Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение эпитопной структуры пероксидазы щитовидной железы человека

На правах рукописи

□□306Т4ТТ

ЗУБКОВ Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ СТРУКТУРЫ ПЕРОКСИДАЗЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

МОСКВА-2006

003067477

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кандрор Виллен Иосифович доктор биологических наук, профессор Сидорова Екатерина Владимировна

Ведущая организация: ФГУ Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию (ФАЗРСР)

Защита состоится «25» января 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казенный пер., д.5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан « » декабря 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Кузьмина Нина Сергеевна Свиридов Валерий Васильевич

кандидат медицинских наук

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные заболевания щитовидной железы' (АИЗ ЩЖ) являются одной из важнейших и актуальных проблем современной эндокринологии. Не менее 15 миллионов человек, проживающих на территории Российской Федерации, имеют явные или скрытые нарушения со стороны функции щитовидной железы, причём ежегодно увеличивается число людей с АИЗ ЩЖ (Мельниченко Г.А., 2002; Шилин Д.Е., 2002). Главными причинами роста АИЗ ЩЖ являются дефицит йода во многих регионах страны, недостатки в проведении йодной профилактики, неблагоприятная экологическая ситуация, возникшая в результате техногенных катастроф. Совершенствование лабораторных и инструментальных методов диагностики способствовало увеличению частоты выявления заболевания.

Основными антигенами ЩЖ, имеющими значение в развитии аутоиммунных расстройств, являются тиреоглобулин (ТГ), тиреопероксидаза (ТПО) и рецептор тиреотропного гормона (рТТГ). В настоящее время ТПО рассматривается как ведущий аутоантиген (Portolano et al., 1993, Volpe 2000, Ruf et al., 2006, Ludgate et al., 2000).

Антитела (Ат) к ТПО выявляются в 90-100 % случаев в сыворотке больных с АИЗ ЩЖ (Marriotti et al., 1990, Feldt-Rasmussen et al., 1991, Volpe, 2000), в 20-35 % с узловым зобом, в 60-70 % с гипотиреозом и при ряде других заболеваний (Шилин Д.Е., 1998). Отмечена корреляция между титром антител к ТПО и гистологическими изменениями щитовидной железы при аутоиммунном тиреоидите (Jeng et al., 1989, Paschke et al., 1993). Эти антитела, в отличие от Ат к ТГ и рТТГ, способны фиксировать комплемент и таким образом участвовать в лизисе тиреоцитов. При этом антимикросомапьные антитела по своей цитоток-сичности гетерогенны. Только часть обследованных сывороток крови больных с аутоиммунным тиреоидитом Хашимото (АИТ) обладала способностью лизи-ровать тиреоциты в присутствии комплемента (Кандрор В.И. и соавт., 1997). Антитела к ТПО в сыворотке крови больных с АИЗ ЩЖ направлены к различным участкам фермента. С помощью химерных белков выявлено 3-х кратное превышение количества аутоантител к фрагменту ТПО, сформированному 513633 а.о., в сыворотке крови пациентов с тиреоидитом Хашимото, по сравнению с сывороткой больных ДТЗ (Berman et al., 1993). Методом проточной цитоф-луорометрии на культуре тиреоцитов было показано, что аутоантитела в образцах сыворотки крови больных с ДТЗ к эпитопу МкАт 64 (Ruf et., 1989) выявляются на 45 % чаще, чем у больных с нетоксичным многоузловым зобом (Bosso-

'Использованные сокращения: Аг - антиген; АИЗ - аутоиммунные заболевания; АИТ - аутоиммунный тиреоидит; Ат - антитела; ДТЗ - диффузный токсический зоб; ГТ -гипотиреоз; ИФА - иммуноферментный анализ; МкАт - моноклональные антитела; МФТ -микросомальная фракция тиреоцитов; ОП - оптическая плотность; рТТГ - рецептор тиреотропного гормона; ТГ- тиреоглобулин; ТПО - пероксидаза щитовидной железы; дТПО - денатурированная; нТПО - нативная; УЗ - узловой зоб; ЩЖ - щитовидная железа; CBD - цел-люлозосвязывающий домен эндоглюканазы из Anaerocellam thermophilum - белок носитель; ФСБТ - фосфатно-солевой буферный раствор с 0,05 % твин 20.

\vski е1 а1. 2005). Выяснение причин подобной гетерогенности аутоантител у больных с различными нарушениями щитовидной железы может уточнить патофизиологические механизмы развития АИЗ ЩЖ.

Несмотря на многочисленные усилия в изучении ТПО и её роли в патогенезе АИЗ ЩЖ, остается ряд нерешенных вопросов, в частности, о пространственной структуре ТПО и ее функционировании на внешней поверхности тире-оцита (МзЫкаша е! а1., 1996, СЬаско е1 а!., 1996, СЬагепЬа1к е1 а]., 1998, КаророЛ й а1., 2001, вио е! а1., 2002), требующих для своего решения использования новых иммунохимических и молекулярно-биологических подходов. Таких, например, как использование моноклональных антител к ТПО и генно-инженерных пептидов (ЯиГ е1 а1., 1985, Вап£а е1 а1., 1986, РогЫапо е! а!., 1988). На основе сравнительного анализа специфичности МкАт и выявляемых в сыворотке с АИЗ ЩЖ аутоантител возможно определение тонкой эпитопной направленности аутоантител к ТПО при различных формах заболеваний.

Цель работы: изучение эпитопной структуры пероксидазы щитовидной железы с помощью коллекции моноклональных антител и генно-инженерных конструкций.

Задачи исследования:

1. Выделить из ткани щитовидной железы высокоочищенный препарат ти-реопероксидазы (ТПО).

2. Получить панель гибридом-продуцентов моноклональных антител к ТПО; провести клонирование гибридных культур и отобрать технологичные клоны гибридом.

3. Изучить специфичность моноклональных антител к ТПО в ИФА и в им-муноблоттинге.

4. Провести сравнительный анализ эпитопной структуры нативной ТПО с помощью панели моноклональных антител и химерных белков, включающих последовательности 599-629 а.о. и 706-720 а.о.

5. Исследовать эпитопную специфичность аутоантител к ТПО в сыворотке крови доноров и пациентов с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы в конкурентном ИФА с применением моноклональных антител и клонированных фрагментов ТПО.

Научная новизна

Создана панель из 36 моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные детерминанты ТПО.

С помощью химерных белков выявлен новый линейный эпитоп, расположенный на участке 606-617а.о. ТПО в иммунодоминантной области А, распознаваемый МкАт 1 и аутоантителами.

Обосновано предположение о том, что линейные эпитопы, расположенные на участках 606-617 а.о. и 706-720 а.о. ТПО, распознаваемые МкАт 1, и 706-720 а.о. - МкАт 70, участвуют в формировании нового конформационного эпитопа на молекуле ТПО. Это согласуется с трёхмерной моделью тиреопероксидазы, в соответствии с которой эти участки молекулы пространственно сближены.

Эпитопы, выявляемые МкАт № 1, 70, 88 (линейные) и № 3 (конформацион-ный), распознаются анти-ТПО аутоантителами больных с АИЗ ЩЖ. Антитела к конформационному эпитопу 3 на 30-60 % ингибируют связывание соответствующих моноклональных антител и выявляются в 96 % образцов сыворотки крови больных с диффузным токсическим зобом и во всех исследованных -при аутоиммунном тиреоидите. Практическая значимость

1. Полученная панель МкАт к пероксидазе щитовидной железы может быть использована в дальнейших исследованиях с целью выявления эпитопов ТПО, значимых для формирования аутоантител при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы.

2. Моноклональные антитела могут применяться в процессе выделения, очистки и контроля сохранности структуры ТПО.

3. Моноклональные антитела могут быть инструментом для проведения имму-ногисто- и цитохимических исследований препаратов щитовидной железы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Создана коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные эпитопы в молекуле пероксидазы щитовидной железы (ТПО).

2. Линейный эпитоп, распознаваемый МкАт 1, расположен в районе 606-617 а.о в иммунодоминантной области А молекулы ТПО. МкАт 1 реагирует и с де-терминантой, образованной линейной последовательностью 706-720 а.о. Эти линейные последовательности участвуют в формировании пространственного эпитопа, также распознаваемого МкАт 1. Линейный эпитоп, расположенный на участке 706-720 а.о. ТПО, распознается МкАт 70.

3. МкАт 3 (к конформационному) и 1, 70, 88 (к линейным эпитопам) выявляют в молекуле ТПО детерминанты, распознаваемые аутоантителами человека при различных АИЗ ЩЖ.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конференции молодых ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2004), на III Объединенном съезде иммунологов России (г. Екатеринбург, 2004), на VIII и X Всероссийских научных форумах с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004, 2006). Публикации

Основные положения диссертации отражены в 7 печатных работах. Объем ч структура диссертации

Диссертация общим объем о м2 стр. состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (5^Гист. отечественных и2£2.зарубежных). Текст диссертации иллюстрирован 17 таблицами и 43 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Тиреопероксидазу выделяли из ткани щитовидной железы, полученной у лиц с диффузным токсическим зобом (ДТЗ) после проведения оперативного вмешательства. Приготовленную микросомальную фракцию тиреоцитов солю-билизировали добавлением 0,3 % дезоксихолата натрия в присутствии трипсина, с целью высвобождения ТПО из микросом. Очистку фермента осуществляли методом аффинной хроматографии на сорбенте CNBr-сефароза-МкАт (МкАт были получены ранее в процессе создания иммуноферментного теста для количественного определения Ат к ТПО в сыворотке крови человека) (Кузьмина Н.С. и соавт., 1999). Денатурированную ТПО готовили термообработкой при 95 °С в присутствии 5 % 2-меркаптоэтанола и 2 % додецилсульфата натрия.

Тиреоглобулин для контроля специфичности МкАт получали из гомоге-ната ткани щитовидной железы методом гель-фильтрации на колонке с сефаро-зой 6В.

