Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Изучение патогенетической значимости мутаций митохондриального генома в клетках крови при бессимптомном атеросклерозе у женщин

На правах рукописи

Чичёва Мария Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ МУТАЦИЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА В КЛЕТКАХ КРОВИ ПРИ БЕССИМПТОМНОМ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ У ЖЕНЩИН

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

16 МАП 2!Ш

Москва-2013

005059628

005059628

Работа выполнена в лаборатории клеточных механизмов атерогенеза ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН.

Доктор медицинских наук Игорь Александрович Собенин

Кандидат биологических наук Маргарита Александровна'Сазонова

Доктор медицинских наук, профессор Всеволод Григорьевич Пинелис

Доктор биологических наук, профессор Владимир Борисович Кошелев

ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Защита диссертации состоится « » ¿¿/¿2^2013 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.003.01 при. ФГБУ Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « /5 » 2013 года

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Учёный секретарь диссертационного совета

Кандидат медицинских наук Лариса Николаевна Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Атеросклероз является одним из самых распространенных в наше время заболеваний и служит фундаментом большинства сердечно-сосудистых заболеваний. Ранее считалось, что атеросклероз является заболеванием людей пожилого возраста. Однако в настоящее время атеросклероз все чаще поражает людей молодого возраста (Chu N.F. et al., 2011; Saukko M., Kesaniemi Y.A., Ukkola О., 2010). Это свидетельствует о том, что изучение проблемы атеросклероза представляет собой одну из важнейших научных и медицинских задач.

На начальных стадиях заболевания атеросклероз распознать крайне трудно. В связи с этим имеет смысл более детальное рассмотрение нарушений липидно-белкового обмена, а также наследственных маркеров, которые являются ранними предикторами атеросклероза. Профилактика атеросклероза имеет не только медико-социальное значение, но и дает значительный материальный эффект.

Большое количество работ зарубежных и отечественных исследователей посвящено мутациям, локализованным в аутосомах (Ben Assayag Е. et al., 2009; Kettunen T. et al., 2011; Kawamoto R. et al., 2001; Sawabe M. et al., 2009 и др.). И всего несколько работ посвящено мутациям митохондриалыюго генома (Nomiyama T. et al., 2004; Желанкин А.В. с соавт., 2011). При этом, в основном, исследовались обширные делеции, приводящие к полной дисфункции митохондриальной хромосомы (Botto N. et al., 2005; Bhat H.К. et al., 1999;).

Материнский тип наследования митохондриальных патологий делает приоритетными исследования, проведённые на выборках добровольцев женского пола.

В связи с вышесказанным не вызывает сомнений актуальность изучения мутаций митохондриальных генов на предмет ассоциации с бессимптомным атеросклерозом у женщин.

Цель исследования

Выявление патогенетической роли мутаций митохондриального генома клеток крови в формировании бессимптомных атеросклеротических поражений сонных артерий у женщин.

Задачи исследования

1) Сформировать выборку женщин с различной степенью выраженности доклинического атеросклероза сонных артерий по данным ультросонографического исследования для создания банка образцов ДНК клеток крови.

2) Изучить взаимосвязь традиционных факторов риска сердечнососудистых заболеваний со степенью выраженности доклинического атеросклероза в исследуемой выборке.

3) Определить степень гетероплазмии тех мутаций митохондриального генома, для которых ранее была выявлена ассоциация с различными заболеваниями и синдромами у человека.

4) Изучить ассоциацию степени гетероплазмии по данным мутациям с толщиной интимо-медиального слоя сонных артерий как маркером бессимптомного атеросклероза.

5) Идентифицировать мутации митохондриального генома, достоверно связанные с формированием бессимптомного атеросклероза у женщин.

Научная новизна

Впервые в клинико-эпидемиологическом исследовании успешно использован оригинальный метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома, позволяющий изучать ассоциации

митохондриальных мутаций с болезнями человека.

Установлено, что женщины с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий по результатам ультрасонографического обследования сонных артерий могут различаться по степени гетероплазмии мутаций митохондриального генома.

Показано, что ряд мутаций митохондриального генома (в 13513А, С3256Т, в14709А, С14846А и С12315А) достоверно ассоциирован со степенью атеросклеротических поражений среди женщин без проявления симптомов сердечно-сосудистых заболеваний.

Обнаружены новые мутации митохондриального генома 5132тзА, 5132с1е1А, 95371пбСС и 9537с1е1С, ранее не описанные в литературе.

Практическая значимость

В работе предложена методика исследования, позволяющая идентифицировать мутации митохондриального генома с целью определения генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у здоровых лиц.

Описанный методологический подход показал свою перспективность для массового обследования.

Результаты проведённой работы наглядно демонстрируют значимость детекции уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома для идентификации предрасположенности к атеросклерозу. Ранняя диагностика такой предрасположенности позволит обследованному человеку сделать выбор в пользу более тщательной профилактики данного заболевания.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1) У женщин с бессимптомным атеросклерозом наблюдаются отличия в уровне гетероплазмии по мутациям С3256Т, С14709А, 012315А, 013513А и С14846А митохондриального генома, что может свидетельствовать о патогенетической роли данных мутаций в атерогенезе.

2) Высокий уровень гетероплазмии по мутациям С3256Т, 014709А и 012315А ассоциирован с патологическим увеличением толщины интимо-медиального слоя (ТИМ), что свидетельствует об их проатерогенной роли.

3) Патологическое увеличение ТИМ демонстрирует ассоциацию с низким уровнем гетероплазмии по мутациям С13513А и С14846А, что свидетельствует об их антиатерогенности.

