Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.Hy926

На правах рукописи

□озоБтевз

АМЧИСЛАВСКИЙ Евгений Игоревич

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЦИТОКИНОВ НА ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ ЕА.Ну926

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2006

003067663

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-Исследовательском Институте Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, заслуженный деятель наук РФ, член-корреспондент РАМН, профессор Фрейдлин Ирина Соломоновна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Серебряная Наталья Борисовна доктор медицинских наук Киселева Екатерина Прохоровна

Ведущая организация: Институт цитологии РАМН

Защита диссертации состоится « лл января 2007 года в « 13 » часов на заседании диссертационного совета Д 001.022.01 при ГУ НИИ Экспериментальной Медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ Экспериментальной Медицины РАМН.

Автореферат разослан » ^¿^¿¿¿^-^ООб года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Ангиогенез представляет собой многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторов в соответствующем микроокружении, благоприятном для формирования новых сосудов из предсуществующих. Ангиогенез очень редко происходит при физиологических условиях (циклические процессы в репродуктивной системе, раиозаживление, обновление волосяного покрова), но может вносить существенный вклад в патогенез ряда патологических процессов (канцерогенез, гемобластозы, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, неспецифический язвенный колит, диабетическая ретинопатия). Клетки - участники воспалительного процесса (Т-лимфоциты, моноциты/макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы) участвуют в регуляции ангиогенеза за счет продукции про- и противовосп&чительных цитокинов, ростовых факторов, которые влияют на функции эндотелиальных клеток (ЭК): их пролиферацию, миграцию и дифференцировку. В связи с тесной сопряженностью процессов воспаления и ангиогенеза весьма аетуальньш является изучение характера влияния цитокинов на свойства ЭК и на ангиогенез в целом.

В литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стимулирующих и ингибирующих эффектов цитокинов в отношении ангиогенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых экспериментальных систем и с гетерогенностью ЭК. В частности, данные, полученные с использованием микрососудистого эндотелия, отличаются от наблюдений, сделанных на клетках макрососудов. Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффекты разных цитокинов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы.

Цель работы. Провести изучение влияния ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК человека с использованием в качестве экспериментальной модели перевиваемой линии клеток ЕА.Ну926.

Задачи исследования.

1. разработать оптимальные методы оценки пролиферативной, миграционной, адгезионной активности ЭК человека линии ЕА.Ну926, экспрессии ими иитегринового комплекса агрЗ и продукции матриксной металлопротеиназы-9;

2. разработать метод количественной оценки способности ЭК человека линии ЕА.Ну926 формировать капилляроподобные структуры;

3. изучить влияние ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК с использованием разработанной экспериментальной модели.

Научная новизна работы. В ходе работы была разработана новая экспериментальная модель, которая позволяет проводить изучение влияния биологически активных веществ на важнейшие функции ЭК. человека линии ЕА.Ну926. Впервые проведено сопоставление влияния основных ростовых факторов и разных цитокинов на свойства ЭК, причастные к ангиогенезу, в рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что 11,-8 может; играть роль более мощного индуктора пролиферативного ответа ЭК, чем ангиогегаше ростовые факторы УЕОБ и ЬБОР. Результаты работы позволили выявить новое свойства ростовых. факторов УЕСБ и ЬРвР - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики №N7 и ОМ-СвР, которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену I типа при отсутствии влияния на другие свойства ЭК. Также впервые была показана экспрессия интегринового комплекса ау(33 на поверхности ЭК человека линии ЕА.Ну926. ■-•■■„■..■

В ходе работы были разработаны новые модификации методов оценки пролиферативной активности ЭК с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка СРБЕ и количественной оценки способности ЭК линии ЕА.Ну92б формировать капилляроподобные структуры на Матригеле.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований были получены новые данные о влиянии конкретных цитокинов на функции ЭК, причастные к ангиогенезу. Показано, что провоспалительные цитокины в основном обладают проангиогенной активностью, что вносит дополнительный вклад в понимание их патогенетической роли при патологических состояниях, ассоциированных с усиленным ангиогенезом. ШИа в той же экспериментальной системе проявил ингибирующую активность в отношении пролиферации и миграции ЭК - ключевых событий ангиогенеза, что дополнительно обосновывает его использование в комбинированной противоопухолевой терапии.

Разработанная экспериментальная модель может быть в дальнейшем использована для оценки влияния на свойства ЭК, актуальные для ангиогенеза, различных биологически активных веществ и фармакологических агентов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Разработанная экспериментальная модель позволяет проводить комплексное изучение про- и антиангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы' \ТЮР, ЬБОР и провоспалительные цитокины ТОТа, 1Ь-1|3, 1Ь-8 оказывают однонаправленное стимулирующее действие на свойства ЭК человека линии ЕА.Ну926, актуальные для ангиогенеза;

3. IFNa зарекомендовал себя как ингибитор ангиогенного потенциала ЭК человека линии

ЕА.Ну926.

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 3 статьи.

Личный вклад в проведение исследования. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение всех описанных исследований и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов по публикациям ограничивался предоставлением в распоряжение автора ряда биологически активных пептидов, технической помощью в проведении анализа образцов на проточном цитофлуориметре, помощью при получении коллагена I типа.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002, 2003, 2004, 2005 и 2006 г.г.), на 6й и 7- международной школе иммунологов им. Дж. Хамфри (Пущино, 2003 и 2005г.г.), на 12" международном конгрессе по иммунологии "Clinical and Investigative Medicine" (Канада, 2004), на 18a*1 Американском симпозиуме по пептидам (США, 2004).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 09 октября 2006 года.

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 32 таблицы и 18 рисунков. Список литературы включает 132 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа проводилась с использованием ЭК человека линии ЕА.Ну926, которая была любезно предоставлена Dr. С. J. Edgel (Университет Северной Каролины, США). Культура была получена путем гибридизации первичной линии ЭК HUVEC с линией клеток аденокарциномы легкого А-549. Клетки линии ЕА.Ну926 воспроизводят основные морфологические, фенотипические и функциональные характеристики, присущие ЭК макрососудов. Использовали следующие условия культивирования: среда DMEM (Sigma, США); 10% от общего объема среды инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ICN, США), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (АО Самсон, Санкт-Петербург), 2 ммоль L-глютамина (ICN, США) и HAT (ICN, США). Культивировали клетки при 37°С во влажной атмосфере с 5% содержанием С02. Пересев осуществляли 1 раз в 3-4 дня по общепринятой методике, вызывая дезинтеграцию монослоя 5-10-минутной экспозицией в растворе Версена (Биолот, Санкт-Петербург). В работе использовали пластиковые флаконы (Costar, США и Sarstedt, Австрия) и плоскодонные планшеты для культивирования клеток (Greiner, Германия; Costar, США и

Sarstedt, Австрия). Отсутствие инфицированное™ (в том числе, микоплазмой) контролировалось.

В работе использовались рекомбинантные препараты человеческих цитокинов и ростовых факторов: bFGF - (Becton Dickinson, США), VEGF - (BioSource, США), GM-CSF -"Leucomax" (Schering-Plough) (специфическая активность препарата 1ЕД = 1 нг), TNFa -"Рефнолин" (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,06 нг), IL-ip "Беталейкин" (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,01 нг) (НИИ Особочистых биопрепаратов, Санкт-Петербург), IL-8 - (CytoLab/PeproTech, Израиль), IFNa - "Реаферон", IFNy -"Гаммаферон" (НПО "Фермент", "Sanitas", Литва), IL-4 - (Becton Dickinson, США) (специфическая активность препарата 1ЕД = 0,2 нг). Синтетические тканеспецифические пептиды из группы геморфинов были любезно предоставлены с.н.с. Е.Ю.Блищенко и проф. А.А.Михайловой (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва).

Чувствительность ЭК человека линии ЕА.Ну92б к цитотоксическому действию различных биологически активных факторов оценивали в стандартном МТТ-тесте, определяя оптическую плотность (ОП) с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность цитотоксического действия выражали в единицах ОП. По степени снижения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о цитотоксическом действии препаратов.