В работе применяли химерные белки, содержащие аминокислотные последовательности трёх антигенных детерминант ТПО человека: Е1 (599-617) <GS>GLPRLETPADLSTAIASRS, Е2 (606-629) <GS> PADLSTAIASRSVAD-K1LDLYKHP<GRS> и ЕЗ (706-720) <GS>MDAFQVGKFPEDFES<GRS>, полученные из ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН, Москва. Фрагменты ДНК, соответствующие линейным антигенным детерминантам ТПО, были вставлены на 3'- и 5'- конец фрагмента ДНК, кодирующего целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндоглюканазы 388-570 а.о. из Anaerocellum thermophilum (NCBI - ACCESSION Z77855). Характеристика пяти исследованных химерных белков представлена в разделе «Результаты и их обсуждение» в таблице 5 на стр. 16.

Для получения гибридом - продуцентов МкАт к ТПО использовали спле-ноциты мышей линии BALB/c иммунизированных трижды внутрибрюшинно нативной ТПО в дозе 25-50 мкг с интервалом между инъекциями 15 дней. При первой инъекции применяли антиген, сорбированный на геле гидроксида алюминия, при последующих - разведённый физиологическим раствором, рН 7,4.

В качестве злокачественного партнёра для гибридизации использовали клетки мышиной миеломы - P3-X63-Ag8.653. В качестве фидерных (подкормочных) клеток использовали спленоциты мышей линии BALB/c в концентрации (3-5)х106 клеток на планшет или клетки перитонеального смыва в той же концентрации. Слияние проводили по стандартной процедуре (Зайцев Е.М. и соавт., 1985).

Антителопродукцию гибридом к пероксидазе щитовидной железы определяли в ИФА на планшетах, сенсибилизированных нативной и денатурированной ТПО, по следующей схеме: антиген + искомые антитела + антивидовой конъюгат. Для контроля специфичности МкАт использовали планшеты, сенсибилизированные высокоочищенным препаратом ТГ. Условия иммуноферментного анализа на всех этапах соответствовали общепринятым.

Антитела к ТПО и к ТГ в сыворотке крови человека определяли в ИФА, используя планшеты, сенсибилизированные ТПО или ТГ в концентрации 5,0 -7,5 мкг/мл. Антитела к ТПО выявляли пероксидазным конъюгатом монокло-нальных антител к Iчеловека в рабочем разведении, Ат к ТГ - пероксидазным коньюгатом белка А в рабочем разведении. Калибровочные пробы готовили на основе сывороток крови человека и оценивали по международным стандарту Ат к микросомальной фракции тиреоцитов (МФТ) № 66/387 и Ат к ТГ № 65/93. Чувствительность методов составляла 10 МЕ/мл, диапазон определяемых концентраций набора ИФА-Ат-ТПО - 25 - 1000 МЕ/мл, ИФА-Ат-ТГ - 100 -2000 МЕ/мл. Уровень Ат к ТПО в сыворотке крови доноров не превышал 50 МЕ/мл, Ат к ТГ - 100 МЕ/мл.

Тиреоглобулин контролировали иммуноферментным методом в «сэндвич» модификации, используя планшеты, сенсибилизированные аффинно-выделенными кроличьими поликлональными антителами к ТГ человека. Образовавшийся на первой стадии реакции комплекс Ат-Аг выявляли конъюгатом кроличьих антител к ТГ, меченных пероксидазой из корня хрена,в рабочем разведении. Калибровочные пробы готовили на основе высокоочищенного препарата ТГ. Чувствительность метода составляла 3 нг/мл, диапазон определяемых концентраций 5-400 нг/мл.

Синтез пероксидазных конъюгатов проводили перйодатным методом (Шкапе е1 а1., 1975).

Эпитопную специфичность антител в образцах сыворотки крови изучали методом конкурентного ИФА в нескольких модификациях:

в первом варианте конкурентного анализа в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО в концентрации 1-5 мкг/мл, одновременно вносили МкАт и МкАт-ПХ (МкАт, коньюгированные с пероксидазой хрена), в концентрации, соответствующей 50 % связыванию антител с антигеном, иммобилизованным на планшете. Оптическую плотность проб, не содержащих антител, принимали за 100 %, ингибирование связывания на 60 % и более считали полным, на 30 -59 % - частичным, менее чем на 30 % - недостоверным;

во втором варианте конкурентного анализа в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО в концентрации 1-5 мкг/мл, предварительно вносили МкАт в разведении, соответствующем 50 % связыванию с ТПО. Планшет инкубировали 1 ч при 37 °С. На следующем этапе в лунки добавляли образцы сыворотки крови пациентов с АИЗ ЩЖ, инкубировали планшет 1 ч при 37 °С, и далее вносили коньюгированные с пероксидазой из корня хрена мышиные МкАт к человека. Значимым считали подавление связывания > 15 %;

в третьем варианте конкурентного анализа при обратной постановке реакции, по сравнению со вторым вариантом, в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО в концентрации 1-5 мкг/мл, предварительно вносили образцы сыворотки крови пациентов с АИЗ ЩЖ, содержащие аутоантитела к ТПО. Снижение степени связывания моноклональных антител с сорбентом в лунках с предварительно внесёнными аутоантителами, по сравнению с контрольными (без аутоантител), позволяло подтвердить или опровергнуть результаты оценки

эпитопной специфичности аутоантител и моноклональных антител, полученных на предыдущем этапе;

в четвёртом варианте конкурентного ИФА в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО в концентрации 1-5 мкг/мл, одновременно вносили образцы сыворотки крови, содержащие аутоантитела к ТПО, и МкАт-ПХ в разведениях, соответствующих 50 % связыванию с антигеном. Снижение связывания пероксидазных коньюгатов моноклональных антител с сорбентом (ТПО) в лунках с внесёнными аутоантителами, по сравнению с контрольными, позволяло сравнить общую эпитопную направленность аутоантител и пероксидазных коньюгатов моноклональных антител;

в пятом варианте конкурентного анализа в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО в концентрации 1-5 мкг/мл, одновременно помещали МкАт в разведении, соответствующем 50 % связыванию с ТПО, и аутоантитела из сыворотки крови пациентов с АИЗ ЩЖ. После инкубации планшета в течение 1 ч при температуре 37 °С в лунки вносили коньюгированные с пероксидазой из корня хрена мышиные МкАт к ^С человека или коньюгированные с пероксидазой из корня хрена антитела кролика к мыши и выдерживали 1 ч при 37 °С. После проявления реакции учитывали результаты связывания аутоантител и МкАт с сорбентом в лунках с предварительно внесёнными МкАт или аутоантителами, сравнивая с контрольными, что позволяло рассчитать процент связывания моноклональных и аутоантител в различных условиях и сопоставить эти данные с полученными в других вариантах конкурентного ИФА.

Изучение взаимодействия химерных белков ТПО с моноклональными антителами и аутоантителами из сыворотки крови больных с АИЗ ЩЖ проводили в конкурентном варианте ИФА. Планшеты сенсибилизировали пероксидазой щитовидной железы в оптимальной концентрации 1,0 мкг/мл. Моноклональные антитела или аутоантитела в концентрации, соответствующей 50 % связыванию антитела с антигеном, предварительно инкубировали в течение 30 мин с препаратами химерных белков ТПО в концентрации от 100 до 3 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали 0,01 М фосфатный буферный раствор с 0,05 % твин 20 (ФСБТ) и белок-носитель (СВБ), а в качестве положительного -нативную ТПО в тех же концентрациях. Для устранения неспецифического влияния в 0,01 М ФСБТ дополнительно добавляли 3 % бычий сывороточный альбумин (БСА). После этапа преинкубации препараты вносили в лунки планшета, сенсибилизированного ТПО, инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. Далее вносили коньюгированные с пероксидазой из корня хрена мышиные МкАт к ^ в человека или коньюгированные с ПХ антитела кролика к ^ О мыши и инкубировали планшет в течение 1 ч при 37 °С. По окончании реакции определяли степень торможения связывания моноклональных или аутоантител, сравнивая с контролем, на основании чего делали вывод о взаимодействии антител с химерными белками.

Взаимодействие МкАт и аутоантител с химерными белками изучали в непрямом ИФА на планшетах, сенсибилизированных химерными белками ТПО в концентрации 10 мкг/мл.

Константы комплексообразования для моноклональных антител рассчитывали методом Фриго (Friguet et al., 1985).

Изотип иммуноглобулинов определяли с помощью набора кроличьих иммуноглобулинов (Ig) к тяжёлым цепям lg М и lg А мыши и к подклассам Ig G (Gi.G2a, G2b) G3) («Bio-Rad», США).

Ферментативную активность пероксидазы выявляли в тесте с использованием гваякола (Hosoya et al., 1962).

Электрофоретическое разделение антигенных препаратов проводили в 5,0-12,5 % в полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli, 1970); иммуноб-лоттинг - методом влажного переноса белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin et al., 1979).

Иммунодот-анализ выполняли на нитроцеллюлозных мембранах (McDou-gal et al., 1983).

Концентрацию белка в препаратах контролировали методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Исследованные в работе образцы сыворотки крови доноров и больных с различными заболеваниями щитовидной железы были получены из лаборатории иммуноферментного анализа кафедры медицинской радиологии РМАПО (рук., к.б.н. Ибрагимова Г.В.) и биохимической лаборатории МОНИКИ им. М.В. Владимирского (рук., д.м.н., профессор Тишенина P.C.).

В работе применяли методы статистической обработки данных для нормального распределения (Бейли М., 1962, Урбах В.Ю, 1975). Для анализа и представления результатов использовали программы Microsoft Excel 2000 и SigmaPlot2000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение пероксидазы щитовидной железы

Результаты выполненных экспериментов по выделению ТПО показали, что на первых этапах очистки в препарате находилась смесь различных белков с преобладанием тиреоглобулина, концентрация которого достигала 83 % от общего содержания белка. Трёхкратная отмывка осадка тиреоцитов приводила к значительному уменьшению содержания ТГ: после первой отмывки уровень ТГ снижался с 8 788 до 936 нг/мл, а после третьей - до 31 нг/мл. Концентрация ТГ в МФТ не превышала 1 % от общего содержания белка.

