Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Кальпротектин в норме, при болезнях крови и гранулематозах легких

го од

- 8 ОПТ «36

На правах рукописи

ИВАНОВ ГЛЕБ ЕВГЕНЬЕВИЧ

КАЛЫ1РОТЕКТИН В НОРМЕ,

ПРИ БОЛЕЗНЯХ КРОВИ И ГРАНУЛЕМАТОЗАХ ЛЕГКИХ

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 1996

На правах рукописи

ИВАНОВ Глеб Евгеньевич

КАЛЬИРОТЕКТИН В НОРМЕ, ПРИ БОЛЕЗНЯХ КРОВИ И ГРАНУЛЕМАТОЗАХ ЛЕГКИХ

14.00.29 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург -1996

Работа выполнена в НИИ гематологии и переливания крови МЗ Республики Беларусь

Научные руководители: кандидат биологических наук A.B. Панютич, кандидат биологических наук Н.И. Мисуно

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Абдулкадыров I доктор биологических наук Кокряков В.Н.

Ведущая организация - Медицинская академия последипломного образования Санкт-Петербурга МЗ РФ

Защита состоится .. 1996 года в . ¿Г .часов на заседании

диссертационного совета Д 084.19.07 Санкт-Петербургского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии МЗ РФ

С диссертацией можно ознаком1ГТЬся в библиотеке Санкт-Петербургского НИ1 гематологии и трансфузиологии МЗ РФ, 193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16.

Автореферат разослан

1996 года

Учёный секретарь диссертационного совета

Быков B.C.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Кальпротектин (КП) представляет собой белковым комплекс, содержащийся в большом количестве (до 5% общего внутриклеточного белка) в цитоплазме нейтрофилов, активированных макрофагов, и, в меньшей степени, моноцитов. В состав КП входят две субъединицы: MRP8 и MRP14, с молекулярной массой 10,8 и 13,2 кДа, соответственно (Odink et al., 1987). Биологическая роль КП окончательно не выяснена, хотя имеются данные о его антимикробной, кальцийсвязывающей и регуляторной активности. Согласно накопленным к настоящему времени сведениям, КП играет важную роль в процессах инфекционного и неинфекционного воспаления у человека (Hessian et al., 1993, Bhardwaj et al., 1992). Показана его высокая бактериостатическая и бактерицидная активность в отношении ряда патогенных микробов и грибков (Steinbakk et al., 1990, Sohiile, Collins-Lech, 1990). Получены данные о повышении уровня КП в плазме кровн при некоторых инфекциях, злокачественных опухолях, коллагеноэах, муковисцидозе (Duiilop et al., 1991, Bemtzen et al., 1991). По-видимому, данный белок имеет существенное значение для роста и дифференцировки клеток крови (Murao et а!., 1990). Вместе с тем, в представлениях о КП остаётся много неясных вопросов касающихся механизмов его синтеза, закономерностей экспрессии и экскреции клетками, участия в иммунорегуляторных процессах при различных патологических состояниях человека. До настоящего момента отсутствуют данные о содержании КП в клетках и плазме при патологиях, непосредственно затрагивающих нейтрофильный ряд лейкоцитов и моноцитарно-макрофагальную систему (инфекционные и неинфекционные гранулематозы).

Предполагается, что определение содержания КП в клетках и в плазме крови может служить критерием, характеризующим качественное и количественное состояние миелоидного ряда при гематологических заболеваниях, являться ранннм маркером изменений в составе гранулоцитарного пула при развитии осложнений химиотерапии, а также при обострениях и наступлении ремиссии.

КП, как белок содержащийся в активированных макрофагах, может быть маркером функционального состояния макрофагальной системы, играющей важную роль в патогенезе гранулематозов лёгких инфекционной и неинфекцнонной природы.

Работа выполнялась в рамках исследований, проводимых согласно темы НИР "Разработать современные биотехнологические подходы для исследования медиаторов иммунитета и кроветворения в эксперименте и клинике" (1991 -1495 г.г. N юс. регистрации 01.9.10018156); гра»та Белорусского Фонда Сороса

"КальпротектиН как новый диагностический маркер для оценки нарушений макрофагально-гранулоцитарной системы человека при патологии (N В95-9-1100-6) и Соглашении о сотрудничестве между Комплексным центром исследования рака Калифорнийского Университета (Лос-Анжелес, США) и НИИ гематологии и переливания крови МЗ РБ.

Мель цсследования

Целью работы являлось исследование закономерностей экспрессии КП в клетках миеломоноцитарного ряда и его содержания в плазме в норме- и' при патологии и изучение возможности использования количественного определения КП в плазме крови в качестве диагностического и дифференциально-диагностического критерия при заболеваниях крови и гранулематозах лёгких.. Задачи работы

1. Получить гибрНдомы, продуцирующие моноклональные антитела (МкАТ) к КП. ...

2. Разработать на основе МкАТ метод иммуноферментного анализа (ИФА) для количественного определения КП в культуральных супернатангах. и биологических жидкостях.

3. Исследовать содержание КП в плазме у здоровых лиц (доноров крови) и пациентов с заболеваниями крови и некоторыми гранулематозами легких.

4. Разработать метод иммуноцитохимического выявления КП с помощью МкАТ.

5. Исследовать экспрессию КП в клетках миелоидного ряда и в моноцитах периферической крови человека.

6. Оценить значение количественного и качественного определения КП для диагностики, дифференциальной диагностики и прогноза при гематологических заболеваниях и гранулематозах легких.