Оценка пролиферативной активности ЭК человека линии ЕА.Ну926 с помощью окраски кристалл-виолетом проводили по общепринятой методике. Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 540 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Дополнительно для оценки пролиферативной активности ЭК человека линии ЕА.Ну926 был разработан метод с использованием витального внутриклеточного флуоресцентного красителя белка - CFSE. Клетки отмывали средой DMEM и окрашивали CFSE (Sigma, США) в концентрации 5 мкмоль в среде DMEM. Окрашенные красителем клетки культивировали в 48 луночных планшетах (15000 клеток в мл) 72 ч в среде без добавления ЭТС. По окончании инкубации дезинтеграцию монослоя вызывали 10-минутной экспозицией в растворе Версена, после чего проводили учет интенсивности флуоресценции с использованием проточной цитофлюориметрии (FACStrack, Becton Dickinson). Цитометрический анализ проводили на основе определения трех параметров: малого углового светорассеяния (FSC), бокового

светорассеяния (SSC) и показателя зеленой флюоресценции CFSE (FL-1). Для обработки данных проводили гейтинг исследуемых клеток в координатах FSC (ось абсцисс) и SSC (ось ординат). Затем данную группу анализировали на наличие флюоресценции в координатах FL1 зеленое свечение (CFSE). Для оценки активности пролиферации клеток, необходимо было выделить пики (маркеры) интенсивности свечения, соответствующие распределению красителя в делящихся клетках. По степени изменения интенсивности флуоресценции клеток, культивировавшихся в присутствие исследуемых препаратов, по сравнению с контрольными, судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Кроме того, пролиферативную активность ЭК линии ЕА.Ну926 оценивали по интенсивности включения бромдезоксиуридина в ДНК делящихся клеток. Эксперименты проводили в соответствие с протоколом фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания). Результаты оценивали, определяя ОП с помощью автоматического спектрофотометра (SLT-Spectra, Австрия) при длине волны 490 нм. Интенсивность пролиферации клеток выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на интенсивность пролиферации.

Для получения коллагена I типа использовали вариант общепринятого метода, разработанный в лаборатории проф. И.Г. Козлова (ММА им. И.М. Сеченова). Стерилизацию полученного раствора коллагена с соблюдением всех правил стерильности проводили при помощи центрифугирования (40000 об/мин и 4°С 1 час). Полученный стерильный надосадок хранили при -20°С. Концентрацию полученного раствора коллагена оценивали на основании определения концентрации оксипролина, составляющего до 80% коллагена I типа.

Оценку миграции ЭК линии ЕА,Ну926 проводили с помощью модифицированного метода компании Becton Dickinson "BD BioCoat™ Angiogenesis System ■ Endothelial Cell Migration". Использовали поликарбонатные трансвеллы (фильтры) 24-х луночного формата (Becton Dickinson) с диаметром пор 3 мкм, предварительно обработанные раствором коллагена I типа (100 мкг/мл). Клетки помещали в верхние камеры (250 мкл клеточной суспензии с концентрацией 200000 клеток/мл), а исследуемые и контрольные растворы - в нижние, в 750 мкл среды, содержащей 0,5% ЭТС. При этом обе камеры оказываются разделенными полупроницаемым фильтром, обработанным раствором коллагена I типа. После этого клетки инкубировали 20 ч при 37°С и 5% С02. По окончанию срока инкубации извлекали фильтры, остатки среды отбирали дозатором и аккуратно удаляли ватным тампоном клетки с поверхности фильтра, обращенной в верхнюю камеру, чтобы избежать окраски немигрировавших клеток. После этого фильтры с клетками на нижней стороне фиксировали 30

минут в метаноле при 4°С, далее высушивали, и клетки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Результаты оценивали по среднему значению количества мигрировавших клеток, которое подсчитывали при микроскопии по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах, при увеличении микроскопа х120. Активность миграции вь1ражали средним количеством мигрировавших клеток. О влиянии препаратов судили по изменению среднего количества мигрировавших клеток в лунках с препаратами по сравнению с количеством клеток при спонтанной миграции.

Оценку образования ЭК линии ЕА.Ну926 капилляроподобных структур проводили с использованием Матригеля (продуют опухолевой линии клеток Engelberth-Hoim-Swarm, представляющий собой композит из различных видов белков внеклеточного матрикса: ламинина, коллагена IV типа, энтактина и гепарансульфат протеогликанов) (Becton Dickinson, Великобритания). Нами разработана модификация данного метода, которая позволяет снизить расход Матригеля в 4 раза, сохраняя возможность количественного учета результатов. Сущность модификации заключается в использовании коллагеновой подложки. Для этого 400 мкл раствора коллагена I типа в концентрации 1 мг/мл, полученного из сухожильных тяжей хвостов лабораторных крыс, вносили в лунки 24-луночного планшета и 1-2 ч инкубировали при 37°С и 5% СОг до полной полимеризации. Затем во все лунки планшета, содержащего коллаген, вносили неразведенный Матригель. Для этого весь расходный материал (наконечники для дозаторов, планшеты и пробирки для разведения Матригеля) предварительно охлаждали, для предотвращения преждевременной полимеризации матрикса. Матригель размораживали на льду, ресуспендировали, избегая образования пузырей, и вносили в объеме 100 мкл поверх коллагена. Далее планшет инкубировали в течение 30-60 мин при 37°С и 5% С02 до образования геля. После полимеризации матрикса аккуратно вносили клетки (200000 кл.) в 500 мкл среды и исследуемые препараты в 10 мкл среды, содержащей 2% ЭТС. Через 24 часа проводили количественный учет результатов. За вышеуказанное время клетки на границе раздела двух видов матрикса формировали сеть из капилляроподобных структур. Документацию результатов проводили с помощью фотографирования цифровым фотоаппаратом Nikon Coolpix 4500 (Nikon, Япония) с окулярным адаптером к инвертированному микроскопу Биолам-Ш (JIOMO, Санкт-Петербург). При этом суммарное увеличение составляло х120. Последующий анализ полученных фотографий проводили с использованием программы "ImagJ" (данная программа в свободном доступе размещена на вебсайте National Institute of Health http://rsb.mfo.nih.gov/nih-image/download.html). При анализе полученных изображений мы расценивали клеточный тяж между двумя клеточными агрегатами как капилляроподобную структуру и учитывали среднюю длину этих капилляроподобных

структур, которую выражали в пикселях, (Рис. I). Результаты оценивали по средним значениям вышеназванных показателей, которые подсчитывали по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах (Рис, I) О влиянии препаратов на способность ЭК человека линии БА,Ну926 к образованию капилляронодобных структур судили по изменению средней длины одной капилляроподобной структуры в лунках с препаратом по сравнению с контрольными.

Для оценки адгезии ЭК человека линии ЕА.Ну926 к коллагену 1 типа была разработана собственная модификация метода. Для этого, в лунки 96-луночного планшета вносили 100 мкл раствора коллагена в концентрации 100 мкг/мл, инкубировали сутки при 4"С, излишки раствора коллагена удаляли, планшет трижды отмывали раствором Хэикса и просушивали 1 час при 37 °С. В лунки вносили исследуемы и контрольные препараты в 50 мкл бессы ворот очной среды. Снятые раствором Верее на клетки однократно отмывали бе с сывороточной кудьтуральной средой и 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 4-5*104 Клеток, вносили в лунки и инкубировали в течении 105 мин при 37°С и 5% ССЬ. По истечении срока инкубации, супернагант аккуратно удаляли и клетки два раза отмывались фосфатно-солевым раствором, предварительно подогретым до 37"С. Отмытые клетки, фиксировали, окрашивали 0,2% раствором кристалл-виолета (60 мкл красителя, содержащего 2 % этанола, вносили в лунку на 15 мин и инкубировали при комнатной температуре). Несвязавшийся раствор крисгадд-еиолета трижды отмывали дистиллированной водой, планшет высушивали 24 ч, окрашенные клетки лизировали 1% раствором уксусной кислоты (100 мил/лунку) и после 15'Минутной инкубации при комнатной температуре (для полного растворении красителя), оценивали ОП с помощью многоканального спектрофотометра (Spectra SLT, Австрия) при длине волны 540 нм. Активность адгезии клеток к коллагену 1 типа выражали в единицах ОП. По степени изменения ОП в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на уровень адгезии ЭК человека линии ЕА.Ну92б.

Рисунок 1. Кап ил лярогго лобные структуры, образуемые ЭК человека линии ЕА,Ну92б, на Матригеле. Л - клеточные агрегаты; линия -клеточный тяж между двумя клеточным» а]-ре га гам и (кап илляроподобная структура).

Оценку продукции ММР-9 ЭК человека линии ЕА.Ну926 проводили в соответствие с протоколом фирмы-производителя (Amersham Biosciences, Великобритания). Уровень продукции ММР-9 выражали в нг/мл. По степени изменения среднего количества ММР-9 в лунках с препаратом по сравнению с контрольными лунками судили о влиянии препаратов на уровень продукции ММР-9 ЭК человека линии ЕА.Ну926.

