Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

Середенина, Тамара Сергеевна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Середенина, Тамара Сергеевна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

На правах рукописи

СЕРЕДЕНИНА Тамара Сергеевна

ИЗУЧЕНИЕ И МОДЕЛИРОВАНИЕ НОВЫХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Институте молекулярной генетики РАН и в компании SienaBiotech (Италия)

Научные руководители:

Гривенников Игорь Анатольевич - кандидат биологических наук Георг К. Терстаппен - докт. фил. (PhD)

Официальные оппоненты:

Островская Рита Ушеровна - доктор медицинских наук, профессор Лимборская Светлана Андреевна - доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 8 » ноября 2006 года в 12°° на заседании диссертационного совета Д-001.024.01 при ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан » _2006

года.

Ученый секретарь Е.А. Вальдман

диссертационного совета, доктор медицинских наук

Актуальность темы

Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что болезнь Альцгеймера (БА) является частой формой сенильной деменции, распространение которой в развитых странах составляет до 5% среди населения старше 65 лет (Lobo et al., 2000). С увеличением продолжительности жизни нейродегенеративные заболевания, обусловленные старением, становятся одной из наиболее актуальных медицинских проблем.

На современном этапе средства фармакотерапии БА ограничены двумя типами препаратов - это ингибиторы ацетилхолинэстеразы (донепезил, галантамин, ривастигмин) (Mayeux and Sano, 1999) и недавно апробированный антагонист NMDA рецепторов, мемантин (Zajaczkowski et al., 2000; Jain, 2000). Эти препараты временно улучшают симптоматику, но не у всех пациентов. Их использование не позволяет существенно замедлить развитие болезни. Поэтому очевидна необходимость разработки новых подходов к фармакотерапии БА, что в свою очередь требует выявления патогенетически обоснованных молекулярных мишеней, экзогенная регуляция которых позволит обеспечить желаемый эффект.

БА обусловлена комплексом нейрохимических нарушений, подробный анализ которых приведен в работах (Воронина и др., 2002; Ostorovskaya et al., 2006; Selkoe, 2001; Walsh and Selkoe, 2004). Большинство авторов приходят к заключению, что поддержанию когнитивных функций способствует активация нейрональных н-холинорецепторов. Другим важным эндогенным фактором является мозговой нейротрофический фактор (BDNF), участвующий в формировании, регуляции функциональной активности и регенерации нейронов (Murer et al., 2001). Одна из гипотез холинергической дегенерации при БА связывает этот процесс с недостаточностью трофических факторов.

Настоящее исследование, выполненное в соответствии с планом международного научно-технического сотрудничества между ГУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН и компанией SienaBiotech (Италия), посвящено изучению никотинового ацетилхолинового рецептора альфа 7 типа (alpha7nAChR) и выяснению

возможности регуляции новым оригинальным пептидным препаратом семакс уровня BDNF в мозге.

Alpha7nAChR представляет собой ионный канал с высокой проницаемостью для ионов кальция. Наиболее высокие уровни экспрессии этого рецептора найдены в коре, гипокампе, гипоталамусе и в миндалине (Seguela et al., 1993). Активация alpha7nAChR опосредует нейропротекцию, что показано в опытах in vitro с применением ряда токсических воздействий, включая ß-амилоид (Shimohama and Kihara, 2001; Prendergast et al., 2001). В опытах in vivo установлено, что стимуляция этого канала ведет к улучшению когнитивных функций (Arendash et al., 1995; Levin et al., 1999). Поэтому перспективным представляется создание клеточной модели alpha7nAChR для скрининга и фармакологической характеристики возможных регуляторов рецептора. Однако в достижении цели возникает ряд проблем. В клеточных линиях не нейронального происхождения не удается получить функционально активный рецептор при гетерологической экспрессии alpha7nAChR (Cooper and Millar, 1997). Сборка и транспорт этого ионного канала являются недостаточно изученным процессом. Однако, как и другие ионные каналы (Green, 1999), alpha7nAChR находится под контролем шаперонов эндоплазматического ретикулума (ЭР). Недавно был обнаружен новый белок, RIC-3 (resistant to inhibitors of Cholinesterase), который оказался необходимым для экспрессии функционирующего alpha7nAChR (Halevi et al., 2002). Поэтому для создания рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR в настоящей работе был использован RIC-3.

Цель и задачи исследования

Основными целями исследования, направленного на изучение новых фармакологических мишеней средств лечения БА, явилось выяснение влияния нового ноотропного препарата семакс на содержание BDNF в мозге крыс и создание клеточной модели функционально активного alpha7nAChR.

Для их достижения необходимо решить следующие задачи: 1. Фармакологически изучить влияние семакса на динамику содержания BDNF в

структурах головного мозга крысы.

2. Клонировать полную кодирующую последовательность RIC-3 человека и крысы для изучения консервативных участков и видовой специфики их структуры и функции.

3. Идентифицировать и охарактеризовать варианты RIC-3 человека и крысы.

4. Изучить экспрессию транскриптов RIC-3 в сравнении с экспрессией alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы.

5. Исследовать субклеточную локализацию RIC-3 в разных типах клеток.

6. Изучить функцию RIC-3 в процессе созревания a!pha7nAChR.

7. На основании полученных результатов создать и охарактеризовать с использованием фармакологических анализаторов рекомбинантную клеточную линию, экспрессирующую человеческий alpha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3.

Научная новизна работы

Установлено, что препарат семакс в дозах 50 и 250 мкг/кг увеличивает уровень белка BDNF в гиппокампе и в базальных ядрах крысы через 3 часа после интраназального введения.

Создана рекомбинантная клеточная линия на основе клеток из яичника китайского хомяка (СНО-К1), экспрессирующая функционально активный человеческий a!pha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3. Впервые клонирована полная кодирующая последовательность ДНК RIC-3 крысы и новый вариант сплайсинга RIC-3 человека, RIC-3-900. Полиморфизм Serl73+/Serl73-, уже описанный для RIC-3 человека, подтвержден для RIC-3 крысы. Впервые получены данные о распределении транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в отделах мозга и в периферических тканях и органах человека и крысы. Описана субклеточная локализация RIC-3 в первичной культуре нейронов коры крысы. Полученные данные показали, что полиморфизм RIC-3 S+/S- не важен для транзиентной экспрессии alpha7nAChR в клетках СНО-К1. Доказана способность человеческого RIC-3 обеспечивать стабильную гетерологическую экспрессию функционально активного человеческого alpha7nAChR в клетках СНО-К1.

Научно-практическая значимость работы

Установленная способность семакса увеличивать уровень BDNF дополняет сведения о механизме действия препарата и обосновывает его применение в качестве нейропротектора при различных заболеваниях, в патогенезе которых отмечено нарушение регуляторной функции и продукции BDNF.

Созданная рекомбинантная клеточная линия СНО-К1, экспрессирующая функционально активный человеческий alpha7nAChR в присутствии RIC-3, является новой экспериментальной моделью, дающей возможность проведения фундаментальных исследований сборки, транспорта и регуляции функции рецептора. Одновременно модель позволяет проводить фармакологический скрининг соединений, новых селективных агонистов, аллостерических модуляторов alpha7nAChR, на основе которых могут быть созданы оригинальные лекарственные средства лечения нейродегенеративных заболеваний, включая БА. Разработаны молекулярные инструменты для дальнейшего изучения функций RIC-3 и его взаимодействия с alpha7nAChR.

Основные сведения об апробации работы

Материалы диссертации доложены на 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Москва, 2005), конгрессе SINS (Искья, сентябрь 2005) и на конгрессе FENS (Вена, июль 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано шесть статей и четыре тезиса в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 210 источников. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 26 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение РНК. Тотальную РНК выделяли из разных отделов мозга и тканей взрослых самок крыс преципитацией в растворе 3 М LiCl/6 М мочевины и фенольно-хлороформной экстракцией (Auffray and Rougeon, 1980). Образцы полиаденилированной РНК из человеческих тканей приобретены в Clontech (Palo Alto, CA).

Синтез кДНК проводили с помощью обратной транскриптазы Superscript П (Invitrogen), используя праймер oligo(dT) 500 нг (Proligo), из 2 мкг тотальной РНК крысы или 1 мкг полиаденилированной РНК человека. 10 нг кДНК крысы или 5 нг кДНК человека использовались для исследований методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Стандартные методы молекулярной биологии. Продукты ПЦР и рестрикции разделяли электрофорезом в агарозном геле, приготовленном в буфере ТАЕ и содержащем бромистый этидий. Для экстракции продуктов из геля и для очистки продуктов ПЦР использовали наборы QIAquick Gel extraction Kit и QIAquick PCR purification Kit (QIAGEN). Трансформация химически компетентных бактерий Е. coli ТОРЮ (Invitrogen) выполнялась по протоколу One Shot ТОРЮ Chemical Transformation Protocol (Invitrogen). Для экстракции плазмидной ДНК использовали наборы QIAGEN Plasmid Purification kits. Для отбора положительных клонов проводилась диагностическая рестрикция (рестрикционные ферменты Invitrogen).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и клонирование. Реакции для анализа генной экспрессии проводились с помощью фермента Taq DNA Polymerase (Invitrogen), по протоколу производителя. Реакции для клонирования - с использованием высокоточного фермента Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) по протоколу производителя. Для клонирования человеческого RIC-3 была выбрана система Gateway (Invitrogen), основанная на механизме сайт-специфической рекомбинации. Для клонирования человеческого RIC-3-900 и RIC-3 крысы применяли систему Zero Blunt TOPO PCR Cloning (Invitrogen), использующую фермент ДНК топоизомераза I, со свойствами рестриктазы и лигазы. Варианты RIC-3

S+/S-, полученные с помощью Taq ДНК полимеразы, были клонированы по протоколу ТА Cloning Kit (Invitrogen).

Конструкция плазмидных векторов. Для создания флуоресцентно меченного продукта крысиный RIC-3 (S+/S-) был субклонирован в вектор экспрессии pZsYellowl-Nl vector (Clontech) с использованием рестрикционных ферментов и последующего лигирования с помощью Т4 ДНК лигазы (New England Biolabs).

Количественная real-time ПЦР выполнялась на амплификаторе I-Cycler с использованием iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) по протоколу производителя. Анализ полученных результатов проводился с помощью программы I-Cycler iQ Optical System software version 3.0a.

Культивирование клеток. Все манипуляции с клетками выполнялись в строго стерильных условиях. Клетки культивировались при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% (v/v) С02/воздух. Клетки СНО-К1 культивировались в среде Fl2 (Ham), содержащей 10% FBS, клетки GH4C1-A7 культивировались в среде F10 (Ham), содержащей 10% FBS и 5% HS в присутствии 0,2 мг/мл гигромицина. Все среды содержали 2 мМ глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки СНО-К1 пересевались 2-3 раза в неделю. Для трансфекций клетки сеяли за день до трансфекции на 13 мм стекла, обработанные поли-О-лизином, 10 мкг/мл.

Первичная культура нейронов коры крысы выделялась из El8 эмбрионов крыс линии CD. Нейроны культивировались на стеклах, обработанных поли-D-лизином, 37,5 мкг/мл и ламинином, 2,5 мкг/мл, в среде Neurobasal, содержащей добавку В-27 (Sigma), 2 мМ глутамина, 50 U/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина.

Транзиентные трансфекции выполнялись с помощью Lipofectamine-2000 (Invitrogen). От 0,1 до 0,3 мкг/см2 плазмидной ДНК использовалось в зависимости от типа клеток. Отношение ДНК/Lipofectamine было 1/3 w/v. Трансфекционная смесь готовилась в среде OptiMEM (Gibco). Инкубация с трансфекционной смесью длилась 1,5-3,5 ч, в зависимости от типа клеток.

