны мезодермальных спланхнотомов (Р. МапаБек, 1970). Они, мшрпруя в облать будущею сердца, образуют довольно компактное скопление - его органную закладку, и в последующем дифференцируются в различные формы мышечных клеток сердца.

Псхо;шую или стволовую клетку будущей мышечной ткани определяют как кардиомнобласт, способный к интенсивной пролиферации, установлению контактов с соседними кардпомнобластамп и дпфферепцпровке в кардномиоцпты.

Результаты_элсктронномикроскоппческого_исследования

свидетельствуют о том, что у куриных эмбрионов 48 - 72 часов инкубации основную .массу грубчагою сердца составляют клетки, морфология которых типична дзя бластных форм. Это довольно большие клетки, округлой или слегка продолговатой формы, по с многочисленными короткими отростками. Они имеют крупное ядро, занимающее большую часть клеточного объема и цитоплазму, весьма бедную ор1анелламп. Материал ядра, умеренной электронной плотности, представлен почти исключительно активным эухроматнном и крупными ядрышками, обычно ретнкулярно1 о типа. Цптоплазматический магрпке выгля;цтт гомогенным п, как видно при больших увеличениях, содержит огромное количество полисом. Помимо рибосом в цитоплазме встречается небольшое количество митохондрии и довольно мно1 о гранул глнко) спа, образующих нередко обширные скопления ("глпкогеновыс озера"). Митохондрии

л!>угшые, продолговатой формы,с прозрачным матрнксом и немногочисленными крисгамп. Достаточно часто мы отмечали, чго некоторые участи мембран митохондрий подвергались характерной лнппдной трансформации с образованием мнелпноподобных телец.

Структура кардиомиобластов 2 - 3 суток развития эмбриона практически идентична морфологии других властных клеток, например, эритробластов, ашпобластов или иитенсивно пролифернрующих клеток некоторых злокачественных опухолей мезодерматьной природа (В. В. Бании с соавг., 1993). Существенным отличием, по нашему мнению, являются мног очисленные "контакты", которые клегка устанавливает с соседними кардпомиобластамн. Эти контакты образуются посредством коротких отростков или, реже, в области прилегания гладких участков тслеточных мембран. Прицельный анализ зон таких контактов чаще всего не выявляет каких-либо специальных мембранных структур - отмечается лишь тесное прилежание участков плазмолемм, без видимого промежутка между ними. Лишь в некоторых участках мы могли видеть локальные уплотнения цнтоплазы в зоне контакта. Эти уплотнения имели характер коротких линий, несколько напоминающих плотные пластинки десмосом. Только эпизодически встречались области контакта, в которых можно было достаточно четко увидеть структуру будущей небольшой десмосомы.

Даже при анализе ульгратонких срезов мы регулярно встречали клетки, находящиеся в различных фазах митоза (чаще, в мстафазе). Для электронной микроскопии такие находки обычно не частое явление и, следовательно, регистрация эпизодов клеточного деления служит хорошим доказательством высокой пролнфератнвнои активности популяции.

Наряд)' с делящимися кардиомнобластами, при улыраструкгурпом исследовании достаточно регулярно отмечались клетки, морфология которых свидетельствовала об их гибели. Эти клетки имели весьма компактное и плотное ядро (точнее элекгронноплотную масс}' на месте ядра), нередко сохранную внешнюю мембрану, светлый, лишенный рибосом,

цнтоплазматнческнй матрикс. Иногда внешни контур "клеток" не выявлялся и клеточный остаток выглядел как типичное апоптотическое тело. Эпизо;ц>1 апоптоза не имели очагового распределения. Ндинпчные клегкп в состоянии апоптоза располагались среди нормальных кардиомпобластов, хотя и теряли с ними связь.

Морфометрнческие показатели целых клеток на окрашенных сиетооптнческнх препаратах, полученных при осторожной щелочной диссоциации ткани выявляют небольшие величины цнтоплазменно-ядерного отношения: 2,5+0,5 (при среднем объеме цитоплазмы 600+150 мкмЗ и объеме ядра равном 240+Юмкм3). Клегкп па препаратах выглядит округлыми н;ш продолговатыми, число недиссоципровапных участков ткапп было небольшим. Для сердца куриных '¡морионов 2-4 сугок развития характерна сравнительно высокая пролпферативная активность - мнтотпчсский индекс достигал 2,0+0,15°о. Подсчет доли клеток, имеющих характерную ятя апоптоза .морфологию покупал, что эта доля, конечно, существенно ниже мнтотнческого индекса, но совсем не незначите.п.на (0,5+0,1° о). Очевидно, что пролиферация клеток мышечной ткани сердца на этом этапе развития сопровождается гибелью части кардпомнобластон.

