Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение различных антигенных препаратов Yersinia enterocolitica и перспектива их использования для серодиагностики иерсиниозов

На правахрукописи

Хоробрых Наталья Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ YERSINIA ENTEROCOL1TICA И ПЕРСПЕКТИВАИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ

Специальность 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2004 г.

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Н.Е.Ястребова

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук К.Г. Каверина

Доктор медицинских наук СВ. Шебалина

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л А. Тарасевича МЗ РФ

Защита диссертации состоится 10 июня 2004 г. на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ГУ Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан 29.04.2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И. В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Yersinia enterocolitica явтяется одним из значимых этиологических факторов в инфекционной патологии человека. Заболевания, вызываемые этим видом бактерий, характеризуются первичным поражением желудочно-кишечного тракта, имеют тенденцию к генерализации процесса с вовлечением в него многих органов и систем организма, а также развитием вторично-очаговых форм заболевания [Коротяев А.И. и соавт., 1998]. При этом иерсиниозной инфекции свойственна полиморфность клипической картины [Гречищева Т.С. и соавт., 1983; Mertz A.K. et al., 1998]. В последние годы Y. enterocolitica рассматриваются в качестве триггерного фактора в запуске аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, что связывают с наличием общих антигенных детерминант в составе бактериальных и тканевых антигенов [Behar S.M. et al., 1995]. Эти обстоятельства, а также то, что иерсинии могут встречаться среди практически здоровых людей, затрудняют установление непосредственной причины заболевания в каждом конкретном случае.

Своевременное выявление заболеваний для проведения адекватной терапии; а также формирование групп риска с целью предупреждения развития осложнений в отдаленные сроки, требует разработки современных диагностических тестов.

Низкая результативность бактериологических методов исследования (25-30%) ввиду тропности бактерий данного вида к тканям человека, и длительность их проведения (5-14 дней) повышают значимость серологических методов диагностики. Наличие или повышение уровня антител к антигенам Y.enterocolitica может служить косвенным доказательством восприимчивости к данной инфекции и важным диагностическим признаком [Покровский В.И. и соавт. 1996].

В настоящее время хорошо изучен антигепный состав Y. enterocolitica [Сомов Г.П. и соавт., 1990; Skurnik M. et al., 1985] и определена диагностическая значимость таких антигенов (АГ) как липополисахариды (ЛПС) и белки наружной мембраны (БНМ) [Ценева ГЛ., 1997]. Вместе с тем, не изучена роль таких поверхностных углеводсодержащих структур, как клеточные стенки (КС), пептидогликан (ПГ), капсульные полисахариды (ПС). Способность бактерий к S->R диссоциации при повышенных температурах культивирования [Brenner D.J. et al.,1980;], наличие более 70 О-сероваров [Коротяев А.И. и соавт., 1998], перекрестные реакции между ЛПС некоторых серогрупп иерсинии и ЛПС других бактерий [Lang S. et al., 1990], а также сложность получения серологически активных БНМ, затрудняют создание современных диагностических препаратов.

Для решения этой проблемы, на наш взгляд, целесообразна разработка такого теста, в

котором б ы сочеталось определение a (i Л^ОСЛПЩИаИЗляге [редпространенных в

СИСЛИОТЕКА 1 С Петербург

ОЭ W0.

популяции серогрупп и АГ, обладающих видовой специфичностью. Единственным тестом, на наш взгляд, в котором возможно одновременное применение различных по специфичности АГ, является иммуноферментный анализ (ИФА).

Поскольку известно, что наиболее широкое распространение при иерсиниозах имеют бактерии 03 и 09 серогрупп Y.enterocolitica [Соколова Е.И., 1998], их ЛПС могут быть включены в состав мультимедийного теста в виде отдельных иммуносорбентов - стрипов полистирольного планшета, лунки которого сорбированы ЛПС разных серогрупп. Третьим иммуносорбентом в составе комплексного теста могут быть стрипы, сорбированные АГ, обладающим видовой специфичностью. Изучение диагностической роли не только БНМ, но и других АГ должно способствовать созданию такого иммуносорбента.

Выделение различных антигенных препаратов Y.enterocolitica необходимо как для создания нового диагностического теста, так и для изучения роли серологически активных компонентов бактерий в перекрестных реакциях с тканевыми антигенами человека.

Целью настоящей работы явилось изучение серологической специфичности различных антигенных препаратов Y.enterocolitica.

Задачи исследования;

1. Получить, охарактеризовать и оценить возможность применения отдельных антигенных препаратов Y.enterocolitica (дезинтеграт, БНМ, КС, ПГ, ЛПС и ПС) для серологической диагностики заболеваний, вызываемых бактериями этого вида.

2. Разработать комплексную иммуноферментную систему для одновременного определения специфических антител к антигенам Y.enterocolitica, обладающим видовой и групповой специфичностью.

3. С помощью разработанной тест-системы изучить состояние гуморального противоиерсиниозного иммунитета у практически здоровых людей и лиц с различной патологией.

4. Определить наличие в составе антигенных препаратов Y.enterocolitica серологически активных компонентов, обладающих перекрестной активностью с антигенами здоровых тканей желудка и щитовидной железы человека.

Научная новизна работы;

Пептидогликаны, выделенные с помощью метода Peterson PLK. et ai. (1978) и углеводсодержащие препараты, выделенные с помощью цетавлона из клеток Y.enterocolitica, не обладают серогрупповой и видовой специфичностью.

Показана возможность использования в ИФА ультразвукового дезинтеграта и препаратов клеточных стенок бактерий как антигенов, обладающих видовой

специфичностью (культивирование бактерий для получения таких препаратов необходимо проводить при температуре 37° С).

Лица пожилого возраста, больные пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы достоверно чаще, чем практически здоровые люди и больные другими аутоиммунными заболеваниями имеют повышенный уровень антител к антигенам Y.enterocolitica.

Перекрестной активностью с антигенами щитовидной железы обладают несколько (М.м. 62,80,100,114 и др.) белоксодержащих компонентов бактерий, а также их ЛПС. Серологически активный компонент Y.enterocolitica с относительной молекулярной массой 11 кДА имеет перекрестнореагирующие эпитопы с антигенами тканей желудка.

Практическая ценность работы:

Разработана высокочувствительная, специфичная и надежная мультимедийная тест-система, позволяющая определять уровень ^ G и ^ M антител к антигенам, обладающим видовой и серогрушювой специфичностью Y.enterocolitica.

Препараты КС Y.enterocolitica могут быть включены в состав скринингового теста для определения ^ G антител к КС целого ряда других условно-патогенных бактерий («ИФА-АТ-УПБ» - прошел контроль и рекомендован к регистрации в РФ Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов, протокол №10 от 24.12.03).

Разработанную тест-систему можно рекомендовать для серодиагностики кишечного иерсиниоза, изучения гуморального звена иммунитета и в качестве скринингового метода для формирования групп риска развития аутоиммунных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получены и охарактеризованы различные антигены Y.enterocolitica (дезинтеграт, БНМ, КС, ПГ, ПС и ЛПС) и установлена целесообразность использования в едином иммуноферментном тесте антигенных препаратов, обладающих серогрупповой (ЛПС 03 и ЛПС 09) и видовой (дезинтеграт) специфичностью.

2. Комплексная иммуноферментная тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью и надежностью и позволяет определять специфические антитела ^ G и ^ M классов в сыворотках крови людей.

