Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Изучение мембранных белков эритроцитов человека в норме, на разных стадиях созревания и принаследственных сфероцитарных анемиях

Ь 11 Я о'

; российская академия медицинских наук

I

i нбдико-генетичесйш научный центр

На правах рукописи УДК 618-05В.7:877. 112. в

1 захаров 'сергей федорович

.1 '

' • 1

изучение менбранных белков эритроцитов человека в норне, на разных стадиях созревания и при наследственных сфероцитарных анемиях

АЦ.СС-^

Генотяка 03.00.04 - Бнохяхкя

автореферат

диссертация на соясканяе учапой степвня . кандидата модяцянскях наук

Москва - 1992

Работа вшюлкона в лаборатории биохимической генетики ИГНЦ РАНН (директор - ЧЛ01Г-корр. РАМН Иванов В Н. ) !

Научный руководитель: .

' доктор биологических наук, профессор Шквжяи С. С. Научный консультант:

кандидат биологических наук Громов П. С.

Официальные оппоненты: д. к. и., профессор ПавикцкаЖ Л. Л.

д. к. в. Хасягов П. 3.

» Ведущее учреждение - Ге>истолог1(чсскнй научный центр РАКИ

»

Завита диссертации состоится X// 1992 г.

в часов на заседании'спецкапязнрованного Совета 1Д 001.16.01) Медико-генеткческого научного центра РАИН

(по адресу. г.Москва, 119478. уя.Хсскворечы», д. 1) , 1

»

. ' . : ' - У

С диссертацией можно ознакомиться ■ библиотеке Центра. Автореферат разослан « ^^* ¿¿-¿Р^ 1992 г.

Уч«1ы< секретарь'.

/спецваяаэярованного-Совета.

доктор Свологачвслжх наук . . Л. е.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Почтя полувековой период развития биохимической генетики принес иного достижений я обеспечил создание стройно! развернутой теории, описывающей молекулярные механизмы реализации генетической информации по направление ДНК -* РНК -» полипептидная цепь . Эта теория продолжает совервенствоваться - детализируются представления о структуре генов, о механизмах генной экспрбссик и ее регуляция (Льюин, 1987, Singer, Berg 1991).

Особым и пока еще явно недостаточно разработанным разделом биохимической генетики остается проблемы генетяческого контроля за формированием реально существующих сложных многокомпонентных надмолекулярных образований, которые часто в различных проявлениях метаболизма выступают как единое целое.

Примерок подобных структур является клеточные мембраны к в частности, мембраны эритроцитов. Именно интегральные-, свойства мембраны, очевидно, определяют специфическую форму эритроцита, а также ае изменения, которые эо многих генетических Ьссладованиях анализируются как простой признак (элляптоцитоз,. стоматоци£оз и т.д.) (Lux, Becker 1989).

Из многих проблем генетяческого контроля за возникноаением такого признака, как нормальная форма эритроцита на данном этапе исследований ключевой, эероятнр, является установление набора признаков" - продуктов генной экспрессия,, необходимого для V формирования структуру эрятроцитарной мембраны. Анализ белков, как продуктов генной экспрессия выдокоразрешаюрим методом двумерного электрофореза является сегодня; * по-видимому,ракым эффективным подходом к изучение экспрессии генома на уровне белков. ^ . - .,** ;

• '¡I Одной из важнейших целей в 'рамках, этогонаправления является ' ..создание компьютеризованных'баз 'данных о ,белках^'|входтях^в''^остав": различных клеток и тканей человека, которые' позволяют /сравниватv

' 1 двумерны* карты белков различных клеток между собой ж норн• в пра

патолога*. В последние годы технолога« двумерного фракционирования белков получала новы! мощнный импульс в связв с разватаем методов чикросеквенарованвя. Двумерный электрофорез, позволяет получать аз смеса в частом авде ранее не адентвфацврованный а не охарактеризованный белок, частичная аманокаслотная последовательность которого ножет быть определена. Этот подход (системшй аналвз) в комбинации с разлвчныма молекулярно-генетаческакж методами, в частиоста цепной поламеразной реакцвей, открывает путь к клонирование генов ранее неизвестжх белков (Celia, 1991, Kloae, 1989).

Вплоть до настоящего времена вмеетса очень мало публвкацвй относательно применения вышеуказанного подхода пра взученвв мембранных белков эукарвотачесвюс клеток. Это обусловлено ах высокой гвдрофобностыв а зиачвтельной агрегацаонной неустойча -востыа. что препятствует ах эффективному разделена» пра двумерном электрофорезе в 1-ом направления - взоэлектрофокусврованва. Такие свойства проявляют мекбрашые белка ' эратроцвтов человека (НБЭЧ). Вместе с тем азученае структуры мембраны эрвтроцнта человека а прежде всего входящих в ах состав белков представляется актуальным как ж теоретическом, так а в практическом аспектах.

С одной стороны, несмотря на неоднократные попытка разделить неубранные белка эратроцвтов двумерным электрофорезом по О'Фарреялу, на одну аз ' нах нельзя счвтать успешной из-за ноаоиспроазводнмости а противоречивости результатов. ■ I tlarell, Havriaon 1979, Roaenblu* at al. 1982, Copeland et al. 1982). В результате до настоацего времена единственно! аироко принятой классвфакаиаей эрвтроцатарных меибрашшх белков человека остается х-оассвфякацая яредложенная Фербенксом, Стеком a дополненная хвстом t ГлхЫиХ» Л. «t al. 1972, Stack 1974, Uaeat 1982) созданная на исиаве одномерно; ^екгрофорвтаческого разделения в присутствия

ДСН, ■ включающая ■ себя только около 20 белков. В то жа арака

очевадио, что реальное час л о балков, аходияих а состав 1] ; эрятроцятаркой кекбрам к о которых пока почт* ншчаго ка известно,

превышает это чжсло по меньшей кара ка порядок. Встастванно, что

распространение катодологвв системного анализа на кекбранше балка i - * - ' ' к прежде всего на мембранные балка эритроцитов человека, позволяло

! ■

бы заложять основу вееобъеклще! компьютеризованной базы данных об этах балках, это а своя очередь откроет возможности, как откачано выше! для изучения экспрессии генов, кодирующие этибелки, включая ах клонирование к картирование в будущем.