4) Генетическая предрасположенность к атеросклерозу определяется не отдельными мутациями, а суммарной нагрузкой митохондриального генома, обусловленной различными сочетаниями проатерогенных мутаций С3256Т, 014709А и 012315А и антиатерогенных мутаций С13513А и С14846А.

Внедрение результатов исследования в практику

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 4 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ, и 1 - в иностранном журнале с импакт-фактором 4,4.

Полученные результаты в дальнейшем планируется использовать с целью разработки тест-систем для ранней генетической диагностики предрасположенности к атеросклерозу, а также для разработки инновационных методов генотерапии атеросклеротических поражений.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на межлабораторной конференции ФГБУ Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН, протокол № от 1 февраля 2013 г.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов, заключения и приложения.

Работа изложена на /^/.страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 7 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В рамках исследования был проведён ряд ПЦР с праймерами на область мутации и дальнейшее пиросиквенирование амплификатов для выявления точечных замен или микроделеций митохондриального генома. Полученные результаты обрабатывались с использованием нового оригинального метода оценки процента гетероплазмии, разработанного коллективом нашей лаборатории. Затем была проведена статистическая обработка с целью нахождения ассоциации между степенью выраженности атеросклеротических поражений и величиной процента гетероплазмии исследованных мутаций.

Материал

Аутопсийный материал: 5 образцов аорты, полученных при аутопсии у лиц обоих полов (возраст от 30 до 60 лет), умерших внезапно или в результате несчастного случая. Материал получали при аутопсии в течение 12-24 часов после смерти. Тип поражения, характерный для участка сосудистой ткани, определяли макроскопически, а также подтверждали микроскопически.

Прижизненный материал: кровь, взятая у 183 условно здоровых женщин-добровольцев, для которых не наблюдалось клинических проявлений заболеваний сердечно-сосудистой системы, при проведении ультрасонографического исследования. Возраст варьировал от 34 до 86 лет, средний возраст по выборке составил 65,41(80=9,34) лет. Для прижизненной диагностики атеросклероза использовали ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с помощью линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц, далее произведена компьютерная оценка ТИМ общих сонных артерий.

Выделение ДНК

В образцах, соответствующих нормальной интиме аорты и липофиброзным бляшкам, механически отделяли интимальный слой от подлежащего медиального слоя и замораживали в жидком азоте; замороженную интиму растирали в ступке под жидким азотом до порошкообразного состояния.

Из полученного материала выделяли ДНК методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К.

Выделение тотальной ДНК из образцов крови (5мл) также проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К.

Визуализацию результатов выделения ДНК проводили с помощью электрофореза в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле. Концентрация раствора ДНК измерялась на наноспектрофотометре при длине волны 260 нм.

ПЦР

Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг ДНК; 16,6 мкМ (ЫН4)2804; 0,3 пикомоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/НС1 (рН 8,8), 2,5/4 шМ М§СЬ2 и 3 ед. Тац-полимеразы.

Условия амплификации и последовательности праймеров даны в таблице1.

Таблица!: Условия для ПЦР фрагментов мнтохондриального генома

Мутация Праймеры для ПЦР С(М8++) Режим

652^ ТАОАСОСОСТСАСАТСАС Ыо-ОСООТАТСТААТСССАОТТТСССТ 2.5шМ АТЗ

Т7160

А15550 ТАССТСААССТСТАССССАТСАСОТСССАА Ыо-ОТААСОТСОАОТСООТПХЮО 2.5шМ АТ2

С3256Т Ыо-АООАСААОАОАААТААООСС Асоттоооасстттссотло 2.5шМ АТ1

С3285Т

03316А

Т3336С

5132тзАА Ыо-ССАОГГСАСОТСаАТТАААС СОАСТАОАТТАОСССТАССТАО 2.5шМ АТЗ

С5178А

в5540А АСАСТСАТСАСССТТАССА Ыо-СОААТААСОАСОСТТАОАО 2.5шМ АТ4

Т5692С

Т5814С

С6489А GGGCCATCAATTTCATCACAACAA bio-CAGCAGCTAGGACTGGGAGAGATAGGA 1.5mM AT2

T8362G bio-AGATTAAGAGAACCAACACCTCTTTACA GGGGGTAATTATGGTGGGCC 1.5mM AT5

G8363A

Т8993С GGCCATCCCCTTATGAGCGG bio-ATGTTAGCGGTTAGGCGTAC 1.5mM ATI

T8993G

G9379A bio-CACTAACCATATACCAATGA CTCCTGATGCGAGTAATACGGATGT 2.5Mm ATI

9480dell5

9537insC

G12315A bio-CTCATGCCCCCATGTCTAA, TTACTTTTATTTGGAGTTGCAC 2.5mM AT2

G13513A CCTCACAGGTTTCTACTCCAAA bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG 1.5mM ATI

G14459A CAGCTTCCTACACTATTAAAGT 1.5mM AT2

C14482G

С14482А

Т14484С

Т14487С

Т14709С bio-CATTATTCTCGCACGGACT GCTATAGTTGCAAGCAGGAG 1.5mM ATI

G14846A

G15059A

G15084A

Режимы проведения ПЦР были следующими:

Режим ATI: 94 °С - 3 мин; 94 °С - 30 сек, 56 °С

(35 циклов); 72 °С - 7 мин; 20 °С - 4 мин.

Режим АТ2: 94 °С - 3 мин; 94 °С - 30 сек, 50 °С

(35 циклов); 72 °С - 7 мин; 20 °С - 4 мин.