3. Частота определения высокой активности антител к антигенам Y.enterocolitica у пожилых людей, больных пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы достоверно выше, чем у практически здоровых лиц и больных другими аутоиммунными заболеваниями.

4. Бактерии У entervcolitica содержат в своем составе антигены, обладающие перекрестной активностью с антигенам тканей желудка и щитовидной железы.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Конференции молодых ученых в НИИВС им. И.И. Мечникова (Москва, 2000); Обществе микробиологов в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва, 2000); на школе иммунологов (Пущино, 2000);на отчетной сессии по Программе «Вакцины нового поколения и медицинские системы будущего» (Сочи, 2000); на 6-ой научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2002); на 5-ом конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела вакцин ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2001).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 447 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 16 рисунками и 14 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 131 источник.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований Материалы

Для выделения бактериальных антигенов и получения сывороток использовали два штамма У. еШегусо1Шса №707 (03) и №92 (09), любезно предоставленные д.м.н., проф. Ющенко Г.В. Культивирование штаммов проводили в течение 24 часов на агаризованной питательной среде Хотгингера и в синтетической питательной среде Ледерберга с добавлением аминопептида. Для получения дезинтеграта, клеточных стенок, пептидогликана и белков наружной мембраны бактерии культивировали на плотной питательной среде при температуре 37°С, для получения ЛПС и капсульных полисахаридов - выращивание проводили при 20-25°С.

В работе использовали гипериммунные кроличьи сыворотки к бактериям Y. enterocolitica и 11 видам других патогенных и условно-патогенных бактерий (УПБ), а также сыворотки к субклеточным фракциям (Сфр) желудка и щитовидной железы человека. Для изучения гуморального противоиерсиниозного иммунитета использовали сыворотки крови доноров станций переливания крови г. Москвы и г. Тулы (225), больных пищевой токсикоинфекцией (ПТИ) (39), увеитом и кератоконъюктивитом (164), больпых различными аутоиммунными заболеваниями (АИЗ) (176), сыворотки пожилых людей (126) и больных хроническими обструктивными болезнями легких (ХОБЛ) (35).

Для подтверждения наличия в выделенных препаратах антител к серогрупповым и видовым антигенам использовали диагностические препараты: сыворотки диагностические к вирулентным иерсиниям и взвесь убитых формалином иерсиний эталонных штаммов серогрупп 03, 04,33; 05,27; 06,30; 07,8; 09 и псевдотуберкулеза I и III биоваров (НИИЭИ им. Пастера, г. С.-Петербург), а также скрининговую иммуноферментную систему для определения Ig G AT к клеточным стенкам 12 представителей УПБ (НИИВС им. И.И. Мечникова). В качестве компонентов ИФА применяли разборные полистирольные планшеты (ВНИИ «Медполимер», г. Москва); 0,1М фосфатно-солевой буферный раствор (рН=6,8-7Д), содержащий 0,5% детергента. Отрицательным контролем в ИФА служил пул 100 сывороток крови доноров, а положительным - пул сывороток больных ревматоидным артритом (РА) с высоким уровнем AT к Y.enterocolitica, подтвержденным в реакции агглютинации и реакции пассивной гемагглютинации. Конъюгатами (КГ) для ИФА были AT диагностические против иммупоглобулинов классов G и М человека, кролика и морской свинки, меченые пероксидазой (ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Субстратная смесь состояла из 0,05% перекиси водорода в цитратно-фосфатном буферном растворе и ортофенилендиамина.

Методы

В работе использовали препараты шести наименований, выделенные из бактерий 03 и 09 серогрупп Y.enterocolitica. Дезинтеграты получали с помощью ультразвуковой дезинтеграции микробных клеток с последующим центрифугированием суспензии. Препараты КС и ПГ получали с помощью метода Peterson PLK. et al (1978), ЛПС - с помощью водно-фенольной экстракции с последующей очисткой ультрацентрифугированием [Westphal О., Jann К., 1965]. Полисахаридсодержащие препараты выделяли с помощью цетавлона [Gotshlich E.C. et al., 1969]. Выделение БНМ осуществляли по методу, описанному Schneitman et al.(1980).

Для характеристики выделенных антигенных препаратов использовали методы определения белков [Lowry O.H. et al., 1951], углеводов [Dubois M. et al., 1956] и нуклеиновых кислот [Спирин А.С., 1958]. Полипептидный состав белоксодержащих АГ

устанавливали с помощью электрофореза в 10% полиакриламидпом геле, определяя относительную молекулярную массу (М.м.) компонентов по калибровочной кривой, построенной по стандартам молекулярных масс. В качестве методов иммунохимического анализа препаратов использовали реакцию преципитации в геле по Оухтерлони (ДЦГ)> линейпый иммуноэлектрофорез, ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ), реакцию агглютинации, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), его торможение и иммуноблотинг.

Полученные результаты подвергали статистической обработке [Бойли М., 1962; Урбах В.Ю., 1975]. Определение специфичности и чувствительности иммуноферментного теста проводили по формулам [Glynn A., Ison C.,1981].

Результаты и их обсуяедение

1. Химическая и иммунохимическая характеристика антигенных препаратов Y.enterocoliuca -

Анализ химического состава АГ шести наименований (дезинтеграт, КС, ПГ, ПС, ЛПС, БНМ), выделенных из бактерий 03 и 09 серогрупп показал, что КС, ПГ, ЛПС и ПС являлись препаратами с преобладанием в их составе веществ углеводной природы (табл.1).

Исключение составляли препараты ПС, выделенные из бактерий 09 серогруппы. А дезинтеграты и БНМ имели доминирующее содержание веществ белковой природы. При этом максимальное количество углеводов содержалось в составе ЛПС 03 и 09 серогрупп (44,7±3,2 и 51,2±2,4% соответственно), а максимальное количество белка - в дезинтегратах (54,3±3,8 и 55,0±4,1% соответственно) и БНМ бактерий 03 серогруппы (60,0±2,8%) (табл.1).

Изучение полипептидного состава белоксодержащих антигенных препаратов (дезинтегратов и БНМ) с помощью электрофореза в 10% ПААГ показало (табл.2), что как препараты БНМ, так и дезинтеграты, выделенные из бактерий 03 серогруппы, содержали больше полипептидных компонентов, чем аналогичные препараты, выделенные из бактерий 09 серогруппы.

Общими для обеих серогрупп в составе их дезинтегратов было девять полипептидов с М.м. 30, 43, 45, 54, 67, 88, 116, 120 и 148 кДа. Общими для бактерий обеих серогрупп в составе их БНМ было три полипептида с М.м. 43,45 и 54 кДа. Эти компоненты, по данным

Таблица 1. Химический состав антигенных препаратов У.еШегосо1Мса

№№ п/п Наименование препарата Кол-во выдел, серий Содержание, %±8

' Белок Углеводы Нукл.к-ты

1. Дезинтеграт ОЗ 5 54,3+3,8 7,2±0,8* 7,8±1,3*

2. Дезинтеграт 09 5 55,0±4,1 15,7±2,2* 14,3±0,4*

3. КС 03 3 16,4+4,9° 26,8±4,3° 1,2±0,7°

4. КС 09 3 16,3 ±5,0° 24,5±2,1° 1,3±0,7°

5. ПТОЗ 3 9,0±0,9° 28,1±3,4° 5,6±0,3

6. ПГ 09 8 11,2±и° 26,5±1,9° 4,8±0,3°

7. ЛПСОЗ 7 4,7+0,6*° 44,7+3,2° 3,2±0,6°

8. ЛПС 09 5 1,9±0,б*° 51,2±2,4° 2,7±0,5°

9. ПС 03 3 3,3+0,7° 32,0+6,9*° ЗД±0,6°

10. ПС 09 2 3,7+0,7° 3,4+0,3*° 1,5±0,5°

11. БНМОЗ 3 60,0±2,8» 8,6+0,7* 2,9±0,4°

12. БНМ 09 3 35,1+1,8»° 4,0±0,5*° 2,3+0,3°

Примечания: * - различия достоверпы (р<0,05) между препаратами одного наименования,

° - различия достоверны (р<0,05) по сравнению с дезинтегратами соответствующих серогрупп.