На следующем этапе проводили солюбилизацию микросомальной фракции для разрушения микросом и выделения ТПО. В качестве солюбилизирую-щих агентов наиболее часто используются: дезоксихолат натрия, дигитонин, Хапс, тритон Х-100, NP-40, трипсин, либо сочетание этих реагентов в различных комбинациях и дозах. Sugawara et al. (1985) было продемонстрировано, что сочетанное применение 5 мМ Хапса (CHAPS), 0,1 % тритона Х-100 и трипсина в расчете 10 мг на 1 г ткани щитовидной железы не только повышало выход ТПО на 20 %, но и увеличивало ферментативную активность в два раза, по сравнению с независимым использованием каждого компонента. Улучшению процесса солюбилизации способствовало введение в реакционную смесь 1 % дигитонина или 0,1 % дезоксихолата натрия вместо тритона Х-100: выход ТПО

и её ферментативная активность увеличивалась в 1,3 и 3 раза, соответственно. Результаты собственных экспериментов показали, что оптимальным было соче-танное применение дезоксихолата натрия в концентрации 0,3 % и трипсина в дозе 2 мг на 1 г ткани щитовидной железы. По данным (Сгагпоска е1 а1., 1985), максимальный выход ТПО в процессе солюбилизации наблюдался при более высокой концентрации дезоксихолата натрия - 0,5 %. Однако в наших опытах при такой концентрации дезоксихолата натрия наблюдалось мицеллообразова-ние в растворе. Кроме того, дополнительное введение в смесь для солюбилизации тритона X 100 в концентрации от 0,1 до 1,0 % и Хапса- от 0,1 до 0,5 % не увеличивало содержание общего белка и ферментативную активность ТПО, по сравнению с использованием только дезоксихолата натрия и трипсина. Различия в полученных результатах, по сравнению с данными других исследователей, на наш взгляд, могут быть обусловлены индивидуальными особенностями ткани щитовидной железы, используемой для выделения ТПО.

После проведения этапа солюбилизации и последующего ультрацентрифугирования частично очищенный препарат ТПО подвергали аффинной хроматографии на колонке СИВг - сефароза 4В с иммобилизованными на ней МкАт (рис. 1).

№№ фракций

Рис. 1. Заключительный этап очистки ТПО методом аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованными МкАт: пик №1 - балластные белки (фракции 5 - 15); пик №2 -очтценная ТПО (фракции 24 - 31).

Концентрация белка в выделенных препаратах ТПО варьировала от 0,7 до 1,3 мг/мл, а ферментативная активность составляла 60 ± 15 ед. акт./мг. Препарат был гомогенным, не содержал примесей ТГ и по молекулярной массе соответствовал ТПО (рис.2), и был использован для иммунизации мышей с целью создания гибридом-продуцентов моноклональных антител. Получение первичных кулыпур гибридных клеток

Успешное получение гибридомных линий, синтезирующих моноклональ-ные антитела, зависит от правильного сочетания ряда условий: схемы иммунизации, выбранной клеточной линии миеломы, соотношения миеломных и селезеночных клеток при слиянии и методов контроля культур-антителопродуцентов.

В наших экспериментах оптимальным мри получении МкАт к ТПО являлось дробное, 3-х кратное введение антигена в течение I месяца с интервалами между инъекциями 15 дней. Анализ сыворотки крови иммунизированных мышей методом непрямого ИФА показал, что оптимальная доза антигена составляла 25-50 икг/нышь. Использование полного и неполного адъюванта Фрейн-да не приводило к существенному усилению иммунного ответа на введение антигена, однако применение геля гидроокиси алюминия стимулировало синтез антител.

кДа 116 - В

98 1

(,(>

31

21,7

17,Я

1 2

Fue. 2. Электрофореграмма препаратов ТПО на стадии аффинной очистки в 10 % ПАЛ/' (концентрация белка 10 мкг/трек): дорожка Ns I - аффцноочищенный препарат ТПО: дорожка Щ 2 - супернатант солюбилизированНой МФТ.

Поскольку внутривенные инъекции приводили к развитию анафилактического шок^получепия гибридом к ТПО, при иммунизации мышей антиген вводили внутрибрюшинно.

Из 480 засеянных лунок в 427 наблюдался рост гибридом, при этом растущие гибридные клетки можно было регистрировать уже на 3-й день после слияния. Эффективность гибридизации, рассчитанная как отношение числа лунок с растущими гибридными культурами к числу засеянных, составляла 89 %. Тестирование супернатантов гибридных культур на 10-25 день культивирования выявило 217 культур, синтезирующих антитела к ТПО. В зависимости от показателей оптической плотности (ОП) при исследовании в ИФА монокло-нальные антитела были разделены на три группы. Первая включала 170 МкАт (ОП - 0,5-1,0 o.e.); вторая - 24 МкАт(ОП = 1,0-1,5 o.e.) и третья - 23 МкАт (ОП > 1,5 o.e.), ОП отрицательного контроля пе превышало 0,1 o.e. Помимо гибридом, секретирующих МкАт к ТПО, были обнаружены 3 культуры, продуцирующие МкАт к ТГ, и 83 со смешанной специфичностью к ТПО и ТГ (таблица I).

а

Получение других коллекций МкАт ТПО также сопровождалось появлением гибридом, синтезирующих антитела к ТГ (РоЛтапп е1 а1., 1986, Вап§а е1 а1., 1988, ЯиГ е1 а1., 1989). Это может быть объяснено тем, что препараты ТПО, использованные для иммунизации, могли содержать незначительную примесь ТГ, не выявляемую в ИФА (Чувствительность набора ИФА-ТГ, с помощью которого в работе проводили определение ТГ, составляет 3 нг/мл, а чувствительность системы иммунологического распознавания мыши значительно превосходит чувствительность иммунохимических методов). С другой стороны литературе имеются указания о наличие у ТГ и ТПО общих эпитопов (Нешу е1 а1., 1991; ТЬгаБууоиНсЬз е! а!., 2004). Для нас представляли интерес клоны, синтези-

Таблица 1

Тестирование первичных культур гибридных клеток в ИФА

Специфичность антител Количество культур Оптическая плотность, 450 нм

ОП < 1,0 1,о<оп> 1,5 ОП > 1,5

ТПО 217 170 24 23

ТГ 3 3 - -

Смешанной специфичности: ТПО + ТГ 83 40 23 20

рующие МкАт к ТПО, поэтому гибридомы, секретирующие Ат к ТГ, а также Ат к ТГ и ТПО, в дальнейшей работе не использовались.

Из 217 первичных гибридных культур отобрали 89, пронумерованных с № 1 по №89, с активной пролиферацией и интенсивным синтезом антител к ТПО. Скрининг супернатантов среды культивирования гибридом повторяли трижды. После третьего тестирования все первичные культуры были криокон-сервированы, а для дальнейшей работы использовали 36 наиболее стабильных гибридом, сохранивших синтез антител. В число тестируемых МкАт вошли три ранее полученных МкАт 1, 2, 3. Следует подчеркнуть, что при анализе МкАт к ТПО было выявлено 5 антител (№ 1, 70, 76, 82, 88), взаимодействующих как с нативной, так и с денатурированной формами ТПО. Все 36 моно-клональных антител к ТПО, полученных из среды культивирования гибридом, также тестировали на планшетах из иммуноферментных наборов реактивов для определения Ат к ТПО «Алкор-Био» (Россия) и «О^еШес» (Германия), 32 МкАт к ТПО определяли антигенные детерминанты, представленные на различных образцах пероксидазы щитовидной железы (таблица 2). Четыре МкАт (3, 27, 61 и 71), направленны^ к конформационным эпитопам, по-разному реагировали с ТПО, иммобилизованной на планшетах. Полученные результаты могут быть обусловлены несколькими факторами: особенностями МкАт, свойствами ТПО, сорбированной в лунках планшетов, и доступностью сайтов связывания Ат с Аг в пространстве. Выявленные различия в структуре ТПО, иммобилизованной на твердой фазе, могут объяснить расхождения в данных количественного определения аутоантител в ТПО в сыворотке крови при ис-

пользовании реагентов разных производителей. Анализ литературных данных показывает, что коэффициент корреляции концентрации аутоантител к ТПО в сыворотках крови, определенной различными диагностикумами, колеблется от 0,85 до 0,98 (ОИегЬотег е1 а1., 2000; Ьтс1Ьег§ е1 а1., 2001). В ранее проведенных нами клинических испытаниях наибольший коэффициент корреляции (0,98) был зарегистрирован при определении аутоантител к ТПО в сыворотке крови человека при использовании разработанного набора ИФА-Ат-ТПО и диагностикума фирмы «Огдеп1ес» (Германия), по сравнению с реагентами других производителей. Результаты опытов с МкАт подтвердили данные о сходстве антигенной структуры ТПО в этих тестах.

Таблица 2

Анализ МкАт на планшетах различных производителей наборов ИФА-Ат-ТПО

Результат взаимодействия (+/-)

№№ МкАт НИИВС им. Мечникова РАМН Алкор Био Orgentec

1,2,6, 8-12,21,

28,30,44,45,

49-52, 55, 60-63, + + +

70,72, 75-79,81-

83,88

3 + - +

27 + - +

61 + - -

71 + + -

На наш взгляд, полученные данные обусловливают целесообразность применения моноклональных антител для контроля антигенной структуры ТПО в процессе выделения и изготовления иммуноферментного набора реагентов ИФА-Ат-ТПО.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов была отобрана коллекция гибридом - продуцентов МкАт к ТПО человека, состоящая из 36 клонов, пять из которых (№ 1, 70, 76, 82, 88) синтезировали моноклональные антитела к линейным эпитопам ТПО.

Клонирование первичных культур гибридом-продуцентов МкАт к ТПО

Для последующей работы отобрали 10 гибридом-продуцентов МкАт: 5 культур синтезирующих МкАт к конформационным эпитопам ТПО (2, 3, 55, 77, 79) и 5 культур, продуцирующих антитела к линейными участкам (1, 70, 76, 82, 88). Все выбранные гибридомы характеризовались высокой скоростью пролиферации и стабильным синтезом специфических антител на протяжении всего срока культивирования in vitro. Титр Ат к ТПО в надосадочной жидкости составлял не менее, чем 5x104. В дальнейшем для получения стабильно растущих и продуцирующих антитела гибридом каждая из культур была клонирована методом предельных разведений. Все 10 МкАт к ТПО относились к изотипу IgG|.