Определение уровня экспрессии интегринового комплекса av|33 на поверхности ЭК линии ЕА.Ну926 проводили в соответствии с протоколом фирмы-производителя (PharMingem, Великобритания). Учет интенсивности флуоресценции проводили с использованием проточного цигофлюориметра FACsCalibur (Becton Dickinson, Великобритания). Экспрессию интегринового комплекса avp3 выражали средними значениями интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity - MIF). О влиянии препаратов на экспрессию молекулы avP3 судили по изменению MIF в опыте по сравнению со спонтанным уровнем MIF.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи методов параметрической статистики. При этом проводили вычисление средней, ошибки средней, критерия Стьюдента, используя компьютерную программу STATISTICA 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для целей нашего исследования была выбрана перевиваемая линия ЭК человека ЕА.Ну926, которая всесторонне охарактеризована, широко используется для исследования свойств ЭК, а нами использована для оценки влияния ростовых факторов и цитокинов на функции ЭК, причастные к ангиогенезу. С использованием этой перевиваемой линии нами разработана экспериментальная модель, позволяющая изучать влияние биологически активных веществ на различные свойства ЭК, актуальные для ангиогенеза, и на ангиогенез в целом, судя по способности к формированию капилляроподобных структур. При разработке экспериментальной модели, мы исходили из того, что она должна воспроизводить ключевые этапы ангиогенеза: пролиферацию, миграцию и дифференцировку ЭК ка внеклеточном матриксе Матригеле. Как показали наши исследования, клетки линии ЕА.Ну926 оказались чувствительны как к стимулирующим, так и к ингибирующим влияниям. В рамках данной модели мы оценивали адгезию ЭК к коллагену I типа, а для уточнения механизма адгезии -экспрессию интегринового комплекса avb3. Впервые было установлено, что данный интегрин спонтанно экспрессируется на поверхности клеток линии ЕА.Ну926, чему соответствует среднее значение интенсивности флуоресценции 41,28 ± 4,6 (п=3). Кроме того, была изучена продукция клетками ММР-9. Клетки линии ЕА.Ну926 характеризовались постоянным уровнем спонтанной продукции ММР-9, который в среднем составлял 4,18 ± 0,14 нг/мл (п=15). Большинство экспериментов проводили в условиях низкого содержания ЭТС в культуральной

среде, гак как стимулирующее действие высоких концентраций ЭТС, содержащей ростовые факторы, МОГЛО экранировать действие исследуемых цитокинон и ростовых факторов. Вместе с тем, показана возможность использования более высоких концентраций ЭТС, оказывающих активирующее действие на ЭК, в качестве положительного контроля. Разработанная экспериментальная модель может быть использована для комплексного изучения влияния биологически активных веществ на свойства ЭК и анпюгенез, К достоинствам модели можно отнести достаточно высокую воспроизводимости результатов.

В задачи исследования входила проверка чувствительности ЭК человека линии ЕА.Ну926 к действию ростовых факторов \'ЕСР и ЬРОР. заведомо проангиогенных агентов, УЕСР считается специфическим митогеном для ЭК, гак как избирательно стимулирует пролиферацию эндотелия при отсутствии влияния на пролиферацию других типов клеток, I! то время как стимулирующее действие ЬРОР не ограничивается только ЭК. 11ри этом ЬРвР может проявлять более выраженное митогеннос действие, чем \'Р,СР. Кроме того, ЬРОР может стимулировать аутокринную продукцию УЕОР ЭК, и это вносит дополнительный вклад в стимуляцию пролиферации ЭК. В наших исследованиях оба ростовых фактора стимулировали пролиферацию ЭК линии ЕА.Ну926 в широком диапазоне концентраций, причем максимальную активность УЕОР и ЬРОР. оказывали в концентрации 20 и 10 нг/мл соответственно (Рис. 2).

□ кошропь (бэзмые условии эксперименте среда с добавлением ЭТС)

□ соеда с добавлением ЭТС (позитивный контроль)

в ■ МКУОЛЬ -гпмруо:'(негативный КОНТРОЛЬ) л 100 нг/мл

ЫУЕОР 20 нг/мл ОУЕСР 2 1ТЩ Я ГСГГ> нг/мл

в: то нг/мл ■ РУНЬ 2 нг/мл

Рисунок 2. Влияние ростовых факторов VEGF и bFGF на пролиферацию ЭК человека линии ЕА. Ну926 (метод с включением бромдезокеиуридина).

По оси абсцисс - росговые факторы и контроля; по оси ординат - значение ОП. Вертикальные отрезки - 95%-ныс доверительные интервалы средних величии. Достоверность отличия от уровня контроля +(р<0,05), **(р<0.01), ***(р<0,001).

Литературные данные свидетельствуют о том, что оба ростовых фактора стимулируют миграцию ЭК in vitro. В нашем исследовании, VEGF проявлял слабую стимулирующую активность, a bFGF никак не влиял на миграцию ЭК линии ЕА.Ну92б, Вероятно, клетки дайной линии в бессывороточиых условиях нуждаются в дополнительной стимуляции, например,

фибронектином, который является мощным хемоаттрактантом для ЭК, вызывая реорганизацию цитоскелета и экспрессию интегриновых молекул.

Ранее было показано, что УВО¥ и ЬРОБ индуцируют образование капилляроподобных структур ЭК на различных видах матрикса, в том числе на Матригеле. Нам удалось получить аналогичные результаты при изучении влияния данных ростовых факторов на ЭК линии ЕА.Ну926. Действие УЕОБ при этом было несколько более выраженным, чем у ЬРОР (Табл. 1).

Таблица 1. Влияние ростовых факторов УЕвР, ЬРвР на формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками человека линии ЕА.Ну926.

Концентрации ростовых факторов и контроль Средняя длина капилляроподобных структур, (М ± т) (в пикселях)

УЕвР 100 нг/мл 138,2 ± 1,5, (п=42)**

УЕОР 50 нг/мл 147,4 ± 2,1, (п=40)***

УЕвР Юнг/мл 146,2 ± 2,3, (п=43)***

ЬРОР 100 нг/мл 137,1 ± 1,9, (п=34)**

ЬРОР 50 нг/мл 131,1 ± 1,9, (п=33)*

ЬРвР 20 нг/мл 125,6 ± 1,9, (п=34)

Контроль3 122,3 ± 1,8, (п=40)

а Клетки, культивировавшиеся в среде без добавления ростовых факторов. Достоверность отличия от уровня контроля *(р<0,05), **(р<0,01), ***(р<0,001).

Наши данные говорят о том, что оба ростовых фактора УЕОР и ЬРОР усиливают адгезию ЭК линии ЕА.Ну92б к коллагену 1 типа, причем УЕОБ несколько более эффективен, чем ЬРОР (Табл. 2).

Таблица 2. Влияние ростовых факторов УЕОР и ЬРОР на адгезию ЭК ЕА.Ну926 к коллагену I типа.

Концентрации ростовых факторов и контроли Средние значения ОПа при окраске кристалл-виолстом (М ± т)

УЕйР 50 нг/мл 0,550 ± 0,015, (п=19)**

УЕОР Юнг/мл 0,568 ± 0,014, (п=20)**

УЕОР 2 нг/мл 0,577 ± 0,015, (п=20)**

ЬРОР 20 нг/мл 0,550 ±0,005, (п= 16)**

ЬРОР 10 нг/мл 0,529 ±0,004, (п=16)**

ЬРОР' 5 нг/мл 0,520 ± 0,004, (п=16)**

Среда, с добавлением 10 % ЭТС (контроль стимулирующего действия) 0,591 ± 0,005, (п=55)***

Среда, без добавления ЭТС и ростовых факторов (контроль спонтанной адгезии) 0,487 ± 0,005, (п=41)

а Оптическая плотность, выраженная в усл. ед., за вычетом фона 0,064 усл. ед. Достоверность отличия отуровня контроля *(р<0,05), **(р<0,01), ***(р<0,001).

и

Нам не удалось найти в литературе аналогичных работ. Ранее было показано, что ростовые факторы VEGF и bFGF модулируют экспрессию целого ряда интегриновых молекул на поверхности ЭК, которые обеспечивают взаимодействие эндотелиальных клеток с белками внеклеточного матрикса, в том числе с коллагеном (al, a2, a3, а4, а5, av, pi, (33). Эти данные в известной степени перекликаются с нашими результатами. Нами была предпринята попытка выяснить, связано ли такое действие ростовых факторов на адгезию ЭК с влиянием на экспрессию иптегринового комплекса avp3. Однако ни один из ростовых факторов не влиял на уровень экспрессии данной молекулы.

В нашей модельной системе VEGF и bFGF не влияли на продукцию ММР-9 ЭК линии ЕА.Ну926, хотя некоторые авторы указывают на способность этих ростовых факторов контролировать систему протеолиза, в том числе благодаря стимуляции продукции ММР-2, -9.

Таким образом, несмотря на некоторые расхождения с литературными данными, результаты, полученные на данной экспериментальной модели, свидетельствуют о проангиогенном действии VEGF и bFGF. Выявленное нами стимулирующее действие обоих ростовых факторов на пролиферативную активность и образование капилляроподобных структур ЭК линии ЕА.Ну92б позволяет рассматривать эти ростовые факторы в качестве проангиогенных препаратов.

TNFa, IL-ip, IL-8, GM-CSF - относятся к группе цитокинов раннего воспалительного ответа. Из литературы известно, что эти цитокины способны стимулировать ангиогенез in vivo. Причем, эти цитокины играют в основном опосредованную роль в ангиогензе, индуцируя продукцию основного медиатора ангиогенеза - VEGF макрофагами, гладкомышечными ктетками, самими ЭК. В группу провоспалительных цитокинов, как правило, включается и IFNa. Спектр действия IFNa не ограничивается противовирусной активностью. Этот цитокин обладает противоопухолевым действием и в последнее время широко используется при проведении комбинированной противоопухолевой терапии. В качестве одного из возможных механизмов противоопухолевого действия IFNa рассматривается угнетение формирования сосудистой сети опухоли.

По литературным данным, TNFa оказывает двойственное влияние на пролиферацию, что может быть связано с дозо- и времязависимым эффектом данного цитокина. Так, кратковременная инкубация при низкой концентрации оказывала проангиогенное действие, в то время как, длительная экспозиция при высоких концентрациях приводила к утрате проангиогенных эффектов TNFa. В нашей модели TNFa в высоких дозах 500 и 100 ЕД/мл TNFa ингибировал пролиферацию ЭК линии ЕА.Ну926 (Рис. 3). Отдельные литературные данные

свидетельствуют о том, что IL-lß, может стимулировать пролиферацию ЭХ, причем данный эффект, вероятнее всего, связан с его влиянием на синтез и секрецию ростовых факторов (PDGF, VEGF, TGFß, FGF, CSF). Кроме того, IL-1 ß можег повышать экспрессию рецепторов к bFGF на эндотелии, что увеличивает чувствительность последнего к стимулирующему влиянию данного ростового фактора. Наши данные также свидетельствуют о стимулирующем действии IL-lß на пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926 (Рис, 3). IFNa, в нашей экспериментальной системе, в концентрациях 10000 и 1000 ЕД'мл и н гиб и ров ал пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926 (Рис. 3),

з.о» ■

2.000

ö кентрогь (Са>эаь* условий ахелвдимента. среда с ftoflvwHnw

1* Э^С)

■ 104 ЭТС (поэтчвный HOKTpilibi

■ 1 мчмогь эпирубиц^на (негатианий контроль? aTMFij 500 ЕДГип

пТМРа 1СЮ ЕД/цл

□ TNFü SO ЕД/нл

о MS 10000 ЕД/нп '.000ЕД/wfl

□ IL-'З ICC £ДМП OlfNa 1СЙ0О ЕД.'мл atfSs 1KB Efldui

□ IFNa 100ЕШил

Рисунок 3, Влияние ТМРа, 1Цр и 1ГКа на пролиферацию ЭК человека линии ЕА.Ну926 (метод с включением бромдезакеиуридина).

По оси абсцисс - ростовые факторы и контроле по оси ординат - значение ОП. Вертикальные отрезки - 95%-мые доверительные интервалы средних величии. Достоверность отличая от уровня контроля *(р<0,05), *'(р<0,0П, *"*(р<0,001).

11.-8 и другие СХС-хемокины рассматриваются в литературе как потенциальные стимуляторы ангиогенеза. 11,-8 может стимулировать пролиферацию ЭК, причем этот эффект носит не только опосредованный характер, через усиление продукции \'ЕОГ и ЬРйР, но может быть и прямым. В нашем исследовании 1Ь-8 дозазависимо стимулировал пролиферацию ЭК линии ЕА,Ну926 (Рис. 4). Стимулирующий эффект 11.-8 был самым выраженным из всех изученных цитокинов и ростовых факгоров и превосходил результаты позитивного контроля (10% ЭТС), По литературным данным, ОМ-СЭР может стимулировать пролиферацию эндотелия. Клетки линии ЕА.Ну926 оказались не чувствительны к действию ОМ-С5Р в опыте по исследованию пролиферации (Рис, 4).

О контроль |.£гэог)ье условия зкспа^менте. С])ода с добавлением 1% ЭТС

■ 10% ЭК, (поашиень^ контроль)

■ 1 мимопи зпируС^^ина (не.-втмвнь^ кон-рсгь) сСМ-СЗР (0000ед/м оси-сар юоо ЕДЛип

□ СМСЗГ 100 ЁДГил

■ 1-0 500 <№п я 11--я 200 нг/мл «11.-я 100 иг' мл

Рисунок 4. Влияние СМ-СБР и 11-8 на пролиферацию ЭК человека линии ЕА.Ну92б (метод с включением бромдезокснуряйдяна). По оси абсцисс - ростовые факторы и контроля; на пси ординат -значение ОП, Вертикальные отрезки - 95%-иые доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличия от уровня контроля *{р<0,0£Ь **(р<0,01), ***(р<0,001).

Ранее было показано, что Т№«, наряду с 1[.-1р и 1РЫу, может ингибировать фибронсктин-индуцирован! тую миграции» микрососудистого эндотелия, никак не влияя на миграцию клеток крупных сосудов, например НЦУЕС. При исследовании влияния цитокииов на миграцию ЭК линии ЕА.Пу92б, ТЫРа оказывал стимулирующее действие, даже в отсутствие дополнительной стимуляции фибронектином, 1Ир стимулировал миграцию ЭК линии ЕА.Ну92б в наибольшей из использованных концентраций и его эффект был сопоставим с действием Т>1Ра. Характерным для (1-8 считается его стимулирующее влияние на миграцию ЭК, для которых он является хемотактическим фактором. В наших исследованиях стимулирующее действие 1Е-8 на миграцию ЭК линии ЕА.Ну926 проявилось при наибольшей из использованных концентраций 500 нг/мл, ОМ-СЭР никак не влиял на миграцию клеток линии ЕА.НуУ26. В отношении миграции ЭК !НРа, также как и в отношении пролиферации эндотелия, проявлял инГибирукнЩё действие в максимальной из использованных концентраций (Табл. 3).

Таблица 3. Влияние провоспалительньгх цитокинов на миграцию ЭК человека линии ЕА.Ну926.

Концентрации цитокинов и контроли Среднее количество клеток" в поле зрения, (М ± т)

TNFa 500 ЕД/мл 51,8 ± 2,9, (п=6)*

TNFa 100 ЕД/мл 50,4 ±3,0, (п=12)*

TNFa 10 ЕД/мл 40,9 ± 4,6, (п=6)

TNFa 0.01 ЕД/мл 41,7 ± 5,3, (п=6)

IL-1P 1000 ЕД/мл 51,3 ± 2,3, (п=12)*

IL-1P 100 ЕД/мл 43,1 ± 4,6, (п=6)

IL-lp 10 ЕД/мл 42,4 ± 4,0, (п=6)

IL-8 500 нг/мл 51,2 ±4,0, (п=6)*

IL-8 50 нг/мл 47,4 ±3,6, (п=12)

IL-8 10 нг/мл 43,3 ± 4,7, (п=6)

IFNa 10000 ЕД/мл 34,5 ± 2,4, (п=6)*

IFNa 1000 ЕД/мл 40,9 ± 3,6, (п=6)

IFNa 100 ЕД/мл 40,7 ± 3,2, (п=6)

GM-CSF 50000 ЕД/мл 40,1 ± 3,2, (п=6)

GM-CSF 10000 ЕД/мл 39,8 ± 2,2, (п=6)

GM-CSF 1000 ЕД/мл 40,8 ± 2,8, (п=6)

Среда, с добавлением 0,5% ЭТС (контроль спонтанной миграции) 40,5 ± 1,0, (п=12)

Среда, с добавлением 2% ЭТС (контроль стимулирующего действия) 102,4 ± 3,1, (аЧ2)***

" Среднее значение количества мигрировавших клеток по результатам 5 рандомизированных полей зрения в трех независимых экспериментах. Достоверность отличия от уровня контроля *(р<0,05), **(р<0,01), ***(р<0,001).

