Автореферат и диссертация по медицине (14.00.50) на тему:Биомаркеры экспозиции и эффекта в системе гигиенического нормирования и оценки риска воздействия вредных веществ

На правахрукописи

Ткачева Татьяна Анатольевна

БИОМАРКЕРЫ ЭКСПОЗИЦИИ И ЭФФЕКТА В СИСТЕМЕ ГИГИЕНИЧЕСКОГО НОРМИРОВАНИЯ И ОЦЕНКИ РИСКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ

14.00.50 - Медицина труда

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте медицины труда Российской академии медицинских наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук

А.И.Халепо

доктор наук, профессор

J.A.Timbrell (King's College London, Великобритания)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ

М.А.Пинигин

доктор медицинских наук, профессор

Г.Н.Заева

доктор биологических наук, профессор

Л.П.Кузьмина

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный медицинский университет МЗСР РФ

Защита состоится 28 марта 2005г. на заседании диссертационного совета Д.001.012.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте медицины труда РАМН по адресу: 105275, Москва, проспект Будённого, 31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ медицины труда РАМН.

Автореферат разослан 28 февраля 2005 г. Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Н.Б. Рубцова

ОБЩАЯХАРК ТЕ РИС ТИКА РАБО ТЫ

Актуальность проблемы В последнее десятилетие в медицине труда успешно разработана концепция оценки профессионального риска. Учитывая перспективность применения в РФ методологии оценки риска, подчеркивается необходимость ее дальнейшей научной проработки, развития и приведения в соответствие с требованиями, принятыми в нашей стране [Г.Г. Онищенко, 1997; Н.Ф.Измеров, 1993; Н.Н.Молодкина, 1996; А.И.Халепо, 2001]. Усовершенствование научно-методических подходов в системе гигиенического нормирования и оценки потенциальной и реальной опасности воздействия химических веществ на здоровье работающих признается в документах МЗСР РФ одним из актуальных направлений для медицины труда [Г.Г.Онищенко, 2002]. При этом гигиенической стандартизации отдается первостепенная роль в профилактике профессиональной заболеваемости. Гигиенические нормативы, установленные с учетом пороговости токсического действия химических веществ, признания приоритета медицинских и биологических показателей, результатов клинико-гигиенических исследований - являются общепризнанными критериями оценки безопасности на химическом производстве. Риск здоровью считается неприемлемым в условиях несоблюдения безопасных уровней воздействия (ПДК, ОБУВ, ПДУ) химических веществ [Н.Ф. Измеров, 1997; И.В.Саноцкйй, 1994; С.М.Новиков, 1996 и др.].

Точность определения величины порога действия промышленного яда в значительной степени зависит от выбора адекватных биомаркеров. Согласно определению ВОЗ «Биомаркер - практически любой измеряемый показатель, отражающий взаимодействие между биологической системой и фактором окружающей среды (химический, физический или биологический). Этот показатель может быть функциональным, физиологическим или биохимическим и отражает взаимодействие на клеточном или молекулярном уровне [WHO, 1993].

Биологические маркеры издавна используют в экспериментальных и клинических исследованиях для изучения характера острого и хронического ток-

сического действия соединений, обнаружения признаков нарушения здоровья и биологического мониторинга потенциально опасных экспозиций. Вопрос об их применении для оценки риска стал рассматриваться сравнительно недавно. Число публикаций на эту тему в мировой литературе неуклонно растет, появились журналы "Biomarkers", "Biomarkers & Prevention" и др., которые рассматривают использование биомаркеров для оценки риска.

В РФ система обоснования гигиенических нормативов вредных веществ как в воздухе рабочей зоны, так и в других средах построены на принципе изменения биомаркеров эффекта в зависимости от величины действующей концентрации (дозы) и продолжительности воздействия вещества. Созданы специальные комплексы биомаркеров для оценки нейротропного, гепатотропного, раздражающего, кардиотропного, сенсибилизирующего и др. эффектов. Однако общие принципы выбора и исследования биомаркеров эффекта при оценке риска промышленных веществ не сформулированы в должной степени, не оценена роль специфических и интегральных биомаркеров различных эффектов действия веществ в системе гигиенического нормирования.

Несмотря на обширность накопленного материала, работы по выявлению корреляций между биохимическими и физиологическими параметрами, характеризующими работу отдельных органов или систем, практически не проводились. Однако такие исследования могут не только прояснить механизм действия яда, но и обосновать применение новых, универсальных биомаркеров эффекта, которые можно будет использовать при исследовании большинства промышленных ядов.

Значимость биохимических исследований в профилактической токсикологии несомненна [ЛАТиунов, 1994; JATimbrell, 2000, 2004; A.Mutti, 1996]. Однако в РФ при установлении гигиенических нормативов крайне редко используются показатели, отражающие процессы детоксикации чужеродных веществ, которые включают энзиматическую трансформацию в системе цито-хром-зависимых монооксигеназ, реакции конъюгации, антиоксидантной защиты и обеспечивающие их биоэнергетические процессы.

С 80-90-х г. г. прошлого века стремительно растет число научных публикаций о биомаркерах экспозиции для новых и уже используемых в промышленности веществ. Регулярно публикуемый журналом «Analytical Chemis-try» обновляемый и дополняемый список биомаркеров экспозиции насчитывает уже более 400 наименований. Такой подход обусловлен в первую очередь необходимостью более точно оценивать величину экспозиции для определения реального риска при контакте с тем или иным промышленным веществом для каждого работающего, возможности выделения лиц с повышенным индивидуальным риском, ранними признаками интоксикации при биологическом мониторинге [AAitio, 1999].

К сожалению, в РФ в силу ряда причин не уделяется должного внимания указанной проблеме, несмотря на то, что для некоторых промышленных веществ были разработаны и рекомендованы биологические ПДК (биоПДК).

Учитывая значительные методические трудности и высокую стоимость выполнения подобных исследований, целесообразно для обоснования биоПДК актуальных для России веществ использовать зарубежный опыт.

В последние годы активно проводится разработка методов оценки риска различных видов токсических эффектов альтернативными методами. На наш взгляд, в настоящее время необходимо сформулировать требования к выбору биомаркеров эффекта для используемых в токсикологических исследованиях методов in vitro, определить перспективные способы тестирования веществ на стадии предварительной оценки токсичности и характера вредного действия на организм.

Цель работы: Научное обоснование принципов и методов использования биомаркеров эффекта и экспозиции в системе оценки риска и гигиенического нормирования промышленных веществ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. На основе анализа данных литературы и результатов собственных исследований обосновать критерии выбора биомаркеров экспозиции и эффекта

для гигиенического нормирования и оценки риска

воздействия промышленных ядов.

2. Провести поиск и обосновать новые критериально значимые метаболические биомаркеры по данным экспериментальных исследований при воздействии промышленных веществ из различных классов химических соединений.

3. Проанализировать и систематизировать отечественный и зарубежный опыт по обоснованию биологических стандартов по биомаркерам экзогенного воздействия химического фактора, определить зависимость между уровнем биомаркеров экспозиции в биологических средах и концентрацией широко используемых в промышленности неорганических фторидов, сероуглерода и окиси углерода в воздухе рабочей зоны, обосновать для них величины биологических ПДК

4. Исследовать соотношение биомаркеров эффекта на органном, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях при воздействии промышленных ядов и обосновать новые перспективные биомаркеры эффекта.

5. Определить роль биомаркеров избирательного и общетоксического эффекта при исследовании риска воздействия промышленных ядов в условиях превышения ПДК.

6. На основе анализа современных альтернативных методов разработать и апробировать методические подходы использования методов in vitro для оценки риска местного раздражающего действия промышленных ядов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы На основании материалов собственных токсикологических исследований различных классов химических соединений (органические растворители, изо-цианаты, пиретроиды, производные морфолина, эфиры фенола и др.) и анализа данных литературы установлено, что биомаркеры эффекта, используемые для оценки риска воздействия промышленных веществ, должны обладать критерием вредности.

Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомальной

фракции печени белых крыс при краткосрочном воздействии веществ является гигиенически значимым биомаркером эффекта, который использован для прогнозирования нормативов промышленных веществ, метаболизм которых осуществляется с участием монооксигеназной системы.

Характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации является новым видом биомаркеров эффекта. Регистрация указанных биомаркеров, требующая минимальных материальных затрат, позволяет получить достоверную информацию о порогах вредного действия веществ, патогенезе и эффективности экспериментальной терапии отравлений.

На примере исследования раздражающих ядов показано, что использование биомаркеров специфического эффекта повышает обоснованность прогноза нарушения состояния здоровья работающих при превышении гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны по сравнению с биомаркерами общетоксического эффекта.

Создана классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих ядов и веществ общетоксического действия в зависимости от кратности превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, которая отражает связь между величиной действующей концентрации химических соединений и выраженностью симптомов интоксикации (биомаркеров эффекта).

На основании анализа данных о содержании вещества в воздухе производственных помещений, состояния здоровья работающих и уровне биомаркера экспозиции обоснованы биологические ПДК широко используемых в России сероуглерода, окиси углерода и группы неорганических фторидов.

Практическая значимость работы и внедрения в практику

Результаты исследований реализованы при разработке следующих документов:

Методические рекомендации «Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ» МР № 5205-90.

Методические указания «Постановка исследований по

выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюнктиву глаза с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона» МУ 2.2.756-99.

Новая редакция Руководства Р.2.2.755-99 «Гигиенические критерии оценки и классификация условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса» (находится на утверждении в МЗ и СЗ РФ).

По материалам диссертации установлены и утверждены в законодательном порядке ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны для 30 веществ (включены в ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.1314-03), ОБУВ в атмосферном воздухе населенных мест для 16 веществ (включены в ГН 2.1.6.1339-03), рекомендованы биологические ПДК для сероуглерода, оксида углерода и группы неорганических фторидов.

Создан банк данных, содержащий параметры токсикометрии и гигиенические нормативы более 600 промышленных веществ.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре медицины труда МПФ последипломного профессионального образования ММА им.И.М.Сеченова.

Положения, выносимые на защиту

Разработанные биомаркеры эффекта (содержание цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени и характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации) обладают критерием вредности и могут быть использованы для оценки риска и обоснования гигиенических нормативов промышленных веществ.

Классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих веществ и веществ общетоксического действия в зависимости от превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны.

Для повышения точности и надежности оценки риска

воздействия вредных веществ используемые в России методы контроля производственной среды и состояния здоровья работающих должны быть дополнены биологическим мониторингом, разработанным на основе биомаркеров экспозиции.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ МТ РАМН (2001,2004), Секциях Проблемной комиссии «Научные основы медицины труда» (1991, 2004), представлены на симпозиумах, конференциях, международных совещаниях: Finnish-Russian Symposiums on Occupational Health (Lappeenranta, 1991, 1996), конференции НИИ МТ РАМН «Актуальные проблемы медицины труда и промышленной экологии (1994), SETAC 18th annual meeting «Bridging the Global Environment: Technology, Communication, and Education» (1997), Joint Conference of Scandinavian Society of Cell Toxicology & Estonian Society of Toxicology (1998), VIIIth International Congress of Toxicology "Chemical safety for the 21st Century" (1998), Всероссийских съездах токсикологов (1998, 2003), Международной конференции "Медицина труда в 3-м тысячелетии" (1998), North-Atlantic Treaty Organization Advanced Study Institute (1999), 2nd Croatian Congress of Toxicology CRO-TOX (2000), International Conference "Molecular Epidemiology in Preventive Medicine: Achievements and New Challenges" (2002), 5th International Congress of Turkish Society ofToxicology" (2003), Международном Конгрессе «Профессия и здоровье» (2004).

Личный вклад автора. Материалы, использованные в диссертации, получены в результате исследований, в которых автор являлась ответственным исполнителем НИР № 022 00 400693 (2003), № 022 00 100875 (2000), либо разделов НИР: № 019 10 046236 (1995), № 029 10 022457 (1990).

Во всех исследованиях, включенных в диссертацию, автором выполнены следующие виды работ: обоснование актуальности, научной и практической значимости, определение цели и задач исследования; организация и координа-

ция исследований, непосредственное участие в

экспериментальных работах по сбору первичного материала и формированию исходных баз данных; выбор научно-методических подходов, освоение, апробация и применение необходимых методов исследований; обоснование и формулировка исходных научных гипотез и их анализ на основе результатов исследований; обобщение результатов исследований, формулировка выводов, теоретических положений и концепций; разработка рекомендаций, написание научных отчетов. В составе авторского коллектива принимала участие в разработке двух методических документов (анализ материалов и написание разделов) и руководства.

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 8 глав, выводов, списка использованной литературы, включающей 365 источников отечественных и зарубежных авторов, 4 приложений. Работа изложена на 296 стр. машинописного текста, иллюстрирована 45 таблицами и 40 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для решения поставленных задач выполнены разносторонние исследования, включающие анализ, систематизацию и обобщение данных литературы, эксперименты на лабораторных животных для оценки токсичности, опасности и характера вредного действия на организм выбранных веществ, а также математическое моделирование.

С целью получения массива данных для научного обобщения совместно с сотрудниками лаборатории токсикологии ГУ НИИ МТ РАМН Карпухиной ЕА, Каютиной С.В. и др. проведены токсикологические исследования химических соединений, которые различались по характеру действия на организм. Среди них были как модельные вещества (толуол, стирол, хлорбензол, дихро-

мат натрия, сероуглерод, хлористый метилен, этанол,

ксилол, этиловый эфир уксусной кислоты, 1-аллилокси-2,3-эпоксипропан, ал-лиловый эфир уксусной кислоты, йод, бензол, 1,2-пропандиол, нитробензол, 4-хлорбензотрихлорид, бис-(трихлор)-1,4-ксилол, 2,3,6-трихлортолуол и др.), так и химические соединения, внедряемые в производство (бутоксибутенин, 4-бром-о-ксилол, о-бромтолуол, фентален, морфолинборан, олеиновая кислота, 2,6-диизопропилфенилизоцианат, изобутиловый эфир 3,5-диамино-4-хлорбензойной кислоты, аллетрин, изобутилбензол, 1-метил-2-меркаптоимидазол, 2,6-дихлоранилин и др.).