Считается, что клетки развивающеюся сердца, в которых уже появляются специфические сократительные органеллы, следует называть кардпомиоцнтамн. Поскольку процесс днфферепппровкн карднобластов в типичные зрелые кардномиоциты не одномоментен, а значите;п.но растяпуг во времени, достаточно обосновано выделение двух форм кардномнощггов - дифференцирующихся и дифференцированных (П. В. Ямщиков, 1991).

Появление сократительных элементов в цитоплазме клеток мышечной ткапп сер;та происходит достаточно быстро и почти внезапно. Уже па 4 сугкн эмбрионального развития цыпленка среди массы клеток встречается много форм, имеющих в цитоплазме развивающиеся мнофнбриллы. К 5 - 6 сугкам такие клетки составляют подав.тающее большинство. Дифференцирующиеся кардномпоцнты, чаще всего оватьнон формы, сохраняют отростчатость, по отростки чаще концентрируются у полюсов клетки - намечается зона будущего

■ _tí..¡очного диска. Ядро клеток содержи! уже участки i етсрохроматпиа, ядрышки "сочные", активные, но чаще имеют более компактное строение. Цптоплазматпческий магрнкс более прозрачен, чем у кардиомнобластов, хотя полисом в цитоплазме еще много. В митохондриях возрастает число крнст, уплотняется матрикс. Скопления митохондрий нередко встречаются в околоядерной зоне или в периферических участках цитоплазмы. Образующиеся мнофпбрнллы довольно MHoi очнелены, но еще не занимают большую часть объема цитоплазмы, как у дефинитивных кардпомпощгтов. Миофнбрнллы не имеют преимущественной ориентации н часто расположены свободно в цитоплазме, без участков прикрепления к клеточной мембране. Формирование мпофибрилл, как показывают наши наблюдения, начинается, возможно, с появления материала будущей Z -полосы. Скоплешш плотного войлокообразного вещества в цитоплазме иногда видны без видимой связи с мнофпламентамн. Толстые п тонкие фнламенты собираются, вероятно, одновременно. Во всяком случае нам не удалось видеть участков образующихся миофибрплл, содержанцьх только тонкие или толстые фнламенты. Образование саркомера - участка между двумя соседними Z -полосами, наступает не сразу. Часто можно видеть фрагменты, где аютшовыс фнламенты прикрепляются только с одной пли по обе стороны одной Z - полосы. В этих случаях толстые мнофпламенты свободно оканчиваются в цитоплазме и закреплены, вероятно, лишь своими связями с акпшовымн нитями. Нередко видны достаточно сформированные миофибрнллы, однако фнламенты в них упакованы рыхло. Компоненты саркоплазматпческого ретнкулюма и Т-системы вокруг мпофибрилл появляются сравнительно поздно. На 5-6 сутки эмбриогенеза немногочисленные пузырьки п короткие цистерны гладкого ретнкулюма встречаются в цитоплазме вне видимой связи с формирующимися мнофнбрилламп. Лишь после того,как мнофнбри-члы приобретаю!' характерную продольную ориентацию в клетке и хруппируются в пучки (8-11 сутки), цистерны гладкого цнтоплазматичсского регнкушома обнаруживаются вокруг мпофибрилл. На уровне Z-полосы сформированных саркомеров

можно видеть типичные триады цистерн ретнкулюма н Т-спстемьг.

Внутриклеточная дифференцировка кардномноцлтов

сопровождается усложнением н дифференцированием контактов между ними. Зоны контактов, в которых ясно узнаются "юные" десмосомы, группируются ближе к полюсам клеток, хотя п не образуют еще типичного, компактного вставочного диска. Десмосомы очень отчетливы, с выраженными плотными пластинками, но часто не имеют прилежащего уплотнения цитоплазмы, зависящего от концентрации здесь деемнновых филаментов. Явных коммуникационных контактов (нексусов) па 'поп стадии развития мы не наблюдали, хотя некоторы уплотнения плазмо.теммы позволяли предполагать начато их формирования.

Интересно, что внутриклеточная дифференцировка, очевидно, рано приводит к дпвср1 ситному развитию сократительных н проводящих кардномиоцптов. Уже на 5-6 сугкн среди массы типичных сократительных клсюк можно видеть группы клеток с прозрачным матрнксом и очень вяло образующимися сократительными структурами.

В препаратах изолированных клеток дифференцирующиеся кардномноцнты имеют продолговатую отростчатую форму. Клетки существенно увеличиваются в объеме (объем цитоплазмы 2000+1000 мкм3, объем ядра 170+20мкм3). Значительно возрастает ЦЯО - 15+5. Митотический индекс на 5 - 6 сутки развития максимально высок и достигает 2,6+0,2°о. Число гибнущих клеток обычно не превышало величины, характерной ;пя предыдущего срока.

Дифференцированные кардномноцнты, как единичные клеточные формы, отмечаются уже на 8 - 11 сутки эмбриогенеза цыпленка. К концу развития в яйце (18 - 21 сугкн) они составляют подавляющее большинство. Для этих клеточных форм характерно интенсивное развитие сократительного аппарата - мнофпбрпллы занимают большую часть цитоплазмы,и строгая взаимная упорядоченность органатл. А [пофнбрпллы с четко выраженным саркомерным строением ориентированны вдоль осн вытянутых цилиндрических клеток. По большей части удается отчетливо видеть участки прикрепления

мпофибрнлл к плазмоле.мме в зоне компактных вставочных дисков. Митохондрии в виде цепочек занимают подобающее им место между миофнбриллами.

Относительно плотный матрпке, множество плотно упакованных крнст в митохондриях, элементы саркоплазматического ретикулюма, окружающие миофибрнллы и общая синтопия органелл создают характерную картину развитых мышечных клеток сер;ща. Небольшие отличия не кажется существенными - довольно рыхлая упаковка фпламенгов в мпофибриллах, сравнительно много гликогена, богатое эухроматнном ядро. Межклеточные контакты организованы в виде типичных вставочных дисков. Десмосомы имеют типичное строение, четкие,иногда подчеркнутые границы. Интересно, что на прилежащих боковых поверхностях клеток мы иногда встречали структуры, напоминающие полудесмосомы - плотные прнмембранные пластинки, не имеющие "партнера" в соседней клетке. В области вставочного диска и прилежащих боковых поверхностях можно видеть типичные короткие нексусы.

Морфомефнческпе показатели дифференцированных

кардпомиоцитов существенно отличались от показателей предыдущей стадии развития клеток: большой объем цитоплазмы (5500+500 мкм3), меньшее ядро (100+10 мкм3), бромное ЦЯО (55+5). Индекс митозов составлял 0,2+0,01° о, а число гибнущих клеток (апоптоз) пе превышаю 0,1+0,01%.

Конечно, ;ц1ффсрспцпровка кардиомпоцнтов - процесс непрерывный. В разные временные интервалы можно видеть мозанчщто картииу:средп основной массы кардномиобластов встречаются дифференцирующиеся клеточные формы, которые постепенно сменяются клетками с типичной морфологией дефинитивных (дифференцированных) карщюмноцнгов. Нам хотелось бы подчеркнуть основное заключение, которое можно вывести из анализа элекгроиномикроскопнческих препаратов - внутриклеточная дифференцнровка (появление специфических органелл) сопровождается, с одной стороны, преобразованием межклеточных связей, с друюй - установлением взаимной тогкмрафпп органелл,

типичной для дифференцированных клеточных форм. По существу это - трн обязательных н взаимно связанных компонента е;пшого процесса ;шффсрснннровки - внутриклеточная специализация, установление характерных межклеточных связей и синтопня органелл.