С другой стороны, реяеняе' этой задача акает рринцяпиальное значение для выявления баохякячаскях дефектов в обширной • группе наследственных гаколятячаскях анеияй,. патогенез которых обусловлен разявчныкк наруиенаями в мембрана эратроцатоа (Lux, Becker 1989).

Цель к задачи исследования. Цель» настоящей работы явилось

системное в*ученее белкового состава иакбран эратроцатов человека в норке, на разных стадяях созраваняя я пря ряде наследственных * патологай, обусловленных кекбраннык дефектом (наследственный микросфероцитоз, хорея Гентянгтона). В райках исследования- этой проблемы в работе реяалясь следующие задача:

1. Разработка кодификаций двумерного электрофореза прякеня -тельно к мембранным белкам эритроцитов человека, пригодных для получения высокоразреааекых и воспроизвединых олектрофореграмм МБЭЧ.

2.:; Построение двумерной карты МБЭЧ а идентификация на ней ряда, болков, включая то. .которые проявляют электрофоретическую

; вариабельность, а также полиморфные варианты а редкие аллели. -. / , | ;3.' Изучение динамики белкового состава-менбран. эритроцитов -

: фракционированных, повозрасту ¡градиенте1 плотноста^ ;. V <-« ' I ;

=';.■' V^ \h Ь ' '"¡¡'...И I Ь 1 - "Л'. V:'/r .--Л-: Т ■ t''

•••7f'.' i,• ^^-.Изучение;/..влв>йня л /.э'йдопрот.еоли^ ^у' МБЭЧ . -'< на результаты,

фракционирования;<• •'..•'•■' ■ ■-'

S. Сравнительный анализ МБЭЧ ■ норме ж при ряде наследствен -ных патологий, характеризующихся мембранным дефектом {наследственный мнкросфероцитоз, хорея Гентингтона)..

Научная новизна работы. Создана новая модификация 2Д-ЗФ по О'Фарреллу. адаптированная для разделонхя МБЭЧ к позволяющая расширять возможности анализа в 3-6 раз. Изучение эндогенно! протеолятхческой активности мембран эритроцитов выявило ее низкий уровень и показало высокую эффективность предложенного комбинированного метода очнсткя эритроцитов от других форменных элементов крови.

Охарактеризован белковый состав мембран эритроцатов человека и впервые построена карта распределения 189 белков. Для всех 189 полипептидных фракций определены вслячиш иолекулярной кассы и относительной электрофоретяческой подвижности в первом направлении (ОЭП-1). На построенной карте локализованы • главные мембранные белки эритроцитов, идентифицированы белки относящиеся к семейству «белков теплового вока», а также фракция относящаяся к карбоангядразе. Выявлены и охарактеризованы электрофоретичесние варианты 4 полипептидных фракций.

Предложена новая трехэтапная программа анализа свойств мекбраи эритроцитов 'человека, которая, с привлечением ряда традиционных методов, позволяет . провести всесторонний анализ белков мембран эритроцитов человека. При изучении ,отдельных нозологических форм, на основе данной программы, удалось найти ряд изменений ва уровне эритроцитаршх мембран.

Теоретическая я практическая ааачкность работы. Построенная

двупарная карта белков мембран эритроцитов человека позволяет иравсдать анализ иэмвн*,шВ свойств.эритроцитов параллельно по 1Ьв пояяпептидным фракциям при различных физиологических я патологических состояниях. Проведенная частичная детализация

I т

карты, ждентяфякацяя ряда белков на нэй, характерястнка вар||абвльиостя' некоторых фракций, создают предпосылка для

пос1роеняя о дальнейшем каталога мембранных белков эрятроцятов

• 1

человека. Разработанная модяфякацяя процедуры двумерного электрофореза для мембранных болкоп эрятроцятов позволяет повысять возможности нотода для фракцяонярованяя КБЭЧ, что может быть полезно пря анализе мембран другях клеток. •

Созданная трехэтапная программа язучоняя свойств мембран

I

эрятроцятов, обоспечяла комплексное язучонве особенностей белко -вого состава мембран эрятроцятов пря мякросфороцитарной анемия, который находятся в прямой завясямостж от возраста эрятроцятов, что вызывает необходякость фракцяонярованяя эритроцитов по воз -расту с послвдуюанн анализом каждой возрастной группы. Этя' данные могут быть использованы пря дальнэйаен изучении белкового состава эрятроцятов разных возрастных групп, как.в норме, так в пря пато -логяя крова.

Основные пояовенмл выноснкые на защиту.

1. Изучение ИБЭЧ, как продуктов генной экспроссян, на основе новой модификация метода '20-ЭФ по О'Фарреллу я построение двумерной карты - схемы распределения белковых фракций в координатах относительная электрофоретическая подвижность в первом направленяя (ОЭП-1)/отиосатольная молекулярная масса; идентификация отдельных ИБЭЧ на двумерной карте.

2. Выявления электрофоретическвх вариантов отдельных -ЧБЭЧ.

3. Изучение свойств эрятроцятов разного возраста с помощь» трех -этапной программы анализа, включающей фракционирование клеток в градиенте плотности, однокервдЗ я- двумерный электрофорез ИБЭЧ, а также ряд функциональных тестов. ,< '

4. Сравнительное исследование свойств эрятроцятов: по трехэтапной

■ ! - -1 ' * * . ' 1 1 * ' ' ■■ . ** ' . программе у больных некоторыми каследст.венныкя ненбранопатяякх

(наследственны! сфероцято» х хорея Гентингтона).

Апробация работы. Маторяалы диссертации докладывалась и обсуждалась на 2-ой международно! конференции по б/х методам рваделения (Венгрия, 1988). на международной конференции по двумерному электрофорезу (Австрия,1988). на всесоюзном симпозиуме «Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессия» (Москва, 1889), на кеждународной конференции по двумерному электрофорезу- (Лондон, 1891), на Семинаре Института генетики человека ВНМГЦ РАКИ (1992).