В эксперименте использовано 35 000 белых крыс, 6 000 мышей, 350 кроликов и 450 морских свинок, приобретенных в питомнике РАМН и содержащихся в виварии НИИ медицины труда РАМН на стандартном пищевом рационе. Статистическая группа состояла из 6 - 12 особей.

Изучение вредного действия проводили при различных путях поступления веществ в организм - ингаляции, введении в желудок, аппликации на кожу и слизистые оболочки глаз в соответствии с требованиями, изложенными в Методических указаниях и рекомендациях [№2163-80, №2196-80, №4000-85]. Для 4-час. ингаляционных затравок использовались камеры объемом 200 и 700 л и динамический режим подачи вещества. В опытах с аэрозолями подопытных и контрольных крыс помещали в индивидуальные пеналы из оргстекла для предупреждения попадания вещества на шерсть. Содержание химических веществ в воздухе затравочных камер определяли методом газо-жидкостной хроматографии с применением пламенно-ионизационного детектора и спектрофото-метрии (сероуглерод, дихромат натрия). Для определения порогов острого действия по интегральным (Lim ac) и специфическим (Lim ас ) биомаркерам эффекта животных обследовали в динамике на 1-й (сразу после окончания затравки), 2-й (через 20 час), 4, 8 и 16 дни и ежемесячно при хроническом воздействии.

Для регистрации влияния изучаемых веществ на организм использовано около 50 физиологических, биохимических и морфологических маркеров.

Оценка функции нервной системы, печени, почек, крови,

сенсибилизации осуществлялась по комплексу методов [И.В.Саноцкий , 1970; Н.И. Шумская, Н.М.Карамзина, 1970; Н.Г.Иванов, 1980; С.В.Сперанский, 1980 и др.]. В сыворотке крови определяли стандартный набор биохимических показателей на анализаторе «Кейсис» (Германия) и «Abbott VH System» (США), а также церулоплазмин [О.Г.Архипова, 1988], активность фруктозо-1-фосфатальдолазы [АВ.Сучков, 1967], уровень SH-групп по В.Ф.Фоломееву [1981], малонового диальдегида (МДА) [В.Б.Таврилов и др., 1987].

Продолжительность гексеналового сна (ПГС) определяли после в/б введения крысам 10% раствора гексенала в дозе 90мг/кг; регистрировали время засыпания и время сна. В микросомальной фракции печени определяли содержание цитохрома Р-450 (Цх Р-450) по СО-дифференциальному спектру [Omura, Sato, 1964], белка [Lowry, 1951], активность анилингидроксилазы (АГ) [D.A.Haugen, 1975], этоксикумариндеэтилазы (ЭК) [F.P.Guengerich, 1982] и бензфетаминдеметилазы (БФА) [G.D.Nordblom, 1977]. Содержание восстановленного глутатиона (Г-SH) в гомогенате печени оценивали по методу R.Doorn et al. [1980].

Для исследования роли специфических и интегральных биомаркеров эффекта при оценке риска профессионального воздействия вредных веществ на работающих создан банк данных по специально разработанному профилю, в который включены собственные и литературные сведения о более 600 химических соединениях различного характера действия.

Биомаркеры методов in vitro для оценки раздражающего действия веществ изучали совместно со ст.н.с. кафедры биологии МГУ АС.Лукьяновым и ст.н.с. НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Е.И.Мельниченко с использованием хорионалантоисной оболочки куриного яйца [НЕТ-САМ test, 1992], оценки подвижности инфузорий Paramecium caudatum и Metabolic Inhibition Test (MIT-24) [H. Ekwall, 1978].

Все полученные результаты обрабатывали с применением

методов математической статистики, использовали регрессионно - корреляционный анализ пакета программ Excel Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Обоснование новых метаболических биомаркеров эффекта для гигиенического нормирования

Проведено исследование продолжительности гексеналового сна (ПГС), содержания цитохрома Р-450 (Цх Р-450), его активности по скорости метаболизма других субстратов и уровня восстановленного глутатиона (Г-SH) после однократной ингаляции 13 промышленных ядов - модельных индукторов и ингибиторов, а также веществ с неизвестными путями биотрансформации. Часть полученных результатов суммирована в таблице 1.

В большинстве случаев изменения ПГС и Г-SH развивались после 4-час. ингаляции, а для некоторых веществ - на 2-й день (стирол, толуол). Эффект синтеза de novo, либо ингибирования Цх Р-450 проявлялся как сразу, так и на следующий день после воздействия яда. Определение микросомаль- ного фермента и его активности (по ПГС) в последующие дни после однократного воздействия промышленных веществ не обязательно, что показано в опытах с хлорбензолом, фенталеном, а также высококумулятивным соединением - дихроматом натрия. Исследование уровня Г-SH в динамике после 2-го дня может принести результат лишь при существенном снижении (на 70% и более) этого маркера сразу после затравки, что продемонстрировано для хлорбензола, но не о-бромтолуола. Таким образом, исследование указанных метаболических маркеров достаточно проводить на 1 и 2-й дни после однократной ингаляции. При воздействии дихромата натрия обнаружено несоответствие знака изменений ПГС и Цх Р-450: ускорение распада гексенала происходило на фоне снижения содержания самого фермента. Относительность понятий «индуктор» - «ингибитор» выявлена в опытах с изобутилбензолом: при повышении концентрации яда эффект индукции Цх Р-450 сменялся на эффект ингибирования, что ранее было

Таблица 1 - Изменения метаболических биомаркеров (в % от параллельного контроля) у белых крыс после однократного воздействия веществ в различных

концентрациях

Вещества, ПГС, другие субстраты Цх Р-450 Г-БИ

уровни,мг/м3 1Д 2Д 1Д 2 д 1Д 2д

4-бром-о-ксилол

1538 ±96 * +24 -25

727 ± 73 * +13 -23

363 ± 37 * *

Изобутилбензол

4250 ±435 АГ+62 * -15 -17

2375 ±189 АГ+38 АГ-18;БФА+223 ЭК-25; АГ-13; +28 -17

528 ±126 * БФА+184 +25 -30 -18

295 ± 42 АГ+11

Стирол

3150±588 -48 + 19 +35

1049 ±190 -19 +24

241 ± 45 * *

51 ±7

Сероуглерод

1629 ±51 +98 * * * *

743 ±108 +41 -21 * *

190 ±11 +51 • •

51 ±9 *

Хлорбензол 2д+45;

928 ± 26 +47 -18 -27 -65 4д + 12

569 ± 37 +42 -38

252 ± 28 -38

77 ±9

Дихромат натрия

1,89 ±0,75 -29 -19 * *

0,35 ±0,11 -28 -28 * *

0,12 ±0,06 -33 * *

пустая клетка - нет изменений; АГ - активность анилингидроксилазы;

ЭК - активность этоксикумарин-деэтилазы; БФА - активность бензфетамин-деметилазы; * - не определяли; д - день обследования.

выявлено для некоторых других веществ [Л.А.Тиунов и соавт.,

1977]. При этом также проявилось несоответствие знака изменений содержания полифункционального микросомального фермента и его активности по разным субстратам.

При воздействии большинства выбранных веществ изменения исследуемых маркеров подчинялись зависимости «доза-эффект», что позволило установить минимально эффективные (пороговые) уровни для каждого метаболического маркера, сравнить их между собой и с величиной интегрального порога острого действия (Ь1шас), установленного по изменению комплекса функциональных, биохимических и морфологических показателей, отражающих состояние организма в целом. С этой целью были использованы данные литературы и результаты собственных исследований, представленные в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, Ыш1с по ПГС (Ь1шас пгс) или другим субстратам и Цх Р-450 (Ь1шас р-4 50) совпали лишь в случае воздействия стирола. Для хлорбензола, изобутилбензола, сероуглерода, дихромата натрия, бутоксибуте-нина и хлористого метилена Ь1ш>с по конкретным субстратам (включая гексе-нал) были ниже, чем Ыш1с р-450; для фенталена и аллетрина Ыш1с пгс оказались выше Ыш1С1-450. Можно заключить, что определение активности цитохрома Р-450 по отдельным субстратам в остром опыте чаще оказывается более чувствительным показателем, чем определение содержания Цх Р-450, однако динамика изменений сравниваемых показателей не совпадает.

Несмотря на многообразие функций, выполняемых глутатионом в организме, основной причиной изменения его содержания в печени, как показывают полученные данные, является степень участия трипептида в реакциях конъюгации при биотрансформации конкретного вещества. Именно это является причиной высокой чувствительности маркера при воздействии веществ, метаболизм которых заканчивается образованием меркаптуратов. В отличие от ПГС и Г-8Ы, Ыш1с р.450 совпадают или близки к величинам Ыш1с по общетоксическому действию (за исключением фенталена) для тех веществ, биотрансформа-

Таблица 2 - Пороги острого действия для белых крыс по общетоксическйм и метаболическим показателям при однократном ингаляционном воздействии изученных веществ

Название вещества Lim „,. (ингаляция 4 часа), мг/м3

общетоксический Цх Р-450 ПГС, др.субстраты Г^

Толуол 1000-2000х 2257 >2257

Стирол 850 1049 1049 *

Хлорбензол 928 928 569 АГ > 569 ЭМД > 569 252

Бутоксибутенин 25х 99(СL50=112) <50

Фентален 2954х 800 >800

Дихромат натрия 5,0х-0,35х 0,35 0,12 *

Изобутилбензол 360 528 АГ-111 БФАД <<528 528

Сероуглерод 700 743 228

Хлористый метилен 8000х > 26583 6315

4-Бром-о-ксилол 810 727 727

Мерказолил >90х >97 <11

Бром-о-толуол 760 1092 150

Аллетрин 22 22 >81 >81

х - данные литературы; * - не определяли; АГ - активность анилингидроксила-

зы; ЭМД - активность этилморфиндеметилазы; БФАД - активность бензфета-миндеметилазы

ция которых происходит с участием этого фермента (выделены жирным шрифтом в таблице 2). Это позволяет сделать вывод, что как снижение, так и увеличение содержания Цх Р-450 при однократном воздействии несет в себе критерий вредности, т.е. имеет гигиеническую значимость.

Учитывая универсальный характер процессов биотрансформации для всех живых организмов, большую роль микросомальной системы в поддержании гомеостаза в организме, неспецифичность реакций, катализируемых Цх Р-450 и значимость этого показателя с позиции критерия вредности можно признать, что содержание Цх Р-450 является интегральным биомаркером эффекта.

Анализ данных, приведенных в таблице 1, позволил определить

значимые изменения Цх Р-450 в числовом выражении. Поскольку минимальные достоверные отклонения от параллельного контроля на уровне Иш1с выявлены уже при 11-15%, а большая часть изменений фиксировалась при 20%, то, учитывая умеренную вариабельность показателя, полагаем , что увеличение или снижение Цх Р-450 при однократном ингаляционном воздействии вещества на 17-20% и выше является значимым для организма и свидетельствует о токсическом эффекте вещества.

Обоснованная критериальная значимость содержания Цх Р-450 позволяет использовать указанный биомаркер для прогнозирования гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны. Установлена математическая связь между величинами ПДК и параметрами токсикометрии - Ь1шас р - 5 0, С150 и ДЦ50: /А/ ^ ПДК = ^ Ышас р-50 -1,12; г = 0,94 ±0,15; р<0,001 /Б/ ^ ПДК = 0,86^ Ышас р-50+ 0,13^С150 - 1,82; г = 0,92 ± 0,11; р<0,05 /В/ ^ ПДК = 1,211ё Ышас р-50 - 0,61еД150 - 0,33; г = 0,90 ±0,19; р<0,05 /Г/ Пв ПДК = 0,2118 Пшас р-50 + 0,481вС150 + 0,1П1&Д150 - 3,95; г = 0,96 ± 0,12; р<0,01

Полученные уравнения были использованы для обоснования ОБУВ в воздухе рабочей зоны ряда новых промышленных веществ: бутоксибутенина, изобутилбензола, бром-о-толуола, аллетрина.

Обоснование новых патогенетических биомаркеров эффекта

Как известно, взаимосвязь отдельных функций организма, биохимических цепей основных видов обмена и защитных механизмов является основой обеспечения гомеостаза. Независимо от характера действия конкретного яда указанные процессы вовлекаются в патогенез интоксикаций. При оценке риска воздействия яда с неизвестным характером действия от выбора показателей в эксперименте зависит как определение механизма и особенностей действия вещества на организм, так и точность обоснования порогов острого и хронического действия.

При обосновании гигиенических нормативов для

новых, актуальных для промышленности соединений параллельно были проведены исследования по выявлению связи между наиболее общими, биологически связанными показателями патогенеза. Изучение характера связей (с помощью парного корреляционного анализа индивидуальных вариант) и их изменения под влиянием ингаляции веществ в различных концентрациях позволило обосновать новые биомаркеры эффекта и оценить степень напряженности компенсаторных механизмов при интоксикации.

В целом, при воздействии изучаемых веществ имели место как исчезновение корреляционных связей, которые наблюдаются в норме, так и появление новых, не присущих норме связей между показателями.

Известно, что Р-липопротеиды (ЛП) в сыворотке крови являются переносчиками холестерина. На большой группе интактных животных было установлено, что концентрации холестерина и ЛП связаны прямой достоверной средней силы (R=0,6) связью. После воздействия изобутилового эфира 3,5-диамино-4-хлорбензойной кислоты (ИБЭХБК), олеиновой кислоты (ОК), и 2,6-диизопропилфенилизоцианата (ДФЦ) в концентрациях на уровне Lim ac и выше, зависимость между указанными показателями исчезла. При повторном воздействии ИБЭХБК указанная связь нарушалась уже на уровне % Lim ac. О значении этой связи для поддержания гомеостаза говорит тот факт, что зависимость между уровнями холестерина и ЛП восстанавливалась через неделю после однократного воздействия ДФЦ в концентрации, в 4 раза превышающей Lim ac.