В этой связи нам хотелось бы обратить внимание на следующее обстоятельство. Как показывает сопоставление

электронномнкроскопических картин в разные сроки эмбрионального развития сердца цыпленка,контакты между плазматеммамп соседних кардиомнобластов отмечаются уже на самых ранних сроках развития,которые нам удалось исследовать. Более того,вначале онп весьма многочисленны,хотя и имеют характер "простых" мембранных контактов между клеточными отростками. В последующем, по мере развития типичных десмосом, контакты ¡руппнруются, "стягиваются", в зоны вставочных дисков,а боковые поверхности клеток становятся гладкими и просто тесно прилежат друг к другу. Похоже,что будущие межклеточные контакты кардпомпоцптов не образуются вследствии соприкосновения 1рупппрующнхся кардиомнобластов при формировании тканевой зактадкп сердца, но уже пресушествуют на самых ранних стадиях се формирования. Наши наблюдения можно интерпретировать в рамках гипотезы, устанавливающей, что истшшые мембранные контакты между ктеткамп, в том числе н десмосомы, являются результатом незавершенного клеточного деления, а ие образуются de novo. (В. В. Банпн, Г. А. Алимов, 1993).

Еще одно важное обстоятельство заслуживает пристального внимания. Как показывают паши данные, клеточная пролиферация, которая собственно н приводит к иарасташпо клеточной .массы и без которой невозможно формообразование органа, обязательно сопровождается гпбелыо части клеток. Похоже, что апоптоз столь же необходимое условие гпсто- и органогенеза, как и пролиферация (П. В. Ямщиков, 1991). Возможно, что с помощью механизма апоптоза -про1раммированнон клеточной гибели, элиминируются не только клетки с генетическими абберацнями, но и клетки, дпфферепцпровка которых не соответствует, каким- либо образом, уровню днфференцпровкп, характерному для данного времени развития.

Возможно это клетки существенно опередившие или, напротив, отставшие в развитии. Поскольку гистогенез, с точки зрения клеточной дпффсренцнровкн, процесс гетерохропнын, доля подобных клеток во всей клеточной популяции должна быть достаточно высокой. В этой связи мы сочли необходимым посмотреть, как соотносятся во времени процессы клеточного деления н гибели. Ориентируясь на комплекс признаков, характерных для апоптоза (табл. 1), мы сопоставили оба показателя.

Т а б л н ц а 2.

Характеристика различии между некрозом п анонтозо.м

Признаки Некроз Апоптоз

1.Стадийность + +

2.Воспалительная реакция + -

3.Программированная клеточная гибель - +

4.Случайная клеточная гибель + -

5.Доза воздействия,способная вызывать реакции высокая низкая

6.Гибнущие одиночные клетки + +

7.Сохранность структуры мембран - +

8.11ервичпое изменение ядра - +

9.Первичное изменение цитоплазмы + -

10.Генетическая обусловленность - +

11.Разрушение органоидов + +

12.Разрушение лпзосом + -

13.Формирование апоптозных тел - +

14. Множественная клеточная гибель + -

Оказалось, что пик индекса апоптоза приходится на 6-8 сутки эмбрионального развития цыпленка п следует нспосредстенпо за пиком митотичсского индекса, который отмечается на 5 - 6 сутки (рис. 1). Наверное этого следовало ожидать, поскольку интенсивная

пролиферация должна приводить и к большей доле клеток, которые подтежат элиминации. 0;щако, наши данные свидетельствуют о том, что именно 5-6 сутки эмбрионального развития цыпленка - это тот рубеж, когда отмечаются массовые эпизоды появления специфических органелл, т. е. время этапа специфической дифференцировкн клеток. Возможно, что гетерохропносль развития стимулирует апоптоз. Еще о/цго интересное обстоятельство выявляется при л аком сопосташгешш. За максимумом кривой, отражающей интенсивность клеточной гибели не следует активизации пролтгфератнвных процессов, как это обычно бывает- при некрозах клеток. Похоже, что сам процесс программированной клеточной гибели организован таким образом, что массовая гибель клеток не приводит к освобождению продуктов, стимулирующих пролиферацию.

Динамику апопгоза можно объяснить также, с позиции гипотезы критических периодов морфогенеза (П. Г. Светлов, 1978). У амфибий массовая клеточная 1пбе.п> отмечается в периоде метаморфоза (В. II. Волков, 1982), у куримых эмбрионов - па 6-8 сутки развития. В этот период происходит смена желточного этапа питания на аллантонсиый. Адаптация сердечной мышечной ткани к новым требованиям и установление регулярных сокращений сердца на фоне инка специфической клеточной днфференцпровке требует, возможно более активного участия в морфог енезе процессов элиминации "дефектных" клеточных форм.