Создание рекомбинантных клеточных линий. 1х10б клеток СНО-К1 сеялось на 10 см2 чашку Петри. Для трансфекции использовалось 7,5 мкг плазмидной ДНК, кодирующей alpha7nAChR и устойчивость к G-418, и 7,5 мкг плазмидной ДНК,

кодирующей RIC-3 и устойчивость к бластицидину. После 3 недель культивации в присутствии антибиотиков резистентные клетки были рассеяны в 96-луночные планшеты, 0,3 клетки/лунку. После получения достаточного количества материала, клоны тестировались на предмет экспрессии alpha7nAChR. Клетки инкубировались в среде, содержащей 2 мкг/мл флюоресцентного а-бунгаротоксина (a-Bgt А1еха-594, Molecular probes), фиксировались 3% параформальдегидом и анализировались с помощью конфокального микроскопа. Для обогащения клонов использовался метод fluorescence activated cell sorting (FACS) (FACSAria, Becton Dickinson).

Иммуноц umoxuM ия. Трансфицированные клетки фиксировали параформальдегидом, 3% или 4%+4% сахарозы, и инкубировали с a-Bgt, 125 мкМ, а затем с первичными антителами анти-a-Bgt (Verona university) и вторичными антителами anti-rabbit AlexaFluor-546 (Molecular probes). Окрашенные клетки заключали в среду ProLong Gold antifade reagent (Invitrogen). Анализ препаратов проводился с помощью конфокального лазерного сканирующего флуоресцетного микроскопа Zeiss LSM510.

FLIPR. The fluorometric imaging plate reader (Molecular Devices) с помощью флюоресцентного красителя (Fluo-4), чувствительного к ионам кальция, позволяет измерять изменения концентрации внутриклеточного кальция, вызванные добавлением препаратов к живым клеткам. FLIPR регистрирует и интегрирует события одновременно для каждой лунки 96-луночного планшета по схеме, позволяющей идентифицировать агонисты, антагонисты и неактивные соединения. Клетки СНО-К1, стабильно экспрессирующие alpha7nAChR и RIC-3, наполнялись кальциевым сенсором Fluo-4, и помещались в прибор FLIPR, в котором автоматически добавлялись исследуемые соединения и регистрировалось изменение флюоресценции.

Анализ данных. Определение ЕС50 и IC50 проводилось с помощью программы Xlfit 4.1: Y=Bottom + (Top-Bottom)/(l+(EC50/X)AHillSlope) (модель 205), где X -концентрация, Y - ответ, Bottom - нижнее плато кривой, Тор - верхнее плато кривой, HillSlope - коэффициент Хилла. Качество эксперимента оценивалось с помощью Z' фактора, описывающего дистанцию между отклонением отрицательного контроля и

отклонением положительного контроля (Zhang et al., 1999). Z' факторы в проведенных экспериментах были больше, чем 0,6.

Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы ex vivo. Количественное содержание BDNF в экстрактах тканей определяли методом иммуноферментного анализа (BDNF E^® Immunoassay System) по протоколу фирмы Promega (США). Крыс декапитировали в различные сроки в соответствии со схемами экспериментов, немедленно извлекали головной мозг и выделяли, кору больших полушарий, базальные ядра, гиппокамп и можзечок. Образцы замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С для приготовления экстрактов и последующего определения количества BDNF. Концентрацию белка в экстрактах определяли с помощью модифицированного метода Лоури.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ряд опубликованных данных свидетельствует об эффективности терапии нейродегенеративных заболеваний с помощью нейротрофинов (Longo et al., 2004; Fumagalli et al., 2006). Российскими учеными из Института молекулярной генетики РАН показано, что гептапептид Семакс увеличивает уровни мРНК для BDNF в первичных культурах глиальных клеток в 7-8 раз (Shadrina et al., 2001). Семакс предотвращает гибель холинергических нейронов в культуре, как в полной среде, так и в неблагоприятных условиях, вызванных депривацией глюкозы (Grivennikov et al., 1997; Гривешгаков и др., 1999). В развитие этих данных в настоящей работе определяли уровни BDNF в экстрактах различных отделов мозга крысы через 3 и 24 часа после шгграпазалыюго введения семакса в дозах 50 и 250 мкг/кг. Полученные результаты показывают (рис. 1), что семакс в исследованных дозах увеличивает уровень белка BDNF в гиппокампе и базальных ядрах крысы уже через 3 часа после ведения. Эффект семакса выявлялся в гиппокампе и через 24 часа. Введение семакса не влияло на уровни BDNF в мозжечке и коре головного мозга.

Известно, что важной функцией BDNF является регуляция синапсов в гиппокампе, ключевом отделе переработки поступающей в мозг информации и формирования памяти (Minichiello et al., 1999; Hall et al., 2000; Mizuno et al., 2000).

Структура переднего мозга участвуют в процессах внимания и восприятия информации. Таким образом, полученные данные позволяют полагать, что выявленное увеличение содержания ЕШИИ в гиппокампе и базальных ядрах при введении семакса является составной частью механизма стимуляции им когнитивных функций. С другой стороны, регуляторное влияние гептапептида на продукцию ЕШЫР позволяет предположить возможность расширения показаний для его применения в качестве нейропротектора.

гиппокамп базальные ядра

-—— ——-—и^йги

3 ч 24 ч 3 ч 24 ч

Рис. 1. Изучение влияния гептапептида семакс на уровень в разных

отделах мозга крысы. Крысам интраназально вводили раствор пептида семакс в концентрации 50 мкг/кг (заштрихованные столбики) и 250 мкг/кг (черные столбики). В качестве контроля вводили дистиллированную воду (белые столбики). Полученные данные нормализированы по массе ткани. На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки. Определение достоверности различий проводилось с помощью Места Стъюдента для парных или непарных данных. *-р<0.05; **-р<0.01.

Вторая часть работы направлена на создание клеточной модели функционально активного а1рЬа7пАСЬЯ. Недавно обнаруженный белок ШС-З непосредственно включен в процесс созревания а1рЬа7пАСЬЯ (На1еу1 <?г а/., 2003). Так как этот рецептор является мишенью для фармакотерапии нейродегенеративных и психических заболеваний, факторы, регулирующие его экспрессию, представляют значительный интерес для изучения с фармакологических позиций.

В начале исследования проведена работа по характеристике RIC-3. В первой серии экспериментов стандартными методами ПЦР клонированы полная кодирующая последовательность человеческого RIC-3 и обнаружен новый вариант сплайсинга этого гена, RIC-3-900 (рис. 2).

Рис. 2. Клонирование человеческого RIC-3. Электрофорез в агарозном геле продуктов ОТ-ПЦР, амплифицирущей человеческий RIC-3 из гиппокампа. В результате реакции были получены четыре продукта. В сравнении с описанными последовательностями

человеческого RIC-3, верхний продукт (са. 1100 пн) соответствует полной последовательности, а два быстро мигрирующих варианта (са. 550 and 700 пн) - известным вариантам RIC-3 (RefSeq accession number указан справа от продукта). ? - продукт, не соответсвующий ни одной из известных форм человеческого RIC-3 (са. 900 пн).

С помощью метода ОТ-ПЦР была изучена экспрессия вариантов RIC-3 в тканях человека. Полученные результаты показывают, что большинство тканей человека экспрессируют более одного варианта RIC-3 (рис. 3).

650 500

Р-актин

Рис. 3. Анализ экспрессии человеческого ШС-З в разных тканях с помощью ОТ-ПЦР. Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации человеческого Р1С-3 из разных тканей с помощью ОТ-ПЦР. На нижней панели представлены продукты амплификации р-актина из исследуемых тканей в качестве контроля качества образцов РНК.

Так как данные о полной кодирующей последовательности RIC-3 крысы отсутствовали, следующая серия экспериментов была направлена на предсказание структуры и кодирующей последовательности RIC-3 крысы in silico. Для этого с помощью программы BLAST проведен сравнительный анализ последовательности кДНК человеческого RIC-3 и полной геномной последовательности крысы (рис. 4).

EST крысы

Рис. 4. Схема предсказания кодирующей последовательности RIC-3 крысы.

Для заполнения пробела в геномной последовательности крысы, использовались EST крысы. .С помощью программы Neural Network Splice Site Prediction tool были предсказаны границы между экзонами. Из результатов предсказания получено, что локус RIC-3 крысы (54 кб) расположен на хромосоме 1 и состоит из 6 экзонов.

Исходя из предсказанной последовательности, были синтезированы праймеры, с использованием которых клонировали полную кодирующую последовательность RIC-3 крысы. В результате были получены 2 варианта, различающиеся по серину (AGC триплет) в положении 173 (рис. 5).

Сравнение последовательности полипептида, кодируемого полученной кДНК крысы, с аминокислотной последовательностью человеческого RIC-3 показало, что эти полипептиды имеют 86% сходства.

В следующей серии экспериментов были идентифицированы новые и проанализированы уже известные варианты альтернативного сплайсинга человеческого и крысиного RIC-3 (рис. 6). Для идентификации вариантов крысиного RIC-3 были синтезированы серии прямых и обратных праймеров, использованных затем для амплификации продуктов известного размера. В результате были получены три новых продукта. Варианты 1 и 3, несут делецию экзонов 2, 3 и 4; в варианте 1

отсутствуют экзоны 2, 3, 4 и 5. Варианты RIC-3 человека взяты из базы данных RefSeq, экзонная структура изучена с помощью сравнительного анализа последовательностей (BLAST). Таким образом, анализ вариантов RIC-3 человека и

крысы демонстрирует наличие множественных транскриптов. ____*__20

rat_ENSEMB rat_predic rat_cloned human

60 57 60 60

120

-щ 119

3FQ 117

-Щ 119

119

rat_ENSEMB rat_predic rat_cloned human

140

160

180

178 171

178

179

rat_ENSEMB rat_predic rat cloned human

200

220

Щкмррс-

.MEL ' 1

:it;i EGYPEETYPIYDL3 YHEE' TEGTCPEETYPITOL

rat_ENSEMB rat_predic rat_cloned human

260

280

300

iif

Ж ОД' si.

s^E^SJD:

jETgSjDi

¡GGVgRrjg SEra^E

288 297 299

* 320 * 340 * 360 rat_ENSEMB : ------------------------------------------------------------ :

rat_predic : ¡ЗЗЦЗЙЗЗШЗЗЗВЗЗя-----------------------22iTi23SiET3iSNTHVfiG21 :

rat_cloned : ¡уНВРВШ^ : 357

human : ЩЭйЗЗшЗгЯЗ!!^^ : 35 9

ra t_EN5EMB rat predic rat_cloned human

335 367 369

100% сходства 80% сходства 60% сходства

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанного и клонированного RIC-3 крысы с ортологом человека.

rat_ENSEMB: неполный вариант RIC-3 крысы (база данных Ensemble); rat_predic: предсказанная кодирующая последовательность RIC-3 крысы; rat_clolned: последовательность RIC-3 крысы, клонированная в результате предсказания; human: человеческий RIC-3. Сравнение выполнено с помощью программы MUSCLE 3.41.

Установленное разнообразие позволяет предполагать возможность множественных функций 1?.1С-3. Вероятно, что изоформы шаперона способны по-разному регулировать экспрессию никотиновых рецепторов (На1еу1 е[ а12003). С другой стороны, его отдельные формы могут участвовать в процессах, не связанных с экспрессией никотиновых рецепторов или же регулировать функцию полного варианта ШС-З. Не исключено также, что не все варианты являются функционально активными.