Можно полагать, что нарушение механизмов, поддерживающих равновесие в системе «холестерин-ЛП» является чувствительным и гигиенически значимым биомаркером, поскольку происходило параллельно с развитием изменений на клеточном, органном и системном уровнях.

При изучении ОК прослежена связь липидного и углеводного обменов. Поскольку ОК разрушается в цепи реакций р-окисления жирных кислот с образованием ацетил-коэнзима А (Ац-КоА), который (через распад пирувата) является также конечным продуктом аэробной части гликолиза, можно ожидать за-

медленна процессов гликолиза и накопления глюкозы в сыворотке

при поступлении большого количества ОК и, следовательно, интенсивного образования Ац-КоА. Глюкоземия была зарегистрирована в проведенных опытах на уровне Lim ас при воздействии ОК и стеариновой кислоты [ЛА.Базарова, 1984], а также в опытах с ОК на изолированных гепатоцитах [С.Могап, 1994]. Со значительной долей вероятности можно предположить, что индивидуальные уровни глюкозы в сыворотке подопытных животных пропорциональны уровням поглощенной дозы ОК и интенсивности ее метаболизма. Показано, что в норме не существует значимых связей «глюкоза - холестерин». Однако на уровне Limac при воздействии ОК появляется достоверная отрицательная корреляционная связь средней силы. У подопытных животных с высоким содержанием глюкозы, концентрация холестерина в сыворотке ниже. Если на подпо-роговом уровне мощности биохимических систем еще достаточно для утилизации Ац-КоА, то увеличение нагрузки ОК приводит к истощению адаптационных возможностей используемых для этого реакций и подключению компенсаторных механизмов - сдвигу равновесия между гликолизом и глюконеогенезом и ингибированию реакций гликолиза.

Таким образом, исследование механизмов действия вещества позволило обосновать новый биомаркер эффекта, характеризующий связь разных видов обмена в организме.

В опытах С морфолинбораном и аллетрином начиная с уровня Lima; выявлено повышение коэффициента корреляции (R) между маркерами мембра-нотоксического эффекта ядов - активностью АЛТ и ACT в сыворотке крови (у интактных животных R=0,37). Так, при воздействии морфолинборана в концентрациях 1,8 (Limac), 12 и 39 мг/м3 R был равен 0,69 ,0,71 и 0,82 соответственно (Р<0,05).

При острой интоксикации ядами различной химической структуры на уровне Lim ac и выше появляется сильная связь между маркерами нарушения функции клетки, окислительного стресса и защитных систем.

Например, аллетрин и ДФЦ вызывали образование сильной

отрицательной связи между уровнем МДА в сыворотке и Г-8И в гомогенате печени подопытных животных: у крыс с высоким содержанием МДА концентрации глутатиона были низкими и, наоборот, достаточный запас трипептида противодействовал активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). На рисунке 1 показана сильная прямая связь между маркером ПОЛ -малоновым диальдегидом и выраженностью мембранотоксического эффекта -выходу внутриклеточного фермента в сыворотку крови после воздействия ал-летрина на уровне Ышас и выше. Подобный эффект был выявлен и при ингаляции морфолинборана.

1,6

1,5

ё 1,4-

з;

1 1,3-

0

г

1 1,2-

I-"

О

< 1,1 -1

0,9 4-V

Рисунок 1 - Связь между уровнем малонового диальдегида и активностью ас-партатаминотрансферазы в сыворотке крови белых крыс после однократного ингаляционного воздействия аллетрина в различных концентрациях.

МДА, нмоль/мл

2 3 4 5 6

О 80 мг/мЗ ♦ 22 мг/мЗ

Сильная отрицательная связь (рисунок 2) обнаружена между ферментами цитолиза и уровнем сульфгидрильных групп в сыворотке крови подопытных

животных: у крыс с низким защитным потенциалом активнее

протекают процессы нарушения мембран гепатоцитов.

1,6

♦

♦

♦

0,8

0,5

1,5 2 2,5 3 3,5 4 SH-группы белковые, ммоль/л

• 22 мг/мЗ (Lim ас) ♦ контроль

Рисунок 2 - Связь между уровнем белковых SH-групп и активностью ACT в сыворотке крови после однократного ингаляционного воздействия аллетрина на уровне Limac

Значимость подобных связей подтверждают и результаты экспериментальной терапии при остром воздействии ДФЦ на уровне 4 Limac, когда клинические признаки интоксикации исчезали вместе с нормализацией параметров связи маркеров ПОЛ и антиоксидантной защиты (таблица 3).

При воздействии ряда изучавшихся веществ имели место изменение характеристик корреляционных связей между биологически связанными физиологическими маркерами. Так, после ингаляции ИБЭХБК (рисунок 3) нарушались взаимоотношения между связанными в норме показателями поведенческих реакций (метод «техмная камера - светлое окно», ТКСО).

Важно отметить, что характеристики соотношения между показателями в норме, при воздействии веществ на уровне Limac и частично смертельных доз/концентраций существенно различаются. Изменения характеристик корреляционных связей между маркерами имели место и в тех случаях, когда стати-

стически значимых отклонений каждого показателя по сравнению с

параллельным контролем не было выявлено.

Таблица 3 - Изменение коэффициентов корреляции между маркерами перекис-ного окисления липидов и антиоксидантной защиты в эксперименте с предварительным введением антиоксидантов и однократным ингаляционным воздействием ДФЦ в концентрации 19,95±0,68 мг/м3

Показатели (определение в сыворотке крови и гомогенате печени) (Аскорбиновая к-та и Унитиол)+ ДФЦ Токоферол + ДФЦ ДФЦ Контроль

SH-белковые -SS-rp, печень -0,633 -0,692 0,621 -0,664

SH-небелковые SH-латентные 0,651 0,541 -0,019 0,559

МДА Г-SH, печень 0,118 -0,087 -0,793 0,468

SH-общие SH-латентные 0,241 0,301 0,766 0,030

SH-белковые SH-латентные -0,328 -0,046 0,532 -0,423

SH-небелковые Церулоплазмин -0,267 0,433 -0,729 0,348

Церулоплазмин -SS-rp, печень 0,758 -0,133 0,481 0,660

АЛТ ACT 0,628 0,225 0,575 0,141

SH-небелковые -SS-rp в печени 0,072 0,529 -0,749 0,546

Жирным шрифтом - Р<0,05

Полагаем, что характеристика корреляционных связей между различными показателями интоксикации является новым видом биомаркеров эффекта, который может быть использован в токсикологических исследованиях промышленных веществ, обладающих различным характером действия на организм, с целью установления параметров токсикометрии, исследования патогенетических механизмов и поиска средств экспериментальной терапии.

Таким образом, обоснованные биомаркеры эффекта обладают критерием вредности, позволяют выявлять тонкие механизмы действия ядов и эффективнее использовать полученные экспериментальные данные.

к Контроль ♦ 23 мг/мЗ (Ут ас) ТКСО, латентный I

Рисунок 3 - Нарушение корреляционной связи между параметрами поведенческих реакций по методу «темная камера-светлое окно» после однократного ингаляционного воздействия ИБЭХБК на уровне Limac

Сравнительная характеристика биомаркеров специфического и общетоксического эффектов при оценке риска профессионального воздействия вредных веществ

Несоблюдение гигиенических стандартов, низкая эффективность профилактических мероприятий на производстве, недостаточная разработка количественных критериев потенциального и реального ущерба для здоровья работающих приводит к необходимости в дополнение к существующей системе гигиенического нормирования оценивать степень вредности/опасности и уровни профессионального риска в условиях неудовлетворительного качества воздуха рабочей зоны. В Руководстве «Гигиенические критерии оценки и классификация условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса» Р 2.2.755-99 дана следующая характеристика нарушений здоровья при работе во вредных (3 класс) и опасных (экстремальных; 4 класс) условиях: подкласс 3.1. - Нестойкие функциональные изменения, не восстанавливающиеся к началу следующей

смены; подкласс 3.2 - Стойкие функциональные изменения,

начальные признаки или легкие формы профзаболеваний через 15 лет от начала работы; подкласс 3.3 - Профзаболевания легкой и средней степени тяжести в периоде трудовой деятельности; подкласс 3.4 - Тяжелые формы профзаболеваний, потеря общей трудоспособности и 4 класс - Угроза для жизни в течение смены, высокий риск острых профинтоксикаций (в т.ч. - тяжелых).

Основная задача оценки риска химического воздействия состоит в определении нарушений здоровья в условиях превышения ПДК. Величина ПДК при этом, по сути, служит референтной дозой для сравнения с реальными концентрациями вредных веществ [Н.Н.Молодкина, А.И.Халепо, 2003].

Недостаток клинико-гигиенических данных в плане зависимости «концентрация - эффект» по конкретным веществам заставляет обращаться к экспериментальному материалу. Обоснованы параллели между клинической характеристикой классов условий труда и параметрами токсикометрии. Поскольку острые отравления, исходя из клинического описания, возможны лишь при работе в 4 классе условий труда, следовательно, границей этого класса должна быть величина Limac. Тогда в 4 класс попадут и интоксикации со смертельным исходом. С другой стороны, если порог хронического действия опреде-

ляет появление минимальных стойких или субкомпенсированных функциональных изменений при длительном воздействии, то, следовательно, этот параметр должен служить верхней границей подкласса 3.2. Обоснование верхней границы подкласса 3.3 не так очевидно, однако, исходя из практики токсикологических исследований, с большой долей вероятности можно полагать, что превышение Limch в 2 и более раз приведет к развитию интоксикаций легкой и средней степени тяжести.

Созданная база токсикологических данных промышленных ядов позволила применить дифференцированный подход к веществам, обладающим избирательным (специфическим) эффектом и оказывающим преимущественно общетоксическое действие, и оценить значимость основных элементов системы оценки потенциального риска воздействия химического фактора - порогов

специфического и общетоксического действия,

установленных с использованием соответствующих биомаркеров.

Раздражающие вещества представляют собой многочисленную известную группу избирательно действующих ядов. Острые и хронические профессиональные отравления раздражающими веществами постоянно лидируют в структуре профинтоксикаций [Г.Г. Онищенко, 1998 - 2004]. Анализ базы данных по раздражающим веществам позволил установить, что их CL5o превышает ПДК в среднем в 1600 (средняя арифметическая) - 1100 (средняя геометрическая) раз, Lim ac для крыс - в 70 - 50 раз, Lim 1г для крыс - в 18 - 15 раз, Lim 1г для человека - в 6,7 - 5,4 раза соответственно (таблица 4).

Таблица 4 - Соотношение параметров токсикометрии и ПДКР 3 раздражающих веществ

Параметры токсикометрии CL^ Lim ackc.. Lim ir kc. Lim ,г„л Lim

ПДК ПДК ПДК ПДК ПДК

М+m 1598 ±264 71,2 ±8,7 18,4 ±1,4 6,7 ±0,6 5,2 ±0,5

Min -Max 230 - 5400 8,6 - 406 4,8 - 59,6 2-9,5 2,4-11

Ср.геомет. 1108,9 50,1 15,5 5,4 4,7

n 30 73 71 65 24

Сравнение полученных результатов с представленными в Р 2.2.755-99 границами подклассов (таблица 5) по кратности превышения ПДК показывает их не соответствие клиническому описанию нарушений здоровья работающих в 3 (вредном) и 4 (опасном) классах условий труда. Как видно из таблицы 5, при существующих границах кратности превышения ПДК (до 2, 4, 6, 10, и более 10 ПДК) подклассы (3.1. - 3.4) 3 вредного и 4 опасного классов существенно не отличаются друг от друга. В каждый из них попадают вещества, которые при таком превышении их ПДК будут вызывать один и тот же эффект. Анализ распределения других параметров токсикометрии по классам условий труда усу-

губляет указанное несоответствие. Распределение веществ, исходя из

средней величины отношений параметров токсикометрии к ПДК, показывает, что все параметры токсикометрии (кроме Limir чел и Limch) приходятся на 4 класс, а все клинические эффекты 3 класса должны будут развиваться при воздействии раздражающих веществ в концентрациях на уровне до 2 Limir чел или 1-2 Limch, что не соответствует реальности.

Таблица 5 - Сравнение классификаций степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих ядов в зависимости от кратности превышения их ПДК (по Р.2.2.755-99 и предлагаемой автором)

Вредные условия труда Опасные условия труда

3.1 3.2 3.3 3.4 4

Кратность превышения ПДК (согласно Р.2.2.755-99)

1-2ПДК 2,1-4 ПДК 4,1-6 ПДК 6,1-10 ПДК >10ПДК

Распределение раздражающих веществ (%) по параметрам токсикометрии

10 37 35 20 0 Lim,r,o,

8 35 35 19 4 Limch kc

0 0 7 20 73 Limir kc

Предлагаемая кратность превышения ПДК

1-2ПДК 2,1-5 ПДК 5,1-10 ПДК 10,1-50 ПДК >50ПДК

Распределение раздражающих веществ (%) по параметрам токсикометрии

8 51 41 0 0 Limir чел

8 54 35 3 0 Limch kc

0 3 25 72 0 Limir kc

0 0 1 57 42 Lim.c kc

0 0 0 0 100 CT 5 0

Таким образом, при обоснованных нами изменениях границ 3 и 4 классов (таблица 5) достигнуто соответствие между клинической картиной интоксика-

ции и величиной кратности превышения ПДК раздражающих

веществ в воздухе рабочей зоны.

Подобный анализ был проведен нами и для веществ общетоксического действия, ПДК которых обоснованы с учетом величины Пшас. Для снижения разброса данных обработка токсикометрических параметров проводилась раздельно для веществ разных классов опасности (таблица 6).

Таблица 6 - Соотношение параметров токсикометрии и ПДКР 3 веществ обще-

токсического действия 1-4 классов опасности

Статистические показатели CLM ПДК Lim . ac.kc. Lim .. ch.kc.