В связи с вышеизложенным нам представлялось важным проанализировать последствия умеренного воздействия на эмбрион некоторых физических факторов. Эмбрионы, 7-8 суток развития, подвергались разовому (в течение 10 и 60 минут) воздействию постоянного магнитного поля (ПМГ1) или ннзкопнтененвного лазерного излучения (ПЛИ). Изучалась ткань сердца взятая в различные сроки, начиная с 12 - 24 часов после воздействия. Анализ показал, что оба типа воздействия прпво;гят практически к одинаковым результатам и в качественном, и в количественном олношепип.

з т

2,5

1,5

0,5

Г »

А

/

\

\

ч

--,-,-1-->--,--,-1-1---+-г-,-1-1-1--1---г--1

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

сутки

2

/

о

Рис. 1

Непрерывна» линии - мптошчсскнм индекс кардмомноцтоп (%)

Пуню ирная .шиш: - индекс тонущих кардиоммоцшов (%) Рис. 1

Динамика мпготнческон активности клеток и анонтоза в сердечной мышечной 1каш1 курнных эмбрионов.

Непрерывные кривые получены при компьютерной экстраполяции данных, зара исгрированных на: 3-4, 5-6, 7-8, 11-12, 15-16 и 20-21 сутки эмбрионального развития.

При ультрас'фуктурпом анализе мы могли наблюдать и некоторых кардномионптах участки просветления п гидратации магршсса цитоплазмы, некоторый отек ядра и расширение ядерной цистерны. Деструктивные явления были более демонстративны в митохондриях - разрушение части крист 01 части органеллы, инода деструкция всей митохондрии. Отмечался также эпизодически локальный лизис миофнбрнл, их разрыхление, истончение или расщепление. Мы не могли отметить картин, которые можно было бы расценить как некроз клеток или их групп. Факгнческн, клетки с умеренными деструктивными процессами в цитоплазме должны быть вполне жизненными и сохранять способность к внутриклеточной регенерации структур. Наряду с этим, более часто встречались клетки или их дериваты, которых можно было отнести по ряду признаков к клеткам в состоянии апоптоза. Как правило, это был уже далеко зашедший процесс - характерная конденсация ядра и уменьшение его объема, расширение перпнуклеарпого пространства. Миофпбрн.тгы часто находятся в состоянии пересокращення. Затем они конденсируются, превращаясь в бесструктурные электрониоплотные массы. Часто можно было видеть типичные апоптотнческне тельца. Клетки с такими признаками чаще встречались па 2 - 3 сугки после воздействия. В более поздние сроки (14-15 и 20-21 суток) ультраструктура .миокарда практически не отличалась от контрольной.

Подсчеты показали, что мнтотнчеекпй индекс после воздействия не отличается от контрольной группы (2,2+0,2° о). Напротив, индекс клеточной I ибели возрастал вполне существенно (с 1,6+0,1%, в контроле, до 4,0+0,1% при ПМП п 5^0+0,1% при ППЛП).

Таким образом, воздействие физических факторов умеренной интенсивности не приводит к фата;и,ным повреждениям клеток, но активирует механизмы про1раммированной клеточной гибели. Очевидно, что в основе этих механизмов лежат факторы активации, несколько отличные от факторов, характерных ;щя нормального морфогенеза. Активацию апоптоза в этом случае уже нельзя

рассматривать как результат усиленной пролпферацнп - клетки не стали делиться чаще. Возможно, что некоторые локальные повреждения плеточных компонентов, не приводящие к некрозу всей клегкп п, принципиально компенсируемые, тем не менее нарушают течение нормального хода клеточной днфференцнровкп. Результатом таких возмущении должно быть увеличение доли клеток, которые по каким-либо характеристикам не соответствуют необходимому уровню развития. Возможно, что усилия, наирааленные на восстановление поврежденных структур п нарушенных функций, приводят к запаздыванию процессов нормального развития. Подобная интерпретация данных может быть, по нашему мнению, определенным, хотя н косвенным, подтверждением ранее высказанного предположения - про1раммированпая клеточная гибель (апоптоз) яаляется одним из важных механизмов контроля процесса клеточной днфференцнровкн.

ВЫВОДЫ

1.Увеличение массы мышечной ткани сердца в эмбриогенезе осуществляется посредством согласованной дииампкп двух принципиальных процессов - клеточной пролиферации и про1раммпровапной клеточной гпбелп (апоптоза). Возрастание пролпфератпвпон активности тканн сердца, достигающей максимума на 4-6 сутки эмбриональною развития цыпленка, стимулирует апоптоз, максимальная активность которого регистрируется на 6-8 сутки. Интенсификация апоптоза не приводит к возрастанию пролпферативной активности клеток.

2.Дифференцпровка клеток сердечной мышечной тканн (кардпомнобласт - дифференцирующийся кардномноцпт дифференцированный кардномноцпт) включает ряд процессов специфического и нсспсцнфпческого характера. 1 ¡сспсцифнчсскне изменения клеток проявляются в возрастании их объемов, увеличении

цитоилазмеино-ядерпых отношений, уменьшении числа полисом и содержания гликогена в цитоплазме.

3.Спсцнфнческая лифференцнровка клеток мышечной ткани сердца выражается комплексом морфологических преобразований, относящихся к впутршстеточным событиям и межклеточным связям. Внутриклеточные события включают:

-появление и развитие специфических (сократительных) оргапелл -миофпбрнлл, саркоплазматнческого рстпкулгома и митохондрии, структура которых характерна для кардиомпоцптов;

-изменение ориентации мнофибрилл в цитоплазме и прикрепление их к внутренней поверхности плазматеммы в области межклеточных контактов;

-установление характерной еннтоппн органелл: миофпбрнлл, митохондрий п саркоплазматичсского ретпкулюма.

4.В течение эмбриогенеза сердца цыпленка динамика внутриклеточных преобразований коррелирует с дифференцнровкои м е жкл с го ч п ы х с в я з е й:

-многочисленные контакты клеточных мембран отмечаются еще па стадии кардномнобластов;

-структурные преобразования мембранных связей закпочаются в развитии,па месте некоторых "простых" контактов, типичных десмосом, а, в последующем, и коммуникационных контактов (нексусов);

-в соответствии с изменением формы клеток, развитием сократи гельных оргапелл и установленном пх характерной ориентации, мембранные контакты кардиомноцпгов изменяют свою топографию и группируются, формируя вставочные диски.

5.Воздействие па куриный эмбрион физических факгоров

(постоянного магнитного поля и ипзкоинтснсивного лазерного нзлучеиня) вызывает умеренные повреждения клеточных органелл, не приводящие к некрозу кардиомиоцнтов. Это воздействие, однако, существенно стимулирует апоптоз, не изменяя уровня пролпфератпвион активности мышечной ткани.

б.Анатнз результатов позволяет заключить, что в эмбриогенезе сердечной мышечной гканп про1раммпровапная клеточная смерть (апоптоз) не только определяет, наряду с про:1Дифсрацней, величину клеточной массы, но и является фактором, регулирующим процесс дифферспцпровкн кардиомиоцнтов.

Список работ, опубликованных по теме днеертацнн

1.Количественная оценка пролиферативной активности

кардимноцитов в эмбриогенезе// Математическое моделирование в теоретической и практической медицине. Самара. 1994. С. 40 - 43. (соавтор II. В. Ямщиков)

2.Математическос моделирование гпсто1 спеза сердечной мышечной ткани в норме п эксперименте// Антропогенные воздействия и здоровье человека. Калуга. 1995. С. 135. (соавтор II. В. Ямщиков)

3.Пролиферация и клеточная гибель в эмбриогенезе сердечной мышечной тканн//Гнстогепетпческнй анализ изменчивости и регенерация тканей. Санкт-Петербург. 1997. С. 79.

4.Дспствпе электромагнитных излучений на сердечную мышечную ткань в :>мбрпогснсзе//Матсрпелы XXVII конференции военно-меднцннского факультета. Самара. 1994. С. 223. (соавторы М. В. Углова, П. В. Ямщиков, II. Л. Слободяшок)

5.Морфометрпческая характеристика сердечной мышечной ткани в эмбриогенезе и раннем постэ.мбрпоналыюм периоде развития

птиц//Гнсто1 епез и регенерация тканей. Санкт-Петербург. 1995. С.39.

6.Пзмеиения кардпомпогенеза при воздействии низконнтенсивного лазерного нзлучення//Морфологпя. 1996. Том 109. 2. С. 90.

7.Клеточ1ю-;шфферопная организация сердечной мышечной ткани. //Морфология. 1997. Том 112. 4. С. 97-98. (соавтор П. В. Ямщиков)