Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Изучение плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов микроорганизмов

На правах рукописи

15 • гл

Никитина Виктория Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов 2002

Работа выполнена в Саратовском государственном медицинском университете и Саратовском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии.

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Бородулин В.Б. кандидат биологических наук Никифоров В.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Гладилин Г.П. доктор медицинских наук профессор Коровкин С.А.

Ведущая организация: Ростовский научно-

исследовательский онкологический институт МЗ РФ.

Защита состоится « 2002 г. в часов на

заседании диссертационного совета К208.094.01 в Саратовском государственном медицинском университете.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СГМУ.

Автореферат разослан « 7^.» 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета *

Доктор медицинских наук, профессор £ )г Бородулин В.Б.

О

р 190. ($4,0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Изучение механизмов возникновения и распространения нозокомиальных (госпитальных) инфекций является в настоящее время одной из актуальных проблем как теоретической медицины, так и практического здравоохранения. Одним из важных показателей, характеризующих такого рода инфекции, является резистентность бактериальных клеток к широкому кругу антибиотиков и химиотерапевтических средств, которые повсеместно используются для лечения в профилактических и лечебных учреждениях [Глатман JT.H., 1979; Мельникова В.М., 1993; Навашин С.М., 1982; Покровский В.Н., 1988; Сидоренко C.B., 1992; Яфаев Р.Х., 1986; Lowbury E.J.S., 1981; Rubens С.Е., 1981.]

Согласно последним данным, [Влодавец В.В., 1993; Габисония Т.П., 1993; Коротяев А.И., 1988; Лившиц М.Л., 1992; Мороз А.Ф., 1988; Яфаев Р.Х., 1989; Maki D.G., 1981; Olexy V.M., 1982; Tantulavanich S., 1981; Tardif G., 1983.] .в 50 - 80% случаев антибиотикорезистентность условно-патогенных бактерий обусловлена R-плазмидами, которые обнаружены более чем у 45 родов бактерий и способны нести устойчивость одновременно к 20 антибиотикам. Именно поэтому изучение структуры и свойств плазмидных ДНК представляет не только чисто академический интерес, но предполагает активное использование полученных знаний и в практическом здравоохранении.

Следует отметить, что необходимость разработки и внедрения методов получения и очистки плазмидных ДНК определяется возможностью использовать плазмидные ДНК в качестве эпидемиологического маркера для изучения процессов возникновения и распространения внутрибольничных инфекций в условиях клинического стационара.

Все вышеизложенное определило цель и задачи наших исследований.

Цель работы.

Целью настоящего диссертационного исследования является разработка наиболее оптимальных методов выделения и очистки плазмидных ДНК из клинических грамотрицательных условнопатогенных микроорганизмов для использования плазмид в качестве дополнительного эпидемиологического

маркера госпитальных инфекций. Задачи исследования.

1. Провести микробиологическую и биохимическую идентификации штаммов, выделенных от больных, находящихся в стационаре (Саратовский научно-исследовательский институт ортопедии и травматологии), определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

2. Выделить плазмидные ДНК из клинических штаммов микроорганизмов.

3. Разработать новые методы очистки плазмидных ДНК из клинических штаммов микроорганизмов.

4. Исследовать структуру и свойства плазмидных ДНК, определить их молекулярную массу, провести рестрикционный анализ некоторых плазмидных ДНК выделенных из клинических штаммов. Новизна исследований.

Впервые разработана модификация метода Бирнбойма-Доли выделения плазмид из грамотрицательных

микрорганизмов, которая требует меньшего количества времени на процедуру выделения плазмидной ДНК из бактерий в сравнении с классическими методиками получения плазмидных ДНК.

Также, впервые разработан и применен в исследовательской работе метод очистки плазмидных ДНК в большом количестве, пригодный для проведения рестрикционного анализа без привлечения таких дорогостоящих и длительных методических процедур как центрифугирование в градиенте хлористого цезия или препаративная хроматография.