ПДК ПДК

Вещества 1 класса опасности

Min -Max 200-12500 15-760 4,0-30,0

n 28 22 25

M±m 2776 ±668 15б,37±41,11 10,55 ±1,23

Доверительный интервал 1309 80,58 2,42

Средняя геометрическая 1473 91,06 9,3

Вещества 2 класса опасности

Min -Мах 100-8500 8,5 - 600 2,0-28

n 98 139 129

M±m 1966 ±199 96,94 ± 8,85 7,75 ±0,45

Доверительный интервал 390,25 17,35 0,89

Средняя геометрическая 1141 60,89 6,31

Вещества 3 класса опасности

Min -Max 141-9000 9-780 2-40

n 58 121 77

M±m 2078 ±269 70,41 ±9,44 7,55 ± 0,73

Доверительный интервал 527,89 18,51 1,44

Средняя геометрическая 1228 42,10 5,91

Вещества 4 класса опасности

Min -Max 93-6600 8,9 - 500 2-20

n 46 50 26

M±m 1096 ±211 58,56 ±11,37 7,72 ±1,07

Доверительный интервал 414,11 22,29 2,10

Средняя геометрическая 610 35,46 6,29

Для всех классов химических соединений отмечается частичное

перекрывание крайними величинами отношений параметров токсикометрии к ПДК соседних рядов отношений. Например, разброс отношений Lim с11/ПДК веществ 4 класса опасности составляет 2 - 20, а минимальная величина отношения Lim ^ПДК равна 8,9. В то же время отмечается близость величин отношения Lim^/ПДКр 3. и Lim с11/ПДКр з в группах веществ общетоксического действия 3 и 4 классов опасности. Исходя из приведенных данных, при воздействии веществ 1, 2 и 3-4 классов опасности вероятность острой интоксикации приближается к 100% при превышении их ПДК соответственно в 90,60 и 35-40 раз; вероятность хронической интоксикации чрезвычайно высока на уровне 9 ПДК для 1-го класса, и 6 ПДК и выше для остальных классов.

Как и для раздражающих веществ, для веществ общетоксического действия выявлено несоответствие возможной выраженности клинических изменений у работающих (по Р.2.2.755-99) тому токсическому эффекту, который был установлен в экспериментальных исследованиях. При существующих границах кратности превышения ПДК (до 3, 6, 10, 20 и более 20 ПДК) для веществ 1-2 классов опасности в каждый подкласс (3.1. - 3.4) 3 вредного класса попадает от 14 до 32% всех веществ на уровне порога хронического действия. Попадание 1/5 всех веществ 1-2 класса опасности при воздействии на уровне Limch («минимальные признаки хронической интоксикации») в подкласс 3.4 («тяжелые формы профзаболеваний, потеря общей трудоспособности») приводит к неоправданному завышению риска дм этих соединений. В группах веществ 3 и 4 классов опасности картина распределения схожа между собой, но отличается от распределения веществ 1-2 классов. Особенно настораживает такое превышение ПДК, которое может вызывать острые интоксикации и смертельные отравления. Поскольку граница подклассов условий труда «более 10 ПДК» соответствует подклассу 3.3 («профзаболевания легкой и средней степени тяжести в периоде трудовой деятельности»), то в этот подкласс без последующей диффе-ренцировки попадают все 100% веществ 3-4 класса опасности при превышении ПДК более, чем в 10 раз, т.е. при достижении ими уровней Limac («минималь-

ная токсическая концентрация при однократной ингаляции»), а также

дальнейшем повышении концентраций, включая средние смертельные (CL50). Такая ситуация означает опасное и неоправданное занижение вероятности возникновения острых отравлений на производстве при оценке потенциального риска.

Результаты, полученные при анализе базы данных для веществ общетоксического действия, позволили разработать дифференцированную классификацию опасности их воздействия на работающих при несоблюдении гигиенических стандартов, которая соответствует клиническому описанию возможных нарушений здоровья. На основе проведенных расчетов и анализа соотношений токсикометрических показателей к ПДК (Limac /ПДК, Lim с11/ПДК) для 3 (вредного) класса и (Lim^/ПДК и CLj/ПДК) 4 (опасного) класса условий труда обоснованы следующие границы классов условий труда работе с веществами общетоксического действия:

для веществ 1 класса опасности: подкласс 3.1. 1-3 ПДК, подкласс 3.2. - 3,1-10 ПДК, подкласс 5.3.-10,1-20 ПДК, подкласс 3.4. - 20,1 - 90 ПДК, 4класс - более 90 ПДК;

для веществ 2 класса опасности: подкласс 3.1. 1-3 ПДК, подкласс 3.2. -'3,1-8 ПДК, подкласс 3.3.-8,1-16 ПДК, подкласс 3.4. - 16,1-60 ПДК, 4класс - более 60 ПДК.

Для веществ 3 и 4 классов опасности: подкласс 3.1. 1-3 ПДК, подкласс 3.2. -3,1-8 ПДК, подкласс 3.3.-8,1-16 ПДК, подкласс 3.4. - 16,1-40 ПДК, 4класс - более 40 ПДК.

При анализе параметров токсикометрии раздражающих веществ и веществ общетоксического действия обращает на себя внимание больший разброс данных для второй группы ядов. Это объясняется многообразием и свободой выбора биомаркеров при обосновании параметров токсикометрии для веществ общетоксического действия и строго фиксированным набором маркеров для раздражающих ядов. Как показали наши исследования, Lim 1r кс в 80% случаев устанавливаются по одному показателю - изменению частоты дыхания; коэф-

фициенты корреляции между параметрами токсикометрии для

раздражающих веществ существенно выше, чем для веществ общетоксического действия. Вместе с тем, выделение из общей массы групп веществ по ведущему токсическому эффекту, либо по общности химической структуры (что, как правило, подразумевает сходный характер действия), позволяет выявить для них более четкую зависимость ПДК от параметров токсикометрии. Полагаем, что дальнейшая разработка оценки риска воздействия химического фактора на производстве должна проводиться в направлении дифференциации подхода к разным группам/классам химических соединений. Такой подход повышает надежность защиты работающих во вредных условиях труда и дает научное обоснование для разработки практических мер гигиенического, медицинского и социального характера.

Таким образом, обоснованность выбора биомаркеров эффекта при установлении минимально действующих концентраций играет основную роль для определения величины ПДК - референтного параметра при оценке риска. От выбора оптимальных биомаркеров эффекта, отражающих характер действия яда, зависят точность определения параметров токсикометрии и, соответственно, обоснованность гигиенических нормативов.

Биомаркеры раздражающего эффекта при тестировании химических веществ в опытах in vitro

С целью совершенствования принципов отбора и использования биомаркеров эффекта в опытах in vitro для оценки риска местного раздражающего действия веществ проведено сравнительное исследование трех методов. Два метода (подвижность Paramecium caudatum и жизнеспособность клеток Hela -MIT-24) основаны на изучении мембранотоксического эффекта химических соединений, который является одной из составляющих раздражающего действия веществ in vivo. НЕТ-САМ тест оценивает повреждение хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона путем регистрации трех маркеров раздражающего эффекта - гиперемии, геморрагии и денатурации белков оболочки. Согласно

разработанному алгоритму в эксперименте были испытаны 20

промышленных веществ, обладающих разной силой раздражающего действия на слизистую оболочку глаза кролика (оценка по стандартному методу Draize).

Установлено, что результаты исследования влияния выбранных веществ на подвижность инфузорий и ингибирование роста клеток Hela не совпадали с выраженностью раздражающего эффекта этих веществ in vivo. Математической связи между дозой, вызывающей 50% цитотоксический эффект in vitro и оценкой местного раздражающего действия по методу Draize не выявлено.

Результаты оценки действия веществ на хориоаллантоисную оболочку (НЕТ-САМ тест) и на слизистую глаза кролика (метод Draize) коррелировали между собой (рисунок 4).

Рисунок 4 - Зависимость между индексом раздражающего эффекта по методу Draize и индексом повреждения хориоаллантоисной оболочки по НЕТ-САМ тесту (о - выпадающие точки)

Математическая зависимость между ними описывалась уравнением: IS-100% =4,13 Draize + 0,69 (n=l 8, r=0,78±0,09 t=8,67p<0,001), где

IS-100% - индекс повреждения хориоаллантоисной оболочки нативным веществом, выраженный в баллах (0-21 балл);

Draize - баллы (1-5 баллов) по системе оценки раздражающего действия веществ in vivo по методу Draize.

Вещества с выраженным раздражающим действием (4-5 класс по методу Draize) имели оценку по НЕТ-САМ тесту 13,7 и выше.

Таким образом, из трех испытанных методов, выбранных для оценки раздражающих свойств химических веществ, только НЕТ-САМ тест, где в качестве биомаркеров эффекта используется регистрация признаков коагуляции белка, гиперемии и геморрагии, - оказался пригоден для практического использования. Два других испытанных метода, основанных на определении цитоток-сичности веществ в опытах in vitro, не позволяют определять выраженность раздражающего действия химических веществ.

Полагаем, что при оценке раздражающего эффекта ядов в опытах in vitro следует отдать предпочтение биомаркерам, которые позволяют моделировать развитие функциональных и морфологических нарушений, близких к наблюдаемым в экспериментах in vivo.

Предлагаемый НЕТ-САМ тест позволит исключить исследование на лабораторных животных химических соединений с выраженным раздражающим действием.

Биомаркеры экспозиции и биологические ПДК промышленных веществ

Биомаркеры экспозиции являются основой для разработки биологических гигиенических нормативов, которые широко используются в промышленных развитых странах для мониторинга риска профессионального воздействия вредных химических веществ. Так, в США рекомендованы BEI (биологический индекс экспозиции) для более 50 веществ и групп веществ, в Германии приняты ВАТ (биологический толерантный уровень) для 62 химических соединений. В

Финляндии рекомендованы BAL (предельно допустимый уровень

для биомониторинга) для более 40 веществ и групп веществ.

В нашей стране также проведены исследования по обоснованию биологических ПДК (биоПДК) ряда актуальных веществ на основе результатов оценки условий труда, состояния здоровья работающих и содержания биомаркеров экспозиции в организме. Разработаны методические рекомендации «Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ» (№ 520590) и обоснованы биоПДК для бензола, стирола, толуола, хлорбензола и свинца. Однако, предложенные биоПДК не были утверждены в законодательном порядке, поскольку органы санэпиднадзора не были готовы в то время использовать биоПДК для контроля условий труда на производстве.

Использование в России методологии оценки риска, ее совершенствование и развитие безусловно диктуют необходимость внедрения биомониторинга состояния здоровья работающих в контакте с вредными химическими веществами. Биомониторинг позволяет наиболее точно оценить интегральную дозу вещества, попавшую в организм разными путями, выявлять отдельных лиц или группы работающих, подвергающихся повышенному риску воздействия веществ и нуждающихся в принятии необходимых мер по предупреждению нарушения здоровья. Кроме того, определение биомаркера экспозиции играет важную роль в диагностике профессиональных интоксикаций. Установление биоПДК в первую очередь целесообразно для веществ, обладающих высокой кумулятивной активностью и кожной резорбцией, а также присутствующих в воздухе рабочей зоны в виде аэрозоля (зависимость поступившей в организм дозы от дисперсности). Кроме того, необходимо учитывать количество работающих, контактирующих с веществом на производстве, статистику острых и хронических интоксикаций.

На основании изучения теории и практики установления биологических (гигиенических) стандартов безопасности в различных странах, анализа данных литературы о зависимости между содержанием вещества в воздухе производст-

венных помещений, состоянием здоровья работающих и

изменениями содержания биомаркеров экспозиции обоснованы биоПДК для широко используемых в российской промышленности и вызывающих острые и хронические профинтоксикации сероуглерода, группы неорганических фторидов и окиси углерода.

Обоснование биоПДКсероуглерода

Для оценки экспозиции С82 предложены различные биомаркеры, определяемые в крови, моче и выдыхаемом воздухе. Сотрудниками НИИ МТ РАМН (Г.Г.Авилова, Н.П.Головкова, ТАТкачева и др.) проведено исследование йода-зидной реакции, как биомаркера экспозиции С82, у работающих на производстве искусственного волокна. Установлена зависимость индекса экспозиции по йодазидному тесту от среднесменной концентрации сероуглерода в воздухе. Однако, вследствие недостаточной чувствительности метода установить биоПДК для С82, соответствующее ПДК указанного соединения в воздухе рабочей зоны, не удалось.

В настоящее время в качестве биомаркера экспозиции С82 используется определение 2-тиотиазолидин-4-карбоновой кислоты (ТТКК) в моче. Согласно собранным данным в воздухе промышленных предприятий, находящихся в разных странах, концентрации С82 составляли 1,6 - 173 мг/м3 , а содержание ТТКК в моче работающих достигали 0,35-13,7 мг/г креатинина.

Установлена зависимость изменения содержания ТТКК в моче от концентрации С82 в воздухе (рисунок 5), которая описывается уравнением:

ТТКК (мг/г креатинина) = 0,147 С82 (мг/м3) + 0,175 (п=11; г = 0,89 ± 0,07; Р<0,01).

В расчет включены данные, касающиеся концентраций С82 в воздухе ниже 46 мг/м3. каждая из использованных точек является средней арифметической из большого числа наблюдений. Вычисленная биоПДК, соответствующая

принятой в России ПДК (среднесменная 3 мг/м3) в воздухе

рабочей зоны составила 0,616 мг/г креатинина (определение проводится в конце смены).

0 10 20 30 40 50

♦ после смены Д контроль О до смены

Рисунок 5 - Зависимость уровня ТТКК в моче работающих в конце смены от концентрации сероуглерода в воздухе рабочей зоны

Концентрации ТТКК в моче лиц, не подвергавшихся воздействию CS2, находятся на уровне 0 - 0,3 мг/г креатинина [Y.H. Gao et al., 1998], а верхняя граница доверительного интервала составляет 0,432 мг/г креатинина [H.Kivisto, 2000]. Таким образом, рекомендованная биоПДК находится выше уровня естественного содержания ТТКК в моче человека.