Научная новизна работы

Получена панель МкАТ к цитоплазматическому белку нейтрофильных гранулоцитоа (НГ) и моноцитов/макрофагов - кальпротектину, реагирующих с мономерными и мультнмерными формами белка. На основе МкАТ разработан метод для количественного определения КП в биологических жидкостях и культуральных супернатантах - гомологичный "сэндвич" ИФА. Исследовано распределение КП в лейкоцитах человека, установлена стадия дифференцировкг клеток миелоидного рада, на которой начинается экспрессия данного белка Определено количественное содержание КП в моноцитах, исследована егс экспрессия на поверхности гранулоцитов. и моноцитов. Проанализирован; субъединичная структура кальпротектинового комплекса. Исследоваш содержание КГ1 в плазме при. ряде гематологических заболеваний, выявлень нозологии, характеризующиеся повышенным содержанием КП в плазме

установлена связь между уровнем данного белка в плазме и патогенетическими факторами гемобластозов. Исследовано содержание КП в плазме при различных формах туберкулеза и саркоидозе легких. Обосновано дифференциально-диагностическое значение определения КГ1 при данных заболеваниях.

Практическая значимость и пути реализации работы

Получены штаммы гибридом, продуцирующих МкАТ, пригодные для использования в современных методах исследований: ИФЛ, иммуноаффинной очистке белка, иммуноцитохимии, иммунофлуоресценшш, иммуноблоттинге. Созданная система иммуноферментного анализа КП пригодна для количественного определения данного белка как в культуральных супернатантах, так и в биологических жидкостях и может быть использована в лабораторной и клинической диагностике. Тест-система внедрена в НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ для дифференциальной диагностики туберкулёза л саркоидоза. Иммуноаффинное выделение КП с помощью МкАТ может быть использовано для получения высокоочищенного препарата в количестве, достаточном для исследования его свойств in vivo и in vitro. Разработанный метод определения внутриклеточного КП, позволяющий точно оценивать содержание нативного белка в 'Небольшом количестве моноцитов, может использоваться для количественной оценки антигенов в прилипающих клетках. Исследование уровня КП в плазме при заболеваниях, связанных с количественными и качественными нарушениями в макрофагально-гранулоцитарной системе, имеет важное диагностическое, дифференциально-диагностическое и прогностическое значение. Выяснение закономерностей экспрессии КП в клетках миелдидного и моноцитарного ряда позволяет глубже понять механизмы дифференцировки этих клеток, а также их роль в патогенезе ряда заболеваний. Предложенные методы являются'ценным'инструментом в изучении структуры, функций, распределения КП, а проведенные исследования вносят важный вклад в понимание биологической роли данного белка.

Апробация работы Результаты исследований были доложены на Ш съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов (Гродно, 1995), IX ' Международном конгрессе иммунологов (Сан-Франциско, 1995), VIII Конгрессе Польского общества иммунологов (Вроцлав, 1995), I Международной конференции "Иммунодиагностика, и иммунотерапия" . (Витебск, 1995), Международном симпозиуме "Актуальные проблемы пульмонологии (Минск, 1995), XXVII съезде Скандинавского общества иммунологов (Турку, 1996),. II съезде Европейской Гематологической Ассоциации (Париж, 1996).

Апробация диссертации состоялась 5 января 1996 года . на заседании Учёного Совета НИИ гематологии и переливания.крови МЗ РБ.

Публикации По теме диссертации опубликовано 16 работ, в кото] отражены основные научные результаты диссертации. Оформл рационализаторское предложение, которое внедрено в пульмонологичеа отделении НИИ пульмонологии и фтизиатрии МЗ РБ.

Объём и структура диссертации Диссертация изложена на 95 страница состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и мет< исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические рекомендаи список литературы (включает 90 источников). Работа иллюстрирована таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Для иммунизации мышей линии Balb использовали высокоочшценный препарат кальпротектина, любез! предоставленный д-ром A.Murthy и д-ром K.Miyasaki (Калифорнийсга университет, США), в смеси с адъювантом Hunter's TiterMax (HTM) (Cytl Corp., USA) или полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (Calbiochem). Титр антител против КП в сыворотке мышей определяли в прямом ИФА использованием планшетов с сорбированным на них антигеном. Гибридом] продуцирующие МкАТ против КП получали путём слияния иммуннь спленоцитов, взятых от мышей с высоким иммунным ответом к КП, и клеп мышиной миеломы P3X63-Ag8.653 (Lane et al., 1984).

Гибридные клетки культивировали в среде 1MDM (Sigma), содержащ« 10% ЭТС, 10% лошадиной сыворотки (Gibco), 2мМ L-глютамина, 0,05 мМ : меркаптоэтанола, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Д] селекции гибридом использовали ГАТ (1х10"6М гипоксантина, 1,6х10-5. тимидина, 4хЮ"7М аминоптерина) и ГТ (1хЮ"6М гипоксантина, l,6xl05i пшидина) (Sigma). Клетки отобранных позитивных клонов гибридом бьи дважды клонированы методом лимитирующих разведений. После да; клонирований 100% субклонов продуцировали МкАТ определение специфичности.

Для получения асцитов клетки гибридом вводили внутрибрюшит мышам Balb/C (5x10е клеток/мышь), предварительно получившим инъекци пристана (Sigma). МкАТ из асцита выделяли методом аффиннс хроматографии на колонке с иммобилизированным протеином A St. aurei Cowan I (BioRad), как описано Келером (1983). Изотопы полученных Мю4 определяли с помощью набора Hybridoma Sub-isotyping Kit, Мои (Calbiochem). Эпитопную специфичность МкАТ оценивали в конкурентне ИФА с мечеными и немечеными биотином антителами. Констат аффинности МкАТ определяли по методу Beatty et al., (1986).