Ранее была изучена способность TNFa индуцировать образование капилляроподобных структур ЭК различного происхождения на разных видах матрикса. В нашем исследовании TNFa также стимулировал образование капилляроподобных структур, что является дополнительным доказательством его проангиогенного действия. Описана способность IL-ip стимулировать формирование новых капилляров in vivo, причем использование рецепторного антагониста IL-ip позволяет ингибировать васкуляризацию опухоли. В опытах in vitro IL-ip как и TNFa потенцировал образование капилляроподобных структур на фибрине и Матригеле. В наших исследованиях IL-lp достоверно по сравнению со спонтанным уровнем, но слабее чем TNFa стимулировал образование капилляроподобных структур ЭК линии ЕА.Ну926. Хотя по литературным данным IL-8 является достаточно мощным индуктором ангиогенного ответа in vivo и in vitro, в нашей модели этот цитокин проявлял слабое стимулирующее действие в отношении образования капилляроподобных структур ЭК линии ЕА.Ну926. IFNa не стимулировал, но и не ингибировал образования капилляроподобных структур, в отличие от ингибирующих эффектов этого цитокина в отношении пролиферации и миграции ЭК человека линии ЕА.Ну926.

□ Среда. 6f?i добэапекия цктикинов (контроль)

а TNfo 100 Ед/нг В 100 ЕД1МЛ ■ К.-б 50 кг/мл

□ lFNn 10000 ЕД'>АП

Рисунок 5. Влияние провоспалягельных цитокинов на формирование капилляроподобных структур ЭК человека линии ЕА, Ну926,

По оси абсцисс - цитокины и контроль; по оси ординат - длина капидляроподобных структур, выраженная в пикселях. Вертикальные отрезки - 95%-ные доверительные интервалы средних величин. Достоверность отличим от уровня контроля *(р<0,05|, **(р<0,01), **+(p<0,001).

Будучи универсальным активатором функций ЭК, TNF« может индуцировать экспрессию ряда адгезионным молекул [(а поверхности эндотелия, в том числе, VCAM-1 и Е-селектина, которые способствуют ангиогенеэу, Наши данные также говорят об усилении адгезионного потенциала ЭК под действием TNFa, который повышал адгезию ЭК линии £А.Ну92б к коллагену 1 типа и экспрессию интегринового комплекса avj33 (Табл. 4, Рис. ö). Как известно, с экспрессией данного комплекса связано повышение жизнеспособности эндотелия, обеспечивается адгезия к белкам внеклеточного матрикса, как следствие, усиливается чувствительность к «итоге иным и хемотактичесним стимулам. Наряду, с другими провоспалигельнымн цитокипами !L-lß закономерно стимулировал адгезию ЭК линии ЕА.Ну926 к коллагену I чипа, но не влиял при этом на экспрессию интегринового комплекса avp3. 11,-8 в наших экспериментах слабо стимулировал адгезионную активность ЭК линии ЕА,Ну926. Стимулирующее действие GM-CSF на адгезию клеток линии ЕА,Ну926 к коллагену 1 типа носило выраженный характер и было сопоставимо с эффектами TNFa и ЭТС. IFNa, единственный из провоспаяительных цитокинов, не оказывал влияния на адгезию ЭК линии ЕА.Ну92б к коллагену I типа (Табл. 4).

Таблица 4. Влияние пронос пал ительных цитокинов на адгезию ЭК человека линии Е А. Ну 92 6 к коллагену I типа.

Концентрации цнтокинов и контроли Средние значения ОПя при окраске кристалл-ни о летом (М ± т)

TNFa 500 Ед/мл 0.567 ± 0,005, (п-1й)***

TNF« 100 Ед/мл 0,590 *0,0ПДп=16>***

TNFa 10 Ед/мл 0.549 £ 0,006, (п=!6)***

IL-1B 1000 Ед/мл 0,577±0,008,(п=16)***

IL-1)3 100 Ед/мл 0,566 ± 0,007, (п=16)***

IL-Iß !0 Ед/мл 0,527 ± 0,006, (п= 16)**

IL-В 500 нг/Wi 0,550 ± 0,005, (п=16)***

IL-8 5D иг/мл 0.548 ± 0.005, (п=1б)***

IL-8 10 иг/мл 0,530 ±0,004, 01=16)***

IFNa 10000 ЕД/мл 0,489 ± 0,008, I2J_

IFNa IOÜO ЕД/мл 0,480 ± 0,008, (п=12)

IFNa 100 ЕД/мл 0,469 ± 0,021, (п=12)

GM-CSF 50000 ЕД/мл 0,590* 0,014. (п-20)***

GM-CSF 10000 ЕД/мл 0,575 * 0,015, (п=20)***

GM-CSF 1000 ЕД/мл 0,571 ± 0.013, (п=20Г**

Среда, с добавлением 10% ЭТС (контроль стимулирующего действия) 0,59) ¿0.005, (п=5 5)***

Среда, без добавления ЭТС и ростовыч факторов(контроль спонтанной адгезии) 0,487 ± 0,005, (п=41)

а Значения ОП за вычетом фона 0.064 усл. ед. Достоверность отличия от уровня контроля *(р<0,05), **(р<0,01),***(р<0,001).

только

проявляющие

Рисунок 6. Оценка экспрессии интегринового комплекса и\'рЗ под влиянием 'ГМРа в концентрации 100 ЕД/мл на поверхности ЭК человека линии ЕА,Ну92б.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток; по оси ординат - количество, проанализированных клеток.

Ранее было показано, что ЮТа стимулирует синтез и секрецию и-РА ЭК, повышает экспрессию рецепторов для и-РА на эндотелии, стимулирует продукцию и повышает активность ММР-2, -9, Это вносит существенный вклад в деградацию базальной мембраны и внеклеточного матрикса, необходимую для последующей миграции ЭК на начальных этапах ангиогенеза. Наши исследования показали, что ТЖа существенно усиливал продукцию ММР-9

клетками линии ЕА.Ну926. 1ИР также вносит вклад в ремоделирование ВКМ: 1Ь-1р непосредственно индуцирует синтез и-РА ЭК и его ингибитора, коллагеназы и эластазы. Кроме того, данный щшжин может стимулировать продукцию ММР-1,-2,-3,-9, как самими ЭК, так и клетками микроокружения. В нашей экспериментальной модели мы выявили способность 1(5 усиливать продукцию ММР-9 ЭК линии ЕА.Ну926. Мы также выявили стимулирующий эффект 1Ь-8 на продукцию ММР-9, ранее описанный в литературе в отношении других ЭК. Отдельными исследователями было ранее показано, что ПТЧа может угнетать синтез матриксных металлопротеиназ (ММР-2, -9), необходимых на первых этапах ангиогенеза. В наших исследованиях 1Ша также проявлял ингибиторную активность, снижая продукцию ММР-9 в 1,3 раза по сравнению со спонтанным уровнем продукции.

Таблица 5, Влияние провоспалительных цитокинов на продукцию ММР-9 ЭК человека линии ЕА.Ну926.

Концентрации цитокинов и контроль Содержание ММР-9 в супернатантах (нг/мл), (М±ш)

ТОТа 500 ЕД/мл 8,39 ± 1,17, (п=6)***

ЮТа 100 ЕД/мл 5,91 ± 0,43, (п=6)***

ЮТа 10 ЕД/мл 4,82 ± 0,38, (п=6)

1ЫР 1000 ЕД/мл 5,43 ± 0,71, (п=6)*

1Ь-1Р 100 ЕД/мл 5,19 ± 0,83, (п=6)

11,-8 500 нг/мл 5,73 ±0,58, (п=6)**

1Жа 10000 ЕД/мл 3,16 ± 0,51,(п=6)*

спонтанный уровень продукции а 4,18 ±0,14, (п=15)

а Клетки, культивировавшиеся 24 часа в среде без цитокинов. Достоверность отличия от уровня контроля *(р<0,05), **(р<0,01), ***(р<0,001).

Таким образом, ЮТа в нашем исследовании зарекомендовал себя, как прооангиогенный агент, который существенно усиливал продукцию ММР-9, матриксной металлопротеиназы, необходимой для деградации внеклеточного матрикса и последующей миграции ЭК, стимулировал миграцию ЭК, повышал адгезию эндотелия к коллагену I типа, что необходимо, как для миграции и пролиферации, так и для повышения жизнеспособности клеток, усиливает экспрессию интегринового комплекса офЗ, что также увеличивает устойчивость ЭК к апоптозу, повышает их сродство к белкам внеклеточного матрикса, способствует миграции. Вместе с тем, ЮТа, будучи мощным апоптогеном, в высокой концентрации подавлял пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926, что подтверждает существующее представление о нем, как о полифункциональном цитокине. Провоспалительные цитокины 1Ь-1Р и 1Ь-8 оказывали однонаправленное стимулирующее действий в отношении ангиогенных свойств клеток линии

ЕА.Ну926. При этом IL-8 показал себя самым сильным индуктором пролиферативного ответа ЭК по сравнению со всеми провоспалительными цитокинами и ростовыми факторами. GM-CSF в данной модели, в отличие от литературных данных, не проявив никакого действия в отношении пролиферации и миграции клеток линии ЕА.Ну926, оказался достаточно сильным стимулятором адгезии клеток к коллагену I типа. В отличие от других провоспалительных цитокинов у IFNa явно преобладали антиангиогенные эффекты, хотя отсутствие влияния на конечный этап ангиогенеза (судя по формированию капилляроподобных структур клетками линии ЕА.Ну926) не позволяет рассматривать IFNa в качестве чисто антиангиогенного фактора.

Ангиогенез регулируется деликатным балансом различных негативных и позитивных эффекторных молекул. При этом в физиологических условиях преобладают сигналы, сдерживающие данный процесс, а при патологии (канцерогенез, хроническое воспаление, раневой процесс) значительно преобладают активирующие стимулы. Балансом различных цитокинов регулируется и иммунный ответ, протекающий с преобладанием либо Thl, либо Th2 субпопуляций Т-лимфоцитов. Thl продуцируют преимущественно IFNy, IL-2 и TNFa/p, в то время как Th2 секретируют IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 и IL-13. Можно предположить, что дихотомия Т-хелперов играет роль и в контроле ангиогенеза. Цитокины, секретируемые Thl и Th2, могут влиять на ангиогенез как напрямую, контролируя рост и дифференцировку ЭК, так и опосредованно, через продукцию других цитокинов и ростовых факторов. Мы остановили свой выбор на изучении с помощью разработанной нами экспериментальной модели эффектов двух альтернативных цитокинов: IFNy и IL-4.

Отдельные литературные данные свидетельствуют о том, что IFNy оказывает скорее ангиостатическое действие. В отношении пролиферации ЭК данный цитокин оказывает как прямое антимитогенное действие, так и опосредованное через угнетение bFGF- и PDGF-стимулированной пролиферации ЭК. Однако в нашем исследовании IFNy ни в одной из изученных концентраций не оказывал влияния на пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926. В литературе описана способность IFNy ингибировать экспрессию ММР-2 и ММР-9, вмешиваясь в процесс ремоделирования внеклеточного матрикса и, как следствие, снижая возможности миграции ЭК и метастазирования опухолевых клеток. Было показано, что IFNy может ингибировать фибронектин-индуцированный хемотаксис клеток микрососудистого эндотелия, не влияя при этом на хемотаксис клеток крупных сосудов. В нашей модели IFNy не оказывал влияния на миграцию клеток линии ЕА.Ну926, которые относятся к клеткам макрососудов. В литературе высказывалось предположение о том, что IFNy снижает жизнеспособность ЭК через угнетение avp3 пути трансдукции сигнала и ингибирует синтез коллагена вспомогательными клетками внеклеточного матрикса. Наши результаты показали, что IFNy усиливал адгезию ЭК

линии ЕА.Ну926 к коллагену I типа, причем этот эффект имел прямой дозазависимый характер и был максимальным среди всех исследованных провоспалительных цитокинов. Эти данные противоречат литературным данным о том, что IFNy является более слабым индуктором экспрессии адгезионных молекул, чем, TNFa. Нам не удалось найти в литературе данных в отношении способности IFNy модулировать образование капилляроподобных структур ЭК. Однако, известно, что IFNy может потенцировать продукцию CXCL-хемокина IP-10, вызывающего ингибицию дифференцировки ЭК на стадии морфогенеза. Наши собственные эксперименты показали, что IFNy не влиял на образование капилляроподобных структур клетками линии ЕА.Ну926 на Матригеле. Суммируя полученные нами данные, можно говорить о том, что в отличие от существующего в литературе представления об INFy, как о ангиостатическом цитокине, нам не удалось получить подтверждающих данных. В нашей модели, IFNy не проявлял антиангиогенных свойств в отношении ЭК линии ЕА.Ну926. Более того, способность усиливать адгезию к коллагену I типа, можно расценивать как проангиогенное действие этого цитокина (Табл. 6).

По литературным данным, IL-4 является потенциальным митогеном для микрососудистого эндотелия. Наши собственные данные, полученные на линии клеток ЕА.Ну926, также говорят о митогенном эффекте IL-4. Причем, максимальный эффект был получен в концентрации - 1 нг/мл. В экспериментах in vivo IL-4 подавлял bFGF -индуцированный ангиогенез, ингибируя миграцию ЭК. В отличие от этого, в низкой концентрации (0,01 нг/мл) IL-4 стимулировал миграцию ЭК. Есть литературные данные о том, что IL-4 индуцирует экспрессию адгезионной молекулы VCAM-1 ЭК, растворимая форма которой является потенциальным хемоаттрактантом для ЭК. В нашей модели IL-4 не влиял на миграционную активность клеток линии ЕА.Ну926. В экспериментах in vilo IL-4 рекомбинантный белок заметно стимулировал образование капилляроподобных структур, как микрососудистым, так и макрососудистым эндотелием. Однако на клетках линии ЕА.Ну926 не удалось воспроизвести этого эффекта IL-4. В наших исследованиях IL-4, в отличие от ЮТу, не влиял и на адгезионные свойства ЭК. В нашем исследовании IL-4 никак не влиял и на продукцию ММР-9 клетками линии ЕА.Ну92б. В литературе имеются сообщения о том, что IL-4 может ингибировать продукцию ММР-9 активированными моноцитами/макрофагами, однако в отношении ЭК нам не удалось найти аналогичных работ.

Таким образом, результаты нашей работы выявили некоторые различия характера действия IFNy и IL-4 на ЭК линии ЕА.Ну926. IL-4 стимулировал пролиферацию этих клеток, не влияя при этом на основные характеристики ЭК, в то время как IFNy проявил наиболее

выраженное из всех изученных факторов стимулирующее действие в отношении адгезии клеток линии ЕА.Ну926 к коллагену I типа, не влияя на их пролиферативную активность.

Таблица 6. Влияние ростовых факторов и цитокинов на свойства ЭК человека ЕА.Ну92б, причастные к ангиогенезу.

Исследованные свойства ■ Ростовые факторы и цитокины

¡VEGF bFGF TNFa IL- 1Р IL-8 GM-CSF IFNa IFNy IL-4

Пролиферация Т Г i т тт 0 U 0 ТТ

Миграция Т 0 тт тт Tí 0 1 0 0

Образование капилляроподоб ных структур ТТ Т т т т - 0 0 0

Адгезия тт ' т ÍT тт т ттт 0 ТТТ 0

Экспрессия интегринового комплекса ау(33 0 0 т 0 0 - - - 0

Продукция ММР-9 0 0 m тт т - U - 0

Обозначения: - стимулирующий эффект, "i" - ингибирующий эффект, количество стрелок указывает на выраженность эффекта, "О" - отсутствие эффекта,"-" - отсутствие данных.

Обобщая результаты работы, необходимо отметить, что наша работа выявила некоторые противоречия с существующими в литературе данными. YEGF и bFGF считаются наиболее эффективными проангиогенными молекулами in vitro и in vivo. В нашей системе эти факторы проявляли относительно слабую активность в отношении пролиферации и миграции ЭК линии ЕА.Ну92б и никак не влияли на продукцию ММР-9. Можно предположить, что сниженная чувствительность ЭК линии ЕА.Ну926 связана с постоянным стимулирующим действием ЭТС на клетки долгоживущих культур, к которым принадлежит и линия клеток ЕА.Ну926. Любая ЭТС содержит остатки ростовых факторов, которые поддерживают пролиферацию клеток в культуре. Следствием, по всей вероятности, является снижение чувствительности к стимулирующему действию ростовых факторов, возможно, за счет снижения уровня экспрессии рецепторов ростовых факторов. В литературе описано стимулирующее действие GM-CSF на ангиогенез и, в частности, на пролиферацию ЭК. Другие исследователи утверждают, что на клетках HUVEC отсутствуют рецепторы для GM-CSF и в отношении этих клеток GM-CSF не обладает митогенным действием. Наши данные также свидетельствуют об отсутствии эффекта GM-CSF на пролиферацию ЭК. Нам не удалось найти данных об экспрессии рецепторов к GM-CSF ЭК линии ЕА.Ну926. Однако среди изученных ростовых факторов и цитокинов GM-CSF показал себя, как один из наиболее эффективных стимуляторов адгезии клеток лиши ЕА.Ну926

к коллагену I типа. Данному феномену пока не удалось найти объяснение. Интегриновый комплекс сс\'РЗ, по литературным данным, относительно слабо экспрессируется покоящимися ЭК, чему соответствует низкий уровень экспрессии, который мы выявили на клетках линии ЕА.Ну926. Только активированные, пролиферирующие ЭК обильно экспрессируют интегриновый комплекс тфЗ. Из всех изученных факторов только TNFa повышал уровень экспрессии этого интегрина. Следует отметить, что все изученные цитокины и ростовые факторы, за исключением IL-4, усиливали адгезию клеток линии ЕА.Ну926 к коллагену I типа. По видимому это связано с тем, что адгезия к белкам внеклеточного матрикса, в том числе к коллагену, обеспечивается целым спектром адгезионным молекул из семейства интегринов. Для каждого вида субстрата (коллаген, фибрин, ламинин, витронектин и т.д.), существует свой набор ответственных за адгезию молекул. В частности, адгезию ЭК к коллагену I типа обеспечивают не только молекулы avp3 и avp5, но и a2pi и aipi. Этим можно объяснить отсутствие корреляции усиления адгезии ЭК к коллагену I типа с экспрессией интегринового комплекса avp3. Тем не менее, выявленный нами факт экспрессии интегринового комплекса av|33 на поверхности ЭК линии ЕА.Ну926 отличается новизной, так как нам не удалось найти в литературе аналогичных данных в отношении этой линии клеток.

В заключение необходимо отметить, что деление цитокинов на провоспалительные и противовоспалительные оказывается чисто условным с учетом их влияния на ангиогенез. Как показали наши данные и анализ литературы по данному вопросу, цитокины с преимущественно провоспалительным потенциалом могут оказывать как стимулирующее действие на ангиогенез, так и ингибирующее. Классические провоспалительные цитокины IL-ip и IL-8 обладают ярко выраженным проангиогенным действием, TNFa характеризуется двойственным влиянием, а IFNa и INFy ингибируют ангиогенез. Противовоспалительный цитокин IL-4 оказывает стимулирующее действие на ангиогенез in vitro и in vivo (в нашем исследовании этот цитокин стимулировал пролиферацию ЭК), а IL-10, также с противовоспалительными свойствами, по данным литературы, характеризуется антиангиогенными потенциалом. Говоря об ангиогенезе, предпочтительно говорить о позитивных и негативных регуляторах данного процесса. Причем, такое разделение отражает не только направленность действия цитокинов на свойства ЭК, но и учитывает их действие в динамике. Подобно воспалительному процессу, в ходе которого на ранних этапах секретируются цитокины с провоспалительным действием и далее по принципу обратной связи активируется продукция молекул, ограничивающих воспаление, так и при ангиогенезе за позитивной регуляцией следует негативная, что приводит к редукции пролиферативного ответа, миграционной активности, к инактивации протеолиза. При этом ангиогенез включается на стыке поздней фазы воспаления и начала репаративного процесса,

когда снижается действие агрессивных факторов микроокружения и формируется благоприятный фон для индукции ангиогенеза. Но необходимо учитывать, что если репаративный, ангиогенез при ранозаживлении обладает тенденцией к самоограничению, то ангиогенез. в патологических условиях (опухоль или хроническое воспаление) характеризуется преобладанием позитивных регуляторов. В связи с этим опухоль часто сравнивают с хронически незаживающей раной.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана экспериментальная модель с использованием перевиваемой линии эндотелиальных клеток человека ЕА.Ну926, пригодная для изучения про- и антиангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы VEGF и bFGF стимулировали основные свойства эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну926: VEGF более эффективно стимулировал образование капилляроподобных структур, a bFGF сильнее стимулировал пролиферацию клеток этой линии;

3. Провоспалительный цитокин TNFa, который в высокой концентрации ингибировал пролиферацию клеток линии ЕА.Ну926, стимулировал все остальные изученные функции эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну92б: повышал интенсивность адгезии, миграции эндотелиальных клеток, экспрессию интегринового комплекса avP3, продукцию ММР-9 и формирование капилляроподобных структур in vitro;

4. Провоспалительные цитокины IL-ip и IL-8 однонаправлено влияли на свойства эндотелиальных клеток линии ЕА.Ну926, стимулируя пролиферацию, миграцию, продукцию ММР-9 и адгезию клеток к коллагену I типа, но IL-8 обладал наиболее выраженным стимулирующим действием на пролиферацию, а IL-lp сильнее стимулировал адгезию и продукцию ММР-9;

5. . INFa оказывал антиангиогенное действие на эндотелиальные клетки линии ЕА.Ну926,

ингибируя их пролиферацию, миграцию и продукцию ММР-9;

6. IL-4 стимулировал пролиферацию эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну926, не влияя при этом на основные характеристики эндотелиальных клеток, в то время как IFNy проявил наиболее выраженное из всех изученных факторов стимулирующее действие в отношении адгезии клеток линии ЕА.Ну926 к коллагену I типа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Старикова Э.А., Амчиславский Е.И.. Соколов Д.И., Фрейдлин И.С., Полосухина Е.Р. Барышников А.Ю. Изменения поверхностного фенотипа эндотелиальных клеток под влиянием провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. // Медицинская Иммунология. -2003,- Т.5, №1-2.- С. 39 - 48.

2. Амчиславский Е.И.. Соколов Д.И., Старикова Э.А., Фрейдлин И.С. Цитокиновый контроль ангиогенеза. // Медицинская иммунология. -2003,- Том 5, №5-6. - С. 493-506.

3. Амчиславский Е.И.. Соколов Д.И., Сельков С.А., Фрейдлин И.С. Пролиферативная активность эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну926 и ее модуляция. // Цитология. -2005,- Т. 47, № 5. - С. 389-399.

4. Старикова Э.А., Соколов Д.И., Амчиславский Е.И., Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р., Фрейдлин И.С. Сравнительная характеристика человеческих эндотелиальных клеток линий ЕА.Ну926 и ЕС304. // Медицинская Иммунология,- 2002. - Т.4, №2.- С.134.

5. Starickova Е.А., Sokolov D.I, Amtchislavski E.I.. Baryshnikov Yy. A., Polosuhina E.P., Freidlin I.S. Comparative characteristics of human endothelial cell lines EA.Hy926 and ECV 304. // 6th John Humphry advanced summer programme in immunology: abstracts. -2002. - P. 131.

6. Amtchislavski E.I.. Starickova E.A., Sokolov D.I, Freidlin I.S. Comparative characteristics of different methods for study of the proliferative activity of human endothelial cell line EA.Hy926. // 6th John Humphry advanced summer programme in immunology: abstracts. -2002.-P. 6.

7. Olga V. Sazonova, Elena Yu. Blishchenko, Konstantin V. Leontiev, Sergei V. Khaidukov, Evgeny I. Amtchislavski, Ella A. Starikova, Dmitry I. Sokolov, Irina S. Freidlin, Oleg N. Yatskin, Marina M. Philippova, Andrei A. Karelin and Vadim T. Ivanov. Tissue Specific Peptide Pools: Fine Tuning of Cell Proliferation Rate in Cell Cultures and Tissues. // Peptides. Peptide revolution: genomics, proteomics & therapeutics. (Proceedings of the 18th American Peptide Symposium, American Peptide Society), San Diego. -2003. - P. 952-954.

8. Амчиславский Е.И.. Старикова Э.А.. Соколов Д.И., Фрейдлин И.С. Влияние провоспалительных цитокинов на пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток линии ЕА.Ну 926. // Медицинская Иммунология. -2003,- 'Г.5, №3-4. - С.188.

9. Амчиславский Е.И.. Фрейдлин И.С. Влияние цитокинов на пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток линии ЕА.Ну 926. // Русский журнал по иммунологии. -2004,- Т. 9, №1. - С. 32.

10. Irina S. Freidlin, Ela A. Starickova, Evgueni I. Amtchislavski. Dmitri I Sokolov, Tatyana E. Kisina, Sergei A. Selkov. Cytokine Control of Intereaction of Endothelial Cells EA.hy926 with Monosytic Cells U-937 in an In Vitro Co-culture System. // Clinical and Investigative Medicine. -2004. - Vol. 27, N. 4. - P. 53B.

11. Амчиславский Е.И.. Фрейдлин И.С. Влияние цитокинов на адгезионную и миграционную активность эндотелиальных клеток. // Медицинская иммунология. -2005. - Т. 7, №2-3. - С. 109.

12. Amchislavskiv E.I.. Proinflammotory cytokines TNFa and IL-1(3 induces angiogenic properties of endothelial cell line EA.Hy926. // 7th John Humphry advanced summer programme in immunology: abstracts. - 2005. - P. 4.

13. Амчиславский Е.И., Соколов Д.И., Сельков C.A., Фрейдлин И.С. Модификация метода образования капилляроподобных структур эндотелиальными клетками человека линии ЕА.Ну926. // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, №2-3. - С. 414.

Подписано в печать 15.12.2006. Формат 60x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО «КопиСервис». Печать ризографическая. Заказ № 1/1512. П. л. 1.5. Уч.-иад. л. 1.5. Тираж 100 экз.

ЗАО «КопиСервис» Адрес юр.: 194017, Санкт-Петербург, Скобелевский пр., д. 16. Адрес факт.: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 3. тел.: (812) 327 5098

Актуальность проблемы,

Лнгногснез представляет собой многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторе» в соответствующем мнкроокруженнн, благоприятном для формирования новых сосудов из предсу шествующих. Лнгногснез очень редко происходит при физиологических условиях (циклические процессы в репродуктивной системе, раноэаживдение, обновление волосяного покрова), но может вносить существенный вклад в патогене? ряда патологических процессов {канцерогенез, гемоблдстозы. ревмаюндный артрит, оетсоартрнт. псориаз, нсспсцифнческий язвенный катит, диабетическая ретинопатия). Клетки - участники вослял нтельн о го процесса (Т-личфошгш, моноцит/макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы) участвуют в регуляции ангиотенеза за счет продукции про- и противовоспалительных цитокинов, ростовых факторов, которые влияют на функции эндотел иальных Клеток (ЭК): их пролиферацию, миграцию и дифференпнровку. В связи с тесной сопряженностью процессов воспаления н литогенеза весьма актуальным является изучение характера влияния цитокинов на свойства ЭК и на aiu иогенез в целой.

Н литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стнмулнруюшнх н ннгнбнрующнх эффектов цитокииов в отношении ашногенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых жсоериментальных систем и с гетерогенностью ЭК. D частности, данные, полученные с использованием микрососуднстого эндотелия, отличаются от наблюдений, сделанных на клетках макрососудов. Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффскш разных шнокннов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы.

Цель работы.

Провести изучение влияния росювых факгорои н ци'гокннов на функции ЭК человека с использованием и качестве экспериментальной модели перевиваемой линии клеток ЕЛ.Ну926.

В процессе работы решались следующие додачи:

1. разработать оптимальные методы опенки пролиферативной, миграционной, адгезионной активности ЭК человека линии ЕА.Ну926, экспрессии ими шгтегрнноиош комплекса avß3 и продукции матриксной мсталлоирогеН1ШШ-9,

2. разработать метол количественной оценки способности ЭК человека линии ЕЛ. Ну 926 формировать капил ля рол сдобные структуры;

3. изучнгь влияние ростовых фактором и шпокинов ни функции ЭК с использованием разработанной экспериментальной модели.

Научная новизна работы.

В холе работы была разработана новая экспериментальная модель, которая позволяет проводить изучение влиянии биологически активных веществ ид важнейшие функции ЭК человека линии ЕА,Ну92б. Впервые лровелено сопоставление влияли» основных ростовых факторов и разных цтокинов на свойства ЭК, причастные к антиогенезу. а рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что IL-8 может играть роль более мощного индуктора пралифератнвиого ответа ЭК, чем ангногсниыс ростовые факторы VEGF и bFGF, Результаты работы позволили выявить новое свойства ростовых факторов VEGF и bFGF - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики IFN7 и GM-CSF, которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену ] типа при отсутствии влияния на лругие свойства

ЭК. Также впервые была [(оказана экспрессии интагринового комплекса а\'рЗ на поверхности ЭК человека линии ЕАЛу92б.

В ходе работы были разработаны ноше модификации методой оценки проднфератншюп активности ЭК с использованием антаяьного внутриклеточного флуоресцентною красителя белка СР5Е и количественной оценки способности ЭК линии ЕАЛу926 формировать юн]илляроподобныс структуры на Матригелс.

Теоретическая и практическая значимость работы,

В ходе работы была разработана новая экснернменталиная модель, которая поз вол»« проводить изучение влияния биологически активных веществ на важнейшие функции ЭК человека линии ЕА-Ну926. Впервые проведено сопоставление влияния основных ростовых факторов и разных щггокиноп на свойства ЭК, причастные к ангиогенезу, » рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что 1Ь-8 может играть роль более четного индуктора гтролифсршнвного ответа ЭК, чем ангногенные ростовые факторы УЕйР н №№. Результаты работы позволили выявит, новое свойства ростовых факторов Ч'КСР и ЫОГ - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики ИгМу и СМ-С51\ которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену 1 тина при отсутствии влияния на другие свойства ЭК. Также впервые была показана экспрессия ннгсгринового комплекса йу|й на поверхности ЭК человека линии ЕАЛу92б.

В ходе работы были разработаны новые модификации методов опенки пролнферативлой активности ЭК с ж пользованием витального внутриклеточ ного флуоресцентного красителя белка СГБЕ и количественной оценки способности ЭК линии ЕА.Ну92й формирован, капнлляроподобные структуры на Матригелс.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

I, Разработанная экспериментальная модель позволяет проводить комплексное изучение про- и пнтнангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2, Ростовые факторы VEGF, bFGF и провоспаянтельныс шггокины TNFa, tL-l{J, 1L-X оказывают однонаправленное стимулирующее дейетвие eta свойства ЭК человека линии ЕА.Ну926, актуальные для ангногенпа.

3. IFNa зарекомендовал себя как ингибитор антигенного потенциала ЭК человека лншш ЕА,Ну92б.

Реяли шин и работы. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 3 статьи. Материалы диссертационной работы представлены на научной конференции с международным участием "Дин иммунологии н Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002, 2003. 2004, 2005 и 2006гг.), на 6вВ и 7ой международной школе иммунологе« им, Дж. Хамфри (Пушнно. 2003 н 2005 гг.), на 12м международном конгрессе по иммунологии "Clinical and Investigative Medicine" (Канада, 2004), ни 18м Американском симпозиуме по иенгндам (США, 2004).

Объем н структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 32 таблицы н 18 рисунков. Список литературы из 132 наименований

ВЫВОДЫ.

Г Разработана экспериментальная модель с использованием перевиваемой линии эндогел мольных клеток человека ЕЛ Ну926, пригодная для изучения про- и антнангиотеиных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы УБОР и ЬРбР стимулировали основные свойства эндотелнальных клеток человека линии £А-Ну92б: УЕСР более эффективно стимулировал образование шшдл яро подобных структур, a bFGF сильнее стимулировал пролиферацию клеток jioft линии;

3. Провоспалнтельиый цнтокин TNFo, который в высокой концентрации ингибнровш! пролиферацию клеток линии ЕА.Ну92б, стимулировал все остальные изученные функции эидотеяиальных клеток человека линии ЕАНу926: повышал интенсивность адгезии, мш рации эндотелиальных клеток, экспрессию иите трикового комплекса avp3, продукцию ММР-9 н формирование каннлляроподобных структур in vitro;

4. Провоепалнгельные цитокнны IL-Iji н 1L-8 однонанравлено влияли на свойства эндотелиальных клеток линии ЕА-Ну926, стимулируя пролиферацию, миграцию, продукцию ММР-9 и адгезию клеток к коллагену I тина, но IL-8 обладал наиболее выраженным стнмулнрующим действием на пролнфераштю. а 1L-10 сильнее стимулировал адгезию и продукцию ММР-9,

5, fNFa оказывал а1гтнангиогеинос действие на тндотелнальные клетки линии ЕА Ну92б, ннгпбируя их пролифсра1Н1ю, миграцию и продукцию ММР-9;

6. II.-4 сгнмулнровал пролиферацию ■энлотслиальных клеток человека линии ЕА.Ну926, ие влияя при этом на основные характеристики эндотелиальных клеток, в то время как IFNy проявил наиболее выраженное из весх изученных факторов стнмулнруюшее действие в отношении адгезии клеток линии ЕА Ж 926 к коллагену I тнла