Обоснование биоПДК группы неорганических фторидов

Фтористый водород и неорганические фториды, гигиеническое нормирование которых в воздухе рабочей зоны проведено по содержанию фтора, выделяются в воздух производственных помещений при многих технологических процессах и являются причиной острых и хронических (флюороз) интоксикаций. В качестве биомаркера экспозиции указанными веществами используется определение количества фтора в моче.

Установлены зависимости между содержанием фтора в воздухе рабочей зоны и моче работающих в конце смены:

F (мг/л, моча) - 1,4 + 4,6 F (мг/м3, воздух) [A.Hogsted, 1984];

F (мг/л, моча) = 2,31 + 1,88 F (мг/м3, воздух) [A.F. Steinegger, 1992];

F (мг/г креатинина, моча) = 0,77 + 2,24 F (мг/м3,

воздух) [F. Pierre et al., 1995]

Расчеты по перечисленным уравнениям использовались при установлении биологических нормативов для фторидов в США, Германии, Финляндии, Великобритании, Дании и др. странах. Анализ данных литературы подтвердил обоснованность приведенных зависимостей. Поэтому указанные уравнения были использованы и для обоснования биологических ПДК фтористого водорода и группы неорганических фторидов, которые соответствовали их установленным ПДК в воздухе рабочей зоны в России (таблица 7).

Важно подчеркнуть, что фоновое содержание фтора в моче составляет менее 1 мг/г креатинина [Lauwerys R.R. and Hoet P., 2001].

Таблица 7 - Рекомендуемые биоПДК для группы

неорганических фторидов (определение в конце смены)

Название вещества ПДК в воздухе рабочей зоны, среднесменная (по F), мг/м3 БиоПДК (F в моче), мг/г креатинина

Фтористый водород 0,1 1,0

Фторид натрия 02 1,2

Фторид калия 0,2 12

Дифторид бария 0,2 1,2

Дифторид кальция 0,5 19

Трифторид церия 0,5 19

Трифторид алюминия 0,5 1,9

Обоснование биоПДКокисиуглерода

При оценке экспозиции оксида углерода в различных странах используется определение карбоксигемоглобина (СОНв) в крови.

Изучена зависимость развития симптомов интоксикации окисью углерода от величины концентрации СО во вдыхаемом воздухе и продолжительности воздействия [Л АТиунов, В В Кустов, 1969, R.F. Cobum et al., 1965; Mathieu D. et al, 1996]. Установленные в разных странах биологические нормативы окиси углерода относятся только к некурящим лицам. У курильщиков содержание СОНв в крови превосходит (достигая 15% и выше) уровни, установленные для производственного воздействия оксида углерода.

Математический анализ литературных данных позволил выявить прямую линейную зависимость между концентрациями окиси углерода в воздухе рабочей зоны и содержанием карбоксигемоглобина в крови работающих (рисунок 6), которая описывается уравнением:

СОНЬ (%) = 0,115 • СО (мг/м3) + 0,802 (п=17, Я=0,91 ± 0,04 Р<0,01).

9

8

СОНЬ, %

♦

2 -

3 -

6 -

4 -

5

1 - ♦

7

СО, мг/мЗ

0

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00

Рисунок 6 - Зависимость уровня карбоксигемоглобина в крови работающих от концентрации оксида углерода в воздухе (определение в конце смены)

Исходя из полученного уравнения, содержание карбоксигемоглобина, соответствующее ПДК окиси углерода, принятой в России (20 мг/м3), составит 3,1 %. Вычисленная величина превышает на 0,6% безопасную величину, рекомендованную ВОЗ для населения (включая группу риска по сердечно-сосудистым заболеваниям). Как и стандарты, принятые в ряде стран, рекомендуемая нами величина биологической ПДК не может применяться для курящих рабочих, поскольку колебания величин карбоксигемоглобина для последних будут минимум в 2 раза ее перекрывать.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о принципиальной возможности обоснования БиоПДК промышленных веществ путем матема-

тического моделирования. Это позволяет избежать значительных

материальных затрат и сократить время. Подобные разработки могут быть сделаны и для некоторых других веществ, что позволит существенно расширить список рекомендованных биоПДК вредных промышленных веществ в России. Принимая во внимание возросшие в последнее время методический уровень [МУК 4.1.763-4.1.779-99] и возможности оснащения санэпидслужбы аналитическим оборудованием, методы измерения рекомендованных биомаркеров экспозиции сероуглерода, окиси углерода и фторидов, как и ряда других биомаркеров, могут быть воспроизведены в России. Однако, следует учитывать, что при значительных различиях величин гигиенических нормативов в воздухе рабочих помещений (а в России ПДК, как правило, ниже гигиенических стандартов в западных странах) может потребоваться иной биомаркер экспозиции и метод его измерения в биосредах.

Таким образом, в настоящее время основное преимущество биомаркеров экспозиции - точное определение количества вещества, которое поступило в организм человека, - наиболее полно реализовано при биомониторинге. Перспективно применение биомаркеров экспозиции при решении и других проблем, связанных с оценкой риска воздействия веществ.

В частности, биомаркеры экспозиции открывают путь к единому гигиеническому нормированию, позволяющему регламентировать количество вещества, поступающего в организм через органы дыхания, пищеварительный тракт и кожу.

ВЫВОДЫ

1. Система оценки риска воздействия промышленных ядов и установления гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны и биологических ПДК базируется на биомаркерах экспозиции и эффекта. Биомаркеры должны обладать критерием вредности, отражать механизм токсического действия, подчиняться зависимости «доза-ответ», быть воспроизводимыми и методически доступными.

2. Анализ созданной информационной базы данных параметров токсикометрии более 600 вредных промышленных веществ показал, что в системе оценки риска вредного действия биомаркеры специфического эффекта (на примере раздражающих ядов) обладают большей прогностической значимостью в по сравнению с показателями интегрального эффекта.

3. Разработаны классификации степени опасности для здоровья работающих веществ раздражающего и общетоксического эффектов в зависимости от превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, обоснованы границы подклассов 3 вредного и 4 (опасного) вредных условий труда при оценке риска.

4. Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени при однократном воздействии химических веществ, биотрансформация которых затрагивает систему монооксигеназ печени, является дозо-зависимым и критериально значимым биомаркером эффекта. Установлена математическая зависимость между Lim ac Р-450 и величиной гигиенического стандарта, разработан метод прогнозирования гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны для указанной группы веществ.

5. Характеристики корреляционных связей между биологически связанными биохимическими и функциональными показателями («холестерин-Р-липопротеиды», «АЛТ-АСТ», «МДА-АСТ», «МДА-Г-SH» и др.) при воздействии вредных веществ могут являться биомаркерами эффекта, обладающими критерием вредности. Регистрация указанных маркеров позволяет выявлять на-

рушение процессов адаптации, изучать патогенез и обосновать

возможные способы терапии интоксикаций.

6. Результаты оценки местного раздражающего действия 20 веществ в опытах на экспериментальных животных и различными методами in vitro свидетельствуют о целесообразности выбора биомаркеров в альтернативных исследованиях, моделирующих развитие морфо-функциональных нарушений, близких к наблюдаемым in vivo.

7. На основе систематизации и обобщения информации о биомаркерах экспозиции, используемых при биологическом мониторинге, разработаны математические модели зависимости изменения биомаркеров у работающих от уровня воздействия химических веществ и обоснованы величины биологических ПДК для окиси углерода (3,1% НЬСО в крови), группы неорганических фторидов (1-2 мг/г креатинина F-ион в моче) и сероуглерода (2-тиотиазолидин-4-карбоновая кислота в моче 0,62 мг/г креатинина).

8. Внедрение биологического мониторинга в практику оценки профессионального риска воздействия химических соединений позволяет оценить индивидуальную поглощенную дозу, выявить лиц с повышенным риском, своевременно разработать и провести необходимые профилактические, организационные и лечебные мероприятия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ: Метод, рекомендации № 5205-90 / Сост. И.В. Саноцкий, И.П.Уланова, Г.Г. Авилова, Т.А. Ткачева и др. - М., 1990. - 30с.

2. Sanotsky I.V., Kurlyandskaya T.V., Avilova G.G., Tkacheva T.A. Ratio of toxicokinetics and toxicodynamics indices: exposure to isobutyl benzene // Eighth Finnish- Soviet Symposium on Occupational Health. - 15 Aug. 1991, Lappeen-ranta, Finland. - Ext. Abstr. - Helsinki, Finland. P. 67-73.

3. Авилова Г.Г., Карпухина Е.А., Ткачева Т.А. Оценка интенсивности воздействия сероуглерода на работающих с помощью биологического мониторинга // Профессиональная патология в восточных регионах страны: Сб. науч. тр. -Новокузнецк.-1991.-т.1.-С.111-112.

4. Уланова И.П., Авилова Г.Г., Халепо А.И., Карпухина Е.А., Ткачева Т.А. Биологические безопасные уровни воздействия химических веществ, как интегральный показатель промышленной экологической нагрузки // Акт.пробл. медицины труда и пром. экологии : Тез. н. конф. - М: НИИ медицины труда РАМН. -1994.-С.74-75.

5. Глущенко В.И., Горячев Н.С., Катосова Л.Д., Ткачева Т.А. и др. 4-бром-орто- ксилол // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ /под ред. Н.Ф.Измерова, Б.А.Курляндского и К.К.Сидорова. - М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С.25-26

6. Авилова Г.Г., Курляндская Т.В., Ткачева Т.А., Карпухина Е.А. и др. Изобу-тилбензол // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ /под ред. Н.Ф.Измерова, Б.А.Курляндского и К.К.Сидорова. - М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С.56-57

7. Тимофиевская Л.А., Иванова Н.И., Петрова Л.П., Ткачева Т.А. и др. а-Аллетрин // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ / под ред. Н.Ф.Измерова, Б.А.Курляндского и К.К.Сидорова. - М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С. 10-11

8. Глущенко В.И., Горячев Н.С., Ткачева ТА, Фесенко МА и др. Орто-бромтолуол // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ / под ред. Н.Ф.Измерова, БАКурляндского и К.К.Сидорова. -М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С. 28-29.

9. Авилова Г.Г., Хоанг Минь Хьен, Ткачева ТА, Карпухина ЕА и др. 2,6-дихлоранилин // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ / под ред. Н.Ф.Измерова, БАКурляндского и К.К.Сидорова. - М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С.53-54.

ЮАилова Г.Г., Карпухина ЕА, Каютина С.В., Ткачева Т.А и др. 2-бромпропан и 2-бромбутан // Новые сведения о токсичности и опасности химических веществ / под ред. Н.Ф.Измерова, БАКурляндского и К.К.Сидорова. - М.: НИИ МТ РАМН, РРПОХБВ, 1996. - С. 27 - 28.

1 l.Ulanova I., Khalepo A., Tkacheva Т., Karpukchina E., Kautina S. State of antioxidant system as a result of exposure to some toxic factors // Tenth Finnish-Russian Joint Symposium on Occupational Health. -15 Aug. 1996, Lappeenranta, Finland. - Ext. Abstr. - Helsinki, Finland. P. 48-49.

12.Карпухина ЕА, Авилова Г.Г., Ткачева ТА, Каютина СВ. Токсичность и опасность пихтового масла «дальневосточного // Ж. Медицина труда и промышленная экология. - 1995. - № 7. - С. 45 - 46.

13.Уланова И.П., Авилова Г.Г., Соркина Н.С., Молодкина Н.Н., Ткачева Т.А и др. Токсикологические, гигиенические и клинические аспекты действия низких уровней органических растворителей // Ж. Медицина труда и промышленная экология. - 1997. - № 3. - С. 11 - 17.

Н.Авилова Г.Г., Карпухина ЕА, Каютина СВ., Курляндская Т.В., Ткачева Т.А. и др. Исследование процессов токсикокинетики химических соединений в организме и использование полученных данных для обоснования безопасных уровней воздействия // Ж. Вестник токсикологии. - 1997. - № 6. - С.17-20.

15.Tkacheva Т.А Use of the liver level of cytochrome P-450 after a single exposure for estimation of toxicity of chemicals // Bridging the Global Environment: Tech-

nology, Communication, and Education : Abstr. SETAC 18th

annual meeting - 16-20 Nov, 1997. - San Francisco, CA. -. No. РТА 128. - P.183 -184.

16.Tkacheva T.A., Avilova G.G., Karpukchina E.A. Indices of biotransformation in rat after short-term exposure ofxenobiotics: pattern of their changes // Abst. Joint Conf. Scand. Soc. Cell Toxicology & Estonian Soc. Tox. (SSCT & ETS 98). -Tallinn: Inst. Chem.& Biophysics, 1998. - P. 58 -59.

17.Уланова И.П., Авилова Г.Г., Наумова А.П., Ткачева Т.А., КаютинаСВ. и др. Гигиеническая оценка условий труда и состояние здоровья работающих печатников издательства "Правда" // Медицина труда на предприятиях города Москвы: М, Охрана труда и социальное страхование,- 1998. - С. 157-161.

18.Tkacheva T.A., Avilova G.G., Karpukchina E.A., Kautina S.V. Glucuronides, a possible urinary marker of nephrotoxicity as indicator of exposure to 2,6-dichloroaniline in rats // Chemical safety for the 21st Century : Abstr. Int. Congr. Toxicology - ICT VIII, Paris, 5-9 July, 1998 : Toxicol. Letters. - 1998. - Suppl. 1/95.-P. 189.

19.Уланова И.П., Халепо А.И., Ткачева Т.А., Карпухина Е.А. Значение антиок-сидантной защиты и ее коррекция при интоксикации химическими соединениями // Тез.докл. 1 Всеросс. съезда токсикологов : М. - 1998. - С.113.

20.Халепо А.И., Рослый И.М., Уланова И.П., Ткачева Т.А. Биохимические сдвиги при острой интоксикации 2,6-диизопропилфенилизоцианатом (ДФИЦ) // Тез.докл. 1 Всерос. съезда токсикологов : М. - 1998. - С. 122.