Публикации. 0о теме диссертации имеется 8 публикаций.

Структура м объбм диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы я методы, экспериментальные результаты я их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на стр. машинописного текста,

включая 4 таблицы я £1 рисунок. Список литературы включает 283 названия, в том чясле 18 работ отечественных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы м методы исследования. Виделана« эритроцитов обыч-

но проводила из Ю-29 мл геп&рвияэвроваиной донорской кроаи. Для анализа контрольной выборки образцы кров.и получали от здоровых доноров (п-97) из донорского пункта ВОНИ РАМН. Для изучения

I

изменений мембран эритроцитов у больных наследственной патологией образцы крови брала у пациентов Института неврология РА)ф я гематологического отделения больницы МПС г. Москвы.' а также КПО ВНМГЦ РАМН. Среда них боли лица с устаыовденшми диагнозами: хорея Гентиигтоыа (№21), кякросфероцнтарная анемии (л-20), аутояммун -мая гемолитическая анемия (п-в).

Эритроциты выделяли комбинировавши методом, включавшим осаждение в декстране Т-500 с последувоши пропусканием через колонку с цеаявлоэрй НВ5 (Громов и др. 1986). Мембраны эритроцитов получали.

легированием эритроцитов ■ гипотоническом раствор* 10 мМ фосфатного буфера рН 7. 4.

J Фракционирование эритроцитов по плотности осуществляли центрифугированием ж 8-ти ступенчатом градиенте плотности двкстра-на т-40 жлж. фяхопа 400 (величины плотностей слоев градиента -'' 1,078: 1.088; 1, 091; 1. 008; !, 102:1, 107 г/кл) (Abrahaa et el. 1973).

j. Для анализа КЕЭЧ использовали одномерный электрофоре* по Laemnli (1970) в градиенте концентрации акрялакида S-23X я даукершй электрофорез по O'Farrall Р.Н. (1975) в модификациями (сн. ниже), Геля окрааявали азотнокислым серебром по методу Blua •Ъ al. (1984), кукасси R-2S0 по rairbanka (1971) к красителем "Stain* all" по методу King et al. (1976). Идентификацию белков на электрофореграмках осуществляли коэпектрофореэом с известными коммерческими беикамн, белками сердечной ньвды человека я другими методами. - Одномерные электрофореграммы сканировали на денситометрах «Gilford* я «Oltraacan XL» и анализировали на компьютере типа IBM PC/AT с использованием программы "Gelscan XL". Анализ двумерных злектрофореграмх я построение двумерной кар'гы осуществлял! по методу Concainga (19ВЗ) е использованием комплекса обработки видеоинформация СВИТ, совместно с сотрудниками НКЯ РАИ Ильинским Р.в.. Борисенко В. И. я Чесаляным Л.И. Оря статистической обработке применяли критерий t я другие общепринятые методы (Урбах В.Ю., 1S78). ; \ ■ ;" ' / '

РЕЗУЛЬТАТЫ КССЛЕДОВАЙЯЙ Н HX ОБСУЯДЕНКЕ ^ 1. Построение двумерной карты! мембранных белков эритроцитов человека. ;■.'.'Л \ Vi^/ . >'■'

;. Однаяз: судвствен1Л1хтрудносгеЙпрк из уче ни я МБЭ Чо бус л q вле на

возкожноетмэ неконтролируемого протеолиэаЗтих белков за счет заг-

рязнения препаратов эритроцитов другими форменными элвкектака крови хля из-за действия эндогенных мембранных протеяназ (Громов я др. 198а). Использованный в данной работе комплексный метод очяст-кя эритроцитов позволял получить препараты мембран эритроцитов стандартного белкового состава по результатам одномерного электрофореза. На всех одномерных электрофореграммах наблюдалась типичная картина распределения МБЭЧ, среди которых четко идентифицировались главные белкя по классификации Стека-Хоста (рис. 1, боковая дорож -ка). Проверка действия эндогенной протеяказы в препаратах эрнтро -цятарных мембран позволяла выявить признаки протеояиза только чороз 24 часа инкубации про температуре 37°С, что свидетельствует о нязкой активности этого фермента(ов).

При'раз делении ИБЭЧ методом О'Фаррвлла в классическом варкак-

9

те возникают определенны» трудности, яа которых наиболее сложно преодолимой оказалась агрегация белков при ИЗ«. С целью снижения

данной агрегация была про»ведена замена детергента тритона Х-100

*

ш более гидрофобный детергент тритон Х-305, как в анализ вру емо'м образце, так в в геле для КЭ#. При этом более высокие гидрофобные свойства тритона Х-303 обусловили определениям особенности при проведении И ЭФ с вспольэованаам этого детергента: трубки с гелан перед аз<> прогрек&ля при 37°С в течении 30 минут, а сам процесс ИЭФ проводили при 30°С. Это реако уяучвяло качество разделения

КБ5Ч я позволило выявлять главвде белив ка 2[>-Э«. Результаты ис -

; >

пользования предлагаемой модкфякацяи фракционяроыанаа КБЭЧ пред -ставлевы ва. рис.1. На пластиках геля пря окраске кукасса 11-250 обычно обнаруживалось 120-190 балковш; пятен, а при серебрения это чясво возрасталояо 170-200.Ддя построения усредненной схемы (двумерной иарты) распределения бвякоьцх фрадщкй до пластина геля после 23» бияо, проанализировано 30 эяаитрофорегракм некбракшх белков эрягроавтов с вркпкл^^хе.« *одл$1«цировакиого метода камингса.

мгю'*

ЛО -

' юо -

30 -»0 -

............. '.......

Ряс. 1

Двумерная электрофореграмна белков мембран эритроцитов чоловека-окраска кумасси И-250, Обозначения основных белков произведены согласно номенклатуре Стека-Хеста. Направление ИЭФ показано стрелкой. Справа дорожка одномерного разделения.

и,«'

ш

«I

и

м а

. ., Рас. 2 „

Двумерная карта мембранных белков эрнтрояятов человека. Ось

абсцисс - относительная электрофоретаческая подвижность в первой

¡направлении. Ось ординат - огнЬситальная молекулярная масса - Мг.

Латинскио буквы обозначают; участок ; электрофореграккы. арабская

ЦВфра^т,-Нбмвр! пятна 8 НОН. 1''-'' " | -1' л . ■ '. ; ;> :'"'>. У" ! : ■' > '' г' ' к ^ ■■ ' '■ 'А \ '> с " Т 1 ' ' *

А з «д» л- ^ <4» & " л &

О) и »V? »^Ча а »." * а

А * Ч а. л + А л ■ а. .1 -А? Р Уте -- * * • 1 •а

Каждую электрофореграмму условно ризбивалк двумя вертикальными и двумя горизонтальными линиями на 8 прямоугольных участков, обозначенных латинскими буквами (рис. 2). Горизонтальные леки* проводили через значения ординаты Мг° 10~3, равные 30 и 50. Вертикальные взаямнопараллелыше линии проводили через середины трех белковых пятен, как показано на рис.2. Указанные белки были выбраны в качестве белков-маркеров и по отношения к ним (по условным линиям) определяли координаты всех остальных белков а первом направлении (ось абсцисс) в виде величины, обозначенном как относительная электрофоретическая подвижность в 1-ом направлении -ОЭП-1. При этом расстояние между вертикальными линиями приним&лв эк 1 в на основе прямо пропорциональной зависимости определяли ОЭП-1 каждого пятна. '

Сравнение электрофорагрвмм по одноименным прямоугольном участкам с определением ОЭП-1 и Кг имеющихся на них пятен позволило выявить постоянно встречающиеся пЯтш и построить на этой основе двумерную карту (рис.2). Постоянно встречающимися считали пятна прнсутстоуюаяе более чек иа 3/4 проанализированных электрофоре -грамм. Обща» число таких пятен составило 180. Характеристика некоторых включенных в карту пятен по координатам 0ЭП-1/Иг приведены ■ таблице I. Нумерацию постоянно встречающихся пяток проводили по участкам (Громов я .соаат., 1888).

Соответственно, номер каждого пятна включая латинскую букву,

I

определяемую участком, где находятся данное пятно, и арабскую цифру, указывающую положение фракики внутри участка. Средняя вариабельность координат пятен определялась с помощью вычислительного комплекса обработки видеоинформация СВЯТ, В память комплекса СВИТ ввали изображение в электрофореграмм и по каждому из ш в усяошгих единицах определила координаты 16 омэнмшых пятен. Затем *ал кляло? р дат на рассчитали средние

аелячяны координат по осям ОЭП-1 и Нг, а такяе средние отклонения от этих величин. В коночной результата оказалось, что сроднив отклонения по координатам ОЭП-1 я Иг составляют 3, В* и 2,8% соответственно. Таким образок, при абсолютном пробеге белковой зоны по обоям направлениям на расстоянии 50 им средняо отклонаняя соответственно составят 1.8 и 1,4 мм. Этя результаты очень близки к данным О'Фаррелла по определена» вариабельности положения белковых фракций (О'ГаггеИ, 1975).

2. Идентификация некоторых мембранных белков эрятроцятов человека на двумерной карте.

В соответствия со стратегией систематического подхода к анализу белковых продуктов генной экспрессия поело построения двумерной нарты начинается этап идентификации белков на карте. Ориентируясь на' координаты, представленность н форму пятой, а также на литературные данные было установлено, что актин соответствует пятну К4. в-спактрин пятну С1, 0-спектрик пятну В1, белки 4. 1а. в 4. 1Ь соответственно пятнам 09 я В10, субьодиняцы полосы 6 соответствует пятнам 017 - 020 я т. д.

Считается, что плазматическую нокбрану эритроцптоа следует рассматривать как своеобразную открытую дикамяческу» структуру, способную специфически я наспацифлчоскя связывать б апня плазмы нрозн п цятозоля эритроцитов. Сравнительный анализ двумерных электрофорограми белкоа макбран'эрнтроцкгоэ н плазмы крови но выявил ни одного поракрыпасяогося полкпептяда за исключением следовых количостэ альбумина, который был ядонтяфнцарозан на нескольких электрофореграммах путем нх сравнительного картирования. Прв ана -лязе цятозольных болков, полученных методом механической дострук -ция эритроцитов, были обнаружены белки координаты которых соответствуют ряду белков на карте мембран эритроцитов. Для сравнения электрофореграмм мембранных я цятозольных. белков эритроцитов в

Номер фракция на карте Молекул. касса Кда 0ЭП-1 Локализация Номер фракции на карте Молекул. масса Кда ОЭП- 1 Локализация

С1 240 -0,11 + В43 56 0,74

В1 220 0,2 + F1 50 -0,03

ВЗ 168 0,3 + 01 45 1,77 +

В7 115 0,17 D2 45 1,60

Al 106 1,01 + 03 45 1,43

С4 98 -0,06 + 45 1,32 +

Ь9 SO 0,28 + 05 45 1,13

В10 78 0,28 + . ГА 43 0 ++

В12 77 0,66 + 017 35 1,82

013 77 0,54 + 018 35 1,64

аи 75 0,82 019 35 . 1,47 +■+

ñlS 73 0,75 020 35 1,36

316 72 0,68 Е27 34,5 0,77

317 70 0,60 Е28 34,5 0,67

ais 68 0,07 ++ Е29 34,5 0,56

А4 66 1,09 £30 34,5 0,46

A'i 66 1,00 4 + 11 28 . -0,43 +

В2Ь 66 0,83 G7 25 1,00

В35 60 0,19 + + G9 24,5 0,9 9

Й41 56 0,91 G10 22 1,80 +

е-42 56 0,61 G14 19,5 1,7

Таблица 1.

Ьваич&ш ОЗП-1 и Иг некоторых белковых фракций, полученных препаратов канбран эритроцитов человека при разделения .даукернш! зиектрофорезои.

+ - белив, л оказии osa шые только на двумерных электрофсреграмио ri^tridparoB мембран эритроцитов.

** - белки, локаяиэованше на двумврвдх эдекгрофореграмках првпа -ратоэ мембран и питозоля эритроцитов.

препараты белков добаалилн три марквршис белка. Получении« поем этого элаитрсфврегр&кмы били проанализированы на комплексе СВН1 а результаты приввдеш » кра!нен правом столби* таблицы 1. Сред» цыйв&ськых белке» о.рьтняв ил себя внимание1 махорка« фракция, ветеран по координатам совпажа»г с пятном G7 на карта мембранных

О-

белков, а по анализируемым параметрам (Иг 29 ООО, pl,8,57) очень напоминала карбоангидразу. При коэлоктрофореэв мембранных я цито-зольиых белков с коммерческим препаратом карбоангидразу человека наблюдалось явное усиление пятна S7 (ряс.3). Можно заключать, что пятно G7 представлено карбоангядразой, а количественная вариабельность этого пятна при изучении разных препаратов мембран обусловлена различной степенью отмывки теней эритроцитов от цито-эояьного содержимого.

Также путем коэлоктрофореза и на основе всеобъемлющей компьютера -знрованной базы данных белков AMA (Celia et al. 1991) на дву.чэркых электрофораграммах были идентифицированы глютатион-S- трансфораэа

Q7

Г " a® *&¿*tCa»bo»nhydre»e

(В)

- Я-

I

Ряс. 3

II

Участки дзуиоркыл электрофорограхм мембранных м цнтозояьни'Х бч.чиор эритроцитов с добаплонной коммерческой карбоангядразой Т. - мембранные белкк; IX - иитозольныв белки.

а - контрольная элоктрофорагракка; в - добавление карбоаигиерми. (Н5Х-НЗЗ), один яз вариантов тропомиозинов (II). актин (Р4) а дяя б^пнз ил сеиэйств» белков тчплоаого иона - 118X70 я ИЙС70.

3 Характеристика элзктрофоротмчаенкк вариантом чембр«нн»л белков эритроцитов человека.

Обично получачиыо электрофорвграммы хаибрашмл белх.о* обладая« високой воспроизводимо :тыо иаргжсы -¿лковых питии. Это облегчило поиск эл «кг рогач »сижх »чркннтси

некоторых фракций. В изученной выборке здоровых доноров электро -форетические варианты были обнаружены у 6 фракций. Обнаруженные варианты касались как изменений заряда, так и изменений количественной представленности одной или нескольких фракций по сравнению с окружающими. К фракциях, у которых были обнаружены электрофоретические варианты, затрагивающие количественную представленность, относились пятна обозначенные иа карте как Н 31-33, I 4-5 И В 23, D 17-20. ДЛЯ фракций Е 27-30 И Е 17-18 наблюдались варианты, связанные с изменением заряда, схематическое расположение некоторых вариабельных фракций и характер их изменчивости представлен на рис.4.

нзПЯГнзз Я» « <ПмП наГнаТнм

I Du-ao 1 fl iij'n л j Е 2 7-30 ^ О»г-20 Еаг-зо

Рис. 4

Некоторые электрофоретические варианты эритроцитарных мембранных белков человека. Вариабельные фракции обозначены стрелкой.

В двух верхних. строках рисунка показана картина количественной вариабельности фракций Н 31-33. В нижней строке приведены Э* - варианты фракции Е 27-30 по заряду. Обнаруженная картина вариабельности ряда фракций мембранных белков позволяет предположить, что выявляемые варианты могут быть следствием нескольких причин и среди них генетически детерминированного полиморфизма белков, дающих вариабельные фракции на электрофорег -раинах. Однако, для подтверждения генетической природы наблюдаемых

вариантов необходимы дальнейшие исследования, с привлеченном соквЯного анализа.

4. Трохотапная программа анализа свойств мембран эритроцитов человека.

Циркулирующие в кровяном русле эритроциты, как известно, представлены клетками разного возраста и свойства их плазматических мембран неодинаковы. Это необходимо принимать во внимание п^н исследованиях различных мембранопатий, а, учитывая сложность строеняя мембран, можно прийти к заключению, что поиски патогенетическая изменений плазматических Мембран должны осуществляться целон&прав-лано, по определенным программам.

Предлагаемая в данной работ» программа анализа свойств мембран эритроцитов состоит из трех этапов, первый из которых включает оценку гетерогенности эритроцитов, циркулирующих а кровяном русле. Второй этап составляют исследования ряда традиционных

характеристик клеточных мембран из суммарных препаратов эрятроци -

U

тов я из отдельных фракций. Основой третьего этапа является двумерный электрофорез мембранных белков эритроцитов человека.

Первый этап исследований составляло " фракционирование эрятроцитов а в ступенчатом; градяенте плотности денстрана Т-40 ял* фиколла 400. Как оядно яз таблецы 2, распределение эритроцитов по фракциям "разного возраста" неравномерно и позволяет прэдпологать, что в кровеносном русло здоровых доноров больве всего эритроцитов с промежуточными плотностям*. 1.088 - 1. 088 г/мл.

На втором этапа исследований яз препаратов мембран полученных Фракций эритроцитов, а также яз препаратов мембран исходно! эритроцитариой массы экстрагировали белки в изучали их одномерным электрофорезом. Традиционное окрааяваняе кукасся в - ZS0 »мяв»ло типичную картину распределения, на которой достаточно легко идея -тифчакровать главные белкя, составлявшие классификацию Ст»ка--"—ти.

Номер фракции эритроцитов плотность, г/кл масса, мг процент от общей массы

1 1. 078 7. 25 1 0, 75 9, 53 1 0, 39

2 1. 0 86 20, 50 1 1, 93 27, 05 1 0, 94

3 1. 081 21, 75 1 1,80 27, 78 1 0, 59

4 1. 096 13. 75 1 0, 75 18, 33 1 0, 63

5 1. 102 5, 25 0, 48 7, 03 1 0, 76

в 1. 107 <7,20 1 0, 42 9, 30 1 0, 37

Табл. 2. Удельное содержанке лнЬфилнзированкых мембран фракиж* эритроцитов (М 1 ю).

фракция

Белки

иембран 1 2 3 4 5 6

1 17, 0710, 29 14, 112,9 15,511, 1 17, 112,2 14, 9*0,8 13, 7.3, 0

2 13,8311,47 13. 911,88 13,911,2 13, 110, 3 13, 210, 1 12, 712, 8

2. 1 4.8 ±1, 1 Э, 811,9 4,6711,9 4,511,5 4,710,7 5,411,2

3 20,0 11,8 20,113,6 21,911,2 22,811,0 21,010,4 23,510,1

4. 1 5,в 11,0 5,010,8 8,710,в 5,710,7 3,710,9 9,310,9

4.2 6,5 11,0 5,711,3 5,811,2 5,911,3 6,410,9 6,911,5

4. 5 • 8,8 11,6 11,213,0 10,814,1 7,511,5 10,912,2 11,010,3

5 9,4 11,6 9,411,5 в,911,2 7,811,4 10,812,2 10,511,9

6 3,4 11,3 3,110,5 3,110,9 4,311,4 5,011,7 4,7512,4

7 3,2 10,6 2,010,1 2,710,2 2,511,8 4,811,3 3,010,8

8 3.4 11,7 36811,7 3, 111, 4 4,011,9 2. 111, 5 ; 3, 110,7

Таблица 3. Удельное содержание (вХ) отдельных мембранных белков во фракциях1 эритроцитов (Н 1 в>).7

Я табл.3 представлены результаты количественного анализа одномер -: шх злектрофореграмк. Сравнение этих данных позволяет сделать вы -ьол, что процесс/старрния: эритроцитов;не•сопровождается з^а^ятель-. . \|&|ми-. изменениями в белковом составе нембрай., Главные; гликопр.отеды, -,

дедектмроаались в эти* опытах окраской по Шиффу. Дополнительные белковые фракции на одномерных электрофореграммах удавалось обна -руяить при окрашивании серебром. К тому же в этом случае одноаро -менно выявлялись я обычные белки, и сиалопротеяды. Второй этап включил также определение активности эндогенных протеиназ я (На+,К+)-АТФазы (Захаров я соавт. 1990).

Проведенные исследования по адаптированно системы двумерного электрофорезе для анализа мембранных белков эритроцитов человека позволила на третьем этапе включить в изучение 109 менбранных

I

белков и сравнить по этому комплексу показателей отдельные фракция эритроцитов. Подобное изучение белкового состава мембран эритроцитов, раздолешыз: а градиенте плотности, позволяет соотнести двна -кику изменений о белковой компоненте мембран эритроцитов а процессе их староная, коррелирующем с увеличением плотности этих' клеток.

'В целок, результаты двумерного электрофоретичэского анализа

белков кембран полученных фракций соотгаотствовали распределению

и

белков суммарного препарата. Внесте с тан проведенное исследование позволило обнаружить определенные закономерности. Во-порпых, представленность некоторых болноэ в процессе старения снижается; во -вторых, обгчза содзриакие веек белковых пятой на гелях сакых старых зритроцЕтов (с 1.107 г/ил плотностью) енчяено, что мояет объясняться увеличением их агрегации в процаосо старения я (или) реальным фазвологяческии снижением в мембранах содэркакзя белка; е-третьих, з самой легкоЗ (состоящей на ЗОЙ из рвтпкулоцатов фракции) обнаружено дополнительное пятил я зоне белка 4.3, возможно спгц.'.^чвскм рэтккулецатарнов локализация. Теням образом, анализ саоЭств мембран эритроцитов по предло-деикоЭ программе свидэтельстоует о малых изменениях белковых компонентов хонбрлш эритроцитов у здоровых индивидуумов. Данная программа анализа сэоДсте мембран эритроцитов помогает ' систематизировать

яссладовамнте эягяояогяж и патогенезу заболеваний крова, .где предполагаете!* Дефект в каком-либо из белков мембраны. в тоже время обнаружено« #*хвн«н«е в зоне ¿елке 4.9 необходимо учитывать при изучении наслЧ'ДеТ «в иных гемолитических анемий, связанных с дефектов вменбрв**, поскольку соотновеняе клеток равной степени зрелости может значительно изменяться при патология яля даже фяз яологичесмях процессах. •'

8. Изучен** свойств мембранных белков эритроцитов человек« при микросфероцхтарной анемия я при хорее Гентингтона.

ипигкш« я генетическая гетерогенность в группе наследственных сфероцитаршх анемий вызвана дефектами многих ркяшшк белковых компонентов цитоскелета. несмотря на досткстцгш* успехи я идентификация первичного биохимического джфЬдег* при1 некоторых формах этой патология, вероятно ее« многие кзргаия» остается сегодня неизвестными. Нельзя исключить, что я группе наследственных сфероцитозов существуют формы с мутационными повреждениям* в других белках, в тон числе неизвестных, пр***м*ж** участие в сборке к поддержании цятоскелетиых структур.

с поковсьв' явумбрного электрофореза я построенной белковой карты МВЭЧ были проанализированы белки мембран эритроцитов в групп« больныхиаследств«нным сфероцитозом. Из 20 обследованных больных у двух пациентов'Не было обнаружено никакяхкачественных отлячяй от нормы«. по »сеМ18в ' белкам /для которых построена двумерная карта. Среди 1'9 остальных больных был* обнаружены общие : для всех •' > характер**» «м»неняя, выражаюахеся в наличии на двумерных 'г

' : У' У ''•■'■У »•■'.'. I 'У!: -Уг*У -'":'У

электрофорегрь^окахг больных со сфероцитозом, помимо картированных / белков. : нескольких дополнительных пептидов.,«На • 5ряс; показаны У ¡| , результаты:^двумврмйго1 разделений белковме|мбранэритроцитов, . фракционнровантлсповоэрастуУ больного кУУ':У д' У ЧУДУ y^::;^^^;vyyy

y:' :::•..- ■ '" '.ЧУ'-« :.чччУУ.иу(У УУУУУ.У1:Ч-У '■>

Представленная влеитрофореграмне являетсятяпичиой ;мя в вех боль -У,'-

21____ __ ____

ЕМ"3

Двумерный электрофорез белков мембран эритроцитов больного наследственным сфэроцитозок. Окраска сереброк.

Прямоугольниками показаны области, где обнаружишь досолилтяль-

*

ные белки обозначенные звездочками.

пых, у которых обнаружены дополнительные пятна. Соотаотствукдвй, 'анализ белкового состава эритроцитов этих пациентов, промаянный;-на предварительно фракционированных по возрасту эритроцитах э градиенте плотности декеграна пли фиколяа 400, не выявил достоверных качественных отличи* между фракциями. Учитывал« чгю при.. исследуемой патологии имеется резкий возрастной сдвиг в, популяции* циркулирующих клеток, можно предположить, что обиаружента; изменения в белковом составе мембраны эритроцита.является приаакок незрелых эритроцитов. Для . проверки этого предположения была исследована группа лиц с высоким ретикулоцитозок (0 - 15Х). В эту группу возля весть больных с аутоиммунно! гемолитической анемией и один больной с яароксизмальной ночной геноглобицуряов. После фракционирования по плотности и 20-3* белков из получаучных франк 5ыло обнаружено, в верхне! (самой "»кой") фракции клеток-»бнаруживаотся те же дополнительные белки;, что в в обвей пояул/ы*»

эритроцитов при наследственном сфероцятозе. При этом в тяжело! ("старой") фракция эти белки отсутствует. Такнк образом,, можно сделать заключение, что двумерный аналяэ белков мембран эрятроцятов больных наследственным сфероцитозом проведенный по 189 белкам, идентифицированных как мембранные компоненты, не выявял' среди них качественных особенностей, присущих этому заболеванию. Обнаруженные у больных в обшрм пуле эритроцитов дополнительные минорные белки, по-видимому, являются признаками незрелых, "молодых", клеток * отражают общий возрастной сдвиг в популяция эритроцитов при этой патологии.

Другим наследственным заболеванием, при котором изучался белковый состав мембран эритроцитов, была хорея Гентянгтона. В настоящее время накоплено достаточное колячество экспериментальных данных в пользу того, что у больных хореей Гентянгтона клеточная мембрана дефектна (ВиЗДег£1е1<3 й. еЪ а1.1979,Кипд Ь. вЬ аХ. 1982 ) Одной из характерястяк, непосредственно связанных с состояняем эрятроцитарной мембраны, является осмотическая резистентность эрятроцятов. Как показаля проведенные исследования осмотическая резистентность у больных достоверна снижена (68,6 ± З.ЗХ) по сравнению со здоровыми донорами (73,5 ± З.ОХ)1. Одним из факторов, определяющях устойчявость эрятроцитарной мембраны к осмотяческому шоку является активная я пассивная проницаемость мембраны эритроцитов для ииэкоиояекуяярных ионов, прежде всего для На* и К*. В связи с этик была произведена оценка активности (Иа*, К*)-АТФазы как основного компонента N8*,К* насоса у больных хореей Гентянгтона (данные по активности На+,К+-ЛТ«азы получены к.б. н. Щегловой К. В./которой диссертант приносит глубокую благодарность). Полученные результаты . свидетельствуют, что несмотря . на

'данные .по изменениям осморезястентностя получены Сычовой В.Л.(Ин-т ■ неврологии раин). , / > ■ . V -

значительную вариабельность значений активности, как у здоровых донсров, так и у больных хореей Гентингтона средние значения активности (На*, К*) - АТФаэы в группе последних превышают соответствующие значения в норме более чем в четыре раза (табл.4).

Группа обследованных нноль фн/мг белка в час

Больные ХГ п-7 133, 0 i 48, В

Здоровые доноры п-14 27, 5 ± В, 4

Табл. 4

Активность На,К - АТФагы мембран эритроцитов в норне и у больных хореей Гвнтингтоиа.

Такая неоднозначность полученных результатов, возможно, объясняется существованием выраионного клинического полиморфизма хорек Гентингтона.

Представления о генерализованном мембрпнном дефекте при хорее Гентингтона предполагают поиск соответствующего молекулярного маркера в лмпндноЯ и белковой составляющей мембран эритроцитов. С этой целью был предпринят сравнительный анализ сйБЭЧ в процесс» старения эритроцитов у 21 больного хореей гентингтона. Розул^тати фракционирования по возрасту позволили обнаружить следующую особенность: почти у всех обследованных больных наблюдалось относительное увеличение доли медленно садхментхрукхцай фракции эритроцитов, что визуально выражалось в том, что у больных ХГ практически всегда выявлялась дополнительная, самая легкая Фракция практически не обнаруживаемая у здоровых лиц (рис.вл). Следует отметить, что представленность указанной фракция сильно варьировала, а у 2 больных аз 14 обследованных по этому методу е» но у далось лылаить. Двухмерный анализ белкового состава мембран эритроцитов, фракционированных по возрасту ко выявил достоверных

Г " ...... *..........

»

Ряс. в

г - распределение эритроцитов в ступенчатой градиенте фнкола 400. 1 - здоровый донор; 2 - больной хореей Гентингтона

ъ -участок двухмерной электрофореграммы белкрв мембраны эритроцита (зона белка 7) больного хореей Гентингтона. Контуром обозначен дополнительный белок.

различий в белковом составе мембран эритроцитов у обследованных лиц ии по локализации на электрофореграммах, ни по количественной представленности, что указывает на отсутствие изменений в составе специфических эндопроте&з, участвующих в процессе старей* эритро -цитов. Нужно отметить, что у одного больного была обнаружена существенная особенность в зоне белков полосы 7, предварительно опре -деленных как немывенше тропоииоэнны, присутствовал дополнительный белок с Нг-30 000и0ЭП-1«-р,25,обозначенный на рис. ВБ контуром. • Вероятнее всего эта находка не имеет; отношения к хорее Гентинтто -на, а отражает индивидуальную особенность экспресии генома в клет- ' ках эритроидного ряда у данного лица (биохимический полиморфизм)! Однако комплекс полученныхданных¡обнаруженное изменен«ев . . распредвлвнии эритроцитов п^ ^ракцяям при - центрифугировании ;в <! регредиенту рлотноЦи. : к\ также язменения ;резиствнтнрсти.:^итррциЪов-^

V ;*;.' и •''.СЙа'^кТ).'•;,' Я"- АТФаэ'Кой-чЧ'ктивнпс^йЛ;.^

^ '\1;/У.. У?" ''";• Л(к./;'■■'.' ' Л- - 'V

г . ^ущеетяованик патологии клеточных мецбран, пр» хорее Гентингтона. ;,<

28 ВЫВОДЫ

1. Разработана адаптированная и фракционирован» мембранных белков кодификация катода двумерного электрофореза по О'Фарреллу, которая включает применение высокогвдрофобного неионного детергента - тритона Х-309 в специального температурного режима на стадии изоэлактрофокусирования.

2. С помощь» разработанной модификации фракционирования охарактё -ризован комплекс белковых продуктов генной экспрессии человкка, участвующих, как структурные компоненты, в формировании мембран

ЭрИТрОЦИТОВ.

в) построена усредненная схема распределения белковых фракций (двумерная карта) на электрофореграимах, содержащая >89 фракций, среди которых определено положение ряда иэвестшх главных мембранных белков.

б) впервые проведена идентификация среди мембранных белков эри-

г

троцитов двух белков относящихся к семейству «белков тепло -вого шока» (НБС70, 118X70), а также на двумерной карте лока -лизована фракция карбоангядразы.

в) при анализе нембранкых белков эритроцитов здоровых доноров обнаружены шесть групп электрофоретических вариантов, среди которых возможно есть полиморфные генетические системы.

д) выявлен ряд белков эритроцита, включал некоторые известных цнтоскелетные белки, которые имеют «двойную локализацию», то есть присутствуют и в препаратах мембран и в цитозоле.

3. Обнаружен низкий уровень эндогенной протеолитической активности а очищенных препаратах мембран эритроцитов, что подтверждав* высокую эффективность предложенного метода видал» н/м эритроик -тов.

4. Изучены изменения белкового состава в мембранах »рятршиги* человека в процессе созревания я старения клетей п/т«.< акалкзв

белков мембран эритроцитов, фракционированных по возрасту в ступенчатом градвенте плотности декстран Т-40 ■ фжколл 400. Обнаружены пептиды (Кг«69 КО ж- pI-5,7,* №>50 ko ■ pl«8,8; Мг'34,5 кО ж pl«8, S) спецжфжческже для ретхкулоцжтов (а-1.078г/кл). г

s. предложена трехэтапная программа жзученжя свойств мембран эрж -троцятов человека, включающая фракционирование клеток а градиенте плотностя, одномерный ж двумерный электрофорез КЕЭЧ, а также ряд функциональных тестов. Проведенное по этой программе сравненяе эритроцитов здоровых доноров ж больных некоторымж наследственными мембранопатжямя позволяло выявять определенные изменения у последних:

а) у больных наследственными сфероцитозамя обнаружено увеляче -ние доли молодых эритроцитов и отмечено присутствие среди НБЗЧ белков, характерных для ретякулоцитов:

б) у больных хореей Гентянгтона определены изменения в соотно -веижж быстро- я медленноседяментярующих эритроцитов, а достоверных изменений на уровне КЕЭЧ обнаружить не удалось.

Список работ, опубликованных по теме диссертация

vi. Shishkin S.S., GrôBOv P.S., Kovalev L.I., Zakharov S.F., Pulyaeva K.~ Tvo-dlmeneional gel electrophoresis of human, protéine fr ob erythrocyte »eabranee and heart. "Proc.2nd Int.Conf.Bloche«. Separations, oçtober 2-7, 1988,; Hungary. Edd. by J.Pick, J.Vajda"^-Budapest, Hungary,1988, p.435. ^ ^

: 2. Вандала А.К.. Громов .П.С. , Захаров С:Ф. Белковый состав мекбран . . ; * эритроцитов человека; ;фракционированных а ступенчатом градиеКте ■ ■: декстрана. Гекатологжя я траНсф^з^ологяя. Щ0> 'с. 28-31, ' '

3, Захаров С.е., Громок П.С., Шишкин С.С. Двумерный электрофорез,

к эрятроцятарних мембрахмоя банков человек« ■ прясутствяв трятона х-308. Вопроси кадацамсмоЙ хамя*, 1S88, N3, с. 139-1*2. Громов П.С., Захаров С.*., Яшкам С.С., ИльансквЙ Р. В. Двумер -мая карта маибраипых беяков эратроивтов человека.. Баохамяя, 1988. т. S3. N8. С. 1318-1326.

Л

Громов П.С.. Захаров С. , Гачнкьска N. , Сованьскай М.. ВартЬш Г.. Лейко В., Яжжнян с. С. Характеристика эндогенного протеоляэа в препаратах мембран эритроцитов человека. Бпл. эхеп. б*ол. в кед.. 1968. т. Юв. MS, с. 282-296.

Захаров С. , Шандала Л. К. , Яеглова К. В. . Громов П. С.. Инсарова Н. Г. . Сычова В. Л. . Маркова В. Д. . Вяакян С. С. . Иванова - Смоленская и. д. Сравнительное научение мембран эратроцатов крова человека в норне а болыалс хореей Гентангтона. Вопросы медицинской химии. 1980, т. Зв. N8, с. 71-73.

firomov P.S., Zakharov S.F., Xaurov В.A., Shiehkln S.S. Hunan red cell яеяЬгапе protein database. Proceed, of the ii,t.Heating on two-dlmene.electrophor., London, ad. by H.J.Dunn, 1991, pp.103-104. i. Crosaov p.s., Zakharov 3.T., HandriXina g.V., Scheglova M;V.

Study of erythrocyte membrane protein» in patients with hereditary nicroapharocytoais. Proceed. 8th Int. Cong.Human Genet. J.Huu.an Cenet., 1991. auppl.v.49. N4. October. N465.p.97