Р Р1_ А

Г2 РЗ Р4 Р5 Р6 Р7

RIC-3 крысы

R3 R2

R FL

ожидаемым размер продукта, лн

пара праймеров

изоформы RIC-3 крысы Е2 ЕЗ Е4 Е5 Е6

1—н-н-

изоформы RIC-3 человека RefSeq

E1 Е2 ЕЗ Е4 Е5 Е6

-[jj]-Ц--(]—j|J-[|]- BC022455/AY326435

Е5 Е6

■Ш-Ш-АК021670

Е1 ______Е6

-И-------- --Ц-AL832601

E1 Е2

—Я—и-

E1 Е2 ЕЗ

—й—ш-

AY326436/AY358475

новый вариант (данная работа)

Рис. 6. Варианты альтернативного сплайсинга RIC-3. А. Схема локализации праймеров, использованных для поиска вариантов сплайсинга, на последовательности RIC-3 крысы. Б. Электрофорез в агарозном геле продуктов амплификации RIC-3 крысы с помощью различных комбинаций праймеров. Ожидаемый размер продукта указан над парой праймеров, задействованных в соответствующей реакции. Стрелки указывают идентифицированные варианты 1 ,2, 3. В. Схема вариантов сплайсинга RIC-3. Экзоны представлены прямоугольниками, разделенными линиями; наполовину закрашенные прямоугольники: частично секвенированные экзоны; пунктирные линии: неизвестная последовательность; экзон 4 существует в двух вариантах, различающихся по Sen73 для крысиного и Ser174 для человеческого RIC-3. Заштрихованный экзон в АК021670 включает кодон инициации, отличающийся от старт-кодона в экзоне 1.

В рамках исследования возможности взаимодействия а1рЬа7пАСЫ1Л11С-3 изучено распределение транскриптов ЫС-З в тканях и органах человека и кр] сравнении с распределением транскриптов а1рЬа7пАСЫ1 с помощью количеств' риал-тайм ОТ-ПЦР (рис. 7).

ИС-З человека

5 АС"' ^ " ^ • *

I 151 *

Рис. 7. Количественный анализ экспрессии ШС-З и а7пАСЬР в разных тканях человека с помощью риал-тайм ПЦР. Результаты представлены как среднее +/- стандартное отклонение по трем измерениям для каждой ткани. На графике представлены уровни экспрессии гена, нормализированные по экспрессии (В-актина в соответствующих образцах.

Показано, что RIC-3 экспрессируется в разных тканях и органах. Наибольший уровень экспрессии в головном мозге найден в мозжечке, гипофизе и миндалине. В периферических тканях значительный уровень этого транскрипта обнаружен в надпочечниках, поджелудочной железе, щитовидной железе и в яичке. Экспрессия alpha7nAChR наблюдается в основном в головном мозге, особенно в коре, гиппокампе и миндалине, что в целом соответствует литературным данным (Seguela et al. 1993). Высокий уровень экспрессии alpha7nAChR в яичке, возможно, подтверждает участие этого рецептора в репродуктивной функции (Bray et al., 2005; Kumar and Meizel, 2005). Важно отметить, что все ткани, в которых найдены транскрипты alpha7nAChR, также экспрессируют значительные количества RIC-3, что косвенно указывает на возможное взаимодействие этих белков. С другой стороны, экспрессия RIC-3 обнаружена в тканях с относительно низкими уровнями alpha7nAChR (хвостатое ядро, таламус, мозжечок). Поэтому можно думать, что RIC-3 выполняет ряд других функций, не связанных со сборкой функционально активного alpha7nAChR. Выяснение этого вопроса является предметом будущих исследований.

Рис. 8. Изучение субклеточной локализации RIC-3 и alpha7nAChR с помощью конфокальной

микроскопии. Разные типы клеток были транзиентно трансфецированы RIC-3-YFP и alpha7AChR. Сх - нейроны коры мозга крысы; GH4C1 а7-рекомбинантная клеточная линия, экспрессирующая крысиный alpha7nAChR. Зеленая флюоресценция - RIC-3-YFP; красная -сайты связывания a-Bgt на клеточной мембране, окрашенные с помощью первичного anti-Bgt атнтитела и вторичного антитела, конъюгированного с AlexaFluor 546. Merged - наложение двух каналов. Изображения получены с помощью конфокального микроскопа. Шкала -10 мкм.

Важную информацию о роли белка представляют данные о его субклеточном распределении. Поэтому проведено исследование разных типов клеток, а именно нейронов коры головного мозга крысы, клеток GH4C1-A7, стабильно

RIC-3-YFP q-Bgt__merged

трансфицированных alpha7nAChR, и клеток СНО-К1, трансфицированных ДНК, кодирующей RIC-3-YFP. В другой серии экспериментов в тех же клетках вместе с RIC-3-YFP суперэкспрессировали alpha7nAChR (рис. 8). Обнаружено, что во всех исследованных типах клеток RIC-3 локализуется внутри клетки, в соответствии с распределением эндоплазматического ретикулума (ЭР), и отсутствует на плазматической мебране. RIC-3 не ко-локализуется на плазматической мембране ни с эндогенным, ни с трансфицированным alpha7nAChR. Суперэкспрессия alpha7nAChR не изменяет распределение RIC-3 внутри клетки. Эти результаты подтверждают литературные данные, полученные для других клеточных систем (Castillo et al., 2005; Cheng et al., 2005) и противоречат работе (Williams et al., 2005), которые показывают, что RIC-3 транспортируется на поверхность клетки вместе с alpha7nAChR. Таким образом, возможно, RIC-3 выполняет функцию шаперона в ЭР, создавая благоприятные условия для сборки функционально активного alpha7nAChR.

Это предположение подтверждают данные следующей серии опытов, в которых установлено, что в клетках СНО-К1, транзиентно трансфицированных ДНК, кодирующей alpha7nAChR, рецептор на мембране клетки отсутствует. Однако, после транзиентной трансфекции клеток разными комбинациями alpha7nAChR крысы и человека с RIC-3 крысы и человека на поверхности клетки зарегистрирована экспрессия alpha7nAChR, способного связывать а-бунгаротоксин, во всех изученных комбинациях. Полученные данные позволяют сделать вывод об эволюционно

закрепленных функциях RIC-3.

А Б

Рис. 9. Клон СНО-А7-129.

А. нетрансфецированные клетки СНО-К1. Б. СНО-А7-129 - клетки СНО-К1 стабильно трансфецированные

человеческим a7nAChR и

человеческим RIC-3. Определение экспрессии oc7nAChR на поверхности клеток осуществлялось с помощью окрашивания a-Bgt-Alexa-594.

Изображения получены с помощью конфокальной микроскопии.

Установленные закономерности взаимодействия alpha7nAChR и RIC-3 и литературные данные о необходимости RIC-3 для созревания функционального

alpha7nAChR послужили основой для создания рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей alpha7nAChR. Для этого клетки СНО-К1 трансфецировали плазмидной ДНК, кодирующей последовательность человеческого alpha7nAChR и человеческого RIC-3 и резистентность к антибиотикам G-418 и бластицидину. Эти антибиотики использовались для отбора трансфицированных клеток. После 3 недель селекции клетки, устойчивые к обоим антибиотикам, рассевались в 96-луночные планшеты, 0,3 клетки на лунку, для получения клонов. Клоны тестировали на предмет экспрессии alpha7nAChR в плазматической мембране с помощью окрашивания флюоресцентно меченым а-бунгаротоксином. В результате скрининга более 100 клонов был обнаружен 1 положительный клон, названный СНО-А7-129, экспрессирующий достаточное для детекции используемым методом количество рецепторов alpha7nAChR на поверхности клетки (рис. 9)

Для доказательства функционирования ионного канала alpha7, транспортирующего Са2+, использовали прибор FLIPR. Метод основан на измерении интенсивности флюоресценции в ответ на изменение внутриклеточной концентрации ионов кальция (рис. 10). К клеткам СНО-А7-129 добавляли агонисты никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, никотин, эпибатидин, ацетилхолин в разных концентрациях. При первой попытке не удалось зарегистрировать увеличения флюоресцентного сигнала.

Однако методом patch clamp показано, что добавление этих агонистов клеткам СНО-А7-129 ведет к формированию быстрого кальциевого тока, характерного для alpha7nAChR. Из литературы известно, что alpha7nAChR является быстро десенситизирующимся каналом, и ток кальция длится миллисекунды (Puchacz et al., 1994). Время регистрации изображений прибором FLIPR измеряется в секундах,

инкубация клеток с флюоресцентным красителем

1"* интервал I 2е4 интервал регистрации I регистрации изображений у изображений

Рис. 10. Схема анализа с помощью прибора FLIPR

поэтому для визуализации работы канала в клетках СНО-А7-129 при помощи этого прибора необходимо было модифицировать рецептор, например, замедлив процесс десенситизации. Для достижения этого эффекта были использованы два подхода.

В первом, к клеткам добавляли позитивный аллостерический модулятор (ЛАМ) alpha7nAChR PNU-120596, способный увеличивать продолжительность ионного тока через alpha7nAChR, вызванного стимуляцией рецептора специфическими агонистами (Hurst et al., 2005). В этом случае добавление 10 мкМ никотина клеткам СНО-А7-129, инкубированным в течение 10 мин с 10 мкМ PNU-120596, привело к резкому увеличению интенсивности флюоресцентного сигнала. Эффект отсутствовал при преинкубации клеток со специфическим антагонистом alpha7nAChR, MLA в концентрации 1 мкМ. Полученные данные свидетельствуют, что клетки СНО-А7-129 экспрессируют функциональный alpha7nAChR.

Второй подход заключался в применении генистеина, ингибитора тирозинкиназ (рис. 11, А). Из литературы известно, фосфорилирование alpha7nAChR по тирозину ведет к снижению его активности. Показано, что генистеин способствует дефосфорилированию рецептора и увеличению тока через ионный канал при стимуляции агонистами (Charpantier et al., 2005). Поэтому в следующей серии экспериментов клетки СНО-А7-129 инкубировали в течение 5-60 мин с генистеином в концентрациях от 10 до 300 мкМ при комнатной температуре или при 37°С, после чего планшеты с клетками помещали в прибор FLIPR, в котором к клеткам добавлялся 10 мкМ никотин и производились измерения (рис. 11, Б). Добавление 10 мкМ никотина клеткам, инкубированным в течение 30 мин с 100 мкМ генистеином при комнатной температуре приводило к сильному увеличению интенсивности флюоресценции (рис. 11, В). Этот эффект отсутствовал при преинкубации клеток со специфическим антагонистом alpha7nAChR 1 мкМ MLA. Добавление 100 мкМ генистеина в отсутствии агонистов никотиновых рецепторов не изменяло интенсивность сигнала. Таким образом, в результате этих экспериментов были выработаны оптимальные условия использования генистеина в качестве инструмента для визуализации активации канала альфа7, стабильно экспрессированного в клетках СНО-А7-129, с помощью прибора FLIPR.

но

'ОН

7000 < вгомин 6000 030 MW

5000

обо MW

airl

100мкМ ЭООмкМ

добавление __

никотина, 10 мкМ

Рис. 11. Влияние генистеина на интенсивность флюоресцентного сигнала, вызванного добавлением никотина клеткам, стабильно экспресирующим alpha7nAChR. А. Структура ингибитора тирозинкиназ генистеина. Б. Клетки СНО-К1 alpha7-RIC-3 инкубировали в течение 5, 20, 30, 60 мин с генистеином в разных концентрациях. Затем добавляли 10 мкМ никотин и измеряли изменение интенсивности флюоресценции с помощью прибора FLIPR. В. Кинетика Са2+ после добавления 10 мкМ никотина клеткам СНО-А7-129, преинкубированным 1. в течение 30 мин с 100 мкМ генистеином (оптимизированные экспериментальные условия); 2. в течение 10 мин с 1 мкМ MLA, а затем с в течение 30 мин с 100 мкМ генистеином. Изображение получено с помощью FLIPR.

Установив возможность стабильной регистрации флуоресцентного сигнала, отражающего вход Са2+ через ионный канал, разработанный экспериментальный протокол использовали для характеристики рекомбинантаого а1рЬа7пАСЬЯ, экспрессированного в клетках СНО-А7-129, с помощью фармакологических анализаторов. Были определены ЕС50 для шести агонистов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (никотин, холин, эпибатидин, БМРР, цитизин, ЮЯ 2429) и 1С5о для антагониста а1 и а7 рецепторов а-бунгаротоксина и специфического антагониста а1рЬа7пАСЫ1 - МЬА. В таблице 1 полученные данные представлены в сравнении с опубликованными значениями эффективных концентраций исследуемых соединений для человеческого а1рЬа7пАСЬК, экспрессированного в клетках ОНЗ (РеиегЬасИ а ей., 2005) и а1рЬа7пАСЬК крысы, экспрессированного в клетках СН4С1 (ВоШшапп е/ а1., 2006).

- СНО-А7-129 GH3-ha-7-22 GH4C1A7

соединение чвп.а7 а7 крысы

1.17 1.78 1.33

51.91 54.95 29.25

эпибвтидин 0.03 0.04 0.01

ШШШШ 0.87 1.23 0.85

3.43 2.09 1.32

0.04 NA 0.02

0.06 0.02 0.002

alphaBgt 0.02 0.04 0.01

Таблица 1. Сравнение с литературными данными полученных значений ECW / ГСзд [мкМ] для человеческого alpha7nAChR, стабильно экспрессированного в клетках СНО-А7-129. Значения ЕС^ / Ю50 для

человеческого alpha7nAChR, стабильно экспрессированного в клетках GH3-ha-7-22 (Feuerbach et al., 2005), вычислены как отрицательный логарифм значений рЕС^ , опубликованных в вышеуказанной статье. Все значения представлены в мкМ. NA- значение отсутствует.

Из таблицы видно, что значения ЕС5о и IC50 очень близки для alpha7nAChR человека и крысы, экспрессированных в разных типах клеток. Исключение составил MLA, IC50 которого для человеческого рецептора оказалась на порядок больше, чем для рецептора крысы. Возможным объяснением могут быть межвидовые различия в фармакологических свойствах рецептора, о которых упоминалось в литературе (Stokes et al., 2004), либо зависимость от модификаций рецептора генистенном, хотя Charpantier et al. показали, что инкубация с генистеином ооцитов Xenopus, экспрессирующих человеческий alpha7nAChR, не изменяет ЕС5о для ацетилхолина (Charpantier et al., 2005).

Тем не менее, полученные результаты подтверждают, что созданная в данной работе рекомбинантная клеточная линия СНО-А7-129 экспрессирует фукциональный ионный канал с биофизическими и фармакологическими свойствами alpha7nAChR, что определяет перспективу ее применения как для фундаментальных, так и скрининговых работ по поиску новых агонистов и модуляторов alpha7nAChR.

выводы

1. Установлена способность нового оригинального лекарственного средства семакс селективно увеличивать содержание ВООТ в гиппокампе и базальных ядрах головного мозга крыс.

2. Клонирована полная кодирующая последовательность ШС-З крысы. Трансляция т яШсо новой последовательности продемонстрировала 86% сходства с белком ШС-З человека.

3. Клонирован новый вариант ШС-З человека, несущий делецию экзонов 4 и 5. Известное для ШС-З человека множество транскриптов подтверждено для ортолога крысы.

4. Охарактеризована экспрессия ШС-З в тканях и органах человека и крысы. Показана преимущественная продукция транскриптов а1рЬа7пАСЬЯ в разных отделах головного мозга. Установлено, что во всех тканях, экспрессирующих а!рЬа7пАСЬК, имеются значительные уровни ШС-З.

5. Установлена внутриклеточная локализация ШС-З, наиболее соответствующая распределению эндоплазм этического ретикулюма. Показано, что на плазматической мембране во всех видах исследованных клеток ШС-З отсутствует.

6. Установлено, что ШС-З способствует экспрессии а1рЬа7пАСЬЯ на поверхности клеток СНО-К1. Эффект не является видоспецифичным и не зависит от полиморфизма 8+/5- в положении 173.

7. Доказана стабильная экспрессия а1рЬа7пАСЬК человека в присутствии ШС-З в клетках СНО-К1, ведущая к продукции функционально активного рецептора с биофизическими и фармакологическими характеристиками а1рЬа7пАСЫ1.

8. Результаты выполненных исследований позволяют сделать заключение о создании новой экспериментальной модели - рекомбинантной клеточной линии СНО-К1 для изучения и скрининга селективных агонистов и аллостерических модуляторов а1рЬа7пАСЫ1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Долотов О.В., Середенина Т.СМ Левицкая Н.Г., Каменский A.A., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Нагаев И.Ю., Золотарев Ю.А., Гривенников И.А., Энгеле Ю., Мясоедов Н.Ф. Гептапептид семакс стимулирует экспрессию BDNF в различных отделах мозга крысы in vivo. (2003) Доклады Академии наук, 391,131-134

2. И.А.Гривенников, Л.А.Андреева, Бобрышева И.В., Григоренко А.П., Долотов О.В., Иноземцева Л.С., Новоселова Е.В., Середенина Т.С., Мясоедов Н.Ф. Клеточные культуры в качестве моделей для исследования механизмов действия и создания фармакологических препаратов с нейропротекторными свойствами (2003). Сборник тезисов 2-го Съезда Российского научного общества фармакологов, часть 1,139.

3. О. Dolotov, Т. Seredenina, Е. Karpenko, Yu. Zolotarev, P. Slominsky, I. Grivennikov, N. Myasoedov. ACTH(4-10) analog semax increases neurotrophin expression in vitro and in vivo.// Тезисы международного симпозиума "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals". Москва, 2003.

4. Д.С. Мелкумян, T.C. Середенина, М.А. Яркова, Е.А. Вальдман, С.Б. Середенин. Анализ содержания BDNF в структурах головного мозга инбредных мышей с различными фенотипами эмоционально-стрессовой реакции. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (2005), т. 140(11), 549-551.

5. Е.А. Вальдман, Д.С. Мелкумян, Т.С. Середенина, М.А. Яркова, С.Б. Середенин. Изменения уровня BDNF в структурах головного мозга мышей C57BL/6 и BALB/c при стрессовых воздействиях

(2005). Психофармакология и биологическая наркология, т. 5, 3,974-979.

6. С.А. Karpenko, O.V. Dolotov, T.S. Seredenina, L.S.Inozemtseva, N.G. Levitskaya, J. Rozyczka, A.A.Kamensky, I.A.Grivennikov, N.F.Myasoedov, J. Engele. Regulation of neurotrophin level in the brain is a novel property of neuroprotective and nootropic melanocortin peptides (2005). European Neuropsychopharmacology. Vol. 15. Suppl. 2. P. 233.

7. TJSeredenina, A.Caricasole, G.C. Terstappen and R.Roncarati. Investigations of the role of RIC-3 in functional expression of nicotinic acetylcholine receptors. // Abstr. SINS (Italian society of neuroscience), P: 48_01, Искья, 2005.

8. Dolotov OV, Kaipenko EA, Seredenina TS, Inozemtseva LS, Levitskaya NG, Zolotarev YA, Kamensky AA, Grivennikov LA, Engele J, Myasoedov NF. Semax, an analogue of adrenocorticotropin (410), binds specifically and increases levels of brain-derived neurotrophic factor protein in rat basal forebrain

(2006). Journal of Neurochemistry; 97, Suppl. 1,82-6.

9. Seredenina Т., Roncarati R., Kremer A, Caricasole A. & Terstappen G. C. Expression and subcellular localization of RIC-3, a putative alpha7 nAChR chaperone (2006). Abstr. 5th Forum of European Neuroscience, Austria, Vienna, A044.15.

10. Oleg V. Dolotov, Ekaterina A. Karpenko, Lyudmila S. Inozemtseva, Tamara S. Seredenina, Natalia G. Levitskaya, Joanna Rozyczka, Elena V. Dubynina, Ekaterina V. Novosadova, Lyudmila A. Andreeva, Lyudmila Yu Alfeeva, Andrey A. Kamensky, Igor A. Grivennikov, Nikolay F. Myasoedov, Jürgen Engele. Semax, an analog of ACTH(4-10) with cognitive effects, regulates BDNF and trkB expression in the rat hippocampus (2006). Brain Research, article in press.

Подписано в печать 25.09.2006 г. Фотмат 60x80 1/16 Бумага офисная, ризография Тираж 100 шт.

Типография "Медлайн-С" 123007, г. Москва, 5-я Магистральная ул., д. 14, стр. 1

Тел. 151-96-10

Оглавление диссертации Середенина, Тамара Сергеевна :: 2006 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Болезнь Альцгеймера.

1.1.1. Определение БА.

1.1.2. Этиология и патогенез БА.

1.1.2.1. Амилоидная гипотеза.

1.1.2.2. Холинергическая гипотеза.

1.1.3. Фармакотерапия БА.

1.1.3.1. Стратегии лечения БА.

1.1.3.2. Нейропротективное действие никотина.

1.1.3.3. Alpha7nAChR как мишень фармакотерапии БА.

1.2. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор типа альфа7.

1.2.1. Семейство никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

1.2.2. Характеристика alpha7nAChR.

1.2.2.1. Ген и варианты альтернативного сплайсинга alpha7nAChR.

1.2.2.2. Локализация и функция alpha7nAChR в головном мозге.

1.2.2.3. Локализация и функция alpha7nAChR в периферических органах.

1.2.3. Биогенез никотиновых ацетилхолиновых рецепторов.

1.2.3.1. Клеточный аппарат, регулирующий биогенез nAChR.

1.2.3.2. Влияние типа клеток на экспрессию функционально активного alpha7nAChR.

1.3. RIC-3 - шаперон alpha7nAChR.

1.3.1. Структура RIC-3.

1.3.2. Локализация RIC-3.

1.3.3. Функция RIC-3.

1.4. BDNF как мишень фармакотерапии болезни Альцгеймера.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение РНК.

2.2. Синтез кДНК.

2.3. Стандартные методы молекулярной биологии.

2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.5. Конструирование плазмидных векторов.

2.6. Количественная риал-тайм ПЦР.

2.7. Культивирование клеток.

2.8. Первичная культура нейронов.

2.9. Транзиентные трансфекции.

2.10. Создание рекомбинантных клеточных линий.

2.11. Окрашивание флюоресцентным a-Bgt.

2.12. Иммуноцитохимия.

2.13. FLIPR анализ.

2.13.1. Реагенты для FLIPR теста.

2.13.2. Анализ данных FLIPR теста.

2.13.3. Оценка качества FLIPR теста.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Клонирование и характеристика RIC-3.

3.1.1. Клонирование RIC-3 человека.

3.1.2. Идентификация нового варианта RIC-3 человека.

3.1.3. Экспрессия вариантов RIC-3 в тканях человека.

3.1.4. Предсказание in silico и клонирование RIC-3 крысы.

3.1.4.1. Идентификация in silico и характеристика RIC-3 крысы.

3.1.4.2. Клонирование RIC-3 крысы.

3.1.5. Идентификация и анализ структуры вариантов альтернативного сплайсинга RIC-3.

3.1.6. Анализ экспрессии вариантов RIC-3 S+/S- в тканях и органах.

3.1.7. Количественный анализ экспрессии RIC-3 и alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы.

3.1.8. Субклеточная локализация и транспорт RIC-3 крысы.

3.1.9. Влияние RIC-3 на поверхностную экспрессию alpha7nAChR.

3.2. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функциональный alpha7nAChR человека.