Плазмидная ДНК, обнаруженная в клинических штаммах микроорганизмов, является своеобразным эпидемиологическим маркером, который может дополнить традиционные микробиологические и биохимические методы идентификации бактерий в стационарах. Исследование плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов, позволит с большей достоверностью определять штаммы, вызывающие внутрибольничные инфекции.

Практическая значимость работы. В условиях клинико-травматологического стационара выделены и исследованы плазмидные ДНК из

условнопатогенных грамотрицательных бактериальных штаммов, которые обнаруживаются у больных, находившихся на длительном лечении в стационаре.

В настоящей работе исследована молекулярная масса плазмид, и доказана принципиальная возможность использования плазмидных ДНК в качестве эпидемиологических маркеров, выделенных из клинических штаммов микроорганизмов.

Разработанный нами метод выделения плазмидной ДНК внедрен в практику бактериологической лаборатории СарНИИТО от 27.09.00 года.

Зарегистрировано 2 рацпредложения от 25.03.99г. №№ 2326, 2327.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены:

на 58-й научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, апрель 1997 г.);

- на 1-й городской конференции студентов и молодых ученых «Молодежь и наука на пороге XXI века» (Саратов, апрель 1998 года);

- на международной конференции «Molecular basis of bacterial infection» (Греция, август - сентябрь 1998 год).

- на межгородской конференции «Химия для медицины и ветеринарии» (Саратов, 1998 г.);

- на юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, 1999 г.)

- Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной межкафедральной конференции кафедры биохимии СГМУ и группы геносистематики ИБФРМ РАН 4 апреля 2000 года.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Разработаны 2 рационализаторских предложения.

Структура работы.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и приложение. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 1 таблицей. Список литературы содержит 135 наименований, из них 53 отечественных и 82 иностранных источника.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Разработаны » модификации методов выделения плазмидных ДНК из клинических штаммов.

2. Разработан метод очистки плазмидных ДНК без применения центрифугирования в градиенте хлористого цезия или использования препаративной хроматографии.

3. Обнаружены плазмидные ДНК из клинических штаммов микроорганизмов и идентифицированы их молекулярные массы.

4. Обнаружены плазмиды, обладающие сходными сайтами рестрикции, которые были выявлены в различных штаммах микроорганизмов, выделенных в разные промежутки времени от больных, находящихся на лечении в стационаре.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалом для исследования служили культуры грамотрицательных штаммов бактерий, полученных из бактериологической лаборатории Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии.

Исследование по изучению клинических культур микроорганизмов выполнено на 147 штаммах грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas и семейства Enterobacteriaceae, выделенных от 140 больных с различными гнойными осложнениями.

Для изучения исследуемого материала использовались следующие методы:

Микроскопия материала. Это дало возможность разделить изучаемые штаммы на грамотрицательные и грамположительные бактерии. Окраску мазка проводили общепринятыми методами [Меньшиков В.В., Делекторская JI.H., 1987.]

Определение антибиотикочувствительности микроорганизмов.

Антибиотикочувствительность определяли методом бумажных дисков к 20-22 антибиотикам: бензилпенициллину, полусинтетическим пенициллинам - ампициллину, метициллину, оксациллину, карбенициллину; макролидам -олеандомицину, эритромицину, фузидину, линкомицину, ристомицину, рифампицину, левомицетину; тетрациклинам -тетрациклину, доксициклину, полимиксину; аминогликозидам -

неомицину, канамицину, мономицину, гентамицину, а иногда к сизомицину и клафорану. Исследуемый материал засевали сплошным газоном на поверхность агара в чашках Петри. Затем стерильным пинцетом накладывали бумажные диски, пропитанные раствором антибиотика, на агар. Диски располагались на одинаковом расстоянии друг от друга, от центра чашки и её краев. Засеянные чашки помещали в термостат на 18 часов при температуре 37 °С. При задержке роста вокруг диска диаметром 15 мм - микроорганизмы с малой чувствительностью к антибиотикам. При задержке роста 15-25 мм - средняя чувствительность. Зона более 25 мм - высокая чувствительность к антибиотику. Наличие роста вокруг диска указывало на нечувствительность микроба к антибиотику [Навашин С.М., Фомина И.П., 1982; Фомичев Ю.К., Израитель Н.П., 1957.]

Для выделения плазмидной ДНК использовалась стандартная методика Birnboim и Doli [Birnboim Н.С., Doli S., 1979; Hardy K.G., 1990.]

Использовались реактивы фирм «Sigma», «Chemopol». Центрифугирование проводилось на микроцентрифуге фирмы «Eppendorf».

Определение молекулярной массы плазмидной ДНК. Молекулярную массу плазмидных ДНК определяли при помощи электрофореза. Электрофорез проводился в стандартных условиях: 1% агарозный гель с объемом заполненной лунки 20 мкл, горизонтальный предфорез - 30 мин при 20V; основной гель-форез - 4-5 часов при 40V.

В качестве маркеров молекулярных масс использовали следующие плазмиды: pUC-19 (1,8МДа), pBR-322 (2,9МДа), pBR-325 (4МДа), рсКд11 (бМДа), pSA (23МДа), pR-386 (78МДа), pRTSl (120МДа).

Для контроля хромосомной ДНК использовали бесплазмидный штамм E.coli HB 101. Электрофоретическая камера заливалась трисборатным буфером TBE с конечной концентрацией бромистого этидия 0,5 мкг/мл.

Рестрикционный анализ проводили по Маниатису [Maniatis Т., Fritsch E.F., 1982.], использовав следующие рестриктазы: Bspl, BspRI, Berti.

Анализ рестриктных фрагментов проводился в (6 %,10 %,12 %,15 %) полиакриламидных гелях в TBE буфере и

в агарозных гелях (1,2% и 2%) в ТАЕ буфере. Фотографирование полученных результатов было осуществлено при наличии оранжевого свето-фильтра фотоаппаратом «Зенит» (Россия), с выдержкой 1-10 минут.

Для обработки пленки использовали: проявитель, фиксаж, вода. Проявитель и фиксаж использовали заводского производства.

Статистический анализ. Статистическую обработку численных данных проводили сравнением длин пробега в агарозном геле маркерных плазмид и плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов, с применением метода наименьших квадратов [Рокицкий П.Ф., 1973.]. Для этого использовались следующие формулы: 1. па+(Их()Ь=£у! 2. (ХхОа+( 1х,2)Ь= 1]х,у, 3. у=а+Ьх где, - сумма длин пробегов плазмидной ДНК, 2у; -

сумма молекулярных масс эталонных плазмидных ДНК, п — количество плазмидных ДНК, которые мы исследуем, Ь -коэффициент пропорциональности, а - первоначальное значение у при х = 0, у, х - коррелирующие величины. Уравнение № 3 предусматривает прямолинейную зависимость между х и у, т.е. прямолинейную регрессию. После подстановки наших данных в имеющиеся уравнения, мы получили уравнение регрессии, которое приняло вид уравнения прямой линии.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ В САРНИИТО.

В СарНИИТО были исследованы бактериальные штаммы, выделенные в течении 29 месячного периода, от пациентов данного стационара. Преобладающими заболеваниями у пациентов, находившихся на лечении в СарНИИТО были переломы (29,5%) и остеомиелит (26,1%). Распределение антибиотикорезистентных штаммов

микроорганизмов в отделениях СарНИИТО за период 1997-1999 гг., в % представлено на рисунке 1.

Плазмидосодержащие штаммы составили 53% от общего количества выделенных бактериальных изолятов (рис. 2).

Рис. 1 Распределение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов в отделениях СарНИИТО за период 1997 -1999 гг., в %.

' / Восст. хирургия (-) Восст. хирургия (+) ' Нейрохирургия (-) '' Нейрохирургия (+) '' Травматология (-) Травматология (+)

(+) - штаммы, содержащие плазмиды (-) - штаммы, не содержащие плазмиды

Рис. 2 Распределение штаммов микроорганизмов содержащих плазмиды, в отделениях СарНИИТО за период 1997 - 1999 гг., в %.

Выявленные плазмиды, согласно молекулярным массам, формировали три группы: 1) плазмиды до 10 MD 2) 18-47 MD 3) 58-88 MD, с преобладанием плазмид первой и второй групп (45% и 47% соответственно, среди плазм идосодержащих штаммов). Частота встречаемости плазмид с идентичным плазмидным профилем - 7,5%.

Широкое распространение плазм идосодержащих штаммов и присутствие в них лишь нескольких доминирующих плазмидных типов, указывает на значимость этих плазмид для исследования госпитальной микрофлоры в условиях специфического селективного давления, характерного для данного стационара.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПЛАЗМИД КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Исследования были проведены на 147 грамотрицательных культурах, с последующим выделением и очисткой плазмидной ДНК. 116 культур были антибиотикорезистентны. Большинство штаммов обладало множественной устойчивостью к антибиотикам.

Разработанные нами методы позволяют, за короткий промежуток времени выделить и охарактеризовать суммарную низко - и высокомолекулярную плазмидную ДНК без применения дорогостоящих процедур.

Использование модифицированного метода Бирнбойма-Доли для выделения и экстракции плазмидных ДНК различной молекулярной массы.

Для выделения контрольной плазмидной ДНК использовалась стандартная методика Birnboim и Doli с нашими модификациями.

Модификации метода состоят в том, что, во-первых, по сравнению со стандартным выделением плазмидной ДНК по методу Birnboim и Doli уменьшено время выдержки в ледяной бане; во-вторых, не применялась баня, содержащая смесь сухого льда и этанола; в-третьих, использование отечественных центрифуг, расчитанных на 8000 об/мин нисколько не снизило процент выхода плазмидной ДНК.

Использование модифицированного метода фенольно-хлороформной экстракции для обнаружения низко- и высокомолекулярных ДНК плазмид в клинических штаммах микроорганизмов.

Этот метод мы использовали для быстрого получения небольшого количества плазмидной ДНК.

Модификация метода фенольно-хлороформной экстракции состоит в том, что в течении 5-15 минут осуществляли встряхивание микропробирок. При проведении данной процедуры можно использовать автоматический роторный перемешиватель «Vortex». Выделенная плазмидная ДНК пригодна для электрофоретического исследования.

Таким образом при данном методе выделения затрачивается меньшее количество времени. После проведения электрофореза хорошо видны линии плазмидной и хромосомной ДНК. Результат хорощо воспроизводим.

Извлечение плазмидной ДНК из агарозного геля в легкоплавкую агарозу.

При извлечении плазмидной ДНК из агарозного геля, мы использовали:

- 1% легкоплавкую агарозу «Bio-Rad», 20 мМ трис HCl, pH - 8,0, 1 мМ ЭДТА, 0,ЗМ ацетат Na, фенол-хлороформную смесь из расчета 1:1, спирт этанол 96% перегнанный, ТЕ буфер.

Перед полоской, содержащей плазмидную ДНК, в агарозном геле вырезали лунку. Заливали её 1% легкоплавкой агарозой, содержащей этидий бромид (0,5 мкг/мл). Затем проводили электрофорез до полного вхождения плазмидной ДНК в легкоплавкую агарозу. Вырезали полоску, содержащую плазмидную ДНК и переносили в силиконовую микропробирку. Заливали пятью объемами 20мМ трис HCl и 1мМ ЭДТА (объем лунки, заполненной легкоплавкой агарозой, предварительно измеряли).

Микропробирку нагревали на водяной бане при температуре 65°С, в течение 5 минут (до полного расплавления агарозы).

Экстрагировали агарозу 1 объемом фенола. Центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. Верхнюю фазу отбирали и переносили в другую микропробирку. Добавляли смесь, содержащую фенол и хлороформ в равных объемах.

Центрифугировали при 14000 об/мин 5 минут. Верхнюю фазу переносили в чистую микропробирку.

Затем добавляли 2 объема хлороформа, центрифугировали и отбирали верхнюю фазу.

При добавлении 2-х объемов 96% этанола и ЗМ ацетата (конечная концентрация соли в растворе составляла 0,ЗМ), осуществляли переосаждение ДНК. После центрифугирования осадок, содержащий плазмидную ДНК, промывали 400мкл 70% этанолом. Осадок подсушивали и растворяли в ЗОмкл ТЕ -буфера.

При повторном электрофорезе результат оказался отрицательным. Плазмидная ДНК не обнаруживалась в исследуемых пробах.

Извлечение плазмидной ДНК из агарозного геля в лунки с буфером.

Выделение плазмидной ДНК происходило по модифицированной методике Бирнбойма-Доли, с использованием стандартных растворов. Проведенный нами электрофорез подтверждает наличие плазмидной ДНК.

Для извлечения плазмидной ДНК из агарозного геля, непосредственно перед ней, вырезалась лунка. ТЕ-буфер, которым была заполнена электрофоретическая камера, отбирался до тех пор, пока не достиг одного уровня с гелем.

С боковых сторон, для предотвращения высыхания геля, была вставлена фильтровальная бумага. Её стороны соприкасались с буфером и гелем.

После этого был проведен электрофорез. Через каждые 5 минут собирали буфер из лунок и помещали в микропробирки. Лунки вновь заполняли буфером и подавали электрический ток. Таким образом форез проводился до полного вхождения полосы, содержащей плазмидную ДНК, в лунку с буфером.

Все полученные пробы подвергались переосаждению ДНК при помощи 2,5 объема 96% перегнанного этанола и 1/10 объема ЗМ ацетата N3. После чего осадок промывали 400мкл 70% этанола и подвергали электрофоретическому исследованию.

Результат оказался отрицательным. При проведении повторного электрофореза линий плазмидной ДНК обнаружено не было.

Извлечение плазмидной ДНК из легкоплавкой агарозы.

Для выделения плазмидной ДНК, непосредственно из легкоплавкой агарозы, мы использовали:

- легкоплавкая агароза «Bio-Rad», остальные растворы соответствуют тем растворам, которые использовались при извлечении плазмидной ДНК из агарозного геля в легкоплавкую агарозу.

Плазмидная ДНК выделялась по модифицированной методике Бирнбойма-Доли. Для электрофореза использовались 0,7% и 1% гели, состоящие из легкоплавкой агарозы.

Полосы содержащие плазмидные ДНК, вырезали и помещали в силиконированные пробирки. Затем осуществляли выделение плазмидной ДНК из легкоплавкой агарозы по описанной выше методике.

После переосаждения плазмидной ДНК, осадок растворяли в ЗОмкл ТЕ буфера и пробы ставили на электрофорез.

Результат также был отрицателен. На снимке не отмечалось линий плазмидных ДНК.

Разработка и использование метода выделения и очистки суммарной плазмидной ДНК из клинических бактериальных штаммов микроорганизмов в двухфазной системе ПЭГ-6000-декстран 500.

При данном методе выделения и очистки плазмидных ДНК, использовали следующие растворы:

Раствор № 1 25 % сахароза 50 мМ ТРИС*НС1 pH 8 1 мМЭДТА pH 8

Раствор № 3 10 % сахароза 0,3 М NaOH

Раствор № 2 0,5 М ТРИС*НС1 pH 9 0,1 М ЭДТА pH 9 3 % ДСН

Раствор № 4 9,3 % ПЭГ - 6000 100 мМ ТРИС*НС1рН 9 1 мМ ЭДТА pH 9 0,3 % ДСН 25 мМ сульфат лития

1 г сырой биомассы ресуспендировать в 16,5 мл раствора № 1, после чего добавляли 0,5 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8 (хорошо перемешать). Непосредственно перед употреблением добавить лизоцим, приготовленный на основе раствора № 1 , из расчета 10 мг/мл, перемешать и инкубировать при температуре 37 °С, 30 мин. Полученную суспензию добавить в 20 мл раствора № 2, осторожно перемешать и инкубировать на водяной бане, при температуре 65 °С ,15 мин.

Затем добавить 80 мл раствора № 3, перемешать и оставить на столе 10 мин. По истечении времени добавить 20 мл 3 М ацетата натрия рН 5, перемешать, потом добавить 63,7 мл 40 % ПЭГ - 6000 («Мегск»), 7 мл 20 % декстран 500 («Pharmacia») и 69,3 мл НгО, перемешать.

Центрифугировать на центрифуге К23 D , 5 тыс. об/мин., 5 мин при температуре 20 °С, верхнюю фазу удалить. Провести 5 ступеней экстракции нижней фазы раствором № 4. Для электрофоретического исследования наличия плазмидных ДНК сохранить последние 4 верхние фазы.

Верхние фазы, содержащие плазмидные ДНК, объединить и добавить к ним 1/20 объема 5 М хлорида натрия, перемешать и оставить на столе на 20-30 мин. Центрифугировать на центрифуге К23 D, 5 тыс. об/мин, 20 мин при температуре 20 °С, супернатант удалить.

Осадок дважды промыть 70 % этанолом или 40 % изопропанолом, подсушить и растворить в ТЕ буфере до необходимой концентрации. Механические примеси из раствора удалить центрифугированием на микроцентрифуге 12 тыс. об/мин в течение 10 мин, супернатант перенести в чистую микропробирку.

После указанных процедур проводили выявление плазмидных ДНК методом электрофореза в агарозных гелях (0,7 %, 1,2 %, 2 %) по Маниатису [Maniatis Т., Fritsch E.F., 1982.].

Полученный результат (рис.3) хорошо воспроизводим. При данном методе выделения плазмидная ДНК практически полностью очищается от всех примесей и РНК. Она пригодна для дальнейших исследований.

< Линия старта

<Хромосомная ДНК г Плазмидная ДНК

1. Klebsiella LG-31

2. Proteus vulgaris LG-161

3. Pseudomonas aeruginosa LG-345

4. Serratia plymuthica LG-662

5. pUC-19

6. E.coli DH5a (pGEM-3Z (+))

7. E.coli DH5a (pET-28a (+))

Рис.3 Электрофореграмма плазмидных ДНК выделенных в системе ПЭГ - декстран.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ.

Выделенная плазмидная ДНК подвергалась электрофоретическому исследованию. Электрофорез всегда проводился в стандартных условиях. На электрофореграммах представлены штаммы микроорганизмов Pseudomonas, Serratia, E.coli, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Каждый штамм имеет свой порядковый номер, который был присвоен ему во время работы.

В качестве примера на рис.4 представлены плазмидные ДНК, выделенные из штаммов E.coli и Enterobacter.

i < линия старта 1 < хромосомная ДНК

1плазмидная [ДНК

I <РНК

1-3 - №№ 95,98,186 {E.coli)-, 4 - №345 {Pseudomonas aeruginosa); 5,6 - №№433, 593 (.E.coli);

7- X фаг;

8-11 - №№ 57,68,98,125 СEnterobacter); 12 - плазмида pUC-I9

Рис. 4 Электрофоре граммы ДНК из штаммов с 1-12 (справа налево)

В качестве маркера использовали плазмиду pUC-19 и X-фаг (Институт молекулярной биологии РАН им. В.А.Энгельгардта). У штаммов E.coli №№ 95,98, Pseudomonas aeruginosa № 345, E.coli № 433 и штамма Enterobacter № 98 выявлены полосы плазмидных ДНК. У штаммов E.coli №№ 186,593 видны несколько линий плазмидных ДНК. Возможно эти штаммы содержат несколько плазмид, либо это различные формы одной и той же плазмидной ДНК. Штамм Enterobacter № 68 плазмидную ДНК не имеет. Линия

хромосомной ДНК есть у всех штаммов.

Молекулярные массы плазмидных ДНК определялись после совместного электрофореза с маркерами плазмид.

1 2 3 4 5 6 ;

^ - эталонная плазмидная ДНК ф - исследуемые плазмидные ДНК

а - длина пробега плазмидных ДНК в агарозном геле, в мм.

Рис. 5 Корреляция между величиной молекулярных масс плазмидных ДНК и длиной пробега плазмид в агарозном геле (условия стандартные).

Электрофорез проводили в горизонтальной камере с ТВЕ - буфером в 1 % агарозном геле. Электрофоретический прибор М-234. Электрофорез проводили в 2 этапа: предварительный электрофорез - 30 мин при напряжении 20 V, основной электрофорез - 4 часа при напряжении 40 V. Затем агарозный гель фотографировали.

Все плазмиды, у которых определялась молекулярная масса, были от 1,4 до 88 МДа. На рис. 5 представлено графическое изображение молекулярных масс плазмидных ДНК.

Все выявленные плазмидные ДНК можно разделить на 3 большие группы. Первая с молекулярной массой от 1,4 до 10 МДа, вторая от 18 до 47 МДа и третья от 58 до 88 МДа. Плазмидные ДНК с другими молекулярными массами встречаются реже.

Рестрикционный анализ плазмидных ДНК, выделенных из клинических штаммов микроорганизмов.

При изучении электрофоретических профилей плазмидных ДНК, выделенных из клинических культур, еще нельзя сделать заключение о сходстве плазмидных ДНК. Изучение их молекулярных масс также не дает однозначный ответ, так как мы определяли молекулярную массу суммарной плазмидной ДНК. Поэтому мы решили провести рестрикционный анализ плазмид, электрофоретические профили которых были схожи.

Плазмидная ДНК присутствовала во многих бактериальных клетках. Особый интерес представляли плазмидные ДНК, выделенные от больных, которые длительное время находились на лечении в СарНИИТО. У бактерий № 345, № 662 и №31 электрофоретические профили плазмидных ДНК были подобны. Нас заинтересовал этот факт, и мы решили провести рестриктный анализ этих плазмидных ДНК.

Для рестрикционного анализа провели препаративное выделение ДНК [Nikiforov V.V., Aistov I.A., 1999.] и их очистку при помощи ПЭГ 6000. Все штаммы имели линию хромосомной и плазмидной ДНК. РНК после очистки отсутствовала (рис. 3).

По наборам фрагментов, полученных после обработки рестриктазами 2?spRI, Всп\, Bspl рестрикционный анализ показал, что одна из плазмид Pseudomonas aeruginosa pBN-345 полностью совпадает с плазмидой pBN-662, выделенной из Serratia plymuthica.

На рис.6, представлен рестрикционный анализ исследуемых плазмид, проведенный в 10% полиакриламидном геле.

1 2 3 4 5 6 7

501 Ьр> 489 Ьр> 404 Ьр> 331 Ьр>

67 Ьр>

1. pGEM-3Z(+)/fispI

2. AyPstI

3. Klebsiella LG-31

4. Proteus vulgaris LG-161

5. Pseudomonas aeruginosa LG-345

6. Serratiaplymuthica LG-662

Рис.6 Рестрикционный анализ профилей плазмидной ДНК, выделенных из клинических бактериальных штаммов после гидролиза BspR\ в 10 % ПААГ.

Наличие одной и той же плазмиды в двух генетически столь далеких друг от друга бактериях, по-видимому, связано с горизонтальным генетическим обменом между ними. Это явление, широко изучаемое в настоящее время [Dowson C.G., Barcus V., 1997; Meyer T.F., Barten R., 1999.], значительно снижает эффективность антибиотикотерапии.

В связи с этим плазмидная ДНК может являться, своего рода, дополнительным эпидемиологическим маркером, который можно использовать для выявления и идентификации микроорганизмов, несущих признаки госпитальных штаммов. Целесообразно сосредоточить усилия биохимиков на разработке и внедрении новых методов получения и очистки плазмидных ДНК, которые можно применять в условиях клинико-бактериологических лабораторий.

ВЫВОДЫ

1. Из 147 бактериальных штаммов: Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Citrobacter, E.coli, Serratia plymutica, с выраженной устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, в 78 обнаружены плазмидные ДНК с молекулярными массами от 1,4 до 88 МДа.

2. Разработана модификация метода Бирнбойма - Доли для выделения и экстракции ДНК плазмид из клинических штаммов микроорганизмов. Разработана новая модификация выделения плазмидной ДНК из клинических штаммов микроорганизмов на основе метода фенольно-хлороформной экстракции.

3. Разработан новый метод препаративной очистки плазмидных ДНК в двухфазной водной ПЭГ-декстрановой системе. Отличительными особенностями метода являются простота, выполнение на дешевом лабораторном оборудовании без привлечения токсичных реактивов, типа фенола и хлороформа и, как следствие, доступность широкому кругу исследователей.

4. Обнаружено сходство в электрофоретических профилях рестрикционных фрагментов плазмидных ДНК pBN -345 и pBN - 662, выделенных из штаммов Pseudomonas aeruginosa и Serratia plymuthica, относящихся к различным таксономическим единицам.

5. Изучение электрофоретических профилей плазмидных

ДНК, а также профилей их рестрикционных фрагментов, позволяет сделать вывод о возможности использования плазмидных ДНК в качестве дополнительного маркера при выявлении и идентификации госпитальных штаммов

микроорганизмов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Никитина В.В., Бородулин В.Б. Плазмиды грамотрицательных микроорганизмов, выделенных от больных в травматологической клинике.//58 научная конференция молодых ученых и студентов СГМУ.-Саратов, 1997.-С.90.

2. Никитина В.В., Вельская H.A., Шебалдова А.Д., Бородулин В.Б. Взаимодействие с плазмидной ДНК комплексов переходных металлов.//Новые достижения в органической химии. - Саратов, I997.-C.96-97.

3. Никитина В.В., Гнетнев A.M. Дополнительный тест для характеристики грамотрицательных инфекций в стационаре.//Клиническая фармакология-практическому здравоохранению.-Саратов, 1998.-С. 131.

4. Никитина В.В., Гнетнев A.M., Бородулин В.Б. Возрастные особенности течения заболеваний травматологической этиологии.//Ж. «Клиническая геронтология».-Москва, 1998.-№3.-С.45.

5. Бородулин В.Б., Никитина В.В., Шебалдова А.Д., Корниенко Г.А., Линтварева В.Б. Антибактериальное действие комплексов переходных металлов на клетки E.coli К-12, содержащие плазмиду pLD-105.//Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Химия живого.-Москва, 1998.-С.18-19.

6. Никитина В.В., Голубев С.М., Никифоров В.В., Бородулин В.Б. Методы выделения плазмидной ДНК в клинико-лабораторных условиях.//Материалы юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ.-Саратов, 1999.-С.105.

7. Орлова Е.Е., Никитина В.В. Распределение антибиотикорезистентных грамотрицательных культур в различных клиниках г.Саратова.//Материалы юбилейной научной конференции молодых ученых и студентов

СГМУ.-Саратов, 1999.-С.106-107. 8. Раздевилова О.П., Никитина В.В., Федотова О.В., Ратушная Е.В., Бородулин В.Б. Взаимодействие солей тиапирилия с ДНК.//Молекулярная биология, 2000, Т.34.-№1-С.95-100. Благодарность.

Выражаем особую благодарность в помощи при подготовке диссертационного исследования к.м.н., зав. бак. лаб. СарНИИТО Гнетневу A.M. и сотруднику РосНИПЧИ "Микроб" к.м.н. Савостиной Е.П.