Режим АТЗ: 94 °С - 4 мин; 94 °С - 45 сек, 50 °С

(35 циклов); 72 °С - 7 мин; 20 °С - 4 мин.

Режим АТ4: 94 °С - 4 мин; 94 °С - 45 сек, 62 °С

(35 циклов); 72 °С - 7 мин; 20 °С - 4 мин.

Режим АТ5: 94 °С - 3 мин; 94 °С - 30 сек, 45 °С

(35 циклов); 72 °С - 7 мин; 20 °С - 4 мин.

Обратный праймер был биотинилирован в пиросеквенирования ПЦР-фрагмента.

Исследование проводилось с использованием DNA Engine 200».

- 30 сек, 72 °С - 1 мин

- 30 сек, 72 °С - 1 мин

- 45 сек, 72 °С - 1 мин

- 45 сек, 72 °С - 1 мин

- 30 сек, 72 °С - 1 мин целях дальнейшего

амплификатора «РТС

Детекцию продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в горизонтальном аппарате в 1,5% агарозном геле.

Пиросеквенирование

После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для выявления точечных замен или микроделеций митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе Р8С>ТМН896МА. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии. Последовательности праймеров для сиквенса представлены в таблице 2.

Таблица 2: Праймеры для проведения пиросиквенса

Мутация Сиквенсовый праймер

652шзО СССАТАААСАААТА

Т716в ОСАТСССССТТСС

А15550 АСССАТТТАТАТАОАООА

С3256Т ААОААОАООААТТСА

С3285Т

С3316А ООАОТАСОАСОТТСО

Т3336С ТОСОАТТАСААТССОТАС

5132т5АА ТСОТСОТССТСОАО

С5178А АТТААСООТСТТАОТСАТаТ

С5540А ТАААТАСАСАССААОА

Т5692С АСССАСАААСАСТТА

Т5814С ТТССААТТСААТАТСАААА

С6489А ААТСАСАОСАСТССТАСТ

Т83620 ТТТАСТТСОООСАТТТ

08363А

Т8993С САТТСААССААТАОСС

Т8993С

09379А ТСТСОТСТТАСАТСОС

948СМе115 ТСОТААААООСТСАОАА

9537тзС ССАОТССССТССТААТ

012315А ТТТСОАСТТССАС

013513А АОСТТТСТАСТССАА

014459А ОАТАСТССТСААТАСССА

С14482С АТАТССАААОАСААС

С14482А

Т14484С

Т14487С

Т14709С АТАСААСОАТССТТТТТС

С14846А ССОССААООАОТСА

С15059А ТТТСТСАОТАОАОАААТСАТ

015084А ООАТААТСССОАТСТТ

♦Подбор праймеров осуществлялся с помощью компьютерной программы РптегЗ.

Исследование проводилось с использованием пиросеквенатора Пиросеквенатор «Р8С>96МЛ». Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.

Процент гетероплазмии рассчитывался с использованием формул, специально сконструированных для каждой мутации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оптимизация способа расчёта степени гетероплазмии

Общая формула для подсчёта процента гетероплазмии выглядит следующим образом:

где Р - процент гетероплазмии;

Ь -высота пика исследуемого нуклеотида,

N - высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;

М - высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Такой метод изучения митохондриального генома является новым и был недавно разработан в нашей лаборатории Сазоновой М.А. с соавт.

В рамках данной работы принцип подсчёта процента гетероплазмии был скорректирован и оптимизирован.

К ранее использованной методике расчёта было добавлено 2 пункта:

1) Поправка на фон: для вычисления поправки от значения каждого пика пирограммы отнимали усреднённую величину нулевого пика (сумму пиков пирограммы, по данным гистограммы равных нулю, делённую на количество таких нуклеотидов).

2) Коррекция пика А: в связи с тем, что при пиросеквенировании, как правило, происходит остаточная детекция АТФ, выделяющегося при прохождении реакций, пик А на пирограмме обычно завышен, по сравнению с нормальным значением, на 10-15%. Исходя из этого, значение всех пиков А

в пирограмме было принято умножать на коэффициент 0.9).

Изучение вариабельности гетероплазмии митохондриального генома в интиме аорты человека

Для проверки предположения о том, что мутации митохондриального генома могут объяснить неравномерность развития атеросклероза в интиме, было проведено пилотное исследование. Его целью являлось детектирование 6 мутаций митохондриального генома (С3256Т, С5178А, 012315А, 013513А, С14459А, С14846А) в 10 парных образцах ДНК, выделенных из непораженных атеросклерозом (нормальных) участков интимы аорты и ткани липофиброзной бляшки.

Статистическая обработка полученных данных включала в себя вычисление среднего и определение межквартильных границ. Среднее значение процента гетероплазмии, а также стандартное отклонение вычисляли при помощи одновыборочного Т-теста. Межквартильные границы в распределениях процента гетероплазмии по отдельным мутациям определяли с помощью анализа частот.

Обнаружены различия в мутационной нагрузке между соседними участками интимы (поражёнными и непоражёнными атеросклерозом). Однако эти данные не объясняют возможных механизмов развития атеросклероза, поскольку причина сопряжённости поражения и мутации не установлена.