Для количественного определения КП методом ИФА проводили ¡орбцию MkAT'FH в течение ночи при +4° С. Исследуемые образцы, вторые штитела (биотинилированные мкАт F11) и авидин-пероксидазу разводили в 1>БР-Т с 1%' БСА или 1% желатина (BioRad). 'В качестве субстрата тспользовали 0,6 мг/мл" о-фенилендиамина и 0,001% Н202 в 20 мМ нитратном 5уфере, рН 4,7, Стандартом служил КП, очищенный методом шмуноаффинной сорбции на колонке с иммобилизированными на CNBr-псгивированной сефарозе (Sigma) МкАТ F11.

Кровь здоровых лиц и больных заготавливали на антикоагулянте (5мМ ЭДТА), центрифугировали. Плазму отбирали, разделяли на аликвоты и «ранили при -70° С.

Для выделения гранулоцитов свежую донорскую кровь с ЭДТА (5 мМ) инкубировали с 6% раствором декстрана 500 000, затем лейкоцитарную взвесь разделяли на одноступенчатом градиенте фиколл-верографина. Осадок, состоящий преимущественно из гранулоцитрв, отмывали ФБР. Примесь эритроцитов устраняли инкубацией с 0,15 M хлоридом аммония.

Для приготовления лизатов НГ, полученные из периферической крови, инкубировали 30 мин на льду в лизирующем буфере, содержащем 1% NP-40, 50 мМ Трис, 0,15 M NaCl и ингибитор протеаз (1 мМ фенилметилсульфонилфлюорид), центрифугировали.

Электрофорез в 15% полиакриламидном геле в присутств!ш додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) проводили как описано Laemmli (1970), с последующим электропереносом разделенных компонентов на нитроцеллюлозную мембрану (НЦ). НЦ инкубировали с МкАТ к КП, затем добавляли антимышиные антитела, меченые пероксидазой, после инкубации с которыми реакцию проявляли в растворе субстрата, содержащем 0,6 мг/мл диаминобензидина (ДАБ) и 0,001% Н202.

Цитослайды для иммуноцитохимических исследований готовили с помощью цитоцентрифуги, фиксировали 3 мин в ФБР, содержащем 1% глютаральдегида (Serva) и 3% формальдегида (Fluka). Для выявления КП использовали метод непрямого иммуноцитохимического окрашивания с МкАТ F3 (10 мкг/мл) в качестве первых антител, пероксидазной либо фосфатазной меткой и субстратами ДАБ либо нитросиним тетразолием/5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфатом (Sigma), соответственно.

Определение КП на поверхности лейкоцитов человека проводилось методом непрямой иммунофлуоресценции на проточном цитофлуориметре FACScail (Beckton Dickinson).

Для количественного определения внутриклеточного КП в моноцитах мононуклеары периферической крови, выделенные, как описано Boyum (1968), суспендировали в среде 1MDM, содержащей 10% ЭТС. После инкубации в

(ечение 1 часа при 37° С неприлипшие клетки устраняли, моноциты заливали свежей питательной средой и культивировали до 7 сугок. По окончании времени культивирования из лунок отбирали супернатанты, клетки отмывали теплой средой и быстро высушивали.

Непрямую иммунохнмическую окраску моноцитов с помощью МкАТ к KI1, козьих антител против иммуноглобулинов мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена и субстрата о-фенилендпамина проводили после фиксации клеток и ' ингибирования эндогенной пероксидазы. Параллельно с иммунохимическон окраской клеток проводили ИФА со стандартизованным КП, сорбированным в лунках пластиковых плат. Количество клеток в лунках определяли окрашиванием 0,5% раствором генцианвиолета и измерением оптической плотности при длине' волны 560 нм. Определив количество КП в лунке на основе результатов иммунохимическон окраски клеток и тестирования стандарта, рассчитывали количественное содержание КП в моноцитах.

С помощью созданного количественного ИФА исследовали образц плазмы 23 доноров крови, а также определяли уровень КГ1 в плазме f пациентов (ематологическото отделения 9-ой городской клинической больниц г.Минска со следующими диагнозами: миеломная болезнь (МБ), хронически миелолейкоз (XMJ1), острый миелобластный лейкоз (OM6J1, Ml и М2, FAI классификация), острый промиелоцитарный лейкоз (ОПрЛ, МЗ), хронически лимфолейкоз (ХЛЛ), эритремия (Эр), идиопатическая тромбоцитопеническ; пурпура (ИТГ1), миелодиспластический синдром (рефрактерная анемия) (МДС острый лимфолейкоз (ОЛЛ). Концентрацию КП в плазме крови определяли у -больных туберкулезом лёгких (очаговый, инфильтративны! диссеминированный, фиброзно-кавернозный, цирротический, туберкулома) и I больных саркоидозом (внутрнгрудных лимфоузлов, внугригрудных лимфоузле и легких, легких) с преимущественно впервые выявленными формам заболевания, поступивших в клинику НИИ пульмонологии и фтизиатрии M РБ.

Для статистической обработки данных использовали программу Excel v. 5.0 (Microsoft Corporation, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение МкАТ к КП

Для исследования содержания КП в клетках, биологических жидкости кулыуральных супернатантах . были получены МкАТ к КП. В наци исследовании при иммунизации мышей высокоочишенным препаратом КП, N

[спользовали HTM, наряду с ПАФ, для сравнения иммунного .ответа при рименении этих адыовантов и эффективности образования гибридом. Было ровелено два независимых слияния спленоиитов (слияние №1 (мышь, ммунизированная с помощью ПАФ) и слияние №2 (мышь, иммунизированная помощью HTM)) с клетками мышиной несекретирующей миеломы X63-Ag8-53 в условиях, описанных Lane et al. (1984). В результате слияния №1 было олучено 34 гибридомных клона, что составило 0,27 гибридом на 1х106 взятых ля слияния сплсношггов. В результате слияния №2 бьио обнаружено 246 лонов гибридом, что составило 2,05 гибридом на 1х106 спленоцитов. Из естированных клонов, полученных после слияния №1, лишь одш! родуцировал МкАТ к КП. В результате слияния спленоцитов мыши, ммушпированной с использованием адьюванта HTM, было обнаружено 152 лона, продуцирующих МкАТ к КП, из которых наиболее быстрорастущие и ысокопродуиирующие были отобраны для дальнейшего двойного лонирования. Таким образом, первый опыт использования адьюванта Hunter's ïterMax для иммунизации животных с целью получения мышиных гибридом видетельствует об эффективности применения этого адьюванта при ммуннзашш ценными антигенами.

Для дальнейшей работы было отобрано 3 клона гибридом, родунируюших МкАТ к КП: F11 (Кафф 1,3x10' М-л-!), F3 и А1(Кафф 8,3х107 1л1). Была определена детерминантная специфичность полученных МкАг етодом конкурентного ИФА.

Антитела F11 не конкурировали с мечеными F3 и AI. МкАТ AI еагировали с КП в присутствий меченых F3 полностью аналогично немеченым '3, то есть ингибировали связывание биотинилированных F3 на 90% п онцентрации 20 мкг/мл. МкАТ F3 и AI лишь частично препятствовали заимодействию меченых Fl 1 с антигеном.

Таким образом, очевидно, что антитеда AI и F3 узнают либо идентичные, ибо близкорасположенные антигенные детерминанты, отличные от эпитоиа вязывания МкАТ Fl 1. Для того, чтобы определить характер 'связывания олученных МкАТ с КП и его компонентами, был проведен ДСН-ПАГЭ в ередуцирующих условиях препарата КП,' который содержал гомо- и :теродимерные формы белка, а также несвязанные MRP8 и MRP14, с оследующим иммуноблоттингом. Эксперименты показали, что МкАТ F1I знают в равной степени как отдельные субьединицы (MRP& и MRP14), так и се виды димерных комплексов (гетеродимер MRP8/MRP14, гомодимсры IRP8/MRP8 и MRP14/MRP14). МкАТ F3 в той же концентрации реагировали с 1П аналогичным образом, однако эти антитела гораздо слабее'реапгровали с 1RP8 и с гомодимером, состоящим из этих субъедшищ. Полученные результаты озволянгг предположить, что эпитопы, распознаваемые FU, не изменяются при

£

формировании комплекса КП и представляют собой некую схожук последовательность в молекулах обеих субьединиц. Наиболее вероятно{ антигенной детерминантой представляется общая для МЯР8 и МЯРЬ последовательность из четырёх аминокислот (ОсНпк е1 а!., 1987).

Создание ИФА для количественного определения КП

На основе полученных МкАТ нами был разработан ИФА дш количественного определения КП в плазме и культуральных сулернатантах. I качестве дизайна для ИФА была избрана широко используемая в настоящее время для измерения концентрации биологически активных белков (цитокино! и др.) модель "сэндвич"- ИФА. По данным Teigelkamp е1 а1. (1991), пр! концентрации ионов кальция, адекватной их концентрации в плазме крови МЯР8 и М11Р14 образуют нековалентно связанные димерные и более крупны комплексы. Таким образом, теоретически оправданным является использовани и в верхнем, и в нижнем слоях "сэндвича" МкАТ, реагирующих с обеим! субьединицами КП.

В процессе создания ИФА были испытаны различные комбинации ] различные разведения нижних и верхних, биотинилированных, антител: РЗ/РЗЬ РЗ/Р11Ь, А1/Р11Ь, А1/РЗЬ, РИ/ИНЬ, П1/РЗЬ. Варианты оценивались и следующим критериям: оптимальные пределы чувствительности анализа линейность калибровочной кривой, минимальный расход реагентов, отсутстви фона. В качестве стандарта был использован препарат КП, выделенный методо1 иммуноаффинной хроматографии, содержащий только димерные формы белк: Наиболее соответствующей вышеописанным критериям оказалась комбинаци Р11/Р11Ь, которая в дальнейшем использовалась для количественног определения КП в биологических жидкостях. Чувствительность данного ИФ, составила 1,5 нг/мл. Коэффициенты вариации анализа находились в предела 0,95-9.3% (Рис. 1).

Коэффициенты вариации при исследовании одного и того же образи плазмы в трёх анализах, проведенных в разные дни, составили 4,6; 8,4 и 8,7$ При определении с помощью данного ИФА концентрации КП в донорско плазме область, в которой сохранялась линейность разведений образцо! находилась в пределах 10-70 нг/мл.

Теще1кашр и соавт. (1991) показали, что образование комплексов К] зависит от концентрации ионов кальция в среде. В то же время Fagerhol и д| (1980) представили - результаты о том, что заготовка крови именно использованием ЭДТА эффективно предотвращает высвобождение КП I клеток. При исследовании образцов плазмы, заготовленной на гепарине

ЭДТА, нами показано, что присутствие ЭДТА не влияет на результат определения концентрации КП с помощью созданного ИФА.

Рис. 6. Калибровочная кривая количественного ИФА для определения KIT (•). Коэффициенты вариации (♦) для каждого разведения рассчитаны из шести измерений.

Экспрессия кальпротектина в клетках миелоидного ряда

На основе МкАТ против КП нами разработан метод непрямого иммуноцитохимического определения данного белка. С помощью иммуноцитохимического окрашивания показано, что цитоплазма всех форм полиморфноядерных НГ, обнаруживаемых в лейкоконцентратах периферической крови доноров (палочкоядерные и сегментоядерные), содержат КП. В отличие от нейтрофилов, эозинофильные гранулоциты, лимфоциты к тромбоциты не содержали КП, что совпадает с данными других авторов (Hessian et al., 1993).

В качестве модели для определения начала экспрессии КГ1 в цитоплазме НГ были выбраны различные формы миелоидных лейкозов, при которых основным субстратом опухоли являются мнелоидные клетки на тех или иных

стадиях созревания. В миелобластах, обнаруживаемых в периферической кро! больных ОМ1П (Ml и М2), указанным методом КП не выявлен. П[ исследовании циюслайдов крови пациентов с ОПрЛ (МЗ), нами установлен что на данной стадии созревания клетки также являются КП-негативньши. цитоплазме миелоцитов и метамиелошггов больных ОПрЛ и'ХМЛ определял! КП, хотя окрашивание шпошшзмы было менее интенсивным по сравнению более зрелыми формами НГ. Таким образом, результаты наших исследоваш показывают,' что миелоциг является наиболее ранней клеткой в миелощнк ряду, в которой обнаруживается кальпротектин.

Содержание кальпротектина в моноцитах

При исследовании циюслайдов лейкоцитов периферической Kpoi человека методами иммуношпохимии цитоплазма моноцитов окрашивала гораздо менее пшенсивио, чем цитоплазма нейтрофилов. Процент К1 положшельиых моноцитов значительно варьировал в образцах, взятых разных доноров, что совпадает с данными Wilkinson et al. (1988) и Zwadlo et (1988): Fageihol и соавт. (1990) описали значительное повышение уровня КП моноцитарных суиернагаитах при стимуляции клеток форболовым эфиро ионофором А 23187, иммунными комплексами, эндотоксином, однако до с пор не было окончательно установлено, чем обусловлено возрастай количества КП в среде: активной секрецией этого белка либо выделением части разрушенных клеток. Одним из возможных способов доказательст факта секреции является подсчёт и сравнение количества КП, содержащего непосредственно в моноцитах и в супернаганте при их культивировании. Д этого нами разработан метод количественного определения КП в моноцит методом иммуноцитохимической окраски прилипших моноцитов в лунк; Было выявлено, что в моноцитах, выделенных из периферической кро здоровою донора, содержится около 80 фг КП на клетку (74,1 ± 7,9). процессе культивирования моноцитов на пластике количество KI1 в клет возрастало приблизительно в два раза в течение 3 суток, затем до 7-х суг сохранялось на достигнутом уровне (150,0 ± 7,9 фг/клетку). Таким образе для моноцитов/макрофагов характерно более низкое содержание - КП сравнению с НГ. В супернатантах моноцитарных культур через 1 сут определялось 445 ± 23 нг/мл (445 ± 23 фг/клетку) КП, через 7 суток - 705 ± нг/мл (705 ±35 фг/клетку) данного белка.

Полученные данные о превышении количества внеклеточного белка г внутриклеточным в процессе культивирования моноцитов свидетельствуют пользу акшвной секреции КП, происходящей, возможно, наряду с t высвобождением из разрушенных клеток. Увеличение количества КП в клет»

в процессе культивирования на пластике, вероятно, индуцируется в процессе адгезии и протекает на фоне дифференцировки моноцитов в макрофаги, которая происходит в течение 3-7 суток in vitro (Davies, Lloyd, 1989).

Экспрессия КП на поверхности клеток

С помощью МкАТ F3 и F11 мы исследовали экспрессию КП на поверхности гранулоцитов и моноцитов методом проточной цитофлуориметрии. МкАТ F3 и F11 в одинаковой степени реагировали с антигеном на поверхности 6,5 ± 2,4% гранулоцитов и 9,7 ± 3,6% моноцитов периферической крови здоровых доноров. При исследовании экспрессии КП на поверхности гранулоцитов и моноцитов больных XMJ1 не выявлено достоверных различий по сравнению со здоровыми донорами. Исследование экспрессии КП на моноцитах, культивированных в пластиковых чашках Петри показало, что количество КП+ моноцитов возрастает уже после первого часа инкубации и достигает максимума (83,8 ± 5,6%) через 3 часа.

Zwadlo et al. (1986) культивировали моноциты в тефлоновых мешках, т.е. в условиях, препятствующих адгезии клеток. По их данным, количество моноцитов, экспрессирующих КП на поверхности, возрастало на вторые сутки инкубации й достигало максимума (45%) к третьему дню культивирования. Таким образом, при инкубации моноцитов в адгезивных условиях наблюдается более раннее увеличение субпопуляции КП-положительных моноцитов. Учитывая вышесказанное, мы предполагаем, что экспрессия KI1 на поверхности моноцитов связана с их адгезией.

Содержание кальпротектина в плазме в норме и при некоторых гематологических заболеваниях

С помощью разработанного ИФА определяли концентрацию КП в плазме здоровых доноров. Содержание данного белка варьировало ог 52 нг/мл до 470 нг/мл. Среднее значение составило 167 ± 114 нг/мл.

Среди исследованных групп гематологических больных повышенная концентрация КП в плазме обнаружена при XMJ1 (435 - 13 280 нг/мл, Р«0,01)^ XJIJI (50 - 7 570 нг/мл, Р<0,05), Эр (450 - 2 790 Ht/мл, 1»<0,05) (рис. 2).

У больных XMJI наблюдалась значительная корреляция концентрации КП в плазме с количеством лейкоцитов (г=+0,82) и с количеством НГ в периферической крови (г=+0,80). Корреляция этих факторов при МБ составила г= + 0,63 и г=-10,49 соотве! ci пенно. У больных XJIJI содержание КП в

плазме коррелировало с количеством лейкоцитов (г=+0,98), но не с количеством НГ.

У пациентов с ОМ6Л, ОПрЛ, ОЛЛ, ИТП, МДС не наблюдалось повышения концентрации КП в плазме по сравнению с контрольной группой. Ни у одного из больных, даже со сниженным количеством лейкоцитов не выявлено достоверного уменьшения концентрации КП в плазме по огношению к норме.

50000

Концентрация КП в плазме, нг/мл

5000

500

50

• •

>8* :1!

• .

в

« ®

• •

о

• 8

•

•

• •

в •

Iе о в*

• • в -

в •

• •

• •

в

Дон. ОМЛ ХМЛ

МБ

ХЛЛ

Эр

ИТП

в

8

Рис. 2. Содержание КП в плазме доноров (Дон.) и гематологических больных. В группу ОМЛ (острый миелолейкоз) объединены больные М1 М2 и МЗ. .

В настоящее время предполагаются два пути поступления КГ1 в плазму Один из них - из цитоплазмы НГ после их повреждения или гибели в процесс апоптоза. На сегодняшний день нет данных, подтверждающих акгивну* секрецию КГ1 .нейтрофилами. Второй источник - моноциты, в которы содержится в 50 раз меньше КП, чем в НГ, но данный белок може секретнроваться этими клетками в значительном количестве. Исходя и разницы в содержании КП в моноцитах и зрелых НГ, а также из соотношени этих клеток в организме, можно предположить, что в норме уровень КП

плазме, в основном, формируется за счет НГ и зависит от стадии дифференнировки, на которой находится большая часть этих клеток.

Так, наши исследования показали, что при OM6JI и ОПрЛ, когда нейтрофильный пул представлен в основном миелобластами и промиелоцитами, в которых КП не экспресснруется, концентрация КП в плазме сохраняется в пределах нормы. В тоже время при ХМЛ, когда наблюдалось десятикратное и более увеличение количества лейкоцитов с преобладанием зрелых КП-позитивных нейтрофилов, отмечалось резкое увеличение количества данного белка в плазме, выеокодостоверно коррелировавшее с числом НГ. .

Вместе с тем, при исследовании лимфопролиферативньсх заболеваний -ОМЛ, ХЛЛ и МБ, когда субстратом опухоли являются КП-негативные лимфоцдные клетки, а количество. НГ в норме, или 'снижено, обнаружение высокого содержания КП в плазме больных ХЛЛ явилось неожиданным результатом. Необходимо отметить, что у подавляющего большинства пациентов с ХЛЛ на фоне инфильтрации костного мозга имела место выраженная заинтересованность ■ периферических лимфоузлов и селезенки. Ранее Brantzaeg и соавт. (1987) показали, что в ткани опухоли при неходжкинских лимфомах содержится большое количество КП-позитивных инфильтрирующих макрофагов. Можно предположить, что при ХЛЛ уровень КП в плазме формируется в большей степени за счет активации клеток макрофагального ряда. Подтверхсдением тому также является высокая корреляция между уровнем- КП и общим количеством лейкоцитов (подавляющее большинство которых при ХЛЛ составляли лимфоциты), что говорит в пользу зависимости концентрации КП' от степбнии экспансии лимфоидного клона, которая влечет за собой макрофагальную инфильтрацию, пораженных органов. При исследовании больных МБ, у которых опухолевая инфильтрация, как правило, не распространялась за пределы костного мозга, у 16 из 20 больных наблюдался нормальный уровень КП, а из 4, больных с повышенным содержанием КП в плазме,- 2 находились в терминальном состоянии.

Интересен тот факт, что при ряде гематологических заболеваний (ОМбЛ, ОПрЛ), даже при абсолютной нейтропении не было выявлено достоверного уменьшения концентрашш КП в. плазме по отношению к норме. Известно, что соотношение циркулирующих полиморфноядерных нейтрофилов и нейтрофилов, депонированных в костном мозге и тканях, составляет 1:10 -1:100 (Athens, 1965). Таким образом, рутинно производимый счет клеток периферической крови отражает только активно циркулирующую часть ^сего нейтрофильного .пула. Вероятно, у больных со сниженным количеством НГ

компенсация уровня КП в плазме происходила за счет непериферических пулов НГ. Можно предположить, что именно поэтому при ОМЛ не наблюдалось корреляции (г=+0,28) между количеством зрелых НГ периферической крови и концентрацией КП.

Полученные нами данные свидетельствуют о возможности эффективного применения количественного определения КП в плазме для оценки состояния общего (периферического и тканевого) пула НГ при миелопролиферативных заболеваниях. Так как относительное снижение КП в динамике заболевания отражает омоложение миелоидного ростка со сдвигом в сторону более незрелых КП-негативных форм, КП может быть применен для мониторинга фаз ХМЛ и для динамического наблюдения за эффективностью химиотерапии и течением ремиссии при острых миелобластных лейкозах.

На примере ХЛЛ обоснована возможность наличия второго значимого источника попадания КП в плазму крови. Зависимость концентрации КП от степени заинтересованности моноцитарно-макрофагальной системы при ХЛЛ на фоне отсутствия расширения миелоидного ростка говорит о включении механизма активного синтеза КГ1 макрофагами, находящимися в инфильтрированных опухолью тканях.

Содержание КП в плазме больных туберкулёзом лёгких и саркоидозом

Получив при исследовании гематологических больных данные, косвенно свидетельствующие в пользу того, что уровень КП в плазме может быть обусловлен активированными тканевыми макрофагами, мы исследовали уровень КП в плазме при туберкулёзе и саркоидозе - заболеваниях, протекающих с активным вовлечением макрофагов в патогенез. У больных с распространенными формами туберкулеза легких имело место существенное увеличение уровня КП в крови по сравнению со здоровыми лицами и больными с ограниченными и неактивными формами туберкулеза, а также по сравнению с больными саркоидозом (Рис. 3).

По уровню КП плазмы среди 15 больных инфильтративным туберкулезом нами выделено две группы. В одной содержание КП в плазме колебалось в пределах 150-500 нг/мл (8 человек). В другой группе содержание КГ1 превышало 1000 пг/мл и достигало уровня 8000 нг/мл (7 человек). При анализе данных клинико-рентгенологического обследования и микробиологического исследования мокроты у больных этих двух групп просматривалась четкая связь уровня КП с распространенностью процесса и бакгериовыделением.

Так, у всех больных второй группы, в отличие от первой, туберкулезный процесс сочетался с распадом и бактериовьщелением, у 3-х больных он

сопровождался обсеменением других участков легкого и у 2-х больных эндоскопически обнаружен туберкулез бронхов.

КП, нг/мл 50004000300020006004002000

*#

*#

гЧ

*#

6 7

Рис. 3. Содержание КП в плазме, крови больных туберкулёзом и саркоидозом. 1

очаговый туберкулез; 2 - инфильтративный туберкулез; 3 днссеминированный туберкулез; 4 - фиброзно-кавернозный туберкулез; 5 -саркоидоз; 6 - неактивные формы туберкулёза (нирротический и туберкулома); 7 - доноры. *р < 0,05 при сравнении с донорами;" #р < 0,05 при сравнении с больными саркоидозом.

У 6 больных с днссеминированной формой туберкулеза, у которых наблюдалась десгрукцпя легочной ткани и обильное бактериовыделение, уровень КП колебался от 900 до 12000 нг/мл. Из 6 больных фиброзно-кавернозным туберкулезом у 4-х уровень КП превышал 2000 нг/мл. У этих больных наблюдался тяжелый прогрессирующий туберкулез с массивных) разрушением легочной ткани, обсеменением других участков легкого и бактериовыделением. У двух больных развилась казеозная пневмония, оба случая закончились летально.

В группе больных саркоидозом содержание КП в плазме крови составляло 284,8±37,1 нг/мл, лишь незначительно превышая средний уровень контрольной группы.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует о том, что у больных активным туберкулезом легких наблюдается значительное повышение уровня КП в крови, которое зависит от тяжести и распространенности процесса. У больных саркоидозом увеличение содержания КП в плазме крови носит менее выраженный характер и не зависит от формы и степени активности патологического процесса. На сегодняшний день причина и патогенетическая значимость увеличения содержания КП в крови у больных с высокоактивными

У

формами туберкулеза -легких, характеризующимися тяжелым клиническим течением, не совсем ясны.

Интересным фактом является обнаружение нормального уровня КП у больных саркоидозом, не зависящего от распространённости поражения, в то время как Delabie et al. (1990), исследуя содержание КП в тканях при туберкулёзном и саркоидозном процессе, показали, что КП в одинаковой степени экспрессирован в эгштелиоидных клетках гранулём при обоих гранулематозах.

Мы предполагаем, что одним из возможных механизмов значительного увеличения уровня КП в крови при инфекционном гранулсматозном поражении легких, то есть при туберкулёзе, может быть повышенный иммунный цитолиз инфицированных макрофагов гранулемы. (Blanchard et al., 1989). Не исключена и возможность секреции КП инфицированными макрофагами при туберкулёзе, а также привлечения и активации нейтрофилов при распространении и неблагоприятном течении процесса.

Основываясь на • полученных нами результатах, можно заключить, чтс определение содержания КГ1 в плазме крови имеет дифференциально-диагностическое значение при неинфекционных и инфекционньи гранулематозных заболеваниях органов дыхания, протекающих с широкт вовлечением клеток макрофагально-гранулоцитарнон системы.

ВЫВОДЫ

1. Получены штаммы гибридом, продуцирующие МкАТ к кальпротектин; человека, узнающие отдельные субъединицы и мультимерные формы-КП.

2. Созданная на основе МкАТ система иммуноферментного анализ кальпрогектина характеризуется специфичностью, воспроизводимостью i пригодна Для определения данного белка в культуральных супернатантах i биологических жидкостях.

3. Экспрессия кальпротектина в нейтрофильном миелоидном ряд начинается на стадии миелоцита, что установлено на основ иммуноцитохимического исследования клеток крови здоровых лиц и больны миелолейкозами.

4. Для моноцитов периферической крови человека характерно более низкое содержание кальпротектина (около 80 фг на клетку) по сравнению с нейтрофильными гранулоцитами. Разработанный иммунохимический метол количественного определения кальпротектина в моноцитах пригоден для количественной оценки антигенов в прилипающих клетках.

5. Поверхностная экспрессия кальпротектина наблюдается на небольшой (около 10%) популяции циркулирующих моноцитов крови человека. Увеличение КП-экспрессирующей популяции моноцитов стимулируется адгезией.

6. Концентрация кальпротектина в плазме значительно повышена при ряде гематологических заболеваний: хроническом мифлолейкозе, хроническом лимфолейкозе, эритремии. Определение уровня кальпротектина в плазме может использоваться как показатель состояния миелоидного клона при гематологических заболеваниях.

7. При туберкулезе содержание кальпротектина в плазме зависит от распространенности и активности процесса.

8. Уровень кальпротектина в плазме может служить критерием дифференциальной диагностики определенных форм туберкулеза и саркоидоза легких.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям к.б.н. Панютичу и к.б.н. Мисуно Н.И. сделавшим возможным выполнение- этой работы, за обучение многим методам, использовавшимися при выполнении исследований, совместное планирование и обсуждение результатов экспериментов, за общее научное руководство и труд по чтению и редактированию диссертации.

Автор также выражает благодарность .сотрудникам НИИГПК и НИИПиФ МЗ РБ Колесниковой Т.С., Смольниковой В.В., Печковскому Д.В. за непосредственную помощь, оказанную при выполнешш экспериментов, к.б.н. Оатовичу O.A. за помощь с литературой, использованной в диссертации. Автор благодарит опытных клиницистов к.м.н. Иванова В.Е. ик.м.н. Печковского Д.В. за консультативную помощь в обсуждении клинической части работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иванов Г.Е., Мисуно Н.И. Кальпротектин: ещё один антимикробный белок?

// Здравоохранение Беларуси. - 1995. - № 6. - С. 32-34.

2. Ivanov G.E., Misuno N.I., Ivanov V.E. Enzyme-linked immunosorbent assay fc human MRP-8/MRP-14 proteins and their quantitation in plasma of hematologici patients // Immunology Letters. - 1996. - Vol. 49, N 1,2. - P. 7-13.

3. Иванов Г.Е., Мисуно Н.И., Иванов B.E. Распределен!) дифференцировочного белка кальпротектина в клетках миелоидного ряда плазме больных гемобластозами // Экспериментальная онкология. - 1996 ( печати).

4. Иванов Г.Е., Мисуно Н.И., Колесникова Т.С., Панютич А.В., Jlepep Р.1 Моноклональные антитела к гранулоцитарному цитоплазматическому белк кальпротектину и их использование в иммунологических методах / Материалы международного науч. конгресса "Молодые учёные в решени проблемы ликвидации медицинских последствий Чернобыльской катастроф сегодня и в будущем". Гомель, 19-21 сентября 1994 г. / М-во здравоохр. Peci Беларусь и др. - Гомель, 1994. - С. 23-24.

5. Иванов Г.Е., Мисуно Н.И., Иванов В.Е., ' Панютич А.В. Измерен! концентрации кальпротектина с помощью сэндвич ИФА в плаз* гематологических больных // Тез. докл. III съезда Белорусского нау общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-е здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Гродно, 1995. - С. 27.

6. Мисуно Н.И., Иванов Г.Е., Иванов В.Е., Панютич А.В. Изучение экспресси кальпротектина в клетках миеломоноцигарного ряда челове! иммуноцигохимическими методами // Тез. докл. III съезда Белорусско! науч. общества иммунологов и аллергологов. Гродно, 7-9 июня 1995 г. / М-! здравоохр. Респ. Беларусь и до. - Гродно, 1995. - С. 160-161.

7. Misuno N.I., Ivanov О.Е., Ivanov V.E. Calprotectin distribution in neutrophil granulocytes and plasma of hematological oatients // IX International Congress Immunology. Los-Angeles, USA. 23-29 July, 1995 : Abstracts. - S.I., s.a. - 228.

8. Ivanov G.E., Misuno N.I., Pechkowsky D.V. Calprotectin plasma levels in patien with phagocyte system disorders // Polish J. Immunology. - V. 20, N 3: Polsk Towarzystwo Immunologiczne VIII Zjazd. - P. 330.

9. Misuno N.I., Ivanov G.E. Calprotectin expression during inyelomonocytic lineaj differentiation // Polish J. Immunology. - V. 20, N 3: Polskie Towarzystv Immunologiczne VIII Zjazd. - P. 333.

10. Иванов Г.Е., Мисуно Н.И., Иванов B.E. Количественное определен) содержания кальпротектина в плазме как показатель состояния пу нейтрофильных гранулоцитов // Труды 1-й Международной конференщ "Иммунодиагностика и иммунотерапия". Витебск, 22-25 ноября 1995 г. / I во здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Витебск, 1995. - С. 61-62.

И.Печковский Д.В., Мисуно Н.И., Иванов Г.Е. Определение уров! лейкоцитарного белка L1 (кальпротектина) в плазме крови больн

туберкулезом и саркоидозом // Труды 1-й Международной конференции "Иммунодиагностика и иммунотерапия". Витебск, 22-25 ноября 1995 г. / М-воздравоохр. Респ. Беларусь и др. - Витебск, 1995. - С. 123-125. 2. Печковский Д.В., Мисуно Н.И., Иванов Г.Е. Дифференциально-диагностическое и прогностическое значение определения уровня содержания кальпротектина в плазме крови при туберкулёзе и саркошюзе органов дыхания // Сб. науч. работ "Современные проблемы пульмонологии", Межд. симп. "Актуальные проблемы пульмонологии". Минск, 6-7 декабря 1995 г. /М-во здравоохр. Респ. Беларусь и др. - Минск,

1995. - С. 174-177.

3.Ivanov G.E., Pechkovsky D.V., Misuno N.I. Calprotectin in bronchoalveolar lavage cells and plasma of patients with lung tuberculosis and sarcoidosis // Scand. J. Immunology. - 1996. - Vol. 43, N 6: XXVHth Meeting of the Scandinavian Society for Immunology. Turku, May 24-27, 1996. Abstracts of Papers Presented. - P. 710. 4. Misuno N.I., Ivanov G.E., Pechkovsky D.V., Smo'nikova V.V. Calprotectin expression in human monocytes during in vitro culture // Scand. J. Immunology. -

1996. - Vol.. 43, N 6: XXVHth Meeting of the Scandinavian Society for Immunology. Turku, May 24-27, 1996. Abstracts of Papers Presented. - P. 735.

15. Misuno N.I., Ivanov O.E. Calprotectin expression in human blood monocytes and neutrophilic granulocytes // British J. Haematology. - 1996. - Vol. 93, Supp. 2nd Meeting of the European Haematology Association, Paris, France, 29 May - 1 June 1996. Abstracts of papers presented. - P. 360.

16. Misuno N.I., Ivanov G.E., Pechkovski D.V. Calprotectin in bronchoalveolar lavage cells and plasma of patients with lung tubeiculosis // 7th International Congress for Infectious Diseases. Hong Kong. June 10-13, 1996 : Abstracts. - P. 167.