21.Халепо А.И., Уланова И.П., Карпухина Е.А., Ткачева Т.А. Роль антиокси-дантной защиты в механизме повреждающего действия химических соединений // Медицина труда в третьем тысячелетии: Тез.докл. межд. конф. 2325 июня, 1998.-М. -1998. - С.121.

22.Лукьянов А.С., Павлова Т.Н., Халепо А.И., Ткачева Т.А. Тест НЕТ-САМ как альтернатива окулярному тесту Draize // Тез.докл. 1 Всерос. съезда токсикологов. - М. - 1998. - С.292.

23.Постановка исследований по выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюнктиву глаза с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона: Методические указания № 2.2.756-99 / Сост. А.С. Лукьянов, Т.Н. Павлова, А.И. Халепо, ТА Ткачева. - М., Минздрав России.- 2000. - 8 с.

24.Tkacheva Т.А Glucuronides as a possible urinary biomarker of nephrotoxicity in 2,6-dichloroaniline-treated rats // Human Monitoring after Environmental and Occupational Exposure to Chemical and Physical Agents. Abstracts NATO ASI: Antalya, Turkey. - 1999. - P.54.

25.Халепо А.И., Уланова И.П., Карпухина ЕА, Ткачева Т.А и др. Морфолин-боран (Т-4)-тригидро(морфолин-М4)бор // Ж. Токсикологический вестник. -2000.-№1.-С.41-42.

26.Халепо А.И., Уланова И.П., Карпухина ЕА, Ткачева ТА и др. Олеиновая кислота (октадец-9-еновая кислота) // Ж. Токсикологический вестник. -2000.-№1.-С.42.

27.Tkacheva Т.А Biomarkers of effect and exposure after chlorobenzene inhalation // Abstr. 2nd Croatian Congress of Toxicology CROTOX 2000: Pula, Croatia. -2000. - P.47.

28.Халепо А.И., Уланова И.П., Карпухина ЕА, Ткачева ТА, Каютина С.В. и др. Изобутиловый эфир 3,5-диамино-4-хлорбензойной кислоты // Ж. Токсикологический вестник. - 2000. - №2. - С.29-30.

29.Уланова И.П., Халепо А.И., Ткачева ТА, Карпухина ЕА, Каютина С.В. и др. 2,6-Диизопропилфенилизоцианат (ДФЦ) // Ж. Токсикологический вестник. - 2000. - №2. - С28-29.

30.Халепо А.И., Уланова И.П., Ткачева ТА, Карпухина ЕА, Каютина С.В. Исследование процессов повреждения и механизмов защиты при воздействии химического фактора // Актуальные проблемы медицины труда : Сб. тр. НИИ МТ РАМН / Под ред. Н.Ф.Измерова. - М., 2001. - С.25-74.

31.Халепо А.И., Уланова И.П., Ткачева ТА, Карпухина ЕА, Каютина С.В. Нарушение процессов антиоксидантной защиты и их коррекция в экспери-

менте при интоксикации 2,6- диизопропилфенилизоцианатом

// Ж. Медицина труда и промышленная экология. - 2002. - №2. - С. 1-6.

32.Бидевкина М.В., Шеина Н.И., Гугля Е.Б., Ткачева Т.А. и др. Барбитуровая кислота // Ж. Токсикологический вестник.- 2003. - № 1. - С.47.

33.Molodkina N.N., Sorkina N.S., Tkacheva T.A. Occupational exposure to monochlorobenzene: biomarkers of effect do not confirm TWA = 350 rng/m3 // Molecular Epidemiology in Preventive Medicine / Ed. W.A. Jendrichowski, F.P. Perera, U. Maugeri. IntCenter for Studies and Research in Biomedicine in Luxembourg: Krakow. - 2003. - P. 349-354.

34.Биологические маркеры экспозиции и эффекта // Профессиональный риск для здоровья работников (Руководство) / Под ред. Н.Ф. Измерова и Э.И. Денисова. - М.: Тровант, 2003. - С. 232-241.

35.Khalepo A.I., Tkacheva T.A., Rosliy I.M., Karpuchina E.A Inhalation exposure of 2,6-diisopropylphenylisocyanate: biomarkers of effect and prevention of toxicity // Abstr. "5th International Congress of Turkish Society of Toxicology", 30 Oct.- 2 Nov.2003: Antalya, Turkey. - 2003. - P. 109.

36.Ткачева T.A. Биомаркеры в токсикологии и оценке риска // Тез.докл. 2-го съезда токсикологов России. -М.: РРПОХБВ МЗ РФ, 2003. - С.256-258.

37.Халепо А.И., Ткачева Т.А., Уланова И.П., Карпухина Е.А.и др. Оценка потенциального риска развития острых и хронических профессиональных интоксикаций при воздействии раздражающих веществ // Тез.докл. 2-го съезда токсикологов России. -М.: РРПОХБВ МЗ РФ, 2003. - С.258-259.

38.Ткачева Т.А., Чесалин П.В. Социальные и этические аспекты мониторинга химического воздействия в медицине труда // Тез.докл. 2-го съезда токсикологов России. - М.: РРПОХБВ МЗ РФ, 2003. - С.259-260

39.Уланова И.П., Халепо А.И., Ткачева Т.А., Карпухина Е.А. и др.-Изменение естественного обмена углеводов и липидов при воздействии олеиновой кислоты // Тез.докл. 2-го съезда токсикологов России. - М.: РРПОХБВ МЗ РФ, 2003.-С. 262-263.

40.Ткачева Т.А. Амины // Российская энциклопедия по охране труда. М: НЦ ЭНАС, 2003. - 1 . - С. 40-45.

41.Ткачева Т.А. Оксид углерода // Российская энциклопедия по охране труда. М: НЦ ЭНАС, 2003. - 1. - С. 346-349.

42.Ткачева Т.А. Углеводороды алифатические галоидированные // Российская энциклопедия по охране труда. М: НЦ ЭНАС, 2003. - 2. - С. 258-261.

43.Ткачева Т.А. Пестициды // Российская энциклопедия по охране труда. М: НЦ ЭНАС, 2003. - 2. - С. 17-21.

44. Ткачева Т.А. Значение биомаркеров экспозиции вредными промышленными веществами для оценки риска // Матер. III Всероссийского конгресса «Профессия и здоровье» М.: «Дельта», 2004. - С. 176-177.

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д 8, тел. 332-50-94.

Подписано в печать28.0.02.2005 г. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 2.0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

, í '

\

1 > \ . -

7•• 87

В последнее десятилетие в медицине труда успешно разработана концепция оценки профессионального риска. Учитывая перспективность применения в РФ методологии оценки риска, подчеркивается необходимость ее дальнейшей научной проработки, развития и приведения в соответствие с требованиями, принятыми в нашей стране [29, 48, 50, 79]. Усовершенствование научно-методических подходов в системе гигиенического нормирования и оценки потенциальной и реальной опасности воздействия химических веществ на здоровье работающих признается в документах МЗСР РФ одним из актуальных направлений для медицины труда [30]. При этом гигиенической стандартизации отдается первостепенная роль в профилактике профессиональной заболеваемости. Гигиенические нормативы, установленные с учетом пороговости токсического действия химических веществ, признания приоритета медицинских и биологических показателей, результатов клшшко-гигиенических исследований - являются общепризнанными критериями оценки безопасности на химическом производстве. Риск здоровью считается неприемлемым в условиях несоблюдения безопасных уровней воздействия (ПДК, ОБУВ, ПДУ) химических веществ [49, 88, 102, 109].

Точность определения величины порога действия промышленного яда в значительной степени зависит от выбора адекватных биомаркеров. Согласно определению ВОЗ «Биомаркер - практически любой измеряемый показатель, отражающий взаимодействие между биологической системой и фактором окружающей среды (химический, физический или биологический). Этот показатель может быть функциональным, физиологическим или биохимическим и отражает взаимодействие на клеточном или молекулярном уровне [171].

Биологические маркеры издавна используют в экспериментальных и клинических исследованиях для изучения характера острого и хронического токсического действия соединений, обнаружения признаков нарушения здоровья и биологического мониторинга потенциально опасных экспозиций.

11

Вопрос об их применении для оценю! риска стал рассматриваться сравнительно недавно. Число публикаций на эту тему в мировой литературе неуклонно растет, появились журналы "Biomarkers", "Biomarkers & Prevention" и др., которые рассматривают использование биомаркеров для оценки риска.

В РФ система обоснования гигиенических нормативов вредных веществ как в воздухе рабочей зоны, так и в других средах построены на принципе изменения биомаркеров эффекта в зависимости от величины действующей концентрации (дозы) и продолжительности воздействия вещества. Созданы специальные комплексы биомаркеров для оценки нейротропного, гепатотропного, раздражающего, кардиотропного, сенсибилизирующего и др. эффектов [12, 44, 46, 61, 114, 139]. Однако общие принципы выбора и исследования биомаркеров эффекта при оценке риска промышленных веществ не сформулированы в должной степени, не оценена роль специфических и интегральных биомаркеров различных эффектов действия веществ в системе гигиенического нормирования.

Несмотря на обширность накопленного материала, работы по выявлению корреляций между биохимическими и физиологическими параметрами, характеризующими работу отдельных органов или систем, практически не проводились. Однако такие исследования могут не только прояснить механизм действия яда, но и обосновать применение новых, универсальных биомаркеров эффекта, которые можно будет использовать при исследовании большинства промышленных ядов.

Значимость биохимических исследований в профилактической токсикологии несомненна [28, 127, 131, 284, 340, 341, 359]. Однако в РФ при установлении гигиенических нормативов крайне редко используются показатели, отражающие процессы детоксикации чужеродных веществ, которые включают энзиматическую трансформацию в системе цитохром-зависимых моно-оксигеназ, реакции конъюгации, антиоксидантной защиты и обеспечивающие их биоэнергетические процессы.

С 80-90-х г.г. прошлого века стремительно растет число научных публикаций о биомаркерах экспозиции для новых и уже используемых в промышленности веществ. Регулярно публикуемый журналом «Analytical Chemistry» обновляемый и дополняемый список биомаркеров экспозиции насчитывает уже более 400 наименований. Такой подход обусловлен в первую очередь необходимостью более точно оценивать величину экспозиции для определения реального риска при контакте с тем или иным промышленным веществом для каждого работающего, возможности выделения лиц с повышенным индивидуальным риском, ранними признаками интоксикации при биологическом мониторинге [156].

К сожалению, в РФ в силу ряда причин не уделяется должного внимания указанной проблеме, несмотря на то, что для некоторых промышленных веществ были разработаны и рекомендованы биологические ПДК (БиоПДК).

Учитывая значительные методические трудности и высокую стоимость выполнения подобных исследований, целесообразно для обоснования биоПДК актуальных для России веществ использовать зарубежный опыт.

В последние годы активно проводится разработка методов оценки риска различных видов токсических эффектов альтернативными методами. На наш взгляд, в настоящее время необходимо сформулировать требования к выбору биомаркеров эффекта для используемых в токсикологических исследованиях методов in vitro, определить перспективные способы тестирования веществ на стадии предварительной оценки токсичности и характера вредного действия на организм.

Цель работы:

Научное обоснование принципов и методов использования биомаркеров эффекта и экспозиции в системе оценки риска и гигиенического нормирования промышленных веществ.

Для достижения поставленной цели решались следующие ЗАДАЧИ:

1. На основе анализа данных литературы и результатов собственных исследований обосновать критерии выбора биомаркеров экспозиции и эффекта для гигиенического нормирования и оценки риска воздействия промышленных ядов.

2. Провести поиск и обосновать новые критериально значимые метаболические биомаркеры по данным экспериментальных исследований при воздействии промышленных веществ из различных классов химических соединений.

3. Проанализировать и систематизировать отечественный и зарубежный опыт по обоснованию биологических стандартов по биомаркерам экзогенного воздействия химического фактора, определить зависимость между уровнем биомаркеров экспозиции в биологических средах и концентрацией широко используемых в промышленности неорганических фторидов, сероуглерода и окиси углерода в воздухе рабочей зоны, обосновать для них величины биологических ПДК

4. Исследовать соотношение биомаркеров эффекта на органном, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях при воздействии промышленных ядов и обосновать новые перспективные биомаркеры эффекта.

5. Определить роль биомаркеров избирательного и общетоксического эффекта при исследовании риска воздействия промышленных ядов в условиях превышения ПДК.

6. На основе анализа современных альтернативных методов разработать и апробировать методические подходы использования методов in vitro для оценки риска местного раздражающего действия промышленных ядов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

На основании материалов собственных токсикологических исследований различных классов химических соединений (органические растворители, изоцианаты, пиретроиды, производные морфолина, эфиры фенола и др.) и анализа данных литературы установлено, что биомаркеры эффекта, используемые для оценки риска воздействия промышленных веществ, должны обладать критерием вредности.

Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени белых крыс при краткосрочном воздействии веществ является гигиенически значимым биомаркером эффекта, который использован для прогнозирования нормативов промышленных веществ, метаболизм которых осуществляется с участием монооксигеназной системы.

Характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации является новым видом биомаркеров эффекта. Регистрация указанных биомаркеров, требующая минимальных материальных затрат, позволяет получить достоверную информацию о порогах вредного действия веществ, патогенезе и эффективности экспериментальной терапии отравлений.

На примере исследования раздражающих ядов показано, что использование биомаркеров специфического эффекта повышает обоснованность прогноза нарушения состояния здоровья работающих при превышении гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны по сравнению с биомаркерами общетоксического эффекта.

Создана классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих ядов и веществ общетоксического действия в зависимости от кратности превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, которая отражает связь между величиной действующей концентрации химических соединений и выраженностью симптомов интоксикации (биомаркеров эффекта).

На основании анализа данных о содержании вещества в воздухе производственных помещений, состояния здоровья работающих и уровне биомар

15 кера экспозиции обоснованы биологические ПДК широко используемых в России сероуглерода, окиси углерода и группы неорганических фторидов.

Практическая значимость работы и внедрения в практику

Результаты исследований реализованы при разработке следующих документов:

Методические рекомендации «Биологический контроль производственного воздействия вредных веществ» МР № 5205-90.

Методические указания «Постановка исследований по выявлению раздражающих свойств химических соединений на конъюнктиву глаза с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона» МУ 2.2.756-99.

Новая редакция Руководства Р.2.2.755-99 «Гигиенические критерии оценки и классификация условий труда по показателям вредности и опасности факторов производственной среды, тяжести и напряженности трудового процесса» (находится на утверждении в МЗ и СЗ РФ).

По материалам диссертации установлены и утверждены в законодательном порядке ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны для 30 веществ (включены в ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.1314-03), ОБУВ в атмосферном воздухе населенных мест для 16 веществ (включены в ГН 2.1.6.1339-03), рекомендованы биологические ПДК для сероуглерода, оксида углерода и группы неорганических фторидов.

Создан банк данных, содержащий параметры токсикометрии и гигиенические нормативы более 600 промышленных веществ.

Материалы диссертации используются при чтении лекций на кафедре медицины труда МПФ последипломного профессионального образования ММА им.И.М.Сеченова.

Положения, выносимые на защиту

Разработанные биомаркеры эффекта (содержание цитохрома Р-450 в микросомалыюй фракции печени и характеристика корреляционных связей между показателями интоксикации) обладают критерием вредности и могут быть использованы для оценки риска и обоснования гигиенических нормативов промышленных веществ.

Классификация степени опасности для здоровья работающих промышленных раздражающих веществ и веществ общетоксического действия в зависимости от превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны.

Для повышения точности и надежности оценки риска воздействия вредных веществ используемые в России методы контроля производственной среды и состояния здоровья работающих должны быть дополнены биологическим мониторингом, разработанным на основе биомаркеров экспозиции.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ МТ РАМН (2001, 2004), Секциях Проблемной комиссии «Научные основы медицины труда» (1991, 2004), представлены на симпозиумах, конференциях, международных совещаниях: Finnish-Russian Symposiums on Occupational Health (Lappeenranta, 1991, 1996), конференции НИИ МТ РАМН «Актуальные проблемы медицины труда и промышленной экологии (1994), SETAC 18th annual meeting «Bridging the Global Environment: Technology, Communication, and Education» (1997), Joint Conference of Scandinavian Society of Cell Toxicology & Estonian Society of Toxicology (1998), VIIIth International Congress of Toxicology "Chemical safety for the 21st Century" (1998), Всероссийских съездах токсикологов (1998, 2003), Международной конференции "Медицина труда в 3-м тысячелетии" (1998), North-Atlantic Treaty Organization Advanced Study Institute (1999), 2nd Croatian Congress of Toxicology CROTOX (2000), International Conference "Molecular

Epidemiology in Preventive Medicine: Achievements and New Challenges"

17 til in Preventive Medicine: Achievements and New Challenges" (2002), 5 International Congress of Turkish Society of Toxicology" (2003), Международном Конгрессе «Профессия и здоровье» (2004).

Личный вклад автора

Материалы, использованные в диссертации, получены в результате исследований, в которых автор являлась ответственным исполнителем НИР № 022 00 400693 (2003), № 022 00 100875 (2000), либо разделов НИР: № 019 10 046236 (1995), № 029 10 022457 (1990).

Во всех исследованиях, включенных в диссертацию, автором выполнены следующие виды работ: обоснование актуальности, научной и практической значимости, определение цели и задач исследования; организация и координация исследований, непосредственное участие в экспериментальных работах по сбору первичного материала и формированию исходных баз данных; выбор научно-методических подходов, освоение, апробация и применение необходимых методов исследований; обоснование и формулировка исходных научных гипотез и их анализ на основе результатов исследований; обобщение результатов исследований, формулировка выводов, теоретических положений и концепций; разработка рекомендаций, написание научных отчетов. В составе авторского коллектива принимала участие в разработке двух методических документов (анализ материалов и написание разделов) и руководства.

выводы

1. Система оценки риска воздействия промышленных ядов и установления гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны и биологических ПДК базируется на биомаркерах экспозиции и эффекта. Биомаркеры должны обладать критерием вредности, отражать механизм токсического действия, подчиняться зависимости «доза-ответ», быть воспроизводимыми и методически доступными.

2. Анализ созданной информационной базы данных параметров токсикометрии более 600 вредных промышленных веществ показал, что в системе оценки риска вредного действия биомаркеры специфического эффекта (на примере раздражающих ядов) обладают большей прогностической значимостью в по сравнению с показателями интегрального эффекта.

3. Разработаны классификации степени опасности для здоровья работающих веществ раздражающего и общетоксического эффектов в зависимости от превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, обоснованы границы подклассов 3 вредного и 4 (опасного) вредных условий труда при оценке риска.

4. Изменение содержания цитохрома Р-450 в микросомальной фракции печени при однократном воздействии химических веществ, биотрансформация которых затрагивает систему монооксигеназ печени, является дозо-зависимым и критериально значимым биомаркером эффекта. Установлена математическая зависимость между Lim ас р.450 и величиной гигиенического стандарта, разработан метод прогнозирования гигиенических нормативов в воздухе рабочей зоны для указанной группы веществ.

5. Характеристики корреляционных связей между биологически связанными биохимическими и функциональными показателями («холестерин-Р-липопротеиды», «AJIT-ACT», «МДА-АСТ», «МДА-Г-SH» и др.) при воздействии вредных веществ могут являться биомаркерами эффекта, обладающими критерием вредности. Регистрация указанных маркеров позволяет выявлять нарушение процессов адаптации, изучать патогенез и обосновать возможные способы терапии интоксикаций.

6. Результаты оценки местного раздражающего действия 20 веществ в опытах на экспериментальных животных и различными методами in vitro свидетельствуют о целесообразности выбора биомаркеров в альтернативных исследованиях, моделирующих развитие морфо-функциональных нарушений, близких к наблюдаемым in vivo.

7. На основе систематизации и обобщения информации о биомаркерах экспозиции, используемых при биологическом мониторинге, разработаны математические модели зависимости изменения биомаркеров у работающих от уровня воздействия химических веществ и обоснованы величины биологических ПДК для окиси углерода (3,1% СОНЬ в крови), группы неорганических фторидов (1 - 2 мг/г креатинина F-ион в моче) и сероуглерода (2-тиотиазолидин-4-карбоновая кислота в моче 0,62 мг/г креатинина).

8. Внедрение биологического мониторинга в практику оценки профессионального риска воздействия химических соединений позволяет оценить индивидуальную поглощенную дозу, выявить лиц с повышенным риском, своевременно разработать и провести необходимые профилактические, организационные и лечебные мероприятия.

Заключение

В заключение следует подчеркнуть, что рост числа биомаркеров интоксикации промышленными ядами привел к необходимости систематизировать накопленные знания, определить подходы к оценке изменения разных биомаркеров в организме, создать учение о норме, сгруппировать и по возможности минимизировать набор биологических параметров, отвечающих за характерологические особенности вредных химических соединений [28, 52, 108, 114, 115, 120, 137- 139, 142].

Как в нашей стране, так и за рубежом, учение о показателях токсического эффекта развивалось особенно быстро в течение последних двух - трех десятилетий. В России существенное внимание уделялось доказательству гигиенической значимости изменений функции органов или систем организма [41, 44, 111, 114 - 116, 142, 152]. Для Западной Европы и Соединенных Штатов характерным был поиск все новых и новых биологических параметров, изменяющихся после нагрузки промышленным ядом, в то время как критериальная (с точки зрения российской токсикологии) значимость признавалась преимущественно за гистологическими (морфологическими) нарушениями структуры органов.

В результате в отечественной токсикологии были сформулированы положения о пороговости и критериальной значимости функциональных и ме-4 таболических нарушений, что явилось базой для разработки и успешного применения системы ускоренного гигиенического нормирования содержания промышленных веществ в разных средах. В западных странах принцип пороговости эффекта выражается в определении недействующих и минимально действующих доз/концентраций (LOEL, LOAEL, NOEL, NOAEL). Кроме того, активно продолжают нарабатываться различные (в основном - биохимические, по своему происхождению) показатели. Они отражают изменение работы отдельных реакций или биохимических цепей, работу органелл, клеток определенной ткани или органа, что позволяет составить сложную картину тонких взаимодействий промышленных ядов с различными рецепторами в организме, т.е. - охарактеризовать патогенез интоксикации. Зарубежными учеными ведется работа по определению свойств идеального биомаркера в системе оценки риска.

Вопрос о гигиенической значимости метаболических показателей являлся одним из научных направлений в России [1, 112, 166, 137, 142]. Накопленный к настоящему времени экспериментальный материал требует разработки принципов использования метаболических биомаркеров для определения риска вредных веществ.

В последнее время все большее внимание уделяется показателям го-меостаза на клеточном, субклеточном и молекулярном (биохимическом) уровнях. Особый акцент делается на изучение механизма действия ядов, нарушающих, прежде всего, согласованное течение биохимических реакций. Совершенствование имеющихся и разработка новых критериев вредного действия на молекулярном уровне является актуальной проблемой, поскольку позволяет выявить тонкие гомеостатические нарушения, а также обнаружить функциональные изменения основных органов и систем. Работы в данном направлении единичны как по химическому, так и по другим профессиональным факторам [35, 59, 73]. В этом направлении на наш взгляд, перспективным будет и проведение специальных исследований по экспериментальной терапии, которые применяются при изучении механизмов развития и течения интоксикаций [28, 31,81, 130].

Несмотря на большое число опубликованных работ по исследованию токсичности вредных веществ in vitro, число публикаций, касающихся принципов использования биомаркеров в альтернативных методах, предназначенных для гигиенического нормирования, крайне ограничено [36]. Учитывая перспективность внедрения таких методов в промышленную токсикологию, актуальной представляется необходимость проведения подобных исследований.

Несомненные достоинства биологических ПДК для оценки риска воздействия промышленных ядов диктуют, как нам представляется, целесообразность их разработки и внедрения в РФ. Сформированные тенденции к гармонизации санитарного законодательства в разных странах также инициируют проведение подобных исследования [63, 65]. Тем более, что в России коллективом авторов при нашем участии были разработаны методические рекомендации по обоснованию биологических ПДК, которые, как ясно из приведенных в обзоре данных, позволили адекватно определить биологические стандарты для ряда широко используемых в промышленности веществ. Несомненно, что расширение списка рекомендуемых БиоПДК в РФ будет способствовать созданию официального списка БиоПДК и внедрению их в практику санитарного надзора [64, 87, 107].

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор методов для исследования токсичности и опасности веществ проводили на основе анализа данных литературы и собственных данных. Он определялся характером действия (по выявленным ранее поражаемым системам и органам) на теплокровных животных соединений, близких по химической структуре. Исследовали нервную, дыхательную, антиоксидантную системы, состояние печени, почек, морфологический состав периферической крови, а также аллергенную и мутагенную активность вещества. Показатели, характеризующие деятельность нервной и дыхательной систем, снимали сразу после окончания 4-часовой затравки (1 день), остальные - через 24 часа (2 день), и на 4 сутки (4 день). В отдельных случаях через 7 дней после воздействия каждой концентрации были обследованы дополнительные группы животных для оценки стойкости обнаруженных изменений и выявления аллергенной опасности вещества при его ингаляционном поступлении. Кроме того, для высококумулятивных ядов (дихромат натрия) некоторые показатели определяли дополнительно на 8 и 16 дни после однократной ингаляции.

Способы и длительность введения охватывали все возможные способы проникновения изучаемого вещества в организм в условиях производства. Исследования проводили в условиях острых и подострых экспериментов, при введении вещества в желудок, ингаляции, нанесении на кожу и слизистые оболочки глаза в соответствии с требованиями, изложенными в Методических указаниях и рекомендациях [76, 84]. Изучение местного раздражающего действия и резорбции вещества через неповрежденную кожу, а также сенсибилизирующего действия проводили в соответствии с Методическими указаниями [91, 139]. Исходя из поставленных в работе задач, основным путем поступления вредных веществ в организм был ингаляционный. Затравку животных проводили в затравочных камерах объемом 200 и 800 л при динамическом режиме подачи вещества. С целью получения массива данных для научного обобщения

45 совместно с сотрудниками лаборатории токсикологии ГУ НИИ МТ РАМН Карпухиной Е.А., Каютиной C.B. и др. проведены токсикологические исследования химических соединений, которые различались по характеру действия на организм. Среди них были как модельные вещества (толуол, стирол, хлорбензол, дихромат натрия, сероуглерод, хлористый метилен и др.), так и химические соединения, внедряемые в производство (бутоксибутенин, 4-бром-о-ксилол, о-бромтолуол, фентален, морфолинборан, олеиновая кислота, 2,6-диизопропилфенилизоцианат, изобутиловый эфир 3,5-диамино-4-хлорбензойной кислоты, аллетрин, изобутилбензол, 1-метил-2-меркаптоимидазол, 2,6-дихлоранилин, барбитуровая кислота и др.).

Использовались животные разных видов - мыши весом 20-30 г, крысы весом 220-320 г, морские свинки - 420-650 г и кролики весом 25004000г. Статистические группы состояли из 6-10 особей (в зависимости от вида эксперимента). Всего в опытах по исследованию токсичности и характера действия на организм было использовано 6000 мышей, 35000 крыс, 450 морских свинок и 350 кроликов. Животных получали из Центрального питомника РАМН. Содержание и питание всех животных соответствовало требованиям [76].

Определение минимально действующей концентрации при однократном ингаляционном воздействии (Limac) осуществляли динамическом способе подачи вещества в различных камерах в зависимости от агрегатного состояния исследуемых продуктов. Затравки твердыми веществами проводили в специальных затравочных камерах для крыс с выносными домиками, чтобы исключить поступление вещества в организм животных иными путями, кроме ингаляции. Затравки осуществлялись аэрозолем дезинтеграции (пылью) при динамическом способе подачи в камеру с помощью распылителя Ю.Г.Широкова [137]. Перед внесением в дозатор вещество растиралось в ступке для повышения дисперсности аэрозоля. Затравка жидкими продуктами проводилась в камерах объемом 100, 200 или 800л при принудительной динамической подаче вещества.

На протяжении 4-часовой затравки пробы воздуха отбирали 4-6 раз для расчета средне-взвешенных концентраций. Содержание химических веществ в воздухе затравочных камер определяли методом газо-жидкостной хроматографии с применением пламенно-ионизационного детектора и спектрофотометрии (сероуглерод, дихромат натрия). Методы разработаны и воспроизведены научными сотрудниками НИИ медицины труда РАМН Е.М.Малининой и С.М.Поповой.

Интегральным биомаркерами эффекта служили масса тела и поведение животных. Поведение животных оценивали методом «открытого поля», учитывая горизонтальный и вертикальный двигательный компоненты, а также «норковый рефлекс» [9]. С этой целью применялся также тест «темная камера - светлые отверстия» (ТКСО), учитывающий ориентировочную реакцию крыс и латентный период ее развития. Поведенческие реакции можно отнести и к методам, характеризующим состояние центральной нервной системы (в частности, коры головного мозга).

Способность нервной системы к суммации подпороговых импульсов (СПП) оценивали по методу Сперанского C.B. [89, 121].

Функциональное состояние органов дыхания оценивали по частоте дыхания методом бесконтактной пневмографии [144] и по клеточной реакции в смывах с верхних дыхательных путей и легких [58].

Система крови оценивалась по анализу периферической крови, который включал в себя подсчет лейкоцитов в камере Горяева [104], эритроцитов и определение количества гемоглобина на фотоэлектроколориметре по методу [32]. На низких уровнях воздействия изучался морфологический состав белой крови. По окончании эксперимента у животных также определяли массу и коэффициент (относительную массу) селезенки.

Функциональное состояние печени оценивали по ряду биомаркеров. Белково-образовательную функцию характеризовало содержание общего белка и альбуминов в сыворотке крови. Установлено, что все альбумины и значительная часть аь а2 и р-глобулинов синтезируется в печени. Воздействие гепатотропных веществ приводит к гипопротеинемии, обусловленной в основном гипоальбуминемией и гипофибриногенемией. Степень выраженности гипопротеинемии является показателем тяжести протекающего в печени процесса [137].

О повреждении печеночных клеток (гепатоцитов) судили по активности в сыворотке крови ферментов - алапипамииотрансферазы (AJIT) и аспартатаминотрансфераш (ACT), лактатдегидрогепазы (ЛДГ), у-глутамилтранспептидазы (ГГТ) и фруюпозо-1-фосфатальдолазы [96, 123].

Трансаминазы присутствуют в цитоплазме клеток печени, мышц и других тканей, а аспарагиновая трансаминаза - еще и в митохондриях, выполняя определенную внутриклеточную функцию - перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. В плазме крови всегда присутствуют трансаминазы. Однако, при повышенной проницаемости клеточных мембран в результате воспаления или некротического процесса выход их в кровь увеличивается. Первыми выходят ферменты, содержащиеся в цитоплазме. При более глубоком повреждении, при разрушении клеток вплоть до некроза, выходят ферменты, прочно связанные с различными внутриклеточными структурами.

Несмотря на то, что аланиновая трансаминаза содержится в клетках разных тканей, все же большая ее часть - «печеночного» происхождения. Трансаминазы, хотя и не являются в полном смысле слова органо-специфическими для печени ферментами, однако, их определение с успехом используется для диагностики выраженных поражений печени. Как известно, повышение активности АЛТ наблюдается преимущественно при поражении печени, активности ACT - при поражении сердечной мышцы, а также печени. Отношение величины активности ACT к АЛТ (коэффициент де Ритиса) при заболевании печени обычно ниже единицы [105, 148]. у-глутамилтранспептидаза (у-глутамилтрансфераза, ГГТ) катализирует перенос глутаминовой кислоты с глутатиона и других у-глутамилпептидов на соответствующие акцепторы или Ь-аминокислоты, находится в мембранах и цитоплазме клеток, относится к индикаторным ферментам. Повышение активности ГГТ наблюдается при остром и хроническом гепатитах, при циррозе печени. По данным некоторых авторов [105] - это самый чувствительный печеночный тест.

Лаюпатдегидрогепаза (ЛДГ) — гликолитический фермент, катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты в молочную, имеет 5 изоформ, органонеспецифичен. В клинической практике повышение активности этого фермента в сыворотке крови находят при повреждениях миокарда, ткани печени, мышечной дистрофии, заболеваниях крови [105].

Известно, что при жировых дистрофиях печени, вызванных, в том числе и действием химических веществ, наблюдается повышение уровня холестерина, уменьшение его этерифицированной формы, повышение содержания триглицеридов в сыворотке. Последнее свидетельствует о подавлении механизмов утилизации жиров из крови и является важным показателем при жировой инфильтрации печени, кроме того, также изменяются соотношения отдельных фракций лнпопротеидов [104]. Поэтому, в эксперименте определяли содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови подопытных и контрольных животных.

Креатинфосфокиназа (КФК), кретинкиназа, АТФ: креатин Ы-фосфотрансфераза ускоряет обратимый перенос фосфатной группы с аденозинтрифосфорной кислоты на креатинин. КФК очень легко инактивируется вследствие окисления входящих в ее состав 8Н-групп, поэтому определение рекомендуют вести в присутствии реактиватора-тиолового соединения, способного восстанавливать сульфгидрильные группы, например, N-ацетилцистеина, а также ЭДТА-комплексообразователя, связывающего тяжелые металлы [105, 140].

Более 90% всех растворимых низкомолекулярных углеводов крови приходится на глюкозу. Она распределяется по всем органам и тканям и участвует во многих биохимических реакциях и циклах в организме, связывая белковый, липидный и углеводный обмены. Изменение показателя имеет место при заболеваниях печени, гормональных нарушениях различного генеза [56].

Содержание вышеперечисленных биохимических показателей, а также уровень креатинина в сыворотке крови определяли на биохимическом анализаторе «Кейсис» (Германия) и «Abbott VH System» (США).

В конце эксперимента у животных измеряли абсолютную и относительную массу (коэффициент массы) печени.

Для исследования состояния ашпиокислительной защиты и метаболизма вещества определяли количество SH-групп (общих, небелковых, белковых и латентных), малонового диальдегида (МДА), церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови и восстановленного глутатиона (Г-SH) в гомогенате печени [206].

Содержание SH-групп (общих, белковых, небелковых и латентных) в сыворотке крови определяли фотометрически количественным ультрамикрометодом по В.Ф.Фоломееву [147]. Известно, что 90% небелковых SH-групп составляет восстановленный глутатион, который является биоантиокислителем [6, 8, 310].

Определение одного из конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) - проводилось в сыворотке крови. В основу этого метода положено определение концентрации окрашенного триметилового комплекса, образовавшегося в результате реакции МДА с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты в кислой среде при температуре 90-100 °С с максимумом поглощения при длине волны 532-535 нм [20, 57].

Церулоплазмин - медь-содержащий а2 -глобулин (купропротеид), Мм 150 ООО; составляет 0,3% от суммарного белка в плазме, относится к медьсодержащим оксидазам. Его функция - поддержание уровня меди в тканях, энзим обладает ферроксидазной и полиаминоксидазной активностью, способен к прямому восстановлению кислородного радикала, образующегося при биотрансформации различных субстратов, или молекулярного кислорода до воды [140].

Состояние микросомальной системы окисления в печени оценивали по содержанию цитохрома Р-450 (Цх Р-450) в микросомальной фракции печени, полученной по методу Cinci [190]. Содержание цитохрома Р-450 определяли по СО-дифференциальному спектру [293] на спектрофотометре Спекорд UV VIS. Содержание белка в микросомах определяли по методу Лоури [268].

Количество восстановленного глютатиона в гомогенате печени определяли в экстрактах трихлоруксусной кислоты по реакции с реактивом Элмана [324]. :

Известно, что барбитураты индуцируют несколько изоформ Цх Р-450: 2В1 и 2В2, 2С, ЗА1 и ЗА2 [341]. В связи с этим, согласно литературным данным, продолжительность гексеналового сна (ПГС), широко используемая в токсикологии [306] может характеризовать не только скорость окисления самого гексенала в монооксигеназной системе печени, но и скорость N-деметилирования аминопирина и этилморфина, а также О-деэтилирования 7-пентоксирезоруфина [305, 341]. Поскольку снотворный эффект гексенала обусловлен воздействием целой молекулы на клетки ЦНС, то увеличение ПГС - означает замедление окисления гексенала и, следовательно снижение активности микросомальной системы. Принято считать, что уменьшение времени сна говорит об индукции Цх Р-450, а увеличение ПГС - об ингибировании. В специальных экспериментах по изучению возможности использования фоновых величин ПГС в качестве индивидуальных контрольных величин для сравнения с таковыми после воздействия ядов учитывалось, что время полного выведения гексенала из организма крыс составляет 6 дней [179].

ПГС определяли после внутрибрюшинного введения крысам гексенала в дозе 90 мг/кг. 10% раствор гексенала готовили ex tempore с использованием изотонического раствора NaCl комнатной температуры. После засыпания животных укладывали на спину в специальную камеру, где поддерживалась температура +18+21 °С. У каждой особи фиксировали время засыпания (период времени от введения гексенала до момента потери "righting reflex", т.е. рефлекса сохранения правильного положения тела на четырех лапах) и собственно ПГС (период времени между моментом потери и восстановления "righting reflex") [306]. Результат выражали в минутах и десятых долях секунды.

Скорости гидроксилироваиия тишина, этилморфина и бепзфетамина определяли спектрофотометрическим методом [230, 232, 288].

Для характеристики состояния функции почек использовали рекомендованный Шумской Н.И. и Карамзиной Н.М. [152] набор методов, включающий определение диуреза, содержания белка и хлоридов в моче, содержание креатинина и мочевины в сыворотке крови и моче.

Количество выделенной мочи {диурез) определяется в большинстве случаев не скоростью клубочковой фильтрации, а канальцевой реабсорбцией воды. Диурез у крыс определяли после воздействия яда: после водной нагрузки (3% от веса тела) животных помещали на 18-20 час. в индивидуальные обменные клетки.

Протеинурия - характерный признак почечной патологии, связанной с повреждением как клубочкового, так и канальцевого аппарата нефрона. Считают, что большое содержание белка в моче свойственно нефротическим состояниям с преимущественным поражением канальцев. В эксперименте был использован унифицированный метод количественного определения белка в моче с сульфосалициловой кислотой [104].

При снижении скорости клубочковой фильтрации и увеличении интенсивности реабсорбции хлоридов в канальцах (хронический нефрит, нефроз) наблюдается гипохлорурия. Увеличение содержания хлоридов в моче характерно для некоторых видов повреждений почечных канальцев, сопровождающихся недостаточной реабсорбцией из клубочкового фильтрата, когда имеет место, наряду с потерей воды, усиленное выделение из организма электролитов. В эксперименте определение хлоридов в моче проводили методом с использованием набора химических реактивов фирмы Lachema (Чехия).

При тяжелом поражении почек наблюдается гипокреатинурия, резкое уменьшение в моче остаточного азота и мочевины, при этом значительно увеличивается содержание тех же веществ в крови. В начальном периоде почечной недостаточности в крови увеличивается количество мочевой кислоты, затем - мочевины и в конце - креатинина. Нарушение выделения креатишиш почками наблюдается лишь в далеко зашедших патологических процессах [152]. Вместе с тем «нормальное количество мочевины в крови не исключает серьезных повреждений функции почек. Этот тест может быть принят только как вспомогательный при общем анализе функционального состояния почек наряду с другими методами исследования [39].

В эксперименте для определения содержания мочевины в моче животных использовали набор химических реактивов «Био-тест». Креатинин в моче определяли по методу Поппера [60]. В конце эксперимента у животных определяли абсолютную и относительную (коэффициент массы) массу почек.

Для исследования роли специфических и интегральных биомаркеров эффекта при оценке риска профессионального воздействия вредных веществ lía работающих был создан банк данных по специально разработанному профилю, в который включены собственные и литературные сведения о более 600 химических соединениях различного характера действия, включая 127 веществ раздражающего действия.

Для каждого соединения база данных заполнялась по следующим параметрам:

1. Название по IUPAC, № по CAS, № по RTECS, Синонимы;

2. Молекулярная масса, Брутто формула, Фактор конверсии (ррт-мг/мЗ);

3. № по ГН 2.2.5.1313-03, ГН 2.2.5.1314-03, или их дополнениям;

4. ПДКр.з. максимальная разовая и среднесменная;

5. Пометки о направленности действия согласно ГН;

6. Величины безопасных уровней воздействия, принятые в США:

7. (TLV/TWA, STEL, Ceiling (OSHA, NIOSH, AGHICH);

Параметры токсикометрии:

8. CL50 - концентрация, вызывающая гибель 50% животных в течение 2 недель наблюдения после 2 час. (для мышей) или 4 час. (для крыс) ингаляции вещества;

9. Lim ас — порог острого интегрального действия - минимальная концентрация в-ва, вызывающая после однократного воздействия изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных реакций, или скрытую (временно компенсированную) патологию;

10.Lim ir кс - порог раздражающего острого действия для крыс -минимальная концентрация вещества, вызывающая у крыс эффект раздражения после 4-час. ингаляции;

1 l.Z Sp - зона специфического (избирательного) раздражающего действия (=Limac/LimirKC);

12.Lim ¡г чел — порог раздражающего острого действия для человека -минимальная концентрация вещества, вызывающая субъективные ощущения раздражения у человека при 1-мин. экспозиции;

13.1лт сь - порог хронического действия - минимальная концентрация вещества, вызывающая у животных в течение и после хронического воздействия изменения, выходящие за пределы физиологических приспособительных реакций, или скрытую (временно компенсированную) патологию;

14.Производные параметров токсикометрии и гигиенических стандартов.

В качестве примера в таблице 2.1 приведены данные по изоамиловому спирту.