Цель проведения кроссекционного клинического исследования

Атеросклеротические поражения локальны, а скорее фокальны, поскольку занимают ограниченное пространство площади сосудистой стенки. Одним из объяснений данного факта является воздействие гемодинамического стресса. Тем не менее, гемодинамический стресс не объясняет сосуществования непоражённых и атеросклеротических участков в пределах люменарной поверхности артерий, подверженной одинаковой силе стрессового воздействия. Традиционные факторы риска сердечнососудистых заболеваний тем более не могут объяснить фокальность атеросклеротического поражения, поскольку действуют системно. Генетические факторы, напротив, вполне могут объяснить данное явление. Мутации митохондриального генома, унаследованные в небольшом количестве от матери, могут избирательно накапливаться в зависимости от условий, в которых находится клетка, или при митозе, в результате

случайного неравномерного распределения митохондриальных геномов, попадать преимущественно в одну из дочерних клеток. Кроме того следует отметить, что интенсивность возникновения спонтанных мутаций в митохондриальном геноме (его уровень мутабельности во много раз превышает таковой для ядерного генома), вероятность многократного мутирования в клетках интимы, обладающих пролиферативной активностью, вполне достаточна для объяснения фокальности атеросклеротических поражений.

В патогенезе атеросклероза играют роль клетки крови, мигрирующие из кровотока через эндотелий сосуда в интимо-медиальный слой. Лимфоциты, попадая в сосудистую стенку, выполняют сигнальную роль в формировании иммунного и воспалительного ответа. Моноциты же формируют макрофагальные клетки, которые призваны удалять избыток холестестерина, накапливающегося в очаге атеросклеротического поражения.

Мы полагаем, что одним возможных патогенетических механизмов, объясняющих влияние мутаций митохондриального генома на формирование атеросклеротического поражения, может служить то, что дефектные макрофаги в интиме сосудистой стенки вследствие понижения уровня метаболизма в большей степени склонны к липоидозу, то есть к превращению в пенистые клетки, после миграции в сосудистую стенку. С целью проверки данной гипотезы было принято решение о проведении клинического кроссекционного исследования.

Изучение связи факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний с бессимптомным атеросклерозом

В рамках данной работы для женщин добровольцев были проанализированы стандартные факторы риска развития атеросклероза: возраст, масса тела, индекс массы тела, систолическое артериальное давление, уровень общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов крови, а также курение, диабет, гипертония.

Для статистического анализа использовали критерии Манна-Уитни и Краскелла-Уоллиса. Результаты проведённого теста демонстрируют, что толщина интимо-медиального слоя, как характеристика бессимптомного атеросклероза, ассоциирована только с массой тела, и, как следствие, с индексом массы тела, но ни с какими другими факторами риска.

Кроме сравнения средних, для факторов риска развития атеросклероза был проведён диперсионный анализ. Я2 модели оказался равным 0,08; следовательно, описанными факторами риска объясняется только 8% вариабельности ТИМ.

Степень гетероплазмии митохондриального генома и бессимптомный атеросклероз

При определении степени предрасположенности к атеросклерозу использовали пограничные возрастно-половые значения показателя ТИМ для женщин Московской популяции. Абсолютные значения показателя ТИМ были перекодированы в квартальные показатели ординарной шкалы (1, 2 или 3) в соответствии с величинами межквартильных границ для квартилей 1/2 и 3/4. При этом принадлежность к 1-й квартили рассматривали как признак низкого уровня атеросклеротической нагрузки (1), принадлежность к 4-й квартили - высокой (3). Принадлежность ко 2-й и 3-й квартилям рассматривали как среднюю степень атеросклеротической нагрузки (2).

Изначально планировалось рассмотрение 33 мутаций митохондриального генома, но при анализе данных пирограмм по известным мутациям с помощью нашего метода удалось выявить 4 новых ранее не описанных мутации - 5132тзА, 5132ёе1А, 9537тзСС и 9537с1е1С.

Рассмотрим детекцию новых мутаций на примере локуса 5132. На рисунке 1 представлены гистограммы, соответствующие

1) нормальному генотипу, последовательность нуклеотидов для которого считывается как ТА О,

2) 100% новой мутации 5132'тзА (последовательность ТААС),

3) 100% мутации 5132тзАА, найденной в литературе, (последовательность ТАААО),

4) 100% новой мутации 5132 <1е1А (последовательность Тв)

Все варианты пирограмм, имеющие дробное значение пика А рассматривались как показатель наличия гетероплазмии. Если значение пика А колебалось в промежутке от 0 до 1 по условной шкале, рассматривали гетероплазмию по мутации 5132 ёе1А, от 1 до 2 - по мутации 5132тзА, и от 2 до 3 - по мутации 5132тзА.

Таким образом, в рассмотрении оказалось 37 мутаций.

100% норма

TAG

Рис. 1. Гистограммы, исследуемые при пиросеквенировании локуса 5132 митохондриального генома.

При первичной оценке значений процента гетероплазмии для каждой мутации стало очевидным, что дальнейшая статистическая обработка данных по 9-ти мутациям С6489А, G15762A, 9537insC, G3316A, C14482G, Т8362С, Т8363А, T716G и 5132insAA не имеет смысла, поскольку значение процента гетероплазмии по ним для всех образцов в рамках исследуемой выборки равно нулю (мутации гомоплазмичны). Далее было продолжено рассмотрение 28 мутаций A1555G, С3256Т, С5178А, G12315A, G13513A, G14459A, G14846A, G15059A, 652insG, 652deIG, 9537delC, 9537delCC, T8993C, T8993G, G9379A, T14709C, T14482A, T14484C, T14487C, 9480dell5, G15084A, G5540A, T5692C, 5132insA, 5132delA, T5814C, G15762A и T3336C, демонстрирующих гетероплазмичность.

Статистическую оценку результатов проводили с использованием пакета SPSS версии 14.0 (SPSS Inc., США). Данная обработка проведена с использованием U-теста для независимых выборок по Манну-Уитни и Н-теста по Краскеллу-Уоллису. Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза. Для определения коэффициента корреляции Спирмена проводили анализ таблиц сопряженности. Для интерпретации направления связи между стадией атеросклеротического поражения и процентом гетероплазмии использовали метод линейной регрессии. Для оценки степени ассоциации атеросклеротических поражений со значением процента гетероплазмии по ряду мутаций использовали факториальную регрессию. Для количественной оценки мутационной нагрузки был рассчитан мутационный эксцесс. Межквартильные границы в распределениях процента гетероплазмии по отдельным мутациям определяли

14

96 5132insA 100% 51321 risAA. 100% 5132 deiA

ij

111 ■ ■

TAG TAG TAG

с помощью анализа частот. В конце исследования производился подсчёт его статистической мощности.

По результатам сравнения средних ассоциацию с атеросклеротическими поражениями демонстрируют мутации С13513А, С3256Т, С14709А, С14846А и С12315А.

По результатам подсчёта парных коэффициентов корреляции по Спирмену высокую степень ассоциации с патологическим увеличением ТИМ демонстрируют те же мутации (013513А, С3256Т, 014709А, 014846А и 012315А).

Регрессионный анализ подтвердил ассоциацию с атеросклеротической нагрузкой уровня гетероплазмии мутаций С3256Т, 012315А, С13513А, Т14709С и 014846А, а также позволил выявить роль уровня гетероплазмии мутаций 9537с1е1С, 5132ёе1А, 015059А и Т3336С.

Для дисперсионного анализа, включающего все 28 мутаций коэффициент Я2 модели равен 0,96. Отсюда следует, что генетические факторы риска (мутации митохондриального генома) в совокупности могут объяснять до 96% вариабельности ТИМ, то есть митохондриальные мутации имеют патогенетическое значение при атеросклерозе.

На основании анализа совокупности вышеприведённых статистических исследований обнаружено пять мутаций, демонстрирующих стабильную ассоциацию с патологическим увеличением ТИМ по всем моделям -013513А, С3256Т, в 14709А, 014846А и С12315А. Для дисперсионного анализа, включающего эти пять мутаций, коэффициент К2 модели равен 0,68, что означает, что в данной выборке совокупностью мутаций С13513А, С3256Т, в14709А, 014846А и С12315А можно объяснить 68% вариабельности ТИМ.

Пять мутаций-лидеров ассоциированы друг с другом, на что указывают высокие парные коэффициенты корреляции по Спирмену. Также следует отметить, что часто одновременно наблюдаются высокие уровни гетероплазмии для изучаемых мутаций, так как для них чрезвычайно высоки коэффициенты коллинеарности. Из этих данных можно сделать вывод о том, что данные мутации, скорее всего, имеют наследственный характер, так как частая совместная встречаемость высокого уровня мутантного аллеля для мутаций, сформировавшихся соматически, крайне маловероятна. Более того, может идти речь об их неравновесном сцеплении. В связи с этим фактом, рассмотрение каждой из этих пяти мутаций в отдельности относительно переменной сравнения даёт меньшую достоверность ассоциации. Поэтому

далее для пяти мутаций-лидеров была проведена факториальная регрессия. Для этого мутации разделили на 2 группы по знаку коэффициента & регрессионного анализа, и рассмотрели совместное влияние пар мутаций С13513АЮ14846А (отрицательно коррелирующие с атеросклеротической нагрузкой), и С3256ТЛ314709А, 014709АЛ}12315А, С3256Т/С12315А (положительно коррелирующие с атеросклеротической нагрузкой) на величину ТИМ. Для каждого такого теста значение Я2 дисперсионного анализа также чрезвычайно высоко (от 0,714 до 0,986), следовательно, наличием не более чем пяти мутаций можно объяснить не менее 71,4% вариабельности ТИМ.

Графическая интерпретация результатов факториальной регрессии для антиатерогенных мутаций представлена на рисунке 2, для проатерогенных -на рисунке 3.

Рисунок 2: Распределение совместной встречаемости мутаций С13513А и С14846А относительно уровня атеросклеротической нагрузки

/

/ /

Г|ги<1. »тервсклсоошческоМ НЙ1 :кн

Рисунок 3: Распределение совместной встречаемости мутаций С3256Т, С14709А и С12315А относительно уровня атеросклеротической нагрузки

Для количественной оценки мутационной нагрузки по пяти мутациям, продемонстрировавшим высокую степень корреляции с патологическим увеличением ТИМ (С13513А, С3256Т, 014709А, С14846А и С12315А), был введён новый термин - «мутационный эксцесс». Мутационный эксцесс -суммарная мутационная нагрузка по пяти мутациям-лидерам. Он

16

рассчитывался не относительно абсолютного значения процента гетероплазмии, а относительно присвоенного данному значению квартального ранга. Для каждой мутации были рассчитаны межквартильные значения. Затем абсолютные значения были перекодированы в ранговые переменные: 1- для первой квартили, 2, 3 или 4 - для второй, третьей и четвёртой соответственно. Для каждого образца суммировались ранги, присвоенные значениям процента гетероплазмии (от I до 4) по каждой из пяти рассматриваемых мутаций в отдельности. Если корреляция между атеросклеротическим поражением и наличием данной мутации была положительна, ранг представлялся в сумме со знаком «+», если отрицательна - со знаком «-» (соответственно знаку На рисунке 4 показано

графическое отображение мутационного эксцесса для различных категорий двух рассматриваемых ранговых переменных по отдельности. Из рисунка видно, что значение мутационного эксцесса увеличивается по мере увеличения степени атеросклеротического поражения.

1 2 з

Степень атероеклеротпческой нагрузки

Рисунок 4: Зависимость атеросклеротической нагрузки

мутационного эксцесса от

Статистической мощности исследования нашей выборки оказалось достаточно для подтверждения компетентности полученных результатов по девяти мутациям С3256Т, С12315А, С13513А, Т14709С, С14846А, 9537с1е1С, 5132с1е1А, С15059А и Т3336С.

Изучение взаимосвязи гетероплазмии митохондриального генома и факторов риска развития атеросклероза

Для оценки взаимосвязи гетероплазмии митохондриального генома с факторами риска развития атеросклероза (такими как возраст, масса тела,

индекс массы тела, систолическое артериальное давление, уровень общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов крови, а также курение, диабет, гипертония) был проведён корреляционный анализ по Спирмену. Оказалось, что из пяти мутаций, составляющих мутационный эксцесс, четыре (013513А, С14709А, 014846А и 012315А) не коррелируют ни с одним из факторов риска. Это подтверждает их роль, как независимых фаторов риска патологического увеличения ТИМ. Исключение составляет лишь мутация С3256Т, продемонстрировавшая ассоциацию с повышением систолического артериального давления. Возможно, данная мутация является опосредованным фактором риска атеросклероза.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Теоретическим обоснованием для проведения кроссекционного клинического исследования послужил тот факт, что ранее были обнаружены различия уровня гетероплазмии между нормальной и поражённой атеросклерозом тканью интимы аорты.

Известно, что клетки крови принимают непосредственное участие в формировании атеросклеротического поражения. Моноциты из кровотока мигрируют через эндотелий сосуда в протеогликановый слой интимы, где, становясь макрофагальными клетками, призваны ликвидировать избыток модифицированных липопротеидов. Лимфоциты, попадая в сосудистую стенку, выполняют сигнальную роль в формировании иммунного ответа и локальной воспалительной реакции. Для того, чтобы понять, действительно ли гетероплазмия митохондриального генома имеет патогенетическое значение, было целесообразно провести исследование на образцах, выделенных из клеток крови людей.

Исходя из вышеописанной информации, мы избрали в качестве рабочей следующую схему: клетки, имеющие высокий уровень дефектных митохондриальных геномов, могут способствовать развитию фокальных атеросклеротических поражений, в соответствии с клональной гипотезой. Кроме того, они неверно интерпретируют приходящие извне сигналы, в результате чего начинают выделять провоспалительные хемокины, привлекая в будущий очаг поражения клетки крови. В случае, если клетки крови также имеют высокий уровень мутантного аллеля, процесс усугубляется.

В клинической практике принято оценивать ряд параметров, для которых доказано независимое влияние на уровень риска возникновения

сердечно-сосудистых заболеваний. Было выяснено, что совокупность влияния факторов риска объясняет только 8% вариабельности ТИМ сонных артерий в исследуемой нами выборке. Вариабельность ТИМ, которую можно было объяснить сочетанием пяти мутаций, составляющих мутационный эксцесс - 68%. При их попарном рассмотрении относительно величины ТИМ мутации объясняли её вариабельность на 71,4 - 98,6%. Этот факт доказывает высокую прогностическую значимость мутаций митохондриального генома для определения предрасположенности к атеросклерозу, даже по сравнению с общепризнанными факторами риска.

Локализация мутаций, наиболее достоверно ассоциированных с доклиническим атеросклерозом у женщин, с описанием функций участков итогового продукта гена митохондриальной ДНК, показана в таблице 4.

Таблица 4: Локализация мутаций, ассоциированных с патологическим увеличением ТИМ, в митохондриальном геноме и нарушаемая при мутировании функция_____

Мутация Ген Локализация мутации в гене Локализация мутации в белке/РНК Функция белка/РНК

G13513A (антиате-рогенный эффект) ND5, комплекс 1 Аминокислота 393: аспарагиновая кислота-аспарагин Регион "Ох1с1огес1_яГ (ам-к 134-397 из 603) Перенос электрона с NADH на убихинон в дыхательном комплексе 1

С3256Т (проате-рогенный эффект) тРНК-Leu (кодон узнавания UUR) Нуклеотид 25 Входит в область терминации транскрипции стебелька петли ОНи (3223-3256) Встраивание в структуру митохондриальных белков аминокислоты Leu

G14709A (проатеро генный эффект) tPHKGIu Нуклеотид 37 Входит в состав петли антикодона Встраивание в структуру митохондриальных белков аминокислоты Glu, находится непосредственно перед антикодоном

G14846A (антиатеро генный Цитохром в, комплексЗ Аминокислота 34: глицин-серин Регион "СуЮсЬготеЬ_Ы" (ам-к 9-179 из N-терминальный конец цитохрома В, отвечает за

эффект) 380) заякоривание белка в мембране, субъединица 111 дыхательного комплекса 111

G12315A (проате-рогенный эффект) тРНК-Leu (кодон узнавания CUN) Нуклеотид 52 Входит в состав стебелька Т-петли Встраивание в структуру митохондриальных белков аминокислоты Leu

В результате мутации С13513А аепарагиновая кислота в составе пятой субъединицы ЫАВН-дегидрогепазы дыхательного комплекса 1, которая несёт дополнительный отрицательный заряд, заменяется на аспарагин -электронейтральную аминокислоту. В связи с этим, в регионе "ОхШогес^1" изменяется уровень заряда. Такое событие может вести за собой увеличение эффективности переноса электрона с ИАОН на убихинон. Комплекс 1 дыхательной цепи начинает работать в усиленном режиме, вследствие чего в клетке возрастает продукция энергии.

Нуклеотид 25 тРНК-Ьеи (позиция 3256 митохондриальной ДНК) входит в область терминации транскрипции, являясь последним нуклеотидом в данной области. Терминация - окончание синтеза белка - осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп-кодонов. Из-за отсутствия тРНК, соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Поэтому в действие вступают специфические белки, катализирующие отсоединение полипептидной цепи от мРНК и рибосомы. В случае, если терминация транскрипции нарушена, рибосомы, связанные с полипептидами, оказываются «занятыми» и их субъединицы не могут использоваться для синтеза других полипепитдных цепей, равно как и полипептиды, связанные с рибосомой, не могут использоваться по назначению. В связи с этим правильно функционирующих белков дыхательной цепи становится меньше нормы, что приводит к падению интенсивности синтеза АТФ.

Нуклеотид 37 тРНК-С1и (позиция 14709) входит в состав петли антикодона тРНК-С1и. К данной тРНК к цепи полипептида присоединяется аминокислота глутамин (полярная, отрицательно заряженная). В результате мутирования непосредственно прилегающий к триплету антикодона нуклеотид меняется с аденина (функциональная группа, присоединённая к

пуриновому кольцу - NH2) на гуанин (функциональная группа, присоединённая в том же месте =0), при этом аминокислота начинает не притягиваться к месту предполагаемого присоединения, а, наоборот, отталкиваться из-за одноимённости зарядов глутамата и гуанина. Итогом является меньшая вероятность формирования комплексов тРНК-Glu и снижение уровня выработки функциональных белков дыхательных цепей. Это, в свою очередь, приводит к падению уровня метаболизма клетки.

Мутация G14846A ведёт к изменению аминокислотного состава цитохрома В, который является частью комплекса III дыхательной цепи. N-терминальный конец цитохрома В отвечает за заякоривание белка в мембране. При мутировании меняется аминокислота глицин на серин, что создаёт дополнительный сайт фосфорилирования белковой цепи. Каким образом высокий уровень гетероплазмии по данной мутации может вести к конкурентному преимуществу клетки перед прочими, остаётся неясным.

Нуклеотид 52 тРНК-Leu (позиция 12315) входит в состав стебелька Т-петли tRNA-Leu. 52-ой гуанин является одним из них для нуклеотидов, формирующих компактную третичную структуру (L-форму) тРНК-Leu. При замене гуанина на аденин третичная структура тРНК нарушается, что ведёт к её нефункциональности. Последствия аналогичны описанным для мутации G14709A.

Снижение интенсивности синтеза АТФ, наблюдающееся при ряде мутаций митохондриального генома, может сыграть роль в формировании атеросклеротической бляшки в случае, если мутация локализована в митохондриальном геноме макрофагапьных клеток, механизм влияния которых на атерогенез был описан ранее. При дефектах дыхательной цепи, и, как следствие, недостаточном уровне выработки АТФ, который необходим для всех метаболических процессов, макрофаги в очаге формирования АСБ усугубляют патологический процесс, оставаясь в стенке сосуда и превращаясь в пенистые клетки. К вышесказанному стоит добавить, что в результате мутирования не только может падать уровень выработки энергии в клетке, но и накапливаются дефектные продукты синтеза, на утилизацию которых клеткам приходится тратить энергию, которой и так меньше, чем необходимо.

Следует подчеркнуть, что механизмы, приведённые выше, являются гипотетическими, а понимание процессов, посредством которых исследованные в данной работе мутации влияют на атерогенез, может внести существенный вклад в расширение знаний о патогенетических механизмах

формирования атеросклеротических поражений на молекулярном уровне. Детализация представлений о механизмах влияния митохондриальных мутаций на атерогенез является приоритетной задачей дальнейшей работы в лаборатории.

Практическим результатом данного исследования может стать разработка диагностического набора для выявления генетической предрасположенности к атеросклерозу. Дальнейшие исследования могут быть направлены на поиски новых генетических маркеров - мутаций митохондриального генома, ассоциированных с атеросклерозом, а также на проведение проспективных эпидемиологических исследований для оценки реальных сердечно-сосудистых рисков, обусловленных данными мутациями.

ВЫВОДЫ

1. Уровень гетероплазмии мутаций митохондриального генома С3256Т, 014709А, 012315А, С13513А и С14846А ассоциирован со степенью доклинического атеросклероза у женщин.

2. Мутации С3256Т, С14709А и С12315А являются проатерогенными, а мутации 013513А и С14846А - антиатерогенными.

3. Суммарная мутационная нагрузка митохондриального генома по мутациям С3256Т, 014709А, С12315А, С13513А и 014846А объясняет 68% вариабельности толщины интимо-медиального слоя сонных артерий, в то время как совокупность традиционных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний объясняет только 8% вариабельности ТИМ.

4. Данные о корреляции степени гетероплазмии по мутациям С3256Т, 014709А, С12315А, С13513А и 014846А между собой указывают на преимущественно наследственную природу данных мутаций, а также на существование проатеросклеротических гаплотипов митохондриального генома.

5. Впервые обнаружены новые мутации митохондриального генома 51321пбА, 5132с1е1А, 9537шзСС и 9537с1е1С, ранее не описанные в литературе.

6. Явление гетероплазмии митохондриального генома является весьма распространённым, поскольку 76% исследованных мутаций оказались гетероплазмичными.

Практические рекомендации

Предложенная схема обследования может быть рекомендована к внедрению в медицинскую практику с целью выявления пациентов, предрасположенных к атеросклерозу.

Для повышения эффективности прогнозирования раннего атеросклероза сонных артерий необходимо проводить скрининг мутаций митохондриального генома С3256Т, G14709A, G12315A, G135I3A и G14846A. Детектирование мутаций 652insG, T716G, A1555G, G3316A, Т3336С, 5132insAA, 5132insA, 5132deIA, C5178A, G5540A, T5692C, T5814C, C6489A, T8362G, G8363A, T8993C, T8993G, G9379A, 9480dell5, 9537insC, 9537insCC, 9537delC, G14459A, C14482G, C14482A, T14484C, T14487C, G15059A, G15084A, G15762A митохондриального генома с данной целью проводить не целесообразно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Букринский М.И., Свиридов Д.Д., Карагодин В.П., Собенин И.А., Сазонова М.А., Коренная В.В., Орехова В.А., Иванова М.М., Мясоедова В.А., Мельниченко A.A., Савинкова И.Г., Орехов А.Н. Повреждение механизма обратного транспорта холестерина, вызванное вирусом иммунодефицита человека: роль АВСА1-зависимого пути // Бюллетень московского общества испытателей природы, отдел биологический. - 2009. -Т.114, №3/1. -С. 297-301.

2. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин A.B., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Прямая количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома// Фундаментальные науки и практика. — 2010.— Т.1, №2. - С. 19-21.

3. Иванова М.М., Сазонова М.А., Желанкин A.B., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Мутации митохондриального генома в патологии человека // Фундаментальные науки и практика. - 2010. - Т.1, №4. - С. 164-167.

4. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин A.B., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Ассоциация мутации митохондриального генома 652INSG с атеросклеротическими поражениями человека // Фундаментальные науки и практика. - 2010. - Т.1, №4. - С. 168-17.

5. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин A.B., Митрофанов К.Ю., Коробов Г.А., Мясоедова В.А., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Постнов А.Ю.,

Орехов А.Н. Детекция митохондриальной делеции гуанина в позиции 652 при атеросклеротических поражениях человека // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. -Т.З, №1. - С. 105-107.

6. Собенин И.А., Сазонова М.А., Мясоедова В.А., Кириченко Т.В., Иванова М.М., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Полиморфизм 3256С/Т митохондриальной ДНК как маркер ишемической болезни сердца и атеросклероза // Проблемы и перспективы современной науки. - 2011. - Т.З, №1. - С. 108-110.

7. Сазонова М.А., Иванова М.М., Желанкин A.B., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Детекция мутации митохондриального генома человека 652insG при атеросклеротических поражениях сосудов человека // Молекулярная диагностика. Сборник трудов VII всероссийской научно-практической конференции с международным участием. — 2010. — Т.5. - С. 109-112.

8. Сазонова М.А., Желанкин A.B., Иванова М.М., Митрофанов К.Ю., Постнов А.Ю., Орехов А.Н., Собенин И.А. Анализ мутации митохондриального генома A1555G при атеросклерозе интимы аорты человека // Современный мир, природа и человек. - 2011. - Т.2, №1. - С. 6769.

9. Сазонова М.А., Желанкин A.B., Иванова М.М., Митрофанов К.Ю., Коробов Г.А., Хасанова З.Б., Постнов А.Ю., Орехов А.Н., Собенин И.А. Детекция мутации G13513A в интиме аорты человека. // Современный мир, природа и человек. -2011. -Т.7, №1. - С. 73-76.

10. Сазонова М.А., Желанкин A.B., Иванова М.М., Орехов А.Н., Постнов АЛО. Анализ митохондриальной мутации A1555G в тотальных гомогенатах атеросклеротических поражений // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2012. - Т.2, №39. - С. 72-73.

11. Сазонова М.А., Желанкин A.B., Иванова М.М. Уровень гетероплазмии митохондриальной мутации С5178А в тотальных гомогенатах пораженной атеросклерозом интимы аорты // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2012. - Т.2, №39. - С. 73-74.

13. Иванова М.М., Сазонова М.А., Орехов А.Н., Собенин И.А. Генетические детерминанты атеросклероза, локализованные в первой хромосоме человека // Актуальные проблемы современной науки. - 2012. -Т.1, №2. - С. 47-53.

14. Иванова М.М., Сазонова М.А., Бородачёв Е.Н. Патологии человека, ассоциированные с мутациями митохондриального генома // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - Т.З. - С. 116-123.

15. Иванова М.М., Сазонова М.А., Орехов А.Н., Собенин И.А. Некоторые мутации митохондриального генома человека, ассоциированные с цитопатиями // Биомедицинский журнал MEDLINE.RU. - 2012. - 13, №26. - С. 309-330.

16. Sobenin I.A., Sazonova М.А., Ivanova М.М., Zhelankin A.V., Myasoedova V.A., et al. (2012) Mutation C3256T of Mitochondrial Genome in White Blood Cells: Novel Genetic Marker of Atherosclerosis and Coronary Heart Disease // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7, №10. - e46573.

17. Чичёва M.M., Синёв В.В., Сазонова М.А. Ассоциация мутаций одиннадцатой и семнадцатой хромосом с атеросклерозом человека // Актуальные проблемы современной науки. - 2012. - Т.1, №3.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

del - делеция (нуклеотида при мутировании)

DHU - дигидроуридин

Glu - аминокислота глутамин

ins - инсерция (нуклеотида при мутировании)

Leu - аминокислота лейцин

NADH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ND5 - субъединица 5 NADH-дегидрогеназного комплекса дыхательной цепи

АСБ - атеросклеротическая бляшка

АТФ - аденозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТИМ - толщина интимо-медиального слоя стенки сосуда

тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

Подписано в печать:

23.04.2013

Заказ № 8400 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru