Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Изменения ультраструктуры эритроцитов при H2O2- и Ca2+-индуцированном старении in vitro и влияние продуктов деструкции плазмалеммы на эритропоэз

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

ИЗМЕНЕНИЯ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ Н202- И Са2+- ИНДУЦИРОВАННОМ СТАРЕНИИ IN VITRO И ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ ДЕСТРУКЦИИ ПЛАЗМАЛЕММЫ НА ЭРИТР0П0ЭЗ

14.00.23.-гистология,цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

НИКИТИНА ГАЛИНА МИХАЙЛОВНА

УДК 612.111:616.155:577.153

Москва - 1994

Работа выполнена в НИИ морфологии человека РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук В.И. Сороковой

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Н.А.Юрина доктор медицинских наук, профессор Н.А.Горбунова

Ведущее учреждение - Московский Государственный медицинский университет им.Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится 23 июня 1994 г. в 12- час. на заседании Специализированного совета Д 001.04.01. при НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418. г.Москва. ул.Цюрупы. Д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН.

Автореферат разослан " " сЦ-^с-гХ 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

И.Н.ЕМЕЛЬЯНЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Эритроциты крови являются одной из наиболее интенсивно обновляющихся клеточных популяций организма. Количество эритроцитов в периферической крови определяется соотношением скоростей двух процессов:кроветворения и разрушения клеток.Согласно общепризнанной точке зрения на регуляцию эритропоэза причины, вызывающие гипоксию почек и печени.приводят к выработке в этих органах эритропоэти-на(Федоров H.A.. 1976, DevereuxS., Llnch D., 1990). К настоящему времени в результате интенсивных исследований открыто и изучено более двух десятков цитокинов - гликопротеи-дов, регулирующих активность гемопоэза (Завьялов В. П..1993, Herrmann F.. Mertelsmann R.,1989),многие из которых участвуют в регуляции эритропоэза.

Помимо гипоксии,фактором стимуляции эритропоэза являются и некоторые неидентифицированные продукты распада мембраны эритроцита.которые образуются в процессе естественного старения эритроцитов In vivo. In vitro или деструкции при замораживании - размораживании " теней" эритроцитов (Ашкинази И.Я.,1979, Ужанский Я.Г..1968, Ужанский Я.Г. и др.. 1977).

За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в изучении процесса старения эритроцитов In vivo. In vitro.Показано,что морфологическим проявлением . старения эритроцитов чаще всего является многоступенчатая трансформация дискоцитов в эхиноциты и реже - в стоматоциты (Мара-чев А. Г. др., 1986, Медведев П. А. .1973, Bessls M. ,1970). Причинами такой трансформации являются в первую очередь изменения в цитоскелете и плазмалемме эритроцитов (Branton D. et al., 1981, Cohen С.M. ,1983). Существенную роль в процессе старения эритроцитов играет активация ионами кальция катаболизма фосфолипидов плазмалеммы (Моченова H. Н. 1991. Allan D.Thomas Р. .1981, Ferren J.E., Huestls W.U..1984,

БЬойей Б.В..1980). Менее понятным представляется вопрос о роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в инициации и модификации процесса старения эритроцитов.хотя процессы ПОЛ представляют важную сторону катаболизма липидов.

Очевидно,что старение эритроцитов приводит к образованию ограниченного числа продуктов деградации.Среди них наиболее интересным представляются микровезикулы, образующиеся при эхиноцитарной трансформации эритроцитов в присутствии ионов кальция, метаболическом истощении и т. д. (СгееиаИ ТЛ.. ВгисЫ).,1. .1984.1988, ттшММ.С.е! а1., 1977, пегС.М,et а1.,1986). Эта микровезикулы могли бы быть теми продуктами деструкции эритроцитов.которые вызывают стимуляцию эритропоэза.

В целом же взаимосвязь между процессами активации разных видов катаболизма липидов.трансформации эритроцитов и микровезикуляции их плазмалеммы является еще далеко не ясной, так же как и функциональная роль микровезикул.

Эти моменты предопределили направление нашего исследования.

Практическая сторона исследования заключается в том. что эти результаты могут способствовать расширению арсенала способов стимуляции кроветворения в норме и патологии, в частности при кровопотерях.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось определение закономерностей формирования морфологических изменений■эритроцитов в процессе старения и изучение влияния продуктов деструкции плазмалеммы на эритропоэз в норме и при кровопотере.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения ультраструктуры с помощью сканирующей электронной микроскопии и некоторые особенности метаболизма липидов эритроцитов человека при активации пере-

кисного окисления с помощью перекиси водорода и ферментативного кальциевого липолиза.

2. Разработать методы изолирования конечных продуктов деструкции плазмалеммы эритроцитов у кроликов.

3. Изучить влияние конечных продуктов деструкции плазмалеммы эритроцитов на эритропоэз у кроликов в норме.при анемии вследствие кровопотери и кровопотери на фоне беременности.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведенная работа является частью комплексных исследований проблемной комиссии "Морфогенез клетки, тканей и организма '' 07.02, Научного совета по морфологии человека и выполнялась в рамках темы РАМН N госрегистрации 01890084578.

Установлено,что процесс старения эритроцитов человека In vitro,индуцируемый активацией перекисного окисления ли-пидов, сопровождается полиморфными изменениями эритроцитов: набуханием дискоцитов, образованием стоматоцитов, эхиноци-тов,микровезикуляцией плазмалеммы и их гемолизом.Старение эритроцитов человека In vitro .индуцируемое одновременной активацией ПОЛ и кальциевого липолиза, приводит преимущественно к эхиноцитарной трансформации , микровезикуляции плазмалеммы и гемолизу. .

Аутогенные микровезикулы (АМВ) из плазмалеммы эритроцитов кролика, полученные разными способами (при старении in vitro с солями кальция.перекисью водорода или путем ультразвуковой обработки), стимулируют эритропоэз у кроликов в норме.

Выявлено,что аутогенные микровезикулы, полученные методом ультразвуковой обработки, способны эффективно стимулировать эритропоэз на фоне массивной (20%) кровопотери при беременности у крольчих.сохраняя нормальное развитие плаценты и плодов.

Эти положения выносятся на защиту.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на итоговых сессиях Института морфологии человека РАМН (Москва,1986-1993Г.) На 4 Всесоюзном съезде патофизиологов (Москва, 1989), на 2 Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии"(Самарканд, 1991), на 5 Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва,1993), на 7 Всероссийском симпозиуме "Эколо-го-физиологические проблемы адаптации"(Москва, 1994).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 17 публикациях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав,заключения,выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на страницах машинописного текста и включает Я.. таблиц, Н%. рисунков. Список литературы содержит IS.Q названий.из них - G.Q отечественных и Q.Q. иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили эритроциты крови человека и кроликов.Использовали стабилизированную гепарином (50 ЕД/мл) кровь 44 практически здоровых людей, 21 кролика-сам-цов весом 1,5-2.0 кг и 24 крольчих, весом 3-4 кг.

Для получения суспензии эритроцитов применяли общепринятую методику центрифугирования гепаринизированной крови при 3 тыс-g в течение 10 мин.с последующей трехкратной отмывкой эритроцитов при тех же условиях центрифугирования в йзотоничном фосфатном (ФБ) буфере,включающем в себя 145 мМ NaCl,7 мМ фосфатов натрия,рН=7,4. Объем полученной эритровз-веси доводили этим же буфером до первоначального объема крови, а непосредственно перед опытом разводили до необходимого гематокрита.

В опытах по исследованию процессов старения эритроцитов In vitro использовали разведенную суспензию эритроцитов

с Ht-5%. В некоторых случаях в среде инкубации создавали анаэробные условия путем введения в среду 10 мМ глюкозы и 25 ME/мл глюкозооксидазы. Н202 вводили в конечной концентрации 10 мМ к суспензии эритроцитов, прединкубированных с азидом натрия (1мМ). В других случаях добавляли СаС12 (2мМ)., кальцимицин, т. е. А23187 (5мМ).ЭДТА (2мМ).

По ходу опыта забирали пробы для сканирующей электронной микроскопии для определения степени гемолиза, содержания свободных жирных кислот (СЖК) и малонового диальдегида (МДА). Степень гемолиза рассчитывали как отношение показателей оптической плотности при 540 нм супернатанта, полученного после 10 мин. центрифугирования при 3 rac.g суспензии эритроцитов в опыте, к величине оптической плотности полного осмотического гемолиза.

Содержание СЖК определяли по методу Anderson- М.М. et al.,1972 в нашей модификации (Никитина Г.М. и др., 1984),МДА - по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Стальная И. Д. и др.,1977).

Содержание общего гемоглобина определяли стандартным методом набором реактивов "Реахим", показатель гематокрита -с использованием гематокритной центрифуги МГЦ-8, количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали с помощью камеры Го-ряева.

Выделение микровезикул (MB) из плазмалеммы эритроцитов

кроликов после старения при активации ионами Са^-.

Н?07 и ультразвуковой обработки.

Суспензию эритроцитов в фосфатном буфере с гематокри-том 20% инкубировали при 37° С в течение 4 часов в присутствии либо 2,5 мМ Ca(N03 )2. либо 2,3 мМ Н202 и 0,67 мМ NaN3.

Для ультразвуковой деструкции 20% суспензию эритроцитов подвергали облучению на дезинтеграторе "Dunatech Sonig Dlcmembrator" при 60% мощности дважды с 3 и 10 мин. охлаждением на льду. Для осаждения неразрушенных эритроцитов, об-

работанных разными способами,суспензию центрифугировали при .2 тыс^ х 10 мин. Далее супернатант центрифугировали при 30 тыс. в х 10 мин.для выделения МВ. Осадки ресуспендировали и дополнительно центрифугировали при 2 тыс^ х 10 мин..затем супернатанты вновь центрифугировали при 30 тыс.я х 10 мин. Получившиеся осадки МВ еще раз отмывали в том же режиме.

Осадок МВ. полученных УЗ-обработкой (УЗ-МВ), ресуспендировали в объеме,равном исходному объему крови. Осадки МВ,полученные другими способами,нормировали по светорассеянию суспензии УЗ-МВ (объем суспензии этих МВ составлял 20-25% от исходного объема крови).Суспензию МВ во всех случаях активации дополнительно пропускали через фильтры Шс1еорог с диаметром пор 0.6 мкм .упаковывая в пластиковые пробирки по 1.0 мл и храня их в течение 3-7 дней в морозильной камере. Размороженные МВ вводили кроликам в/венно из расчета 1,0 мл на кг веса.Масса плазмалеммы,содержащейся в 1 мл суспензии вводимой опытным животным, составляла - 155 от суммарной массы плазмалеммы всех кроличьих эритроцитов.

В ходе эксперимента соблюдались условия стерилизации: пробирки и инструментарий обрабатывали этанолом, а фосфатный буфер стерилизовали кипячением в течение 20 мин.

В эксперименте по изучению действия АМВ на беременных крольчихах при анемии проводили по несколько измененному способу при тех же условиях стерилизации. После УЗ - обработки осадок центрифугировали при 6 тыс^ х 5 мин. для удаления крупных обломков клеток или агрегатов. Супернатант центрифугировали.при 20 тыс^.х 10 мин..фракцию МВ отмывали еще дважды при тех же оборотах и времени. Осадок ресуспендировали ФБ в объеме, составляющим половину объема исходной крови. Взвсь МВ фасовали в пластиковые стерильные пробирки и хранили при температуре -10-15° С. Перед введением суспензию размораживали при комнатной температуре и вводили в ушную вену животного из расчета 0,4 мл взвеси АМВ на один

кг веса.

. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) эритроцитов.

■. Трижды отмытую в изотоничном ФБ гепаринизированную кровь обрабатывали по методу Hattorl А.' (1972). Эритроциты, фиксированные в 2.5% глютаральдегиде при t + 4° С в течение 1-4- суток, дважды отмывали дистиллированной водой и дегидратировали этиловым спиртом, проводя по возрастающей концентрации. Затем наносили эритроциты на покровные стекла. высушивали на воздухе и напыляли золотом на установке "Rllco" (Япония). Просматривали образцы на сканирующем электронном микроскопе "Hitachi S-500" (Япония).Для оценки морфологического статуса эритроцитов использовали наиболее широко применяемую классификацию по Bessls M.et al., 1983. ,Ма-рачев А. Г. ,1986.

Результаты экспериментов подвергались статистической обработке с применением критерия Сгьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения ультрзструктуру и гидролиз липидов плазмалеммы при Н?0, и Са2* - индуцированном старении эритроцитов человека In vitro .

Началом процесса старения эритроцитов In vivo по мне-' нию большинства исследователей являются такие феномены, как деэнергизация эритроцитов и увеличение в цитозоле концентрации ионов кальция.Это приводит к перестройке" цитоскелета и активации ферментативного катаболизма липидов плазмалеммы эритроцитов и их трансформации в эхиноциты с потерей мембранного материала путем микровезикуляции (Моченова Н.Н.. 1991. Allan D. .Thomas P.. 1981).

Очевидно,что возникновению этих феноменов in vivo предшествует целый ряд физиологических или патологических изменений з метаболизме самого эритроцита и плазмы крови. 3 самом эритроците происходит "естественное изнашивание" фер-

ментов.например.гликолитического цикла, системы антиокси-дантной защиты .Внешних.не факторов (по отношении к эритро-щтам). т. е.имеющихся: в . плазме крови, существует "гораздо большее . количество.Среди них можно, 'выделить '■ переписное окисление липидов.Несмотря на наличие многокомпонентной системы антиокислительной защиты в организме.процессы ПОЛ мембран имеют место в, норме.не говоря уже о патологии (Бур-• . лакова Е.Б..-' Храпова Н.Г.. 1985. Владимиров Е.А..Арчаков А.К. 1972, ).Активация перекисного окисления липидов плазмы и плазмалеммы эритроцитов может приводить к инициации и (или) модификации процесса старения и последующей элимина- ' ции этих клеток из кровеносного русла.

В данном разделе работы была поставлена задача изучить изменения ультраструктуры и некоторые особенности метабо-' лизма липидов эритроцитов человека и животных при активации только перекисного окисления липидов In vitro в солевой среде или в сочетании с Са2* - активацией ферментативного липолиза. -

В эту серию входили три основные группы опытов. В первой группе эритроциты человека инкубировались в изотоничной солезой среде с перекисью водорода (без добавления кальция)

Однако, такая постановка опытов является идеализированной, поскольку в реальных условиях в • составе окружающей эритроциты среды обязательно присутствуют катионы кальция. Поэтому во 2й группе эксперимента добавление перекиси водорода проводилось при наличии в инкубационной среде 2мМ СаС12.а в третьей группе - дополнительно и кальцимицина (А23187),который является трансмембранным переносчиком ионов кальция. Такие условия эксперимента способствуют активации. кроме ПОЛ, также кальций-зависимых фосфолипаз эритроцита.

Во всех трех вариантах опытов наблюдается накопление МЛА (от 0.1-0.6 до 2.0-4.5 нмоль / 100мг НЬ за 120

мин.),что свидетельствует об активации перекисного окисления липидов и гемолиза эритроцитов (до 15-65% за 120 мин.) Несколько неожиданным явилось уменьшение уровня СЖК (от 5-8 до 1,5-2,5 нмоль/100 мг НЬ) даже во второй и третьей группе опытов, поскольку уровень СЖК должен был бы возрастать при активации фосфолипаз.Этот факт, однако, можно объяснить тем обстоятельством, что ненасыщенные свободные жирные кислоты переокисляются гораздо быстрее,чем образуются вследствие ферментативного липолиза.Действительно, в дополнительной серии опытов было показано, что при создании анаэробных условий и наличии ионов кальция в суспензии эритроцитов уровень свободных жирных кислот возрастает (от 6,1±1,0 до Э,8±1,45 нмоль / 100 мг НЬ за 120 мин.).

Изменения ультраструктуры эритроцитов в зависимости от условий инкубации были неодинаковыми. Морфологические изменения эритроцитов в присутствии перекиси водорода были полиморфными. Во всех опытах этой серии наблюдалась трансформация эритроцитов как по стоматоцитарному, так и по эхиноци-тарному пути.причем значительная часть популяции эритроцитов сохраняла форму дискоцита с различной степенью набухания. При этом от опыта к опыту выраженность различных видов трансформации эритроцитов была очень вариабельной.как к степень гемолиза. Так.к 15 мин. инкубации с перекисью водорода в разных опытах от 30 до 70 % популяции эритроцитов было представлено дискоцитами, 5 - 15 % - эхиноцитами I,II порядка и 10 - 30 % - стоматоцитами 1.П порядка ,а выход гемоглобина наблюдается у 5-10 % эритроцитоз. К 60 - 120 мин. инкубации количество дискоцитов с разной степенью набухания составляет 30 - 60 % . эхиноцитов и стоматоцитов по 10 - '40 %. а количество гемолизирующихся клеток достигает 10 - 25 " ; наряду с этим обнаруживаются и тени эритроцитов. При этих сроках инкубации значительная часть ( 10 - 20 % ) эхиноцитов и стоматоцитов представлены III и IV поряд-

ками.

К другим наблюдаемым феноменам относится микровезику-ляция .приводящая к потере мембранного материала. При этом отшнуровывание мембранного материала у эхиноцитов III, IV порядка происходит с вершин конусовидных спикул , а у сто-матоцитов III , IV порядка и набухших дискоцитов - с поверхности плазмалеммы. Отшнуровавшиеся микровезикулы (ИВ), как правило,имеют размер 0,05 - 0,3 мкм, однако, у стомат'оци-тов и дискоцитов могут отшнуровываться и более крупные везикулы.

Наблюдаемый в ходе опытов гемолиз эритроцитов связан с выходом гемоглобина через дефекты плазмалеммы ( в одном и реже 2-3 местах). По мере выхода гемоглобина наблюдается потеря формы эритроцита .сморщивание поверхности плазмалеммы ,а конечными продуктами гемолиза являются плоские тени эритроцитов с дефектами мембраны размером 0.2 - 0,5 мкм, и которые образуются .очевидно.на последних стадиях процесса, после выхода гемоглобина.

Во второй и третьей группах опытов,где .кроме перекиси водорода.з среде присутствовал кальций (без или вместе с калыммицином). наблюдалась иная картина. Подавляющее большинство клеток претерпевало эхиноцитарную трансформацию. Через 15 мин. опыта 50 - 80 % популяции эритроцитов представлены эхиноцитами I - II порядка . 10 - 20 % - дискоцита-ми и до 10 % - стоматоцитами I - II порядка. Через 60 - 120 мин. инкубации эти соотношения сохраняются.но большая часть (~ полозина эхиноцитов и стоматоцитов) является эхиноцитами и стоматоцитами III - IV порядка. Аналогичные изменения отмечались ранее в опытах Моченовой H.H., 1991, Allan D..Michail R..1975., Whltte J. .1974, где эритроциты инкубировались в присутствии ионов кальция и калышмицина, но без перекиси водорода. В отличии от опытов этих авторов в нашем эксперименте эхнноцитоз был не абсолютным и даже при 60 -

120 мин. инкубации некоторая часть популяции эритроцитов представлена дискоцитами.стоматоцитами. что можно отнести.за счет эффекта перекиси водорода. Нам кажется возможным считать, что перекись водорода способна ингибировать и модифицировать перестройку подмембранного цитоскелета ( и соответственно трансформации эритроцита) за счет образования сшивок спектрин - гемоглобин (Shyder L.М. et al.. 1985)."

К другим феноменам К202 + Са2+ - индуцируемого старения относятся микровезикулы размером 0. 05 - 0.3 мкш. отшну-ровавшиеся с вершин конусовидных спикул ЗХЦ III - IV порядка и гемолиз. Гемолизированные клетки после выхода гемоглобина также превращаются з тени с дефектами ялазмалеммы. Некоторые различия между второй и третьей группами опытов заключаются з том, что в отсутствии калышишша зхиноцитоз развивается медленнее. Вероятно,что эта задержка объясняется более медленным поступлением кальция з цитсзоль клетки ;: определяется зременем необходимым для нарушения барьерной функции плазмалеммы и деэнерглзации эритроцита .

Результаты этих опытов позволяют сказать.что з условиях присутствия ионов кальция процесс старения эритроцитов протекает зсегда по эхиноцитарному пути. Перекись водорода всегда модифицирует этот процесс по данным СЗМ довольно заметно, но не драматическим образом.

Общей закономерностью в этих всех группах опытов является то, что конечные продукты старения эритроцитов одинаковы: микровезикулы.сфероциты.тени и свободный гемоглобин.

Изучение механизма стимуляции эоитпопоэза микоозезику-лами из плазмалеммы эритроцитов з норме и при анемии у беременных крольчих.

3 предыдущем разделе работы было показано.что одним иг конечных продуктов деградации эритроцитов з ходе старения являются мпкровезикулы. Представлялось вероятным, что зт::

микровезикулы могут быть начальным звеном в системе регуляции эритропоэза. Аналогичные микровезикулы по данным других авторов получаются при различных видах воздействия на эритроциты .приводящие к их старению и разрушению. Эти МВ представляются реальными претендентами на роль стимуляторов эритропоэза продуктами собственного распада эритроцитов, которые предполагались в опытах Ужанского Я.Г.(1977). с использованием 3-кратного замораживания - оттаивания "теней" эритроцитов для получения стимулирующих эритропоэз' продуктов распада. В связи с этим возникла необходимость получить ответ на вопрос : являются ли МВ,полученные разными способами в наших опытах, стимулятором эритропоэза. Было проведено изучение изменений гематологических показателей в ответ на однократное внутривенное введение МВ из плазмалеммы аутогенных эритроцитов, полученных путем обработки кальцием, перекисью водорода и ультразвуком.

Масса аутогенных микровезикул (АМВ),вводимых животным равнялась массе плазмалеммы -1 % эритроцитов циркулирующей крови. После введения АМВ в течение 5 дней опыта определяли общее количество ретикулоцитов.эритроцитов и лейкоцитов,количество гемоглобина,величину гематокрита и скорость эритропоэза. Контролем были кролики, которым вводился стерильный физиологический раствор (тот же объем). Было выявлено.что независимо от способа получения.АМВ стимулируют эритропоэз. При этом другие гематологические показатели:. количество лейкоцитов,гематокрит и гемоглобин практически не изменялись. Первые двое суток после введения АМВ отмечаются увеличением количества ретикулоцитов на 30 - 50 % и скорости эритропоэза примерно в два разаГ На 3 - 4 сутки эти показатели снижаются до нормы. Таким образом, эти данные свидетельствуют о том.что введение АМВ вызывает кратковременную, до трех суток, стимуляцию эритропоэза.

Методическим выводом этих опытов явилась целесообраз-

ность использования микровезикул, полученных с помощью ..ультразвукового дезинтегратора.:

/Следующая.серия опытов позволила выявить "действие мюс-ровезикул . на эритропоэз у крольчих в норме, при кровопотерё и кровопотере на фоне беременности. У- небеременных крольчих 20 %-ное кровопускание сопровождается "резким падением в течение последующих двух дней концентрации эритроцитов и гемоглобина .сменяясь быстрым подъемом на 3 - 4 день с постепенным выходом до исходных значений на 8-ой день .

' У беременных же крольчих такая кровопотеря сопровождается только снижением на 30 - 40 % концентрации эритроцитов и гемоглобина в течение двух последних дней ; имеется только тенденция к возрастанию этих показателей на третий день

после кровопускания (24 день беременности).

/

В группе беременных крольчих, которым после кровопускания трижды зводили через 2-3 суток внутривенно АМВ. снижение концентрации, эритроцитов и гемоглобина ■ наблюдается только в первые сутки, а затем наблюдается устойчивое возрастание этих показателей с достижением почти исходных значений к 8-ому дню опыта (23 день беременности). При исследовании ультраструктуры эритроцитов крольчих с помощью СЭМ на 4-й день после кровопускания. ' как у небеременных. так и беременных в более выраженной степени было обнаружено увеличение количества эхиноцитов разного порядка, что свидетельствует об ускорении процессов старения эритроцитов, как и в опытах Горбуновой Н.А.и др. (1985,1991). Таким образом, проведенные опыты свидетельствуют, что АМВ на фоне кро-вопотери оказывают значительное стимулирующее влияние на резервный эритропоэз.Параллельно проведенные исследования по изучению морфофункциональных параметров плаценты и плода показали наличие выраженного положительного эффекта АМВ в этих экспериментах. Если кровопотеря у крольчих без лечения сопровождается резким уменьшением веса плацент и плодов, то

в группе крольчих, которым вводили АМВ. эти показатели замет но ближе к нормальным. • ■ • "

Концентрация свободных жирных кислот в плазме кроЕ крольчих до и после кровопотери остается постоянной , одна* после введения АМВ снижается с 9,0 ± 0,5 до 7.0 ± 0.4 нмо; СЯК / мг белка.что может свидетельствовать об интенсификг ции анаболизма фосфолипидов. Отмечается интересная динами* •изменения скорости Н202 - индуцированного гемолиза. Исхо/ ный уровень - 12,3 ± 0,9 55 .через двое суток после кровопс тери - 3.3 ± 0,5« , через 5 суток - 4,3 1 0,8 2 .а в груш-животных, которым вводили АМВ,этот показатель был через дзс суток равным уже - 5.4 ± 0.9 %. через 5 суток - 8,2 ± 0.6 3 _1..е. . имел явную тенденцию к возрастанию до исходного уоое ня. Эти критерии, по-видимому, можно будет при соответств; щей доработке использовать с прогностической целью.

Для выяснения судьбы МВ в организме было изучено рас ределение меченных 131 I микровезикул по органам кролш после внутривенного введения. Показано, что наибольшее I коплеаие метки имеет место через 4-6 мин. в проекции пече (более 60%) и селезенки (6%), которые, очевидно, и являю: органами-мишенями для МВ.

Полученные в работе экспериментальные факты в совокуг ности с данными литературы по смежным вопросам поззоляк считать, что конечные продукты деструкции плазмалеммы - ми? ровезикулы - являются первичным звеном в передаче информг ции по стимуляции резервного эритропоэза. Можно предполг гать, что стимуляция эритропоэза включает в себя этапь захват МВ макрофагами печени и селезенки - передача сто лирующей информации в строму костного мозга - активация ре зервного эритропоэза.

Очевидно.что полученные результаты можно использован для разработки и внедрения в практику метода стимулящ

эритропоэза. Представляется интересным использовать МВ также для целенаправленной доставки лекарств в органы-мишени.

ВЫВОДЫ

1.Эритроциты человека в процессе их старения In vitro, индуцированного активацией перекисного окисления липидов, претерпевают полиморфные деструктивные изменения: нор-моциты трансформируются в набухшие дискоциты, стоматоци-ты, эхиноциты и подвергаются гемолизу. В процессе этой трансформации происходит образование из плазмалеммы эритроцитов микровезикул размером около 0,05-0.3 мкм.

2.При старении эритроцитов человека in vitro, вследствие одновременной активации ферментативного (кальциевого) липолиза и переокисления липидов наблюдается преимущественно эхиноцитарная трансформация с образованием таких же микровезикул и гемолиз.

3. Микровезикулы из плазмалеммы эритроцитов кроликов, полученные при деструкции их в процессе старения in vitro, индуцированного ионами кальция, перекисью водорода или при ультразвуковой обработке, оказывают стимулирующее влияние на эритропоэз при нормальном кроветворении.

4. Аутогенные микровезикулы, полученные методом ультразвуковой обработки, обладают способностью эффективно стимулировать эритропоэз на фоне массивной (20 % ) кровопо-тери у беременных крольчих.

5.С помощью сцинтиграфического метода показано,что органами-мишенями для R - меченных аутогенных микровезикул являются печень и селезенка.

6. Результаты исследования свидетельствуют о том.что микровезикулы из плазмалеммы эритроцитов могут быть применены в разработке метода стимуляции кроветворения и целенаправленной доставки лекарственных веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Применение колометрического метода с использованием родамина 6Ж для ' определения содержания свободных жирных кислот в биологических мембранах. -Билл, экспер. биол. и медицины. 1984. -.9, с. 374-375.

2. Особенности обмена ненасыщенных жирных кислот фосфо-липидов плазмалеммы эритроцитов человека в условиях Севера. -Гематология и трансфузиология, 1987, ю, с.24-28 (соавт. Ма-рачев А. Г.. Сороковой В. И., Моченова Н. Н.. Лифатова Е. С.. Корнев A.B.).

3. Изучение морфологических признаков Н202 - индуцированного гемолиза эритроцитов человека с помощью сканирующей микроскопии. Сб. Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии. 1987, с.64.

4. Катаболизм липидов плазмалеммы эритроцитов в норме и патологии. 4 Всесоюзн.конференция по патологии клетки. 1987, с.28 (соавт.Моченова H.H.).

5. Стимуляция эритропоэза у кроликов с помощью аутогенных микровезикул из плазмалеммы эритроцитов. Сб. Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии, 1987, с. 65 ' (соавт.Марачев А.Г..Сороковой В.И., Ботвинникова Е.П.. Моченова H.H..Казаньев В. В;-.'Лифатова Е. С.).

'6. Изучение гемолиза эритроцитов человека, индуцированного ионами кальция в присутствии ионофора А23187. Сб.Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии, 1988, с.11 (соавт. Моченова Н. Н.Лапинский А. Г.. Сороковой В. И.).

7. Сравнительное изучение некоторых видов гемолиза. Сб. Материалы по актуальным вопросам современной гистопатологии, 1988, с. 10. (соавт.Моченова H.H. .Лысенко В.П., Марачев А.Г. .Потапенко А.Я. .Сороковой В.И.).

8.(Ca + A23187) - индуцированный гемолиз человека и крыс в норме и при панкреатите. Сб. Актуальные вопросы современной гистопатологии, 1988, с. 34 (соавт.Моченова H.H.. Матвеев Н.Л.,Сороковой В.И.)

9.Адаптационные особенности обмена жирных кислот человека и животйых при действии холода. Сб. Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Тез.докл.4. Всесоюзн. сьезд патофизиологов. 1989, т. 3, с. 1269 (соавт. Сороковой В.И.. Марачев А. Г. .Моченова Н. Н. .Корнев A.B.).

10. Исследование механизмов стимуляции эритропоэза микровезикулами из плазмалеммы эритроцитов. Сб.Актуальные вопросы современной гистопатологии. 1989, с.62-63 (соавт.Сороковой В.И..Моченова H.H. .Казаньев В.В.,Ботвинникова Е. П., ДягтеренкоВ. В.. Матвеев В. А.. Брускин А. П.).

11.Накопление свободных жирных кислот, гемолиз и изменения ультраструктуры эритроцитов в присутствии ионов кальция и калимицина ин витро. Сб.Актуальные вопросы современной гистопатологии. 1990,с.67-71. (соавт. Сороковой В. И..Моченова H.H.)

12.Стимуляция эритропоэза аутогенными микровезикулами. Тез.докл.3 Всесоюз.сьезд гематологов и трансфузиологов. 1990. т.2,с.355-356 (соавт.Сороковой В.И. .Ботвинникова Е.П. .Моченова H.H.,Дегтяренко В.В. .Матвеев В. А. .Брускин А.П.).

13.Изучение Ca2* - зависимой трансформации эритроцитов ин витро.как модели их старения. Сб. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии. 2 Всесоюз.симп. 1990, с. 141. (соавт. Сороковой В. И.. Моченова H.H.).

14.Изучение перекисного и (Ca + калимицин) индуцируемого гемолиза эритроцитов с помощью сканирующей электронной микроскопии. Тез.докл.3 Всесоюзн. сьезд гематологов и трансфузиологов. 1991, т. 2, с. 351-352. (соавт. Моченова Н. Н.).

15.Роль плазмалеммы в процессах старения, элиминации и

воспроизводства эритроцитов. Тез.докл. 5 Всероссийская конференция по патологии клетки, 1993, с. 15 (соавт.Сороковой В. И., Моченова H.H.).

16.Изменения ультраструктуры эритроцитов при каль-ций-активируемом старении ин витро. - Бюлл. экспер.биол.и медицины.1994. 5. с.555-560 (соавт.Сороковой В.И.. Моченова H.H.).

17.Стимуляция эритропоэза микровезикулами из плазмэлеммы эритроцитов. Тез.докл. 7 Всеросс. симп. "Эколого-физиологи-ческие проблемы адаптации". 1994. с.263. (соавт.Сороковой В.И. Моченова H.H.).