Таблица 2. Молекулярные массы полипептидов в антигенных препаратах У.еШегосоИйса по результатам электрофореза в 10 % ПЛАТ

АГ | мопекугцаьв массы (Мм.), кЦа : I I : 1

1 24 ЭСС3741 434547,54 59626466676а 72; 80868390951а 114 116118112014014815С

дез-тОЗ. + + |+|. |+|+1+' + +1+!-!+ +! + + 1 - - ¡+;. +|+ | + + | + ¡' + (- 1 + | +

деэ-тСб! - + 1-1+1+1+1-1 + -1-1+1- +!- -! + + !+! + !-1- !- + 1 - | + ; + 1 + : -

БНиЮЗ 1 - . I +1. : +| +|-! + - ! - 1 - ! - - 1 - - I. - !- !- -

БНМ 09! - -1-!-1 + 1+1+1 +; -1-1-1 - -;-!-!-:- |-

Обозначения: - наличие (+) или отсутствие (-) полипептидных компонентов в составе антигенных препаратов.

литературы, определяют видовую специфичность У.еШегосоПИса [К^^а 1. е! а1., 1993; Ценева ГЛЯ.,1997]. Таким образом, как в составе БНМ, так и в составе дезинтегратов обеих серогрупп У.еШегосоШка были обнаружены видоспецифические АГ.

Анализ антигенного состава выделенных препаратов в различных иммунохимических реакциях показал, что ни ПС, ни ПГ не обладали серологической активностью (табл.3). Препараты ЛПС обладали серогрушювой специфичностью, поскольку реагировали только с кроличьими сыворотками, полученными к штаммам гомологичной серогруппы.

Препараты БНМ, выделегаше из бактерий 03 и 09 серогрупп, обладали аналогичной серологической специфичностью, так же как и дезинтеграты. Вместе с тем, в составе дезшггегратов двух штаммов с помощью РИЭФ обнаружены отрицательно заряженные АГ,

общие для бактерий обеих ссрогрупп. В составе дезинтеграта 03 серогруппы доля этого общего компонента более чем в 2 раза превышала его количество в дезинтеграте 09 серогруппы.

Препараты дезинтегратов и КС в реакции по Оухтерлони имели также общую дугу преципитации с ЛПС. Однако форма преципитата («шпора») свидетельствовала об изменении структуры ЛПС, входящего в состав дезинтегратов и КС.

Таблица 3. Характеристика серологической активности антигенных препаратов

У.еШегосоИНса

Наименование Реакции (+ или -) в различных иммунологических тестах

АГ ДДГ с сыв-кой Линейный РИЭФ ИФА* Тормож.

электрофорез с сыв-кой с сыв-кой ИФА»*

03 09 03 09 03 09

Дезинтеграт 03 Дезинтеграт 09 ++++ -н-н- ++++ ++++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ + ++++ ++++ 1111 11П

КС 03 + + + + - +++ +++

КС 09 + + + + н/о н/о +++ +++

ПС 03 - - - . - - н/о

ПС 09 - • - - н/о н/о - н/о

ПТОЗ - ± ± - - ■ н/о

ПГ 09 - - н/о н/о н/о н/о - н/о

ЛПС 03 ++++ - + - - - -

ЛПС 09 - ++++ - + - - -

БНМ 03 + + + + - +++ н/о

БНМ 09 + + + + - - +++ н/о

Примечание: * - ИФА проводили с сывороткой к вирулентным иерсиниям;

**- для торможения ИФА использовали иммупосорбенты с дезинтегратом 03 и сыворотку к У.еЫегосокИса 03 серогруппы Обозначения:« - » отсутствие активности;« + » наличие активности;«++»,«+++», «ми» • степень активности.

На основании полученных данных мы предположили, что в составе КС и дезинтегратов У.еШегосоИНса находятся ЛПС, не имеющие О-специфических полисахаридных цепей. Результаты реакции перекрестного торможения ИФА (использовали полистирольные пластины, сорбированные дезинтегратом 03 серогруппы) различными АГ (дезинтегратами, КС и ЛПС 03 и 09 серогрупп) подтвердили высказанное предположение (табл.3).

Для дополнительного, установления наличия в составе выделенных антигенных препаратов серологически активных видоспецифических АГ применяли ИФА, в котором использовали сыворотку к вирулентным иерсиниям, содержащую AT к БНМ У.еШегосоИНса. С помощью ИФА было установлено, что наиболее выраженной видовой специфичностью обладали дезинтеграты обеих серогрупп (они реагировали с разведением диагностической

сыворотки 1:1600), а также БНМ и КС (реагировали с разведением диагностической сыворотки 1:800). Препараты ПС не обладали серологической активностью, а ПГ и ЛПС реагировали с сывороткой, разведенной в 1:50 и 1:100 соответственно (табл.3).

Таким образом, стало очевидным, что использование дезинтегратов, не содержащих 8 -специфических ЛПС, предпочтительнее, чем БНМ, т.к. способ их получения был значительно проще.

Обобщив результаты химического, физико-химического и иммунохимического анализа антигенных препаратов (дезинтеграт, БНМ, КС, ПГ, ЛПС и ПС), выделенных из бактерий наиболее распространенных в популяции серогрупп У.еШегосоШка, стало очевидным, что для разработки ИФА с целью определения видоспецифических АТ можно использовать дезинтеграт или КС бактерий 03 серогруппы, а для определения АТ к серогрупповым АГ -очищенные ЛПС бактерий 03 и 09 серогрупп.

2. Разработка комплексной иммувоферментной тест-системы для определения антител против У. еШегосоКйса

При разработке теста на основе видовых и серогрушговых АГ У.еШегосоШка были использованы отечественные разборные полистирольные планшеты для ИФА. Коэффициент вариации результатов анализа контрольных (К + и К -) сывороток на этих планшетах, как в случае иммуносорбента на основе дезинтеграта, так и ЛПС двух серогрупп, не превышал 6%, что свидетельствовало о высокой надежности анализа.

Для установления сенсибилизирующей дозы иолисчирольные планшеты сорбировали АГ в концентрациях 1,2,5 и 10 мкг/ мл. Растворяющим АГ буфером был ФСБ. Длительность сорбции составляла 2 ч при 37°С. На полученных иммуносорбентах анализировали гипериммунные кроличьи сыворотки к бактериям 03 и 09 серогрупп и сыворотки не иммунизированных животных, взятые в разведении 1:1000. Критерием подбора оптимальной дозы служила максимальная величина разности оптической плотности (ДОП) реакции между контрастными сыворотками. Минимальной сенсибилизирующей дозой дезинтеграта, обеспечивающей максимальные различия между положительным и отрицательным контролями была концентрация 2 мкг/мл, а КС и ЛПС 03 и 09 серогрупп - 5 мкг/мл.

Для установления оптимального рабочего разведения сывороток использовали пулированные сыворотки людей. Отрицательным контролем служил пул сывороток крови 100 доноров станции переливания крови (К-), а положительным - пул 39 сывороток от 13 больных ревматоидным артритом с высоким уровнем АТ к У.еШегосоШка (К+), установленным с помощью реакции агглютинации с шестью серогрупповыми

иерсшшозными АГ. В сыворотках определяли АТ двух классов (Ig О и ^ М) с помощью коммерческих конъюгатов. Критерием подбора рабочего разведения сывороток служила также максимальная величина АОП между К+ и К-. При определении АТ ^ М класса рабочее разведепие сывороток составляло 1:400 независимо от природы АГ в составе иммуносорбента. Рабочим разведением сывороток при определении ^ О АТ в случае использования дезинтеграта и ЛПС 03 серогруппы было разведение 1:800, а для КС и ЛПС 09 серогруппы-1:100.

При установлении рабочего разведения КГ был использован тот же критерий, что и при определении рабочего разведения сывороток - максимальные различия между К+ и К-. Как правило, рабочее разведение КГ соответствовало указанному в инструкциях по применению.

При разработке ИФ-теста для определения АТ к АТ У.еШеюсоШка было решено использовать в качестве внутреннего контроля пул сывороток 100 доноров станции переливания крови и оценивать результаты ИФА в величинах разности оптической плотности между анализируемой сывороткой и внутренним контролем (К-), взятых в рабочем разведении. Для выбора «точки отсечения» отрицательных показателей с иммуносорбентом на основе дезинтеграта, КС и ЛПС 03 и 09 серогрупп были проанализированы три группы сывороток: сыворотки здоровых доноров (п=35); сыворотки больных бронхо-легочными заболеваниями(п=35); сыворотки больных РА (п=39), среди которых в 21 случае с помощью реакции агглютинации предварительно определили высокий уровень АТ к У.еШеюсоШка 03 серогруппы, а в 18 - к бактериям 09 серогруппы (табл.4).

В результате скрининга сывороток в ИФА с различными АТ У.еШеюсо1Шса Сдезинтеграт, ЛПС 03 и 09 серогрупп и КС) установлено, что основная масса сывороток доноров и больных ХОБЛ давали ДОП в диапазоне значений от +0,2 до -0,2. Только для 2,6 -5,7% лиц этих групп показатель АОП был >+0,2. У лиц положительного контроля наблюдалась другая закономерность, от 74,4 до 100% сывороток имели показатель АОП £ +0,3. В связи с этим точка отсечения отрицательных показателей соответствовала величине ДОП=+0,2, а сыворотки, дающие значения АОП>+0,3, стали считать положительно реагирующими.

Следует отметить, что для всех используемых АГ при определении специфических АТ ^ О и ^ М классов точка отсечения отрицательных показателей была единой.

Поскольку распределение анализируемых сывороток по уровню ^ О и ^ М АТ с дезинтегратом и КС У.еШеюсо1Шса не имело достоверных различий, в дальнейших исследованиях для анализа противоиерешшозных АТ использовали иммуносорбент на основе дезинтеграта. Вместе с тем, полученные результаты позволяют дополнить

иммупосорбентом на основе КС ранее разработанный скрининговый тест на основе КС 12 представителей УПБ [Ястребова Н.Е. и соавт., 1999].

Чувствительность и специфичность ИФА на основе дезинтеграта и ЛПС 03 и 09 серогругш устанавливали при анализе сывороток крови тех же групп обследованных -доноров, больных РА и ХОБЛ и выражали в процентах (табл.4 и 5).

Таблица 4. Чувствительность и специфичность теста на основе различных антигенов

Иммуно-сорбент на основе АГ Число сывороток в группах Частота положительв. (ДОП £+0,3) реакций в группах Чувствительность ,% Специфичность, %

Положит, контр.* Здоровых и больных ХОБЛ Положит, контр.* Здоровых и больных ХОБЛ

Дезинтеграт 39- 70 39 3 100,0 95,7±2,4

ЛПС 03 21 70 21 4 100,0 94,3±2,8

ЛПС 09 18 70 17 3 84,4±5,6 95,7±2,4

Таблица 5. Чувствительность и специфичность ИФА на основе различных антигенов • _У.епХвгосоГМса при определении антител ^ G класса

Иммуно-сорбент на основе АГ Число сывороток в группах Частота положительн. (ДОП £+03) реакций в группах Чувствительность. % Специфичность, %

Положит, контр* Здоровых и больных ХОБЛ Положит, контр* Здоровых и больных ХОБЛ

Дезинтеграт 39 70 29 4 74,7±7,0 94,3±2,8

ЛПС 03 21 70 17 3 . 81,0±8,6 95,7±2,4

ЛПС 09 18 70 15 3 83,3±8,8 95,7±2,4

Примечания к табл.№4 и №5: при определении чувствительности и специфичности к антигенам различной природы различия не достоверны (р>0,05); * -сыворотки больных РА с высоким уровнем AT в реакциях агглютинации и РПГА.

Чувствительность теста на основе дезинтеграта, ЛПС 03 и ЛПС 09 не имела достоверных различий (р >0,05) при определении специфических M (табл.4) и Ig G AT (табл.5) и находилась в диапазоне значений 84,4 -100% (при определении M AT) и 74,7 -83,3% (при определении ^ G AT).

При определении ^ M AT к ЛПС 03 серовара во всех сыворотках больных с серологически диагностированным иерсиниозом 03 серовара были определены высокие уровни AT, что свидетельствовало также о высокой чувствительности теста (табл.4). Только в одной из 18 сывороток больных с серологически определенным иерсиниозом 09 серовара не было в ИФА определено повышенного уровня AT. Поэтому, чувствительность такого

теста была ниже - 94,3%. Однако эти различия по сравнению с тестом на основе дезинтеграта и ЛПС 03 серовара не носили достоверного характера (р>0,05).

В случае определения ^ М АТ к дезинтеграту в сыворотках здоровых и больных ХОБЛ повышенный уровень АТ (Л ОП^+0,3) был определен в трех случаях. Исходя из этого, специфичность теста составила 95,7% (табл. 4). Среди этих же сывороток высокий уровень ^ М АТ в ИФА к ЛПС 03 серовара определили в 4-х случаях, а ^ М АТ к ЛПС 09 серовара - в 3-х случаях. Исходя из полученных результатов, специфичность теста на основе ЛПС составила 94,3 и 95,7 % соответственно.

Чувствительность и специфичность разработанного теста при определении АТ ^ О класса не носила достоверных различий (р>0,05) по сравнению с определением АТ ^ М класса. Однако имелась тенденция к понижению чувствительности теста при определении ^О АТ (табл.5).

Таким образом, на основании препаратов ультразвукового дезинтеграта У.епШегосоШса и очищенных ЛПС 03 и 09 серогрупп была разработана комплексная иммуноферментная тест-система, обладающая высокой чувствительностью, специфичностью и надежностью и позволяющая определять в сыворотках крови людей уровень специфических АТ ^ О и ^ М класса.

3. Изучение уровня специфических антител к У. впХвгосоНИса среди различных групп людей

Процесс установления диагноза с помощью ИФА следует рассматривать как вероятностный, тле любой иммунохимический метод может быть только частью общей диагностической процедуры и не может быть использован вне клинической интерпретации. Поскольку мы располагали лишь сыворотками здоровых и больных различными заболеваниями людей (диагноз был определен клиницистами), разработанный иммуноферментный тест использовали для определения уровня АТ к АТ У.епШегосоНПса в этих сыворотках, а не для постановки диагноза.

При скрининге сывороток доноров станций переливания крови г.г. Москвы и Тулы (возраст доноров 20-57 лет) было установлено (табл.6), что около 10% этих лиц имели повышенный уровень ^ О и ^ М АТ к АТ У.епШегосоНПса. При этом имелась тенденция к более высокой частоте позитивных реакций с ЛПС 03 серогруппы. О том, что у практически здоровых людей может регистрироваться повышенный уровень АТ к У.епШегосоНПса, уже сообщалось в литературе. Так среди доноров Болгарии такие показатели регистрировались в 10,9% случаев, среди здоровых жителей Финляндии - в 4,0%, Северо-восточных штатов

Америки -1,6% [8сЬо11е«т С. й а1., 1987]. Среди жителей Заполярья нашей страны повышение титра АТ к УепШегосоНПса обнаружено в 0,68% случаев [Ющенко Г.В., 1984]. Среди жителей Ярославской и Самарской области лица, имеющие напряженный иммунитет в отношении возбудителя иерсиниоза, составляли 23,9 и 10,6% соответственно [Воронцова Т.А., 1986].

С помощью ИФА изучали состояние противоиерсиниозного иммунитета у пожилых людей в возрасте старше 60 лет (табл.6). Повышенные уровни ^ О АТ к дезинтеграту УепШегосоНПса регистрировали в 22,1% случаев. Среди пожилых людей, в отличие от практически здоровых, преобладали положительные реакции с ЛПС 09 серогрушш, что может быть связано с наличием в закрытом коллективе (пансионат ветеранов труда г. Москвы) больного или носителя иерсиниозной инфекции данной серогруппы.

Таблица 6. Частота определения высокого уровня антител к У.еМегосоТШса у

здоровых и больных различными заболеваниями людей

Группа обследуемых Частота положительных реакций, % ± т

Дез-т ЛПСОЗ ЛПС09

£0 Ь в 1ЙМ

Доноры г.Москвы (103) 10,7±3,0 12,6±3,3 8,7±2,8 8,7±2,8 5,8±2,3 6,8±2,5

Доноры г.Тулы (122) 12,5±1,1 9,8±2,9 7,4±2,4 12,4±3,0 4,1±1,8 6,2±2,2

Пожилые люди (126) 22,1±3,2* н/о 12ДЬ2,9 н/о 17,1±3,3* н/о

Больные ПТИ (39) 28,2±7,2* 7,7±4,3 23,1±6,7 20,5±6,5 5,1±3,5 7,7±4,3

Больные керато-увеитом (164) н/о н/о 5,5±1,8 н/о 4,3±1,6 н/о

СКВ(32) - 9,4*5,1 н/о н/о - 6,25±4,3

ССД(67) 6,0±2,9 14,9±4,3 2,98±2,1 11,9±2,9 2,98±2,1 5,79±2,8

ДМ(16) 6Д±6,2 12,5±8,5 6Д±6,2 12,5±8,5 - 6,2±6,2

РА(23) 43,5±10,6* 13,04±7,2 39,1±10,4* 13,04±7Д 4,35±4,3 -

АЗЩЗ(25) 40,0±10,0* н/о 36,0±9,6* н/о н/о н/о

Обозначения: ПТИ - пищевая токсикоинфекция; СКВ -системная красная волчанка; ССД -системная склеродермия; ДМ -дерматомиозит; РА -ревматоидный артрит; АЗЩЗ-аутоиммунные заболевания щитовидной железы; н/о -не определяли. Примечания: "-различия достоверны по сравнению с донорами (р<0,05).

Изучение с помощью разработанного теста уровня AT в сыворотках больных пищевой токсихоинфекцией позволило установить, что у 11 (28,2%)пациентов имелся повышенный уровень Ig G AT, а у трех(7,7%) Ig M AT - к дезинтеграту Yenter-ocolitica. При этом уровень Ig G и Ig M AT к ЛПС 03 серогруппы достоверпо (р< 0,05) превосходил аналогичные показатели к ЛПС 09 серогруппы (табл.6). Полученные результаты свидетельствовали о существенной этиологической роли данного вида бактерий в развитии ПТИ.

Поскольку многими авторами обсуждается возможное участие Y enterocolitica в развитии аутоиммунных реакций [Wenzel B.E., Peters A., 1996; Mertz А.К. et al, 1998;], с помощью разработанной тест-системы был проведен анализ сывороток больных с различной аутоиммунной патологией. В исследования включили группу пациентов института глазных болезней им. Гельмгольца, страдающих увеитом и кератоконъюктивитом, тле. такое поражение глаз является симптомом синдрома Рейтера, значительную роль в развитии которого отводят Y.enterocolitica. В силу объективных причин был проведен анализ сывороток крови, а не слезной жидкости. Вероятно поэтому не было обнаружено высокой частоты позитивных реакций с AT Y.enterocolitica (5,5% и 4,3% к ЛПС 03 и 09 серогрупп соответственно) (табл.6). Однако, в отличие от доноров, у которых регистрировались положительные реакции к AT Y.enterocolitica, уровень AT в положительно реагирующих сыворотках пациентов с заболеваниями глаз была достоверно выше (р<0,05).

При анализе сывороток детей с диффузными заболеваниями соединительной ткани (СКВ, ССД, ДМ) не было обнаружено более частых положительных реакций по сравнению с донорами станций переливания крови (табл.6), что свидетельствует о том, что Y.enterocolitica не участвует в запуске оргапонеспецифических аутоиммуппых заболеваний.

Однако при таких аутоиммунных заболеваниях как РА и АЗЩЗ в 43,5% и 40,0% соответственно определяли высокий уровень AT к AT Y.enterocolitica. Полученные данные могли быть связаны как с перенесенной иерешшозной инфекцией, так и с наличием в составе AT Y.enterocolitica перекрестнореагирующих эпитопов с аутоантигенамя человека. Вероятно, поэтому в последние годы проводятся многочисленные исследования по изучению триггерной роли Y.enterocolitica в запуске РА и АЗЩЗ [Luo G. et al., 1994; Mertz A.K. et al., 1998; Strieder T.G. et al., 2003].

Таким образом, скрининг сывороток крови здоровых и больных различными заболеваниями людей показал, что наиболее часто антитела к Y.enterocolitica выявлялись у больных РА, АЗЩЗ, ПТИ и лиц пожилого возраста.

4. Изучение перекрестных реакций между антигенными препаратами

К е^егосоНПса и органными антигенами

В настоящее время считается, что аутоиммунные заболевания возникают в результате дефекта иммунной системы, связанного с реализацией толерантности. В результате происходит активация аутоантигенспецифических клонов Т- и В-лимфоцитов, продуцирующих циркулирующие аутоаптитела и огромное число цитокинов и других медиаторов воспаления [БеЬаг 8.М. е! а1.,1995]. Однако пусковые механизмы аутоиммунных заболеваний до настоящего времени не установлены. Одной из общепризнанных гипотез, пытающихся объяснить причину аутоиммунных заболеваний, является постулирование того, что бактерии, вирусы и паразитарные инфекции являются главными факторами окружающей среды, способными инициировать и поддерживать аутоиммунные реакции. Этот процесс связывают с феноменом молекулярной мимикрии, т.е. способностью микроорганизмов, имеющих структурное подобие с аутоантигенами, стимулировать реакции, ведущие к подрыву нормальных механизмов толерантности. Предполагают, что бактериальные АГ нарушают толерантность на уровне В-лимфоцитов, ведущих к презентации скрытых аутоэпитопов и активации аутореактивных клонов Т-лимфоцитов.

Имеющиеся в литературе данные о наличии в составе клеток Уе^егосоШса плазмидкодированных вирулентных белков (УоРб) с низкой молекулярной массой (5,5 и 8 кДа), имеющих перекрестные реакции с АГ щитовидной железы Н. Е! а1., 1997],а

также результаты анализа сывороток больных АЗЩЗ послужили основанием для более тщательного исследования антигенных компонентов У.еМегосоНПса, участвующих в этих реакциях. Перекрестные реакции изучали с помощью иммуноблотинга и торможения ИФА (рис.1 и рис.2).

Наличие перекрестнореагирующих серологически активных компонентов в составе дезинтеграта У.еМегосоШса было установлено с помощью гипериммунной кроличьей сыворотки морских свинок, содержащих АТ к субклеточной фракции щитовидной железы (рис.1). Такая сыворотка в составе дезинтеграта выявляла около 13 компонентов с относительными молекулярными массами от 24 до 116 кДа. На основании полученных результатов стало очевидным, что перекрестной активностью с АГ щитовидной железы обладают многие АТ У.еМегосоШса, а не только указанные выше. Вместе с тем, при получении сыворотки к АГ щитовидной железы использовался полный адъювант Фрейнда (эмульсия убитых нагреванием M.tubeгculosis, суспендированных в минеральном масле). Точная роль этих бактерий, играющих роль в индукции аутоиммунитета, не установлена.

Рис 1. Иммуноблотинг антигенов УепШегосоНПса и щитовидной железы

Обозначения: А, В - фракции щитовидной железы; С -дезинтеграт У.епШегосоНПса, Д -стандарты молекулярных масс

Проявлены: антисыворотками 1-к У.епШегосоШса, 2- к антигенам щитовидной

железы; 3 - сывороткой больного ДТЗ; 4,5 - сыворотками больных АИТ.

6. 8Э8-электрофорез в 15% ПААГ, реплики окрашены амидо черным.

Поэтому в дальнейшем для определения перекрестнореагирующих АТ У.епШегосоПИса в иммуноблотинге использовали сыворотки больных, страдающих АЗЩЗ (рис.1).

В одной сыворотке содержались ^ О АТ, реагирующие с 11 серологическими компонентами с М.м. от 18 до ПО кДа, сыворотка другого больного проявляла в дезинтеграте один компонент М.м. 62 кДа, а сыворотка третьего больного - четыре аптигенных компонента с Млс. 62, 80, 100 и 114 кДа. Иммунохимически активным компонентом, который проявляли все три сыворотка больных АЗЩЗ, являлся компонент с относительной Мм. 62 кДа. Таким образом, У.епШегосоШса содержит много белоксодержащих серологически активных компонентов, имеющих перекрестную активность с АГ щитовидной железы. Вероятно значительную роль в репертуаре АТ, специфических в отношении У.епШегосоШса, играет состояние иммунной системы каждого человека.

Помимо белоксодержащих АГ У.епШегосоШса перекрестную активность имеют ЛПС этого вида бактерий. Так, торможение иммуноферментной реакции связывания сыворотки больного АЗЩЗ АГ микросомальной Сфр щитовидной железы и различными дозами ЛПС 03 и 09 серогрупп (рис.2) позволило установить, что оба бактериальных АГ и Сфр вызывали 100% торможение в концентрации 4 мкг/мл. В связи с этим, можно высказать

предположение, что перекрестнореагирующие эпитоны У.еЫегосоНИса находятся в структуре липида Л или полисахариде кора ЛПС.

Аутоиммунные реакции часто наблюдают в условиях предшествующей инфекции. Однако до сих пор -не установлено, каковы механизмы поддержания аутоиммунного синдрома после элиминации инициирующего агента. Одним из возможных механизмов является поддержка аутоиммунного процесса иерсистирующими АГ бактерий в течение многих лет. При этом отсутствуют при высеве жизнеспособные бактериальные клетки [Behaг S.M. et э1.,1995]. Другим механизмом, отмеченным тем же автором, является инициация и поддержание аутоиммунного заболевания суперантигенами. Поскольку ЛПС У.впЫгосоШка являются суперантигенами, возможно, им принадлежит основная роль в запуске таких аутоиммунных заболеваний как РА и АЗЩЗ.

PHCJ. Торможение препаратами ЛПС У.еМегосо1Шса и Сфр щитовидной железы реакции связывания антител сыворотки больного аутоиммунным тиреоидитом в тесте на основе антигенов щитовидной железы

Обозначения: по оси абсцисс - концентрация АГ для торможения (мкг/мл);

по оси ординат - значения оптической плотности при 492 нм.

Согласно третьей гипотезе [Behaг S.M. et. э1.,1995], аутоиммунная реакция распространяется волнообразно - экспрессивный аутоиммунный репертуар развивается в течение аутоиммунной болезни. АГ, обладающие перекрестнореагирующими эпитопами, генерируют реакцию, которая распространяется и внутри и межмолекулярно, постепенно вовлекая более широкий диапазон аутоантигенов. Косвенное подтверждение этой гипотезы, как нам кажется, получено при исследовании перекрестных реакций между дезинтегратом

У. вЫвгосоШса Сфр желудка и щитовидной железы человека.

Известно, что бактерии У.е^егосоШса при инфицировании организма человека поражают в первую очередь тонкий кишечник. Однако в дальнейшем страдает весь желудочно-кишечный тракт [Йегер Л., 1986; В.И. Покровский, 1996; Коротяев Л.И. и соавт.,1998]. Поэтому с помощью иммуноблота изучали наличие перекрестнореагирующих АГ в составе вышеназванных бактериальных и тканевых АГ (рис.3).

Сыворотки морских свинок, иммунизированных Сфр желудка, в отличие от сывороток животных, иммунизированных Сфр щитовидной железы, выявляли в составе ультразвукового дезинтеграта У.е^егосоШса только один серологически активный компонент, имеющий относительную М.м. ПкДа. Вместе с тем, гипериммунная кроличья сыворотка к Уе^егосоШса выявляла в составе Сфр желудка шесть серологически активных компонентов с М.м. 21,37,50,54,55 и 60 кДа. А пулированная сыворотка больных АЗЩЗ -

РисЗ. Иммуноблотинг антигенов У.еЫегосоНиса, желудка и щитовидной железы Обозначения: антигены - А -Сфр желудка; В-дезинтеграт У. enteгocohtica\ С-Сфр

щитовдной железы; Д-калибранты молекулярных масс. Сыворотки: 1-Уе^егосоШса\ 2-Сфр желудка; 3 -больных АЗЩЗ.

два компонента с Мм. 37 и 55 кДа. Следовательно, в составе здоровой ткани желудка находится не менее двух (37 и 55 кДа) антигенных компонентов, имеющих перекрестнореагирующие эпитопы как с АТ Уе^егосоШса, так и с АГ щитовидной железы.

Очевидно, что Уе^егосоМта может быть инициатором в запуске аутоиммунных заболеваний не только щитовидной железы и РА, но и желудка [№БЪаккеп Т. е! а1., 2003]. Не исключено, что Уе^егосо!Шса в силу высокой иммуногенности при инфицировании

чувствительных к инфекции людей может вызывать каскад реакций в отношении более широкого спектра органов и тканей.

Полученные нами сведения являются поддержкой гипотезы о молекулярной мимикрии, инициирующей и поддерживающей аутоиммунные реакции. Однако молекулярная мимикрия довольно часто встречается в природе, но не всегда приводит к развитию аутоиммунных заболеваний. Вероятно, этот феномен не является единственной причиной аутоиммунных расстройств.

Так исследования, проведенные Поддубиковым А.В.(2000 г.) показали, что среди доноров экологически неблагоприятного региона (г. Тула), где имеются последствия Чернобыльской катастрофы и прекращена профилактика йод-дефицитных состояний, число серопозитивных реакций в отношении Сфр щитовидной железы примерно в 15 раз выше, чем среди доноров г. Москвы. Вместе с тем, нами установлено, что частота серопозитивных реакций с АТ УеМегосоШса среди доноров двух городов примерно одинакова. При этом частота встречаемости высокого уровня АТ к АТ У.еШегосоШса и АГ щитовидной железы у доноров различных городов имела значительные различия: 78,6% - у доноров г. Тулы и 6,7% - у доноров г. Москвы. Поэтому очевидно, что инициирующим аутоиммунные расстройства у лиц, проживающих в Тульском регионе, выступает не только У.еМег осоИИса, но и другие факторы окружающей среды.

Таким образом, в результате проведенных исследований получены и охарактеризованы шесть различных по химическому составу и локализации в бактериальной клетке антигенных препаратов У.еМег осоНИса двух серогрупп 03 и 09 (дезинтеграты, БНМ, КС, ПГ, ПС и ЛПС). Оценена роль каждого из препаратов в серодиагностике заболеваний, вызываемых У.еШегосойИса. Для создания мультимедийной тест-системы отобраны препараты, обладающие наиболее выраженной видовой (дезинтеграт У.еМегосоНИса 03) и групповой (очищенные ЛПС 03 и 09 серогрупп) специфичностью. На их основе разработана высокоспецифичная, чувствительная и надежная иммуноферментная тест-система, позволяющая определять уровни АТ Ig G и Ig М классов в сыворотках крови людей. С помощью такого теста проведено изучение гуморального противоиерсиниозного иммунитета у здоровых и больных различными заболеваниями людей. Установлена высокая частота встречаемости высоко иммунных в отношении УеМегосоШса лиц, страдающих аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и РА.

Поэтому разработанную тест-систему можно рекомендовать для серодиагностики кишечного иерсиниоза, изучения гуморального звена иммунитета и в качестве скринингового метода для формирования групп риска развития аутоиммунных заболеваний.

Установлено, что бактерии У.епШегосоШса имеют в своем составе много АГ, обладающих перекрестной активностью с АГ здоровых тканей желудка и щитовидной железы, что поддерживает гипотезу о «молекулярной мимикрии», инициирующей аутоиммунные реакции человека.

Выводы

1. Разработана комплексная иммуноферментная система, сочетающая в себе возможность определение специфических антител ^ М и ^ О классов в сыворотке крови людей к антигенам У.епШегосоШса, обладающим серогрушювой (ЛПС 03 и ОПС 09) и видовой (дезинтеграт 03) специфичностью.

2. Иммупосорбенты на основе препаратов клеточных стенок УепШегосоШШса могут дополнить имеющийся скрининговый тест для определения ^ О антител к клеточным стенкам двенадцати представителей условно - патогенных бактерий.

3. Препараты пептидогликанов и капсульных полисахаридов, выделенные по известным методикам из бактерий двух серогрупп У.епШегосоШШса, не обладают серогрупповой и видовой специфичностью.

4. У лиц пожилого возраста, больных пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы установлена более высокая частота положительных реакций с антигенами УепШегосоШШса (35,9-43,5%) в отличие от здоровых и больных другими аутоиммунными заболеваниями людей (3,0-12,6%).

5. Разработанную тест-систему можно рекомендовать для серодиагностики кишечного иерсиниоза, изучения гуморального звена иммунитета и в качестве скринингового метода с целью формирования групп риска развития аутоиммунных заболеваний.

6. Бактерии У.епШегосоШса имеют в своем составе антигены белковой и липополисахаридной природы, обладающие перекрестной активностью с антигенами здоровой ткани щитовидной железы и желудка человека, что поддерживает гипотезу о «молекулярной мимикрии», инициирующей аутоиммунные реакции человека.

Список опубликованных работ

1. Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Цветкова Н.В., Овечко Н.Н., Лебедь Н.Е. (Хоробрых Н.Е.), Елкина С.Е., Сергеев В.В. Характеристика скринингового иммуноферментного теста для определения антител к условно - патогенным бактериям. Ж. Аллергология, астма и клиническая иммунология. 1999,9:148-150.

2. Лебедь Н.Е.(Хоробрых Н.Е.), Подцубиков А.В., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П. Сравнительный анализ активности Ig G антител к антигенам Y.enterocolitica и органоспецифическим антигенам гормонпродуцирующих органов в сыворотках доноров станций переливания крови Москвы и Тулы. Ж. Аллергология и иммунология. 2000, 1(2): 199.

3. Лебедь Н.Е (Хоробрых Н Е.), ЯстребоваН.Е., Ванеева Н.П., Поддубиков Л.В. Определение антител к Yersinia enterocolitica в сыворотках крови доноров. Сб. науч. труд. НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Проблемы инфекционных болезней». 2000, (2): 35-38.

4. Поддубиков А.В., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Лебедь Н.Е.(Хоробрых Н.Е.) Характеристика активности антител к тканевым антигенам гормонпродуцируюпщх органов у доноров крови. Сб. науч. труд. НИИЭМ им. Г.Н. Габричевского «Проблемы инфекционных болезней». 2000, (2):41-45.

5. Лебедь Н.Е( Хоробрых Н.Е.), Поддубиков А.В., Ястребова Н.Е., Ванеева Н.П., Богачева Е.А., Захарова Н.Е. Специфические противоиерсивиозные антитела классов G и М у здоровых доноров крови и больных пищевой токсикоинфекцией. Ж.Микробиол. 2001,2: 8789.

Принято к исполнению 23/04/2004 Исполнено 23/04/2004

Заказ № 153 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68

VAvw.autoieferat.ru

Ш - 91 3 4

Актуальность проблемы. Yersinia enterocolitica являются одним из значимых этиологических факторов в инфекционной патологии человека. Заболевания, вызываемые этим видом бактерий, характеризуются первичным поражением желудочно-кишечного тракта, имеют тенденцию к генерализации процесса с вовлечением в него многих органов и систем организма, а также развитием вторично-очаговых форм заболевания [11,17]. При этом иерсиниозной инфекции свойственна полиморфность клинической картины [6,11,27,37,60,94]. В последние годы Y. enterocolitica рассматривают в качестве триггерного фактора в запуске аутоиммунных заболеваний щитовидной железы, что связывают с наличием общих антигенных детерминант в составе бактериальных и тканевых антигенов [50,76,87,124]. Эти обстоятельства, а также то, что иерсинии могут встречаться среди практически здоровых людей, затрудняют установление непосредственной причины заболевания в каждом конкретном случае.

Своевременное выявление заболеваний для проведения адекватной терапии, а также формирование групп риска с целью предупреждения развития осложнений в отдаленные сроки, требуют разработки современных диагностических тестов.

Низкая результативность бактериологических методов исследования (25-30%), связанная с тропностью бактерий данного вида к тканям человека, и длительность (5-14 дней) повышают значимость серологических методов диагностики. Наличие или повышение уровня антител к антигенам Y.enterocolitica может служить косвенным доказательством I восприимчивости к данной инфекции и важным диагностическим признаком [11,28].

В настоящее время хорошо изучен антигенный состав Y.enterocolitica [31,106,116,120] и определена диагностическая значимость таких антигенов (АГ) как липополисахариды (ЛПС) и белки наружной мембраны (БНМ) [35]. Вместе с тем, не изучена роль таких поверхностных углеводсодержащих структур, как клеточные стенки (КС), пептидогликан

ПГ), капсульные полисахариды (ПС). Способность бактерий к Б—диссоциации при повышенных температурах культивирования [57,58,82], наличие более 70 О-сероваров [120,121], перекрестные реакции между ЛПС некоторых серогрупп иерсиний и ЛПС других бактерий [5,38,89], а также сложность получения серологически активных БНМ, затрудняют создание современных диагностических препаратов.

Для решения этой проблемы, на наш взгляд, целесообразна разработка такого теста, в котором бы сочеталось определение антител (АТ) к ЛПС наиболее распространенных в популяции серогрупп и к АГ, обладающим видовой специфичностью. Единственным тестом, в котором, на наш взгляд, возможно одновременное применение различных по специфичности АГ, является иммуноферментный анализ (ИФА).

Поскольку известно, что наиболее широкое распространение при иерсиниозах имеют бактерии 03 и 09 серогрупп У.еШегосоИНса [17], их ЛПС могут быть включены в состав мультимедийного теста в виде отдельных иммуносорбентов - стрипов полистирольного планшета, лунки которого сорбированы ЛПС разных серогрупп. Третьим иммуносорбентом в составе комплексного теста могут быть стрипы, сорбированные АГ, обладающими видовой специфичностью. Изучение диагностической роли не только БНМ, но и других АГ должно способствовать созданию такого иммуносорбента.

Выделение различных антигенных препаратов У.еМегосоИИса необходимо как для создания нового диагностического теста, так и для изучения роли серологически активных компонентов бактерий в перекрестных реакциях с тканевыми антигенами человека.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящей работы явилось изучение серологической специфичности различных антигенных препаратов У.еМегосоШгса.

Задачи исследования:

1. Получить, охарактеризовать и оценить роль различных антигенных препаратов

Y. enterocolitica (дезинтеграт, БНМ, КС, ПГ, ЛПС и ПС) для серологической диагностики заболеваний, вызываемых бактериями этого вида.

2. Разработать комплексную иммуноферментную систему для одновременного определения специфических антител к антигенам Y.enterocolitica, обладающим видовой и групповой специфичностью.

3. С помощью разработанной тест-системы изучить состояние гуморального противоиерсиниозного иммунитета у практически здоровых людей и лиц с различной патологией.

4. Определить наличие в составе антигенных препаратов Y.enterocolitica серологически активных компонентов, обладающих перекрестной активностью с антигенами здоровых тканей желудка и щитовидной железы человека.

Научная новизна работы:

Пептидогликаны, выделенные с помощью метода Peterson Ph.K. et al. [99] и углеводсодержащие препараты, выделенные с помощью цетавлона из клеток Y.enterocolitica, не обладают серогрупповой и видовой специфичностью.

Показана возможность использования в ИФА ультразвукового дезинтеграта и препаратов клеточных стенок бактерий как антигенов, обладающих видовой специфичностью (культивирование бактерий для получения таких препаратов необходимо проводить при температуре 37°С).

Лица пожилого возраста, больные пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы достоверно чаще, чем практически здоровые люди и больные другими аутоиммунными заболеваниями имеют повышенный уровень антител к антигенам Y.enterocolitica.

Перекрестной активностью с антигенами щитовидной железы обладают несколько (М.м. 62,80,100,114 и др.) белоксодержащих компонентов бактерий, а также их ЛПС.

Серологически активный компонент У.еШегосоИНса с относительной молекулярной массой 11 кДа имеет перекрестнореагирующие эпитопы с антигенами тканей желудка.

Практическая ценность:

Разработана высокочувствительная, специфичная и надежная мультимедийная тест-система, позволяющая определять уровень ^ в и ^ М антител к антигенам, обладающим видовой и серогрупповой специфичностью У.еЫегосоИНса.

Препараты КС У.еМегосоШгса могут быть включены в состав скринингового теста для определения ^ О антител к КС целого ряда других условно-патогенных бактерий («ИФА-АТ-УПБ» - прошел контроль и рекомендован к регистрации в РФ Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов, протокол №10 от 24.12.03).

Разработанную тест-систему можно рекомендовать для серодиагностики кишечного иерсиниоза, изучения гуморального звена иммунитета и в качестве скринингового метода для формирования групп риска развития аутоиммунных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получены и охарактеризованы различные антигены У.еШегосоШка (дезинтеграт, БНМ, КС, ПГ, ПС и ЛПС) и установлена целесообразность использования в едином иммуноферментном тесте антигенных препаратов, обладающих серогрупповой (ЛПС 03 и ЛПС 09), и видовой (дезинтеграт) специфичностью.

2. Комплексная иммуноферментная тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью и надежностью и позволяет определять специфические антител й и М классов в сыворотках крови людей.

3. Частота определения высокой активности антител к антигенам У.егйегосоШса у пожилых людей, больных пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы достоверно выше, чем у практически здоровых людей и больных другими аутоиммунными заболеваниями.

4. Бактерии У.еМегосоИНса содержат в своем составе антигены, обладающие перекрестной активностью с антигенам тканей желудка и щитовидной железы.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на конференции молодых ученых в НИИВС им. И.И.Мечникова (Москва, 2000); Обществе микробиологов в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва, 2000), школе иммунологов (Пущино, 2000); представлены на 3-ем съезде иммунологов и аллергологов СНГ и отчетной сессии по программе «Вакцины нового поколения и медицинские системы будущего» (Сочи, 2000); на научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2002); на 5-ом конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела вакцин ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2001)

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 117 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 16 рисунками и 14 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 131 источник.

5. ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная иммуноферментная система, сочетающая в себе возможность определение специфических антител М и ^ в классов в сыворотке крови людей к антигенам У.еМегосо1Шса, обладающим серогрупповой (ЛПС 03 и ЛПС 09) и видовой (дезинтеграт 03) специфичностью.

2. Иммуносорбенты на основе препаратов клеточных стенок У.еШегосоНйса могут дополнить имеющийся скрининговый тест для определения 1% О антител к клеточным стенкам двенадцати представителей условно - патогенных бактерий.

3. Препараты пептидогликанов и капсульных полисахаридов, выделенные по известным методикам из бактерий двух серогрупп У.еШегосоИйса, не обладают серогрупповой и видовой специфичностью.

4. У лиц пожилого возраста, больных пищевой токсикоинфекцией, ревматоидным артритом и аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы установлена более высокая частота положительных реакций с антигенами У.еШегосоШса (35,9-43,5%) в отличие от здоровых и больных другими аутоиммунными заболеваниями людей (3,0-12,6%).

5. Разработанную тест-систему можно рекомендовать для серодиагностики кишечного иерсиниоза, изучения гуморального звена иммунитета и в качестве скринингового метода с целью формирования групп риска развития аутоиммунных заболеваний.

6. Бактерии У.еШегосоИйса имеют в своем составе антигены белковой и липополисахаридной природы, обладающие перекрестной активностью с антигенами здоровой ткани щитовидной железы и желудка человека, что поддерживает гипотезу о «молекулярной мимикрии», инициирующей аутоиммунные реакции человека.