Гамма-глобулиновую фракцию специфических антител из асиитиых жидкостей мышей получали осаждением сульфатом аммония при 50-ти процентном насыщении. Концентрация белка в диализованных сульфатных препаратах асцитных жидкостей колебалась от 2,4 до 25 мг/мл. Титр 10 МкАт к нативной ТПО составлял 2x10 - 5x10 . Минимальная концентрация МкАт, при которой фиксировался сигнал о взаимодействии антител с антигеном, варьировала от 0,1 мкг/мл до 0,1 нг/мл. Максимальным титром (5x10') и показателем ОП в ИФА (1,6 о.е.) ^ нативной ТПО обладало МкАт 55. При титровании пяти МкАт (1, 70, 76, 82, 88) в ИФА на планшете, лунки которого сенсибилизировали дТПО в концентрации 5 мкг/мл, подтвердилась их направленность к линейным эп и толам П 110. Титр МкАт к дТПО составлял 5х104-1х106. Максимальным показателем оптической плотности (2,17 о.е.) и титром (10 ) на дТПО обладало МкАт 76. Следует подчеркнуть, что с нативной Т110 титр МкАт 76 был тот же (106), а ОП была ниже (1,48 о.е.), что свидетельствовало о более высоком сродстве МкАт 76 с денатурированным, чем с нативным Аг. Использованное в качестве контроля МкАт 3 к конформационной детерминанте ТПО не взаимодействовало при титровании с дТПО. В конкурентном ИФА денатурированная ТПО в концентрации 10 мкг/мл ингибировала связывание всех пяти МкАт (1, 70, 76, 82, 88) с нативной ТПО, сорбированной на поверхности лунок пол »стиролового планшета,

П иммуноблоттииге пять МкАт (1, 70, 76, 82, 88) в концентрации 10 мкг/мл выявляли на дорожках с препаратами дТПО и пТПО белок с молекулярной массой 100-110 кДа, что соответствовало м.м. тнреопероксидазы и согласовывалось с данными ИФА (рис.3). Остальные пять МкАт (2, 3, 55, 77, 79) в той же концентрации не окрашивали дорожки с препаратами дТПО и нТПО. Данные иммуноблоттинга представлены только для МкАт 55, так как для остальных 4-х МкАт (2. 3. 77,19) результаты были аналогичными. Отсутствие реак-

. I К;.

1 70 76 52 85 1 70 76 32 8® -К

Рис. 3, Результаты иммуноблоттинга МкАт с нативной и денатурированной ТПО.

ции МкАт 2, 3, 55, 77 и 79 с нТПО, по-видимому, объясняется тем, что в БОБ-электрофорезе возможна частичная денатурация образцов вследствие присутст вия додецилсульфата натрия в ПААГе и в буфере. Очевидно, это приводило к конформационным изменениям пероксидазы щитовидной железы и препятствовало связыванию моноклональных антител.

В иммунодот анализе МкАт 1, 2, 3, 70, 76 в разведении 1:100 взаимодействовали с нативной ТПО в дозах 1,0 и 0,1 мкг. Степень интенсивности реакции уменьшалась со снижением концентрации антигена на твердой фазе. МкАт 2 и 3 взаимодействовали только с нативной формой ТПО в дозах 1,0 и 0,1 мкг, а МкАт 1, 70 и 76 активно взаимодействовали с дТПО в дозе 1,0 мкг, интенсивность окраски превосходила реакцию с нативной ТПО. При снижении сенсибилизирующей дозы дТПО до 0,1 мкг наблюдалась слабая реакция для МкАт 76. Это может быть обусловлено большей доступностью эпитопа МкАт76 в дТПО, по сравнению с эпитопами других МкАт к ТПО.

Определение констант образования иммунных комплексов между монокло-нальньщантителами и пероксидазой щитовидной железы

В таблице 3 представлены рассчитанные величины констант комлексооб-разования 10 МкАт с нативной и денатурированной пероксидазой щитовидной железы. МкАт 55 характеризовалось максимальным значением константы ком-плексообразования для нативного фермента (Ка = 0,65x1011 М"1), а МкАт 70 -для денатурированного (Ка= 2,27x109 М"1). Значения констант комплексообра-зования для моноклональных антител с нативной пероксидазой различались на три порядка, что может быть обусловлено различной аффинностью полученных антител. Величины констант комплексообразования для пяти МкАт, реагирующих с денатурированной ТПО, варьировали в диапазоне 0,96х108 М"1 -2,27х109 М"1. Значение Ка МкАт 1 с нТПО на порядок выше, чем с дТПО, 1,64x109 М"1 и 0,94х108 М"', соответственно. По-видимому, на эффективность взаимодействия этого антитела влияет расположение эпитопа в третичной структуре ТПО. Средние значения Ка МкАт 82 с нТПО и дТПО были близкими - 2,1х109 М"1 и 1,6x109 М"1, соответственно. Можно предположить, что эпитоп МкАт 82 сохраняет свои свойства при денатурации, либо различия в структуре нативной и денатурированной пероксидазы в этой области незначительны, что не влияет на связывание антигена с антителом. Для МкАт 70 и 88 Ка с дТПО была выше, чем для нТПО, 2,27x109 М"1 и 1,67х109 М"', соответственно, что подтверждает предположение о направленности антител к линейным участкам молекулы ТПО, которые после денатурации оказываются более доступными для взаимодействия с МкАт. Для МкАт 76 наблюдалась обратная картина. Константа комплексообразования для этого антитела с нативной ТПО на два порядка ниже, чем с денатурированной: 4,4 х 107 М'1 и 1,89 х 109 М"1, соответственно. Антигенная детерминанта МкАт 76, по-видимому, образована элементами первичной и вторичной структуры ТПО, которые могут быть доступны для антитела только при строго определённой конформации. Возможно, что при

денатурации происходило изменение структуры ТПО, что приводило к увеличению сродства между МкАт 76 и его эпитопом в молекуле ТПО.

Таблица 3

Характеристика МкАт к ТПО

№№ МкАт Изотип ч Титр Ат в асцитах Константа комплексообразования, М"1

нТПО дТПО нТПО дТПО

и 3 1 1x10й 1x10й (1,64 ± 0,30) х 109 (0,94 ± 0,2) х 108

Е 70 1§ С, 1x10й 1x10й (1,67 ± 0,24) х 109 (2,27 ± 0,30) х 109

Я 76 1 х 106 1x10й (4,40 ± 0,60) х 107 (1,89 ± 0,20) х 109

82 1x10й 1x10й _(2,10 ± 1,10) х 109 (1,60 + 0,20) х 109

88 1X10й 1x10й (0,39 ± 0,20) х 109 (2,18 ± 0,30) х 10"

в о 2 1x10й 5х105 (1,60 + 0,20) х 109

2 о 3 1x10й 1x10й (1,23 + 0,40) х 108 -

о. 5 о - 55 к в, 1x10й 5x107 (0,65 ± 0,15} х 10" -

77 10 с, 1x10й 1x105 (1,80 ± 0,50) х 109 -

Ы 79 1x10й 1x10й (0,82 +0,15) х 109 -

Примечание: МкАт не взаимодействует с дТПО, константа не определялась

Определение эпитопной специфичности МкАт

Перекрёстную активность моноклональных антител к ТПО изучали в конкурентном ИФА. С этой целью были приготовлены коньюгаты всех МкАт (1, 70, 76, 82, 88, 2, 3, 55, 77, 79) с пероксидазой из корня хрена. По результатам титрования МкАт и синтезированных МкАт-ПХ на планшетах с иммобилизованным антигеном- нативной ТПО в концентрации 1,0 мкг/мл определили титры антител, соответствующие точке 50 % связывания с сорбентом (таблица 4).

По результатам конкурентного анализа,два антитела, 1 и 70, проявляли высокую перекрёстную активность при взаимодействии с нативной молекулой ТПО. МкАт 88 реагировало с 1 и 70. МкАт 55, 77, 79 частично препятствовали друг другу в связывании с антигеном. Полученные данные показывают, что 10 моноклональных антител выявляли пять доменов на ТПО (рис. 5). Первый домен образован участками молекулы ТПО, распознаваемыми антителами 1, 70 и 88; второй - 2 и 82; третий - 55, 77 и 79. Домен 4 и 5 распознаются антителами МкАт 3 и МкАт 76, соответственно.

Таблица 4

I (ерекрёстная активность МкАт к ['ПО

МкАт- пх. №№ МкАт / степень ингибирования, %

1 70 76 82 88 2 3 55 77 79

1 77 8? 23 20 46 13 20 27 7 10

70 7! 93 31 33 38 13 10 29 7 15

76 10 26 99 37 16 11 7 21 6 13

82 14 39 37 64 35 30 13 33 34 40

88 37 40 5 17 77 26 19 15 8 26

2 2 ¡1 19 30 29 62 19 30 23 46

3 39 42 23 13 33 1 92 22 15 ¡3

55 5 20 25 1 6 31 7 95 25 28

77 25 25 15 10 23 38 29 49 69 48

79 0 0 26 8 31 27 16 61 46 69

Рис. 5. Предполагаемое распределение участков распознавания моноклинальными антителами на молекуле ТПО.

Определение )питанной специфичности МкАт с помощью химерных белков

Для изучения более тонкой специфичности МкАт к Т1 Ю были синтезированы химерные белки, соответствующие последовательностям 599-629 и 706720 а.о., расположенным на М- и С-концевых участках белка-слияния. Эти два участка соответствуют линейным антигенным детерминантам молекулы ТПО, находящимся в иммунодоминантной области А (513-633) и иммуИОДОминант-

ной области В (633-933) и играют важную роль при формировании гуморального ответа у больных с АИЗ ЩЖ (Вегшап ег а1., 1993). Характеристика химерных белков представлена в таблице 5.

Таблица 5

Характеристика химерных белков ТПО

№№ химерных белков Молекулярная масса, кДа Позиция а.о. в ТПО Аминокислотная последовательность антигенной детерминанты Расположение относительно белка-носителя

804 25,4 599-617 GLPRLETPADLSTAIASRS* И-конец

805 25,4 606-629 *PADLSTAIASRSVADKILDLYKHP Ы-конец

806 25,9 599-617 GLPRLETPADLSTAIASRS* С-конец

807 25,9 606-629 *PADLSTAIASRSVADKILDLYKHP С-конец

907 24,9 706-720 MDAFQVGKFPEDFES Ы-конец

Белок-носитель CBD 21,7 - - -

Примечание: тёмным цветом выделены совпадающие аминокислотные последовательности в химерных белках 804-807.

Первая и вторая детерминаты были перекрывающимися и несли в своём составе аминокислоты 599-617 и 606-629, соответственно. Химерные белки 804 и 805 несли последовательность первой антигенной детерминанты, а химерные белки 806 и 807 - второй. Третья антигенная детерминанта состояла из аминокислот 706-720 и была представлена в одном варианте химерного белка - 907, расположенном на N- конце белка слияния. Как видно из результатов электрофореза (рис. 6, 7), все пять химерных белков имели молекулярную массу 24-26 кДа, по сравнению с белком-носителем CBD, молекулярная масса которого -21,7 кДа. Полосы деградации, которые наблюдались на треках химерных белках 804 и 907 ТПО на уровне 22 кДа, могли быть вызваны расщеплением химерного белка в точке прикрепления спейсера на белок-носитель и соответствующую линейную детерминанту ТПО.

При постановке непрямого варианта ИФА на планшетах, сенсибилизированных нативной ТПО, было выявлено, что четыре химерных белка 804-807, добавленные к моноклонапьным антителам в концентрации 3 мкг/мл, тормозили связывание только МкАт 1 на 40-50 %. Химерный белок 907 ингибировал не только активность МкАт 70 на 90 %, но и МкАт 1 на 73 %. В экспериментах с использованием в качестве отрицательного контроля белка-слияния в концентрации 3 мкг/мл торможения связывания МкАт не наблюдалось. Применение нТПО в той же концентрации вызывало полное ингибирование связывания МкАт в тех же условиях.

В иммуноблоттинге были получены аналогичные результаты. МкАт 1 взаимодействовало со всеми пятью химерными белками 804-807 и 907, а МкАт 70 реагировало только с химерным белком 907 (рис.8, 9). Взаимодействие

116 У 8 66

21.7

17.8

_

ым^w«

«Да

1234 56 78 9 10

116.

98 .

66

46

31

i 21.7 — 17.8 _

"Р

кДь

« *

«

В м

«.II

! 23 4 5678 9 1

о]

Рис. 6. Электрофореграмма четырёх химерных белков 804-807 в 12,5 % ПААГ: № 1,10- маркер молекулярных весов; ЛЬ 2, 3 - 805 ПО мкг): Aï 4 - 804 (10 мкг);

Лг 5 - бланк; M 6 - 806 (1С мкг); M 7, 8 - 807 (10мкг): АЬ 9 - ТПО (5 мкг).

Рис. 7, Элекшрофорег/х/мма химерного белка 907 к 12,5 % ПААГ: дорожки: M 1,4- маркер молекулярных весов; As 2 - ТПО (5 мкг); Ne 3 - 907 (10 мкг): M 5, 6 - 901 (20 мкг); As 7. S - 907 (5 мкг); M 9. 10-CBD (К) мкг).

кДа

31 ~

21.7 _

17.8 -

2 3 4 5 МкАт I

6 7 8 -К

кДа

21.7

17.8

МкАт

70 76 82 88 1 70 76 82 88 -К -К

Рис. 8. Результаты иммунобядттингв МкАт 1 с химерными белками 804-807 а ¡2,5 % ПААГ: дорожки M 1. 5 - 805; № 2, 6 - 804: M 3, 7 -806: АЬ 4, 8 807. Концентрация МкАт 1 на дорожках 1-4 50 мкг/мп.

Отрицательный контроль: КГ козьих Ат к Ig G мыши в разведении 1/10000- дорожки N° 5-8.

Рис. 9. Результаты иммуноблоттинга химерного белка 907 с 5 МкАт к линейным imi топам:

дорожки Ai 1-6 - 907: As 8-13 - CED. Концентрация Ат - Юмкг/мл: Отрицательный контроль: КГ козьих Ат к Ig мыши о разведении 1/10000 - Л? 6 .13.

МкАт 1 и 70 с химерным белком 907 подтвердили в трёх независимых экспериментах иммуноблоттинга и в ИФА. Однако, по данным конкурентного ИФА, МкАт 1 и 70 направлены к одному эпитопу.

Дополнительные исследования специфичности МкАт 1 и 70 проводили на планшетах, сенсибилизированных химерным белком 907 в концентрации 10 мкг/мл. При постановке ИФА положительная реакция наблюдалась для МкАт 1, 70: титр Ат достигал значений 1,5x105,

В конкурентном ИФА наблюдалось полное торможение связывания МкАт 1 и 70 с химерным белком 907 при внесении нативной ТПО и химерного белка 907 в диапазоне концентраций от 10 до 0,1 мкг/мл. Аналогичные результаты были получены с использованием других вариантов конкурентного ИФА. Моноклональные антитела 1 и 70 ингибировали связывание МкАт1-ПХ, соответственно МкАт 70 и 1 вызывали торможение связывания МкАт70-ПХ. Значение Ка с х,имерным белком 907 для МкАт 1 равнялось (2,0 ± 0,45)х108 М"1, а для МкАт 70- (4,3 ± 0,63)х108 М"'. Высокие значения констант МкАт 1 и 70 также подтвердили, что участок 706-720 аминокислотной последовательности ТПО является основной частью эпитопа для каждого из этих МкАт.

Результаты экспериментов с химерными белками позволяли считать, что оба МкАт - 1 и 70, распознают антигенную детерминанту на участке аминокислотной последовательности ТПО 706-720 а.о. В то же время МкАт 1 взаимодействует и с антигенной детерминантой на участке 606-617. На гипотетической трехмерной модели ТПО эти линейные участки молекулы сближены в пространстве (рис.10). Это позволяет высказать предположение, что участки 606-617 и 706-720 а.о. формируют общую конформационную структуру, распознаваемую МкАт 1. В случае разрушения третичной структуры ТПО сродство МкАт 1 к денатурированной ТПО снижается на порядок, что подтверждается значениями константы образования иммунных комплексов для этого антитела.

Рис. 10. Гипотетическая пространственная структура ТПО (Иарором и МсЬасЫап, 2001).

МкАт 70 взаимодействует только с участком 706-720 а.о. сложного эпитопа МкАт 1. Таким образом, полученные данные позволяют считать, что нам удалось выявить два эпитопа, один из которых (распознаваемый МкАт I) сформирован двумя участками 606-617 и 706-720 а.о. на молекуле ТПО, а другой эпи-тог! (распознаваемый МкАт 70) находится на участке 706-720 а.о. и входит в состав более сложного.

Изучение э пи тонной специфичности аутоантител к ТПО в образцах сыворотки крови больных с различными заболеваниями щитовидной железы

Дальнейшее изучение коллекции моноклональмых антител проводили с использованием образцов сыворотки крови больных с различными заболеваниями щитовидной железы: с аутоиммунным тиреоидитом - АИТ (п=13), с диффузно-токсическим зобом - ДТЗ (п=23) с гипотиреозом - ГТ (п=7) и с узловым зобом - УЗ (п—6). Контрольная группа состояла из 31 образца сыворотки крови практически здоровых людей, не имеющих в анамнезе заболеваний щитовидной железы. Средний уровень антител к ТПО в сыворотке крови пациентов с АИТ составлял 733.8 ± 487,8 МЕ/мл (309,7 МЕ/мл - 2095,2 МЕ/мл); с ДТЗ

- 2530,9 ± 4759,8 МЕ/мл (161,1 МЕ/мл - 21 841 МЕ/мл); с ГТ -601,9 ± 382,8 МЕ/мл (111,8 МЕ/мл - 1120.4 МЕ/мл); с УЗ - 628,7 ± 326,6 МЕ/мл (205,5 МЕ/мл

- 1103,6 МЕ/мл). Содержание Ат ТПО в сыворотках доноров не превышало 38,75 МЕ/мл и составляло 15,5 ± 12,3 МЕ/мл.

Эпитопную направленность аутоантител к ТПО в сыворотках исследовали в различных модификациях конкурентного ИФА. Преимущественное подавление связывания аутоантител с ТПО выявлено для МкАт 3 в 96 % анализируемых сывороток; процент ингибирования составлял (30,8 ± 10,8). МкАт 88 подавляло связывание Ат к ТПО в 86 % образцов сыворотки на (21,7 ± 6,6)

%., МкАт 1 - в 82 % на (18,5 ± 6,4) %, МкАт 70 - в 55 % на (15,2 ± 5,6) %

(рис.! 1).

1'ис, I!. Перекрёстная реактивность аутоантител с МкАт.

Остальные шесть МкАт (2, 55, 76, 77, 79 и 82) мс подавляли связывания аутоантител. В контрольной группе добавление в реакционную смесь МкАт 3, 88, I и 70 не влияло на связывание аутоантител к ТПО с антигеном. Не было выявлено зависимости между уровнем антител к ТПО в сыворотке крови и степенью ингибирования связывания монокл опальными антителами, что согласуется с результатами других авторов (Ruf et al, 2005, Chazenbalk et al., 1993, Gardas et al., 1997),

Все исследованные образцы сыворотки крови больных тормозили связывание пероксидазных копыогатов МкАт 3, !S8, 1, 70 на 50-90 % (рис. 12). Следует подчеркнуть, что степень ингибироваиия была выше для сывороток с высоким уровнем антител к ТПО (>1000 МЕ/мл), по сравнению с образцами со средней (200-500 МЕ/мл) и с низкой концентрацией аутоантител (100-200 МЕ/мл): 70-90 40-60 %; 20-30 %, соответственно. Торможение снижалось с разведением сывороток от 1:10 до 1:100, что особенно было выражено для образцов с меньшим содержанием аутоантител к тиреоидной пероксидазе. В том же диапазоне разведений сыворотки с высоким уровнем антител - 1000-10000 МЕ/мл подавляли связывание МкАт на 30-70 %. МкАт 3, направленное к кон-формационному эпитопу ТПО, в наибольшей степени ингибировало связывание аутоантител с ТПО во всех исследованных образцах сывороток крови. Это позволяет рассматривать комплементарный этим антителам эпитоп, как один из важных, имеющих значение при формировании аутоиммунного

Рис. ¡2. Торможение связывания пероксидазных копыогатов МкАт аутоантителами.

процесса. Полученные результаты совпадают с данными литературы о преимущественной направленности аутоантител при АИЗ ЩЖ к конформацион-ным эпигонам ТПО, При этом ассоциации направленности аутоантител с какой-то определённой нозологической формой патологии выявить не удалось.

Из 49 исследованных проб сыворотки крови больных только три с высоким уровнем Ат к ТПО (первая - от больного с АИТ и две другие - с ДТЗ: 1072,

3600 и 10 ООО МЕ/мл), реагировали с иммобилизованной денатурированной ТПО. Причём реакцию выявляли, начиная с разведения 1:10, тогда как при анализе сывороток крови на планшетах, сенсибилизированных нативной ТПО, образцы разводились в 100 раз. В иммуноблоттинге эти же сыворотки с высоким содержанием Ат к ТПО взаимодействовали с дТПО, в отличие от контроля -сыворотки донора.

На ограниченной коллекции образцов сыворотки крови больных с заболеваниями ЩЖ изучали эпитопную направленность аутоантител в сыворотках с использованием пяти химерных белков §04-807, 907 (рис,13). Химерные белки 804-807 вызывали 30-80 % торможение связывания аутоантител из сыворотки крови больных с ЛИЗ ЩЖ с повышенным содержанием аутоантител к ТПО. При этом ингибирование связывания аутоантител сыворотки крови пациента с субклиническим гипотиреозом (низкое содержание антител) наблюдалось только на 20 %. Это позволяет предположить, что у пациентов с АИЗ ЩЖ присутствуют аутоантитела, направленные к линейной детерминанте (- ам) расположенным в пределах 599-629 а.о. тиреопероксидазы.

I

t 100

I

I т

i -10

Л

а го

г

СП-/ 200 АНТ I 800 АИТ/650 АНТ/7-Ю Диагноз / уровень Ат к ТПО ME 1 нл

■ Сыворотка ■ Л. .1 ЕЗ Сыворотка +S04 " Сыворотка -SOS Я Сыворотка ' >'.'■ □ Сыворотка +S.1"

£ 25

I

г го i

I 15

и

Г

^ S с

X

Í о

Концентрация 907. нкг/мл

Л ДТЗ 10 000 МЕ/нл ■ ДТЗ, 3 500 МЕ/мл [ИГппптпрес.з. 300 MEA-in

КАНТ, 1140 МЕ/мл

□ Узлоьой to6 600 МЕ/нл

□ Норма. 2.06 МЕ/мл_

E3S¿:

30 Ш 5

¡■ ЩИТ .. I- II1 1 » г И"

Ш ДГЗ. 10 ООО МЕ/мл И АНТ, 11-Ю МЕ/нл

■ дгз, з бда ме/мп □ Уадмо» мб, аю ме/ил

ш Гипотраоз, 300 МЕ/мл И Норна, ¿.05 НЕ/нЛ_

В с

Рис. 13. Конкуренция аутоантител к ТПО с нашитой ГПО и химерными белками: А - .х имерными белками 804-807, В • химерным белком 907. С - нативной ТПО

Аналогичные данные представлены в работе (Hobby et al., 2000). При изучении эпитопной направленности аутоантител из сывороток крови больных с АИЗ ЩЖ с 14 рекомбинантными белкам также было установлено, что химерный белок и пептид, содержащие детерминанту ТПО 599-626 а.о., вызывали торможение связывания Ат на 30-40 % в 60-ти процентах исследованных сывороток. Очевидно, что этот участок ТПО может быть вовлечён в патогенез различных аутоиммунных заболеваний щитовидной железы.

Постановка конкурентного ИФА с химерным белком 907, ТПО, СBD на планшете, сенсибилизированном нативной ТПО в концентрации 10 мг/мл по схеме, использованной для исследования химерных белков 804-807, не выявила торможения связывания аутоантител из сывороток крови пациентов с АИЗ ЩЖ. Однако, при сенсибилизации планшета химерным белком 907 в концентрации 10 м кг/мл были выявлены два образца сыворотки крови больных ДТЗ с высоким уровнем Ат к ТПО (3600 МЕ/мл, 10 000 МЕ/мл), которые имели титры 160 и 640, соответственно. При анализе сыворотки крови больных с высоким уровнем Ат к ТПО АИТ и ДТЗ (1072 МЕ/мл; 10 000 МЕ/мл) в иммуноблоттинге с химерным белком 907, также было подтверждено, что в сыворотке крови больного ДТЗ с очень высоким уровнем Ат к ТПО содержатся аутоантитела, направленные к 706-720 а.о. ТПО.

Таким образом, создание коллекции МкАт к ТПО позволило подойти к изучению проблемы гетерогенности специфичности антитиреопероксидазных аутоантител человека, выявляемых при различной тиреопатологии. Был выявлен конформационный иммунодоминантный эпитоп 3, аутоантитела к которому выявлялись в 96 % образцах сыворотки крови больных с ДТЗ и во всех исследованных образцах сыворотки с АИТ. МкАт 3 подавляло связывание аутоантител на (30,8±10,8) %. Торможение связывания пероксидазного коньюгата МкАт 3 аутоантителами из исследованных образцов сыворотки крови больных колебалось от 30 до 85 % и было максимальным из всех изученных перокси-дазных коньюгатов МкАт. Эпитопы, распознаваемые МкАт 1, 70, 88 к линейным антигенным детерминантам, тоже являлись иммунодоминантными, поскольку торможение связывания аутоантител этими МкАт наблюдалось в 55-86 % изученных образцов сыворотки крови больных с АИЗ ЩЖ, однако степень ингибирования связывания аутоантител этими МкАт не превышала (21,7 ± 6,6) %. В тоже время аутоантитела подавляли связывание пероксидаз-ных коньюгатов МкАт 1, 70, 88 на 20-70 %. Использование химерных белков 804-807 и 907, содержащих аминокислотные участки ТПО 599-617, 606-629, 706-720, распознаваемые МкАт 1 и 70, также подтвердило направленность аутоантител к этим антигенным детерминантам.

Следует полагать, что оценка конкурентных взаимодействий с аутоантителами других моноклональных антител, не включённых в проведённое исследование, а также расширение панели сывороток крови больных с различными формами патологии щитовидной железы позволит выявить новые участки в молекуле ТПО, ответственные за формирование аутоантител.

Выводы:

1. Созданная панель из 36 моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные детерминанты пероксидазы щитовидной железы (ТПО), является эффективным инструментом при изучении структуры ТПО.

2. С помощью десяти вариантов МкАт, направленных к линейным и кон-формационным эпитопам, определяется 5 групп антигенных детерминант в молекуле ТПО.

3. Аутоантитела к линейному эпитопу, образованному 606-617 а.о. молекулы ТПО в иммунодоминантной области А, распознаваемому МкАт 1, выявляются в 82 % исследованных образцов сыворотки крови лиц с АИЗ ЩЖ.

4. Линейные эпитопы, расположенные на участках 606-617 а.о. и 706-720 а.о. ТПО, распознаваемые МкАт 1, и 706-720 а.о. - МкАт 70, участвуют в формировании на молекуле ТПО конформационного эпитопа. Это согласуется с трёхмерной моделью тиреопероксидазы, в соответствии с которой эти участки ТПО пространственно сближены.

5. Аутоантитела в сыворотке больных имеют одинаковую направленность с МкАт 1, 70, 88 (к линейным) и 3 (к конформационному) эпитопам. Аутоантитела к эпитопу 3 на 30-60 % ингибируют связывание соответствующих моноклональных антител и выявляются в 96 % образцов сыворотки крови больных с ДТЗ и во всех исследованных - с АИТ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Зубков A.B., Кузнег/ова Г.И., Кириллова Г.А., Свиридов В.В., Буркин М.А. Моноклональные антитела к перок-сидазе щитовидной железы // Российский журнал иммунологии: Материалы докладов объединённого иммунологического форума, г. Екатеринбург, 31 мая - 4 июня 2004 г. - 2004. - Том 9. - Приложение 1 . -С. 63.

2. Кузьмина Н.С., Кириллова Г.А., Кузнецова Г.И., Зубков A.B., Свиридов

B.В., Яковлева И.В., Буркин М.А. Изучение изотопического спектра ау-тоантител к антигенам щитовидной железы в сыворотках больных различными заболеваниями // Российский журнал иммунологии: Материалы докладов объединённого иммунологического форума, г. Екатеринбург, 31 мая - 4 июня 2004 г. - 2004. - Том 9. - Приложение 1 . -

C. 139.

3. Зубков A.B., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Кузьмина Н.С., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Лунин В.Г., Буркин М.А. Изучение эпитопной структуры пероксидазы щитовидной железы человека с помощью моноклональных антител // Медицинская иммунология: Материалы VIII Всероссийского научного форума с международным участием имени

академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», г. Санкт-Петербург, 27-30 сентября 2004 г. - Том 6. - № 3-5. - С. 231.

4. Свиридов В.В., Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Зубков A.B., Буркин М.А., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Гаврилова Н.Ф. Использование моно-клональных антител при изучении патологии щитовидной железы // Материалы докладов третьего Российского конгресса по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем», посвященного 60-летию Российской академии медицинских наук. Москва, 9-12 ноября 2004 г. - С. 107-108.

5. Кузьмина Н.С., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Зубков A.B., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Буркин М.А., Jlema-ров A.B., Лаврова Н.В., Рязанова Е.М. Моноклональные антитела к человеческой пероксидазе щитовидной железы // Биотехнология. — 2005. - № 1. - С. 51 -58.

6. Зубков A.B., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Кузьмина Н.С., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Буркин М.А., Гаврилова Н.Ф., Сергиенко О.В., Лунин В.Г., Летаров A.B., Лаврова Н.В., Рязанова Е.М. Моноклональные антитела в исследовании структуры тиреопероксидазы - ведущего аутоантигена щитовидной железы // Физиология и патология иммунной системы. - 2005. - № 8 (9). - С. 25 - 30.

7. Кузьмина Н.С., Кириллова Г.А., Зубков A.B., Яковлева И.В., Кузнецова Г.И., Свиридов В.В. Перекрёстная активность моноклональных антител и аутоантител человека к пероксидазе щитовидной железы // Медицинская иммунология: Материалы X Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», г. Санкт-Петербург, 2006 г. - Том 8.-№2-3.-С. 228.

Заказ № 134/12/06 Подписано в печать 21.12.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1,5

^Л ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Аутоиммунные заболевании щитовидной железы (АИЗ ЩЖ) являются одной из важнейших и актуальных проблем современной эндокринологии, Не менее 15 миллионов человек, проживающих на территории Российской Федерации, имеют явные или скрытые нарушения со стороны функции щитовидной железы» причём ежегодно увеличивается число людей с АИЗ ЩЖ, по данным Мельниченко Г. А. (16, 17] и Шнлнна Д. П. [24, 25], Главным и причинами роста АИЗ ЩЖ являются дефицит йода во многих регионах страны, недостатки в проведении йодной профилактики, неблагоприятная экологическая ситуация, возникшая в результате техногенных катастроф [4, 6, 17, 18, 21, 270]- Совершенствование лабораторных н инструментальных методов диагностики способствовало увеличению частоты выявления заболевания [4, 16, 25,2701

Основными антигенами ЩЖ, имеющими значение в развитии аутоиммунных расстройств, являются тнреоглобулнн (ТГ), тнреопероксидаза (ТПО) и рецептор тиреотропного гормона (рТТГ) [4,6,18,187,189,270],

ТПО - ключевой фермент в процессе синтеза и высвобождения гормонов щитовидной железы (тироксина и трнйодтнроннна) из молекулы тиреоглобулина, 1'ауа(1а1 е! а]. |96, 97]* Яаророп аЦ228], по своей природе это - глнкошпнрованный трансмембранный гсмомротснн сложной пространственной структуры, с молекулярной массой 107 кДа, расположенный на апикальной мембране тнреодитов. Первоначально, в 1959 г, из ткани щитовидной железы человека была выделена мнкросомальная фракция тнреоцнтов [39). В дальнейших исследованиях было показано, что основным се компонентом является тиреопероксидаза, Сгагпоска ег а). [72], Роптал е1 а1. [221], е[ Вип£а с с а1. [36], которая и рассматривается в настоящее время как ведущий аутоантнген щитовидной железы, РоПо1апо е1 а1. [222], Уо1ре [4, 2701, ЯцГ е1 а1. [240,241, 243], 1-ис1ва1с « а|. [173].

Антитела (Ат) к ТПО выявляются в 90-100 % случаев в сыворотке больных с А ИЗ ЩЖ. Мапчош е! а!.[ 183), Ге1с1(-Ка&ти$5«1 е! а1. [98], \го1ре [4. 270], в 20-35 % с узловым зобом, в 60-70 % с гипотиреозом и при ряде других заболеваний, Шилин Д.Е. [24). Отмечена корреляция между титром антител к ТПО и гистологическими изменениями щитовидной железы при аутоиммунном тирсоидите, Ячи^ е( а1. [144], РазсИке е* а]. [217]. Эти антитела, в отлнчне от Ат к ТГ и рТТГ. способны фиксировать комплемент и, таким образом, участвовать в лизисе тнреопитов [48, 50, 67, 188], При этом антимикросомальные антитела но своей цнтотоксичиости гетерогенны. Только часть обследованных образцов сыворотки крови больных с аутоиммунным тнреоиднтом Хашнмото

ЛИТ) обладала способностью лидировать тнреоциты в присутствии комплемента, Кандрор В.И. [10]. Антитела к ТПО в сыворотке крови больных с А ИЗ ЩЖ направлены к различным участкам фермента. С помощью химерных белков выявлено 3-х кратное превышение количества аутоантктел к фрагменту ТПО, сформированному 513-633 ао., в сыворотке крови пациентов с тиреоиднтом Хашимото, по сравнению с сывороткой бальных ДТЗ, Всгтапп е! а1. [40]. Методом проточной цитофлуорометрин на культур« тнреонитов было показано, что аутоантнтела в образцах сыворотки крови больных с ДТЗ к эпнтопу МкАт 64, КиГ й-а1. [241] выявляются на 45 % чаше, чем у больных с нетоксичным многоухповым зобом, Bos.soi.vski е( а]. [53], Выяснение причин подобной гетерогенности аутоантнтел у больных с различными нарушениями щитовидной железы может уточнить патофизиологические механизмы развития ЛИЗ ЩЖ.

Несмотря на многочисленные усилия в изучении ТПО и её роли в патогенезе АИЗ ЩЖ, остается ряд нерешенных вопросов, в частности, о пространственной структуре ТПО и ее функционировании на внешней поверхности тнреоцита, Мз-Ыка^а е1 а]. [206], СЪяско <Л «[. [62], СЬагспЬЫк « а1. [65], Йаророп е! а1. [228], Оио е( а1. 1127], КиГ е1.а1. [243], требующих для своего решения использования новых нммунохимнческих и молекулярно-бнодогических подходов. Таких как использован не моноклональных антител к ТПО и генно-инженерных пептидов. Ме1 а1. [241], Вапца с( а1. [36), РоПо1апо с1 а). [222]. На основе сравнительного анализа специфичности МкАт и выявляемых в сыворотке с АИЗ ЩЖ аутоантител возможно определение тонкой эпитопной снецнфичноети аутоантител к ТПО при различных формах заболеваний.

Целью исследования являлось изучение эпитопной структуры перокенлазы щитовидной железы с помощью коллекции моноклональных антител н генно-инженерных конструкций.

Для достижения этой цели следовало решить следующие задачи:

1. Выделить из ткани щитовидной железы высокоочищенный препарат тнрсопсроксидазы (ТПО),

2. Подучить панель гибридом-продуиентов моноклональных антител к ТПО; провести клонирование гибридных культур и отобрать технологичные клоны гибридом.

3. Изучить специфичность моноклональных антител к ТПО в ИФА и в иммуноблоттннге.

4. Провести сравнительный анализ зпитопной структуры нат иеной ТПО с помощью панели моноклональных антител и химерных белков, включающих последовательности 599-629 а.о. н 706720 а.о.

5. Исследовать эпнтопную специфичность аутоантител к ТПО в сыворотке крови доноров и пациентов с аутоиммунным и заболеваниями щитовидной железы в конкурентном ИФА с применением моноклональных антител и клонированных фрагментов ТПО.

Научная новизна

Создана панель из Зй моноклональных антител, распознающих линейные и конформационные детерминанты ТПО,

С помошыо химерных белков выявлен новый линейный эпитоп. расположенный на участке 606-617а.о< ТПО в нммунодоминантной области А. распознаваемый МкАт I и аутоантнтелами.

Обосновано предположение о том, что линейные эпитопы, расположенные на участках 606-617 а.о. и 706-720 а.о. ТПО, распознаваемые МкАт Е, и 706-720 а.о. - МкАт 70, участвуют в формировании нового конформэпионЕюго эпнтопа на молекуле ТПО. Это согласуется с трёхмерной моделью тиреопероксидазы, в соответствии с которой эти участки молекулы пространственно сближены,

Эгентопы, выявляемые МкАт № 1, 70, 88 (линейные) и № 3 (конформацнонный), распознаются анти-ТПО аутоантнтелами сыворотки крови больных с АИЗ1ДЖ, Антитела к ко н форм ацнон и ому эпнгопу 3 на 30-60 % ингибируют связывание соответствующих моноклональных антител и выявляются в 96 % образцов сыворотки крови больным с диффузным токсическим зобом и во всех исследованных - при аутоиммунном тнреонднте. Практическая зиачишнггь

1. Полученная панель МкАт к пероксидазс щитовидной железы может быть использована в дальнейших исследованиях с целью выявления эпигонов ТПО, значимых для формирования аутоаптнтел при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы.

2. Моноклональные антитела могут применяться в процессе выделения, очистки и контроля сохранности структуры ТПО.

3. Моноклональные антитела могут быть инструментом для проведения нммуногнето- и цитохимических исследований препаратов щитовидной железы.

Основные положения, выносимые на защиту I Создана коллекция гибридом-продуцентов моноклоналъных антител, распознающих линейные и конформационные эпигоны в молекуле пероксидазы щитовидной железы (ТПО). 2. Линейный элитоп, распознаваемый МкАт 1, расположен в районе 606-617 а.о. в нммуиодомннантной области А молекулы ТПО. МкАт I реагирует и с детерминантой, образованной линейной последовательностью 706-720 а.о. Эти линейные последовательности участвуют в формировании пространственною эпитопа. также распознаваемого МкАт I, Линейный эпнтоп, расположенный на участке 706-720 а.о. ТПО, распознается МкАт 70. 3. МкАт 3 (к конформационному) н 1, 70, 88 - к линейным эпнтопам, выявляют в молекуле ТПО детерминанты, распознаваемые аутоантктелами человека при различных АИЗ ЩЖ,

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ВЫВОДЫ:

1. Созданная панель нз 36 монсжлональньгх антител, распознающих линейные и конформаиионные дегермшшггы пероксидазы щитовидной железы (ТПО), является эффективным инструментом при изучении структуры ТПО.

2. С помощью десяти вариантов МкАт, направленных к линейным и конформационным эпнтопамт определяется 5 групп антигенных детерминант а молекуле ТПО.

3. Аутоантитела к линейному зпитопу, образованному 606-617 а.о. молекулы ТПО в нммунодоминантной области А, распознаваемому МкАт 1, выявляются в 82 % исследованных образцов сыворотки крови лмцеАИЗЩЖ.

4. Линейные эпитопы, расположенные на участках 606-617 а.о, и 706-720 а,о. ТПО, распознаваемые МкАт 1, н 706-720 а.о. - МкАт 70, участвуют в формировании на молекуле ТПО конфирмационного эиитонв. Это согласуется с трёхмерной моделью тнреомерокендазы. в соответствии с которой эти участки ТПО пространственно сближены.

5. Аутоантитела в сы воротке больн ых имеют од и наковую направленность с МкАт к I, 70, 88 (линейным) н 3 - конформационному эпктопвм, Аутоантитела к ЭПКТОЛу 3 на 30-60 % ннгибнруют связывание соответствующих моноклонольных антител и выявляются в 96 % образцов сыворотки крови больных с ДТЗ и во всех исследованных - с АИТ

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение эпнтопной структуры пероксидазы щитовидной железы невозможно без использования основного инструмента - моноклональ-ных антител, направленных к различным участкам молекулы ТПО. Для создания коллекции МкАт было необходимо на первом этане выделить высокоочишенный препарат тнреопероксидазы.

В результате проведенных экспериментов был получен высоко-очищенный препарат пероксидазы щитовидной железы, что достигалось применением метода аффинной хромато]-рафни на колонке с иммобилизован ными моноклональнымн антителами к ТПО. По своим характеристикам [чистоте (>95 %). иммунологическим свойствам и ферментативной активности (60 ± 15 ед.акт./мг)] ТПО не уступала об-раздам, полученным другими авторами Таиго® с[ а[. (256], Сгагпоска с! а]. [72]. Выделенную тиреоперокендазу использовали для иммунизации мышей с целью создания коллекции гибридом-ггродуцентов моноклопальных антител.

Были отобраны 36 культур-продуцентов МкАт к ТПО, пять из которых взаимодействовали с натнвноЙ н денатурированной формами пероксидазы щитовидной железы. Гибридомы характеризовались высокой продукцией антител: титры Ат в супернатантах среды культивирования составляли 104 - 105, в асцитах - 10*- 10?. Все изученные МкАт к ТПО относились к нзотнпу 1§0|. Детально исследовались 30 МкАт, из которых пять реагировали с конформационными участками

183

ТПО (2, 3,55, 77, 79) н пять - с линейными (1,70,76, 77. 79). МкАт 55 характеризовалось максимальным значением константы комплексо-образования для нативного фермента (К» = 0,65x10'1 М"1), а МкАт 70 -для денатурированного (К4 - 2,27x10Ч М"1). Величины констант ком-плексообразования для пяти МкАт, реагирующих с денатурированной ТПО, варьировали в диапазоне 0,96x10я М'1 - 2,27x1 О* М'1. Значение К» МкАт 1 с нТПО на порядок выше, чем с дТПО, 1,64x109 М"1 и 0,94x10я М"\ соответственно. Средние значения К* МкАт 82 с нТПО и дТПО были близкими -2,1x10'М'1 и 1,6х10*М"'. Для МкАт 70 и 88 Ка с дТПО была выше (2.27x10* М"1 и 2,18x10Ч М"1), по сравнению нТПО (1,67х 10* М1 и 0,39х iO4 М"1), что подтверждало предположение о специфичности антител к линейным участкам молекулы ТПО, которые после денатурации формируют более прочный комплекс с моноклинальными антителами. Константа комплексообразовання для МкАт 76 с нативной ТПО была на два порядка ниже, чем с денатурированной: 4,4х107 М"1 и 1,89x10* М"1. Антигенная детерминанта МкАт 76, по-видимому, образована элементами первичной н вторичной структуры ТПО, которые доступны для антитела при строго определенной конформацин. При денатурации ТПО происходило изменение структуры, приводящее к образованию более стабильного комплекса с МкАт 76.

По данным конкурентного ИФА, десять моноклональных антител взаимодействовали с пятью нммуногенными участками тиреопероксндазы; доменом 1, в состав которого входили эпнтопы трвх МкАт - 1, 70, 88; доменом 2-2, 82; доменом 3 - 55» 77, 79; доменом 4-3; и доменом 5 - 76, Два антитела, которые входили в состав домена I (1 и 70), были направлены к одной клн к двум близко расположенным антигенным детерминантам на молекуле ТПО, Для изучения тонкой эпнтопной специфичности антител были использованы 5 химерных белков 804-807 и 907, содержащих аминокислотные последовательности, соответствующие трём участкам ТПО: 599 - 617 а.о„ 606 - 629 а. о. н 706 - 720 а,о. Эта участки входят в состав двух иммунодоми-нантньгх областей ТПО; последовательности 599 - 617 а,о, и 606 - 629 а.о, принадлежат области А, 706 - 720 а.о. - области В, и играют важную роль при формировании гуморального ответа у больных с ЛИЗ ЩЖ [40{, В конкурентном ИФА было установлено, что четыре химерных белка: 804-807 тормозили связывание только МкАт I на 40-50 %, Учитывая, что аминокислотные последовательности химерных белков 804 - 807 были перекрывающимися (599 - 617 и 606 - 629 а.о,), можно предположить, что МкАт 1 взаимодействует с общим участком 606-617 а.о. Химерный белок 907 (706 - 720 ао, ТПО) инги-бпровал активность МкАт 70 на 90 %. а также МкАт 1 на 73 Применение нТПО в той же концентрации вызывало полное ингнбирова-нне связывания МкАт в тех же условиях. Результаты ИФА были подтверждены методом иммуноблоттингз- Значения констант комплексе-образования с химерным белком 907 (706-720 а.о.) для МкАт 1 и 70

185 были высокими и составляли (2,0 ± 0,45)х1 0* М1, (4,3 ± 0,63)х10я М'. соответственно, Можно заключить, что МкАт 1 и 70 имеют общую линейную антигенную детерминанту на участке аминокислотной последовательности ТПО 706-720 а,о. Однако, МкАт J взаимодействует также с антигенной детерминантой на участке 606-617 а-о. Таким образом, нам удалось выявить два новых эпигона, одни из которых, распознаваемый МкАт I, сформирован двумя линейными участками 606-617а.о. и 706-720 а,о, на молекуле ТПО, а другой эпитоп, определяемый МкАт 70, одним участком 706-720 а,о, В случае разрушения третичной структуры ТПО связывание МкАт I с линейными детерминантами снижается на порядок, что подтверждается значениями константы комплексообразовання этого антитела, В существующей трехмерной модели ТПО линейные детерминанты 606-617 а.о. и 706-720 а,о. сближены в пространстве. На основании этого и собственных материалов выдвинута гипотеза о том. что участки аминокислотой последовательности ТПО 606-617 а.о. и 706-720 а.о, формируют общий информационный зпитоп, распознаваемый МкАт ].

Полученная коллекция гибридом не первая, но одна из наиболее представительных. Кроме того, каждое МкАт обладает уникальными свойствами, Панель МкАт к ТПО, предложенная Ruf et al. [24 lj включала 13 гибридом, Portmann et al., [22E) - 6, Banga el al,, [36] - 5, Cha?enbalk et al. [64| - 4, Цыганова и соавт. [23] (Белоруссия)- 3- В литературе описаны три МкАт к ТПО 47, 20.10, А4, которые взаимо

186 действовали с линейными детермнкантами ТПО, соответствующими 713-717 а,о., 215-225 а.о., 549-563 аю. на молекуле ТПО [36,54,55, 56, 170, 221]. Можно предположить, что полученные в нашей работе МкАт 70, по своей специфичности идентичны МкАт 47.

Создание коллекции МкЛт к ТПО позволило подойти к изучению проблемы гетерогенности эпигонов антнтнреопероксидазных аутоантнтел человека, выявляемых при различной тирсопатологии.

При изучении эпитопной специфичности аутоантнтел больных с различными заболеваниями ЩЖ; АИТ (п=13), ДТЗ (п=23), УЗ (п=6), ГТ (п=7) - ннтибируюшая активность была выявлена только у четырех МкАт: 1,3,70 и 88, Остальные шесть МкАт не ннгнбировалн связывание аутоантнтел с ТПО. Был обнаружен нммунодоминантиый зпнтоп, распознаваемый конформапионным МкАт 3, выявляемый в 96 % образцах сыворотки крови больных с ДТЗ и во всех исследованных образцах сыворотки с АИТ, Степень нпгибирования связывания аутоантнтел МкАт 3 составляла (30.8 ± 10,8) %. Торможение связывания МкАт 3-ПХ аутоантнтеламн из исследованных образцов сывороток крови больных варьировало от 30 до 85 % и было максимальным для всех изученных перокендазных коныогатов МкАт.

Эти результаты свидетельствовали о специфичности аутоантнтел к определенным участкам молекулы ТПО и согласовывались с данными литературы о преимущественной направленности аутоантнтел к конформапионным зиитопам молекулы ТПО. РоПо!агю ет а1.

187

1222], Сгагпоска et al. 173], Velpe [4], McLachlan and Rapopon [189]. Однако нами было показано, что линейные эпитопы, распознаваемые МкАт t и 70, а также линейный эпитоп, определяемый МкАт 88, тоже являлись нммунодоминантнымн и встречались в 55 - 86 % изученных образцов сыворотки крови больных. Степень ингибнровання связывания аутоантнтел для этих МкАт не превышала (21,7 ± 6,6) %, Торможение связывания перокендазных конъюгатов МкАт 1, 70, 88 аутоантитсламн из исследованных образцов сывороток крови больных варьировало от 20 до 70 %. Использование химерных белков 804-807 н 907, содержащих аминокислотные участки ТЛ0 599 - 617а.о„ 606 -629 а.о., 706 - 720 а.о., распознаваемые МкАт 1 и 70, также подтвердила направленность аутоантнтел из образцов сывороток крови больных к этим антигенным детерминантам.

Проведенные эксперименты показали, что методы с использованием МкАт и химерных белков могут успешно использоваться для изучения зпнтолной структуры ТПО, Можно предположить, что дальней шее изучение конкурентных взаимодействий с аутоангнтелами других моноклональных антител, не включенных в проведенное исследование, а также расширение панели сывороток крови больных с различными формами патологии щитовидной железы, позволит выявить новые иммунодомннантиые участки на молекуле ТПО, ответственные за формирование аутоантнтел при различных заболеваниях и будет способствовать улучшению диагностики, контроля за состоянием функции щитовидной железы и проводимым лечением.