3.2.1. Создание клеточной линии, экспрессирующей alpha7nAChR человека и RIC-3 человека.

3.2.2. Фармакологическая характеристика клеток СНО-К1, экспрессирующих рекомбинантный человеческий alpha7nAChR.

3.3. Изучение влияния препарата семакс на уровень BDNF в мозге крысы.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Клонирование и характеристика RIC-3.

4.2. Экспрессия транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в разных органах.

4.3. Субклеточная локализация и функция RIC-3.

4.4. Создание и характеристика рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR.

4.5. Влияние семакса на уровень BDNF в мозге крысы. выводы.

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Середенина, Тамара Сергеевна, автореферат

Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что болезнь Альцгеймера (БА) является частой формой сенильной деменции, распространение которой в развитых странах составляет до 5% среди населения старше 65 лет (Lobo et а!., 2000). С увеличением продолжительности жизни нейродегенеративные заболевания, обусловленные старением, становятся одной из наиболее актуальных медицинских проблем.

БА обусловлена комплексом нейрохимических нарушений, подробный анализ которых приведен в работах (Selkoe, 2001; Walsh and Selkoe, 2004). Большинство авторов приходят к заключению, что поддержанию когнитивных функций способствует активация нейрональных н-холинорецепторов. Другим важным эндогенным фактором является мозговой нейротрофический фактор (BDNF), участвующий в формировании, регуляции функциональной активности и регенерации нейронов (Murer etal., 2001).

Alpha7nAChR представляет собой ионный канал с высокой проницаемостью для ионов кальция. Наиболее высокие уровни экспрессии этого рецептора найдены в коре, гиппокампе, гипоталамусе и в миндалине (Seguela et ai, 1993). Активация alpha7nAChR опосредует нейропротекцию, что показано в опытах in vitro с применением ряда токсических воздействий, включая р-амилоид (Shimohama and Kihara, 2001; Prendergast et ai, 2001). В опытах in vivo установлено, что стимуляция этого канала ведет к улучшению когнитивных функций (Arendash et ai, 1995; Levin et ai, 1999). Поэтому перспективным представляется создание клеточной модели alpha7nAChR для скрининга и фармакологической характеристики возможных регуляторов рецептора. Однако в достижении цели возникает ряд проблем. В клеточных линиях не нейронального происхождения не удается получить функционально активный рецептор при гете рол о ги ческой экспрессии alpha7nAChR (Cooper and Millar, 1997). Сборка и транспорт этого ионного канала являются недостаточно изученным процессом. Однако, как и другие ионные каналы (Green, 1999), он находится под контролем шаперонов эноплазматического ретикулума (ЭР). Недавно был обнаружен новый белок, RIC-3 (resistant to inhibitors of cholinesterase), который оказался необходимым для экспрессии функционирующего alpha7nAChR (Halevi et ai, 2002). Поэтому для создания рекомбинантной клеточной линии, экспрессирующей функционально активный alpha7nAChR, в настоящей работе был использован RIC-3.

Цель и задачи исследования

Основными целями исследования, направленного на изучение новых фармакологических мишеней средств лечения БА, явилось создание клеточной модели функционально активного alpha7nAChR и выяснение влияния нового ноотропного препарата семакс на содержание BDNF в мозге крыс.

Для их достижения необходимо решить следующие задачи:

1. Клонировать полную кодирующую последовательность RIC-3 человека и крысы для изучения консервативных участков и видовой специфики их структуры и функции.

2. Идентифицировать и охарактеризовать варианты RIC-3 человека и крысы.

3. Изучить экспрессию транскриптов RIC-3 в сравнении с экспрессией alpha7nAChR в тканях и органах человека и крысы.

4. Исследовать субклеточную локализацию RIC-3 в разных типах клеток.

5. Изучить функцию RIC-3 в процессе созревания alpha7nAChR.

6. На основании полученных результатов создать и охарактеризовать с использованием фармакологических анализаторов рекомбинантную клеточную линию, экспрессирующую человеческий alpha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3.

7. Фармакологически изучить влияние семакса на динамику содержания BDNF в структурах головного мозга крысы.

Научная новизна работы

Создана рекомбинантная клеточная линия СНО-К1, экспрессирующая функционально активный человеческий alpha7nAChR в присутствии человеческого RIC-3. Впервые клонирована полная кодирующая последовательность ДНК RIC-3 крысы и новый вариант сплайсинга RIC-3 человека, RIC-3-900. Полиморфизм Ser173+/Ser173-, уже описанный для RIC-3 человека, подтвержден для RIC-3 крысы. Впервые получены данные о распределении транскриптов RIC-3 и alpha7nAChR в отделах мозга и в периферических тканях и органах человека и крысы. Описана субклеточная локализация RIC-3 в первичной культуре нейронов коры крысы. Установленные данные показали, что полиморфизм RIC-3 S+/S- не важен для транзиентной экспрессии alpha7nAChR в клетках СНО-К1. Доказана способность человеческого RIC-3 обеспечивать стабильную гетерологическую экспрессию функционально активного человеческого alpha7nAChR в клетках СНО-К1.

Научно-практическая значимость работы

Созданная рекомбинантная клеточная линия СНО-К1, экспрессирующая функционально активный человеческий alpha7nAChR в присутствии RIC-3, является новой экспериментальной моделью, дающей возможность проведения фундаментальных исследований сборки, транспорта и регуляции рецептора. Одновременно модель позволяет проводить фармакологический скрининг соединений, новых селективных агонистов, аллостерических модуляторов alpha7nAChR, на основе которых могут быть созданы оригинальные лекарственные средства лечения нейродегенеративных заболеваний, включая БА. Разработаны молекулярные инструменты для дальнейшего изучения функций RIC-3 и его взаимодействия с alpha7nAChR.

Основные сведения об апробации работы

Материалы диссертации доложены на 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), региональной конференции Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Москва, 2005), конгрессе SINS, Искья (сентябрь 2005) и на конгрессе FENS, Вена (июль 2006).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 4 тезиса в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включаюещего 214 источников. Работа иллюстрирована 5-ю таблицами и 26-ю рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера"

ВЫВОДЫ

1. Установлена способность нового оригинального лекарственного средства семакс селективно увеличивать содержание BDNF в гиппокампе и базальных ядрах головного мозга крыс.

2. Клонирована полная кодирующая последовательность RIC-3 крысы. Трансляция in silico новой последовательности продемонстрировала 86% сходства с белком RIC-3 человека.

3. Клонирован новый вариант RIC-3 человека, несущий делецию экзонов 4 и 5. Известное для RIC-3 человека множество транскриптов подтверждено для ортолога крысы.

4. Охарактеризована экспрессия RIC-3 в тканях и органах человека и крысы. Показана преимущественная продукция транскриптов alpha7nAChR в разных отделах головного мозга. Установлено что во всех тканях, Экспрессирующих alpha7nAChR, имеются значительные уровни RIC-3.

5. Установлена внутриклеточная локализация RIC-3, наиболее соответствующая распределению эндоплазматического ретикулюма. Показано, что на плазматической мембране во всех видах исследованных клеток RIC-3 отсутствует.

6. Установлено, что RIC-3 способствует экспрессии alpha7nAChR на поверхности клеток СНО-К1. Эффект не является видоспецифичным и не зависит от полиморфизма S+/S- в положении 173.

7. Доказана стабильная экспрессия alpha7nAChR человека в присутствии RIC-3 в клетках СНО-К1, ведущая к продукции функционально активного рецептора с биофизическими и фармакологическими характеристиками alpha7nAChR.

8. Результаты выполненных исследований позволяют сделать заключение о создании новой экспериментальной модели -рекомбинантной клеточной линии СНО-К1 для изучения и скрининга селективных агонистов и аллостерических модуляторов alpha7nAChR.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Середенина, Тамара Сергеевна

1. Андреева ЛА, Ашмарин ИП, Каменский АА и др. 1994. Патент №2045958, заявка № 94010496. Приоритет изобретения от 28 марта 1994г.

2. Ашмарин ИП, Незавибатько ВН, Мясоедов НФ и др. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10 Семакс Журнал высшей нервной деятельности. 1997. T47. №2. Стр.420-430.

3. Волков АВ, Заржецкий ЮВ, Постнов АЮ и др. Результаты применения регуляторных пептидов при реанимации после остановки сердца в эксперименте. М.: Ин-т общей реаниматологии РАМН,1992.

4. Гривенников ИА, Долотов OB, Гольдина ЮИ. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. Молекулярная биология. 1999. T.33. Стр.120-126.

5. Каплан АЯ, Каменский АА, Ашмарин ИП и др., Антиишемические свойства нейропептида семакс: электроэнцефалографический анализ. М.,1991.

6. Пономарева-Степная МА, Незавибатько ВН, Антонова J1B и др. Аналог АКТГ(4-10) стимулятор обучения пролонгированного действия. Хим.-Фарм. Журнал 1984. №7. Стр. 790-795.

7. Пономарева-Степная МА, Незавибатько BH, Ашмарин ИП и др.,1982. Удостоверение патента по авторскому свидетельству № 939440, заявка №3233411. Приоритет изобретения от 6 января 1981 г.

8. Akaike A, Tamura У, Yokota Т, Shimohama S, Kimura J (1994) Nicotine-induced protection of cultured cortical neurons against N-methyl-D-aspartate receptor-mediated glutamate cytotoxicity. Brain Res 644: 181-187.

9. Alderson RF, Alterman AL, Barde YA, Lindsay RM (1990) Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture. Neuron 5: 297-306.

10. Alkondon M, Pereira EF, Albuquerque EX (1998) alpha-bungarotoxin- and methyllycaconitine-sensitive nicotinic receptors mediate fast synaptic transmission in interneurons of rat hippocampal slices. Brain Res 810: 257-263.

11. Alkondon M, Pereira EF, Barbosa CT, Albuquerque EX (1997) Neuronal nicotinic acetylcholine receptor activation modulates gamma-aminobutyric acid release from CA1 neurons of rat hippocampal slices. J Pharmacol ExpTher283:1396-1411.

12. Alonso M, Vianna MR, Depino AM, Mello e Souza T, Pereira P, Szapiro G, Viola H, Pitossi F, Izquierdo I, Medina JH. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation.Hippocampus. 2002;12(4):551-60.

13. Alzheimer A, Stelzmann RA, Schnitzlein HN, Murtagh FR (1995) An English translation of Alzheimer's 1907 paper, "Uber eine eigenartige Erkankung der Hirnrinde". Clin Anat 8: 429-431.

14. Arendash GW, Sengstock GJ, Sanberg PR, Kem WR (1995) Improved learning and memory in aged rats with chronic administration of the nicotinic receptor agonist GTS-21. Brain Res 674: 252-259.

15. Arredondo J, Nguyen VT, Chernyavsky Al, Bercovich D, Orr-Urtreger A, Kummer W, Lips K, Vetter DE, Grando SA (2002) Central role of alpha7 nicotinic receptor in differentiation of the stratified squamous epithelium. J Cell Biol 159: 325-336.

16. Auffray С, Rougeori F (1980) Purification of mouse immunoglobulin heavy-chain messenger RNAs from total myeloma tumor RNA. Eur J Biochem 107: 303-314.

17. Aztiria EM, Sogayar MC, Barrantes FJ (2000) Expression of a neuronal nicotinic acetylcholine receptor in insect and mammalian host cell systems. Neurochem Res 25:171-180.

18. Ben Ami HC, Yassin L, Farah H, Michaeli A, Eshel M, Treinin M (2005) RIC-3 affects properties and quantity of nicotinic acetylcholine receptors via a mechanism that does not require the coiled-coil domains. J Biol Chem 280: 28053-28060.

19. Berg DK, Conroy WG (2002) Nicotinic alpha 7 receptors: synaptic options and downstream signaling in neurons. J Neurobiol 53: 512-523.

20. Bergis, О. E., Pichat, P., Santamaria, R., Biton, В., Rouquier, L., Steinberg, R., Griebel, G., Ouri-Donat, F., Avenet, P., Soubrto, P., and Scatton, B. Soc.Neurosci. 34, 583.2. 2004.

21. Bettany JH, Levin ED (2001) Ventral hippocampal alpha 7 nicotinic receptor blockade and chronic nicotine effects on memory performance in the radial-arm maze. Pharmacol Biochem Behav 70: 467-474.

22. Blumenthal EM, Conroy WG, Romano SJ, Kassner PD, Berg DK (1997) Detection of functional nicotinic receptors blocked by alpha-bungarotoxin on PC12 cells and dependence of their expression on post-translational events. J Neurosci 17: 6094-6104.

23. Bray C, Son JH, Kumar P, Meizel S (2005) Mice deficient in CHRNA7, a subunit of the nicotinic acetylcholine receptor, produce sperm with impaired motility. Biol Reprod 73: 807-814.

24. Brenner DE, Kukull WA, van Belle G, Bowen JD, McCormick WC, Teri L, Larson EB (1993) Relationship between cigarette smoking and Alzheimer's disease in a population-based case-control study. Neurology 43: 293-300.

25. Brodsky JL, McCracken AA (1999) ER protein quality control and proteasome-mediated protein degradation. Semin Cell Dev Biol 10: 507-513.

26. Broide RS, O'Connor LT, Smith MA, Smith JA, Leslie FM (1995) Developmental expression of alpha 7 neuronal nicotinic receptor messenger RNA in rat sensory cortex and thalamus. Neuroscience 67: 83-94.

27. Butterfield DA (2002) Amyloid beta-peptide (1-42)-induced oxidative stress and neurotoxicity: implications for neurodegeneration in Alzheimer's disease brain. A review. Free Radic Res 36: 1307-1313.

28. Carlson NG, Bacchi A, Rogers SW, Gahring LC (1998) Nicotine blocks TNF-alpha-mediated neuroprotection to NMDA by an alpha-bungarotoxin-sensitive pathway. J Neurobiol 35: 29-36.

29. Castillo M, Mulet J, Gutierrez LM, Ortiz JA, Castelan F, Gerber S, Sala S, Sala F, Criado M (2005) Dual role of the RIC-3 protein in trafficking of serotonin and nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem 280: 27062-27068.

30. Chen D, Dang H, Patrick JW (1998) Contributions of N-linked glycosylation to the expression of a functional alpha7-nicotinic receptor in Xenopus oocytes. J Neurochem 70: 349-357.

31. Cheng A, McDonald NA, Connolly CN (2005) Cell surface expression of 5-hydroxytryptamine type 3 receptors is promoted by RIC-3. J Biol Chem 280: 22502-22507.

32. Clarke PB, Schwartz RD, Paul SM, Pert CB, Pert A (1985) Nicotinic binding in rat brain: autoradiographic comparison of 3H.acetylcholine, [3H]nicotine, and [125l]-alpha-bungarotoxin. J Neurosci 5: 1307-1315.

33. Conroy WG, Berg DK (1999) Rapsyn variants in ciliary ganglia and their possible effects on clustering of nicotinic receptors. J Neurochem 73:1399-1408.

34. Cooper ST, Millar NS (1997) Host cell-specific folding and assembly of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit. J Neurochem 68: 2140-2151.

35. Corriveau RA, Romano SJ, Conroy WG, Oliva L, Berg DK (1995) Expression of neuronal acetylcholine receptor genes in vertebrate skeletal muscle during development. J Neurosci 15: 1372-1383.

36. De Simone R, Ajmone-Cat MA, Carnevale D, Minghetti L (2005) Activation of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor by nicotine selectively up-regulates cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2 in rat microglial cultures. J Neuroinflammation 2: 4.

37. Dineley KT, Patrick JW (2000) Amino acid determinants of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor surface expression. J Biol Chem 275: 13974-13985.

38. Dominguez dT, Juiz JM, Peng X, Lindstrom J, Criado M (1994) Immunocytochemical localization of the alpha 7 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor in the rat central nervous system. J Comp Neurol 349: 325-342.

39. Donnelly-Roberts DL, Xue 1С, Arneric SP, Sullivan JP (1996) In vitro neuroprotective properties of the novel cholinergic channel activator (ChCA), ABT-418. Brain Res 719: 36-44.

40. Drisdel RC, Manzana E, Green WN (2004) The role of palmitoylation in functional expression of nicotinic alpha7 receptors. J Neurosci 24:10502-10510.

41. Eisele JL, Bertrand S, Galzi JL, Devillers-Thiery A, Changeux JP, Bertrand D (1993) Chimaeric nicotinic-serotonergic receptor combines distinct ligand binding and channel specificities. Nature 366: 479-483.

42. Elgoyhen AB, Johnson DS, Boulter J, Vetter DE, Heinemann S (1994) Alpha 9: an acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell 79: 705715.

43. Elgoyhen AB, Vetter DE, Katz E, Rothlin CV, Heinemann SF, Boulter J (2001) alphalO: a determinant of nicotinic cholinergic receptor function in mammalian vestibular and cochlear mechanosensory hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 3501-3506.

44. Emilien G, Durlach C, Minaker KL, Winblad B, Gauthier S, Maloteaux J (2004) Pharmacology of Alzheimer disease. In: Alzheimer Disease (Emilien G et al, ed), pp 33-46. Basel-Boston-Berlin: Birkhauser Verlag.

45. Erdo SL, Schafer M (1991) Memantine is highly potent in protecting cortical cultures against excitotoxic cell death evoked by glutamate and N-methyl-D-aspartate. Eur J Pharmacol 198: 215217.

46. Esch FS, Keim PS, Beattie EC, Blacher RW, Culwell AR, Oltersdorf T, McClure D, Ward PJ (1990) Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive processing of its precursor. Science 248: 1122-1124.

47. Felix R, Levin ED (1997) Nicotinic antagonist administration into the ventral hippocampus and spatial working memory in rats. Neuroscience 81: 1009-1017.

48. Feng G, Steinbach JH, Sanes JR (1998) Rapsyn clusters neuronal acetylcholine receptors but is inessential for formation of an interneuronal cholinergic synapse. J Neurosci 18: 4166-4176.

49. Ferrer I, Marin C, Rey MJ, Ribalta T, Goutan E, Blanco R, Tolosa E, Marti E (1999) BDNF and full-length and truncated TrkB expression in Alzheimer disease. Implications in therapeutic strategies. J Neuropathol Exp Neurol 58: 729-739.

50. Feuerbach D, Lingenhohl K, Dobbins P, Mosbacher J, Corbett N, Nozulak J, Hoyer D (2005) Coupling of human nicotinic acetylcholine receptors alpha 7 to calcium channels in GH3 cells. Neuropharmacology 48: 215-227.

51. Fischer U, Reinhardt S, Albuquerque EX, Maelicke A (1999) Expression of functional alpha7 nicotinic acetylcholine receptor during mammalian muscle development and denervation. Eur J Neurosci 11: 2856-2864.

52. Freedman R, Wetmore C, Stromberg I, Leonard S, Olson L (1993) Alpha-bungarotoxin binding to hippocampal interneurons: immunocytochemical characterization and effects on growth factor expression. J Neurosci 13:1965-1975.

53. Friedman B, Kleinfeld D, Ip NY, Verge VM, Moulton R, Boland P, Zlotchenko E, Lindsay RM, Liu L (1995) BDNF and NT-4/5 exert neurotrophic influences on injured adult spinal motor neurons. J Neurosci 15: 1044-1056.

54. Fujii S, Sumikawa К (2001) Nicotine accelerates reversal of long-term potentiation and enhances long-term depression in the rat hippocampal CA1 region. Brain Res 894: 340-346.

55. Fumagalli F, Racagni G, Riva MA (2006) The expanding role of BDNF: a therapeutic target for Alzheimer's disease? Pharmacogenomics J 6: 8-15.

56. Gahring LC, Rogers SW (2005) Neuronal nicotinic acetylcholine receptor expression and function on nonneuronal cells. AAPS J 7: E885-E894.

57. George-Hyslop PH (2000) Piecing together Alzheimer's. Sci Am 283: 76-83.

58. Gilman S, Koller M, Black RS, Jenkins L, Griffith SG, Fox NC, Eisner L, Kirby L, Rovira MB, Forette F, Orgogozo JM (2005) Clinical effects of Abeta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial. Neurology 64:1553-1562.

59. Glenner GG, Wong CW (1984) Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun 120: 885-890.

60. Glenner GG, Wong CW, Quaranta V, Eanes ED (1984) The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol 2: 357-369.

61. Gottschalk A, Almedom RB, Schedletzky T, Anderson SD, Yates JR, III, Schafer WR (2005) Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. EMBO J 24: 2566-2578.

62. Gozes I (2002) Tau as a drug target in Alzheimer's disease. J Mol Neurosci 19: 337-338.

63. Grando SA, Horton RM, Mauro TM, Kist DA, Lee TX, Dahl MV (1996) Activation of keratinocyte nicotinic cholinergic receptors stimulates calcium influx and enhances cell differentiation. J Invest Dermatol 107: 412-418.

64. Green WN (1999) Ion channel assembly: creating structures that function. J Gen Physiol 113: 163-170.

65. Grivennikov IA, Dolotov OV, Gol'dina I (1999) Peptide factors in processes of proliferation, differentiation, and extended viability of mammalian nervous system cells., Mol Biol (Mosk) 33: 120-126.

66. Grundke-lqbal I, Iqbal K, Quinlan M, Tung YC, Zaidi MS, Wisniewski HM (1986) Microtubule-associated protein tau. A component of Alzheimer paired helical filaments. J Biol Chem 261: 6084-6089.

67. Guan ZZ, Zhang X, Blennow K, Nordberg A (1999) Decreased protein level of nicotinic receptor alpha7 subunit in the frontal cortex from schizophrenic brain. Neuroreport 10: 1779-1782.

68. Guan ZZ, Zhang X, Ravid R, Nordberg A (2000) Decreased protein levels of nicotinic receptor subunits in the hippocampus and temporal cortex of patients with Alzheimer's disease. J Neurochem 74: 237-243.

69. Halevi S, McKay J, Palfreyman M, Yassin L, Eshel M, Jorgensen E, Treinin M (2002) The C. elegans ric-3 gene is required for maturation of nicotinic acetylcholine receptors. EMBO J 21: 1012-1020.

70. Halevi S, Yassin L, Eshel M, Sala F, Sala S, Criado M, Treinin M (2003) Conservation within the RIC-3 gene family. Effectors of mammalian nicotinic acetylcholine receptor expression. J Biol Chem 278: 34411-34417.

71. Hall J, Thomas KL, Everitt BJ (2000) Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning. Nat Neurosci 3: 533-535.

72. Hardy J, Selkoe DJ (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297: 353-356.

73. Hardy JA, Higgins GA (1992) Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256: 184-185.

74. Helekar SA, Char D, Neff S, Patrick J (1994) Prolyl isomerase requirement for the expression of functional homo-oligomeric ligand-gated ion channels. Neuron 12: 179-189.

75. Henderson (1996) Role of neurotrophic factors in neuronal development.CurrOpin.Neurobiol.6,64-70.

76. Hunter BE, de Fiebre CM, Papke RL, Kem WR, Meyer EM (1994) A novel nicotinic agonist facilitates induction of long-term potentiation in the rat hippocampus. Neurosci Lett 168: 130-134.

77. Jain KK (2000) Evaluation of memantine for neuroprotection in dementia. Expert Opin Investig Drugs 9: 1397-1406.

78. Jarrett JT, Berger EP, Lansbury PT, Jr. (1993) The C-terminus of the beta protein is critical in amyloidogenesis. Ann N Y Acad Sci 695: 144-148.

79. Jeanclos EM, Lin L, Treuil MW, Rao J, DeCoster MA, Anand R (2001) The chaperone protein 14-3-3eta interacts with the nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit. Evidence for a dynamic role in subunit stabilization. J Biol Chem 276: 28281-28290.

80. Kaneko S, Maeda T, Kume T, Kochiyama H, Akaike A, Shimohama S, Kimura J (1997) Nicotine protects cultured cortical neurons against glutamate-induced cytotoxicity via alpha7-neuronal receptors and neuronal CNS receptors. Brain Res 765: 135-140.

81. Kasa P, Rakonczay Z, Gulya К (1997) The cholinergic system in Alzheimer's disease. Prog Neurobiol 52: 511-535.

82. Kellar KJ, Whitehouse PJ, Martino-Barrows AM, Marcus K, Price DL (1987) Muscarinic and nicotinic cholinergic binding sites in Alzheimer's disease cerebral cortex. Brain Res 436: 62-68.

83. Keller SH, Lindstrom J, Taylor P (1998) Inhibition of glucose trimming with castanospermine reduces calnexin association and promotes proteasome degradation of the alpha-subunit of the nicotinic acetylcholine receptor. J Biol Chem 273: 17064-17072.

84. Keller SH, Taylor P (1999) Determinants responsible for assembly of the nicotinic acetylcholine receptor. J Gen Physiol 113: 171-176.

85. Kem WR (2000) The brain alpha7 nicotinic receptor may be an important therapeutic target for the treatment of Alzheimer's disease: studies with DMXBA (GTS-21). Behav Brain Res 113: 169-181.

86. Khiroug SS, Harkness PC, Lamb PW, Sudweeks SN, Khiroug L, Millar NS, Yakel JL2002) Rat nicotinic ACh receptor alpha7 and beta2 subunits co-assemble to form functional heteromeric nicotinic receptor channels. J Physiol 540: 425-434.

87. Kihara T, Shimohama S (2004) Alzheimer's disease and acetylcholine receptors. Acta Neurobiol Exp (Wars) 64: 99-105.

88. Kihara T, Shimohama S, Sawada H, Kimura J, Kume T, Kochiyama H, Maeda T, Akaike A (1997) Nicotinic receptor stimulation protects neurons against beta-amyloid toxicity. Ann Neurol 42: 159-163.

89. Kitagawa H, Takenouchi T, Azuma R, Wesnes KA, Kramer WG, Clody DE, Burnett AL2003) Safety, pharmacokinetics, and effects on cognitive function of multiple doses of GTS-21 in healthy, male volunteers. Neuropsychopharmacology 28: 542-551.

90. Kosik KS, Joachim CL, Selkoe DJ (1986) Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 4044-4048.

91. Kovalchuk Y, Hanse E, Kafitz KW, Konnerth A. Postsynaptic Induction of BDNF-Mediated Long TermPotentiation. Science. 2002 Mar 1;295(5560):1729-34.

92. Kumar P, Meizel S (2005) Nicotinic acetylcholine receptor subunits and associated proteins in human sperm. J Biol Chem 280: 25928-25935.

93. Landy A (1989) Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem 58: 913-949.

94. Lansdell SJ, Gee VJ, Harkness PC, Doward Al, Baker ER, Gibb AJ, Millar NS (2005) RIC-3 enhances functional expression of multiple nicotinic acetylcholine receptor subtypes in mammalian cells. Mol Pharmacol 68:1431-1438.

95. Le Novere N, Changeux JP (1995) Molecular evolution of the nicotinic acetylcholine receptor: an example of multigene family in excitable cells. J Mol Evol 40:155-172.

96. Le Novere N, Corringer PJ, Changeux JP (2002) The diversity of subunit composition in nAChRs: evolutionary origins, physiologic and pharmacologic consequences. J Neurobiol 53: 447-456.

97. Levin ED (2002) Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol 53: 633640.

98. Levin ED, Bettegowda C, Blosser J, Gordon J (1999) AR-R17779, and alpha7 nicotinic agonist, improves learning and memory in rats. Behav Pharmacol 10: 675-680.

99. Levin ED, Briggs SJ, Christopher NC, Rose JE (1992) Persistence of chronic nicotine-induced cognitive facilitation. Behav Neural Biol 58: 152-158.

100. Levin ED, Briggs SJ, Christopher NC, Rose JE (1993) Chronic nicotinic stimulation and blockade effects on working memory. Behav Pharmacol 4:179-182.

101. Levin ED, McClernon FJ, Rezvani AH (2006) Nicotinic effects on cognitive function: behavioral characterization, pharmacological specification, and anatomic localization. Psychopharmacology (Berl) 184: 523-539.

102. Liao BY, Zhang J (2006) Evolutionary conservation of expression profiles between human and mouse orthologous genes. Mol Biol Evol 23: 530-540.

103. Lim GP, Chu T, Yang F, Beech W, Frautschy SA, Cole GM (2001) The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci21: 8370-8377.

104. Lindholm D, Carroll P, Tzimagiogis G, Thoenen H (1996) Autocrine-paracrine regulation of hippocampal neuron survival by IGF-1 and the neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4. Eur J Neurosci 8: 1452-1460.

105. Liu RH, Mizuta M, Matsukura S (2004) The expression and functional role of nicotinic acetylcholine receptors in rat adipocytes. J Pharmacol Exp Ther 310: 52-58.

106. Longo FM, Massa SM (2004a) Neuroprotective strategies in Alzheimer's disease. NeuroRx 1: 117-127.

107. Longo FM, Massa SM (2004b) Neurotrophin-based strategies for neuroprotection. J Alzheimers Dis 6: S13-S17.

108. Lu Q, Wood JG (1993) Functional studies of Alzheimer's disease tau protein. J Neurosci 13: 508-515.

109. Macallan DR, Lunt GG, Wonnacott S, Swanson KL, Rapoport H, Albuquerque EX (1988) Methyllycaconitine and (+)-anatoxin-a differentiate between nicotinic receptors in vertebrate and invertebrate nervous systems. FEBS Lett 226: 357-363.

110. Maggi L, Sher E, Cherubini E (2001) Regulation of GABA release by nicotinic acetylcholine receptors in the neonatal rat hippocampus. J Physiol 536: 89-100.

111. Mameli-Engvall M, Evrard A, Pons S, Maskos U, Svensson TH, Changeux JP, Faure P (2006) Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron 50: 911-921.

112. Marin P, Maus M, Desagher S, Glowinski J, Premont J (1994) Nicotine protects cultured striatal neurones against N-methyl-D-aspartate receptor-mediated neurotoxicity. Neuroreport 5: 1977-1980.

113. Marvanova M, Lakso M, Pirhonen J, Nawa H, Wong G, Castren E (2001) The neuroprotective agent memantine induces brain-derived neurotrophic factor and trkB receptor expression in rat brain. Mol Cell Neurosci 18: 247-258.

114. Mayeux R, Sano M (1999) Treatment of Alzheimer's disease. N Engl J Med 341: 16701679.

115. Mazurov A, Hauser T, Miller CH (2006) Selective alpha7 nicotinic acetylcholine receptor ligands. Curr Med Chem 13:1567-1584.

116. McGehee DS, Heath MJ, Gelber S, Devay P, Role LW (1995) Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science 269: 1692-1696.

117. Merlie JP, Lindstrom J (1983) Assembly in vivo of mouse muscle acetylcholine receptor: identification of an alpha subunit species that may be an assembly intermediate. Cell 34: 747757.

118. Meyer EM, Kuryatov A, Gerzanich V, Lindstrom J, Papke RL (1998) Analysis of 3-(4-hydroxy, 2-Methoxybenzylidene)anabaseine selectivity and activity at human and rat alpha-7 nicotinic receptors. J Pharmacol Exp Ther 287: 918-925.

119. Meyer EM, Tay ET, Papke RL, Meyers C, Huang GL, de Fiebre CM (1997) 3-2,4-Dimethoxybenzylidene.anabaseine (DMXB) selectively activates rat alpha7 receptors and improves memory-related behaviors in a mecamylamine-sensitive manner. Brain Res 768: 49-56.

120. Millar NS (2003) Assembly and subunit diversity of nicotinic acetylcholine receptors. Biochem Soc Trans 31: 869-874.

121. Minichiello L, Korte M, Wolfer D, Kuhn R, Unsicker K, Cestari V, Rossi-Arnaud C, Lipp HP, Bonhoeffer T, Klein R (1999) Essential role for TrkB receptors in hippocampus-mediated learning. Neuron 24: 401-414.

122. Mu JS, Li WP, Yao ZB, Zhou XF. Deprivation of endogenous brain-derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats. Brain Res. 1999 Jul 24;835(2):259-65.

123. Murer MG, Yan Q, Raismari-Vozari R (2001) Brairi-derived neurotrophic factor in the control human brain, and in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Prog Neurobiol 63: 71124.

124. Murray KD, Gall CM, Jones EG, Isackson PJ (1994) Differential regulation of brain-derived neurotrophic factor and type II calcium/calmodulin-dependent protein kinase messenger RNA expression in Alzheimer's disease. Neuroscience 60: 37-48.

125. Navaneetham D, Penn A, Howard J, Jr., Conti-Fine BM (1997) Expression of the alpha 7 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor in normal and myasthenic human thymuses. Cell Mol Biol (Noisy -le-grand) 43: 433-442.

126. Nguyen M, Alfonso A, Johnson CD, Rand JB (1995) Caenorhabditis elegans mutants resistant to inhibitors of acetylcholinesterase. Genetics 140: 527-535.

127. Nilsson L, Nordberg A, Hardy J, Wester P, Winblad B (1986) Physostigmine restores 3H-acetylcholine efflux from Alzheimer brain slices to normal level. J Neural Transm 67: 275-285.

128. Nordberg A (1992) Neuroreceptor changes in Alzheimer disease. Cerebrovasc Brain Metab Rev 4: 303-328.

129. Ortells MO, Lunt GG (1995) Evolutionary history of the ligand-gated ion-channel superfamily of receptors. Trends Neurosci 18:121-127.

130. Palma E, Maggi L, Barabino B, Eusebi F, Ballivet M (1999) Nicotinic acetylcholine receptors assembled from the alpha7 and beta3 subunits. J Biol Chem 274: 18335-18340.

131. Petersen RC, Smith GE, Waring SC, Ivnik RJ, Tangalos EG, Kokmen E (1999) Mild cognitive impairment: clinical characterization and outcome. Arch Neurol 56: 303-308.

132. Phillips HS, Hains JM, Armanini M, Laramee GR, Johnson SA, Winslow JW (1991) BDNF mRNA is decreased in the hippocampus of individuals with Alzheimer's disease. Neuron 7: 695702.

133. Picciotto MR, Zoli M (2002) Nicotinic receptors in aging and dementia. J Neurobiol 53: 641-655.

134. Pichat, P, Bergis OE, Terranova JP, Santucci V, Gueudet C, Francon D, Voltz C, Steinberg R, Griebel G, Ouri-Donat F, Avenet P, Soubrie P, and Scatton B. Soc.Neurosci. 34, 583.3. 2004.Ref Type: Abstract

135. Plazas PV, Katz E, Gomez-Casati ME, Bouzat C, Elgoyhen AB (2005) Stoichiometry of the alpha9alpha10 nicotinic cholinergic receptor. J Neurosci 25: 10905-10912.

136. Plummer HK, III, Dhar M, Schuller HM (2005) Expression of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor in human lung cells. Respir Res 6: 29.

137. Puchacz E, Buisson B, Bertrand D, Lukas RJ (1994) Functional expression of nicotinic acetylcholine receptors containing rat alpha 7 subunits in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. FEBS Lett 354: 155-159.

138. Quik M, Choremis J, Komourian J, Lukas RJ, Puchacz E (1996) Similarity between rat brain nicotinic alpha-bungarotoxin receptors and stably expressed alpha-bungarotoxin binding sites. J Neurochem 67:145-154.

139. Rakhilin S, Drisdel RC, Sagher D, McGehee DS, Vallejo Y, Green WN (1999) alpha-bungarotoxin receptors contain alpha7 subunits in two different disulfide-bonded conformations. J Cell Biol 146: 203-218.

140. Rangwala F, Drisdel RC, Rakhilin S, Ко E, Atluri P, Harkins AB, Fox AP, Salman SS, Green WN (1997) Neuronal alpha-bungarotoxin receptors differ structurally from other nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci 17: 8201-8212.

141. Rezvani AH, Levin ED (2001a) Cognitive effects of nicotine. Biol Psychiatry 49: 258-267.

142. Rezvani AH, Levin ED (2001b) Cognitive effects of nicotine. Biol Psychiatry 49: 258-267.

143. Romano SJ, Corriveau RA, Schwarz Rl, Berg DK (1997) Expression of the nicotinic receptor alpha 7 gene in tendon and periosteum during early development. J Neurochem 68: 640-648.

144. Rusted JM, Newhouse PA, Levin ED (2000) Nicotinic treatment for degenerative neuropsychiatric disorders such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Behav Brain Res 113: 121-129.

145. Saragoza PA, Modir JG, Goel N, French KL, Li L, Nowak MW, Stitzel JA (2003) Identification of an alternatively processed nicotinic receptor alpha7 subunit RNA in mouse brain. Brain Res Mol Brain Res 117:15-26.

146. Schmid FX, Mayr LM, Mucke M, Schonbrunner ER (1993) Prolyl isomerases: role in protein folding. Adv Protein Chem 44: 25-66.

147. Schoepfer R, Conroy WG, Whiting P, Gore M, Lindstrom J (1990) Brain alpha-bungarotoxin binding protein cDNAs and MAbs reveal subtypes of this branch of the ligand-gated ion channel gene superfamily. Neuron 5: 35-48.

148. Schroeder KM, Wu J, Zhao L, Lukas RJ (2003) Regulation by cycloheximide and lowered temperature of cell-surface alpha7-nicotinic acetylcholine receptor expression on transfected SH-EP1 cells. J Neurochem 85: 581-591.

149. Seguela P, Wadiche J, Dineley-Miller K, Dani JA, Patrick JW (1993) Molecular cloning, functional properties, and distribution of rat brain alpha 7: a nicotinic cation channel highly permeable to calcium. J Neurosci 13: 596-604.

150. Sekhon HS, Jia Y, Raab R, Kuryatov A, Pankow JF, Whitsett JA, Lindstrom J, Spindel ER (1999) Prenatal nicotine increases pulmonary alpha7 nicotinic receptor expression and alters fetal lung development in monkeys. J Clin Invest 103: 637-647.

151. Selkoe DJ (1991) Amyloid protein and Alzheimer's disease. Sci Am 265: 68-6, 78.

152. Selkoe DJ (2000) The origins of Alzheimer disease: a is for amyloid. JAMA 283: 16151617.

153. Selkoe DJ (2002) Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science 298: 789-791.

154. Selkoe DJ (2004) Alzheimer disease: mechanistic understanding predicts novel therapies. Ann Intern Med 140: 627-638.

155. Selkoe DJ, Podlisny MB (2002) Deciphering the genetic basis of Alzheimer's disease. Annu Rev Genomics Hum Genet 3: 67-99.

156. Shaw S, Bencherif M, Marrero MB (2002) Janus kinase 2, an early target of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor-mediated neuroprotection against Abeta-(1-42) amyloid. J Biol Chem 277: 44920-44924.

157. Shimohama S, Greenwald DL, Shafron DH, Akaika A, Maeda T, Kaneko S, Kimura J, Simpkins CE, Day AL, Meyer EM (1998) Nicotinic alpha 7 receptors protect against glutamate neurotoxicity and neuronal ischemic damage. Brain Res 779: 359-363.

158. Shimohama S, Kihara T (2001) Nicotinic receptor-mediated protection against beta-amyloid neurotoxicity. Biol Psychiatry 49: 233-239.

159. Shytle RD, Mori T, Townsend K, Vendrame M, Sun N, Zeng J, Ehrhart J, Silver AA, Sanberg PR, Tan J (2004) Cholinergic modulation of microglial activation by alpha 7 nicotinic receptors. J Neurochem 89: 337-343.

160. Siegel GJ, Chauhan NB (2000) Neurotrophic factors in Alzheimer's and Parkinson's disease brain. Brain Res Brain Res Rev 33:199-227.

161. Skok M, Grailhe R, Changeux JP (2005) Nicotinic receptors regulate B lymphocyte activation and immune response. Eur J Pharmacol 517: 246-251.

162. Stevens KE, Kem WR, Mahnir VM, Freedman R (1998) Selective alpha7-nicotinic agonists normalize inhibition of auditory response in DBA mice. Psychopharmacology (Berl) 136: 320-327.

163. Stokes C, Papke JK, Horenstein NA, Kem WR, McCormack TJ, Papke RL (2004) The structural basis for GTS-21 selectivity between human and rat nicotinic alpha7 receptors. Mol Pharmacol 66: 14-24.

164. Sugaya K, Giacobini E, Chiappinelli VA (1990) Nicotinic acetylcholine receptor subtypes in human frontal cortex: changes in Alzheimer's disease. J Neurosci Res 27: 349-359.

165. Sweileh W, Wenberg K, Xu J, Forsayeth J, Hardy S, Loring RH (2000) Multistep expression and assembly of neuronal nicotinic receptors is both host-cell- and receptor-subtype-dependent. Brain Res Mol Brain Res 75: 293-302.

166. Tohgi H, Utsugisawa K, Nagane Y (2000) Protective effect of nicotine through nicotinic acetylcholine receptor alpha 7 on hypoxia-induced membrane disintegration and DNA fragmentation of cultured PC12 cells. Neurosci Lett 285: 91-94.

167. Trojanowski JQ, Lee VM (2002) The role of tau in Alzheimer's disease. Med Clin North Am 86:615-627.

168. Villiger Y, Szanto I, Jaconi S, Blanchet C, Buisson B, Krause KH, Bertrand D, Romand JA (2002) Expression of an alpha7 duplicate nicotinic acetylcholine receptor-related protein in human leukocytes. J Neuroimmunol 126: 86-98.

169. Wanamaker CP, Christianson JC, Green WN (2003) Regulation of nicotinic acetylcholine receptor assembly. Ann N Y Acad Sci 998: 66-80.

170. Wang PN, Wang SJ, Hong CJ, Liu TT, Fuh JL, Chi CW, Liu CY, Liu HC (1997) Risk factors for Alzheimer's disease: a case-control study. Neuroepidemiology 16: 234-240.

171. Wang Y, Pereira EF, Maus AD, Ostlie NS, Navaneetham D, Lei S, Albuquerque EX, Conti-Fine BM (2001) Human bronchial epithelial and endothelial cells express alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. Mol Pharmacol 60:1201-1209.

172. Williams ME, Burton B, Urrutia A, Shcherbatko A, Chavez-Noriega LE, Cohen CJ, Aiyar J (2005) Ric-3 promotes functional expression of the nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit in mammalian cells. J Biol Chem 280:1257-1263.

173. Woodruff-Рак DS, Green JT, Coleman-Valencia С, Рак JT (2000) A nicotinic cholinergic agonist (GTS-21) and eyeblink classical conditioning: acquisition, retention, and relearning in older rabbits. Exp Aging Res 26: 323-336.

174. Woodruff-Рак DS, Li YT, Kem WR (1994) A nicotinic agonist (GTS-21), eyeblink classical conditioning, and nicotinic receptor binding in rabbit brain. Brain Res 645: 309-317.

175. Yamada K, Mizuno M, Nabeshima T (2002) Role for brain-derived neurotrophic factor in learning and memory. Life Sci 70: 735-744.

176. Yamashita H, Nakamura S (1996) Nicotine rescues PC12 cells from death induced by nerve growth factor deprivation. Neurosci Lett 213: 145-147.

177. Yankner BA, Caceres A, Duffy LK (1990) Nerve growth factor potentiates the neurotoxicity of beta amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 9020-9023.

178. Yu CR, Role LW (1998) Functional contribution of the alpha7 subunit to multiple subtypes of nicotinic receptors in embryonic chick sympathetic neurones. J Physiol 509 ( Pt 3): 651-665.

179. Zajaczkowski W, Hetman M, Nikolaev E, Quack G, Danysz W, Kaczmarek L (2000) Behavioural evaluation of long-term neurotoxic effects of NMDA receptor antagonists. Neurotox Res 1:299-310.

180. Zamani MR, Allen YS, Owen GP, Gray JA (1997) Nicotine modulates the neurotoxic effect of beta-amyloid protein(25-35)) in hippocampal cultures. Neuroreport 8: 513-517.

181. Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999) A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen 4: 67-73.

182. Zhang X, Liu C, Miao H, Gong ZH, Nordberg A (1998) Postnatal changes of nicotinic acetylcholine receptor alpha 2, alpha 3, alpha 4, alpha 7 and beta 2 subunits genes expression in rat brain. Int J Dev Neurosci 16: 507-518.

183. Огромное спасибо моему Папе за вдохновение и постоянную помощь и поддержку во всем

184. Ringrazio cordialmente tutta SienaBiotech e Dott. Gaviraghi per aver mi dato la possibilita di fare questo lavoro e di imparare tantissime metodiche di neurobiologia moderna

185. Grazie infinite a Renza per guidarmi passo dopo il passo, per sua logica, obbiettivita e pazienza

186. Grazie mille ad Andrea per essere un fonte infinito delle idee brillanti e per discussioni costruttivi

187. Vielen Dank an Hendrick, dass er mir den FLIPR assay an langen FLIPR Abenden beigebracht hat und besonders fuer genistein und PNU Ideen

188. Herzlichen Dank an Georg fuer seine weisen Ratschlaege und fuer die vielen Fragen, die mich zum Nachdenken gebracht haben

189. Grazie a Teresa arrivata da poco che forse senza saperlo mi ha aiutato tanto nella scrittura della tesi

190. Grazie mille all'Llnita di Neurobiologia per I'amichevole atmosfera di collaborazione

191. Andreas danke ich fuer seine optimistische Kritik und dafuer, dass er mir die Grundlagen der Bioinformatik beigebracht hat

192. Grazie a Silvia per i primi esperimenti con IL CLONE Grazie all'Llnita di Protein Sciences e soprattutto a Roberto e Eloise per tutti i gel che abbiamo fatto. Grazie a Eloise per sua amicizia, allegria e ottimismo quali mi hanno aiutato piu di una volta

193. Благодарю Игоря Анатольевича и Олега за конструктивное обсуждение результатов. Отдельное спасибо Олегу за его доброжелательность и за научный дух

194. Благодарю Елену Артуровну, Валентину Александровну и Елену Владимировну за помощь в оформлении работы. Отдельное спасибо Диане за все мейлы с ценными советами, которые она мне прислала

195. Спасибо Маме и Варе за то, что они меня терпели, понимали и поддерживали все это время, создавая все условия для работы

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера

Оглавление диссертации Середенина, Тамара Сергеевна :: 2006 :: Москва

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Середенина, Тамара Сергеевна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение и моделирование новых фармакологических мишеней для лечения болезни Альцгеймера"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Середенина, Тамара Сергеевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций