Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование влияния направленного транспорта антибактериальных препаратов на морфофункциональное состояние легких и эффективность лечения экспериментальной пневмонии

На правах рукописи

Левина Татьяна Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НАПРАВЛЕННОГО

ТРАНСПОРТА АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛЕГКИХ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 6 МАЙ 2013

Москва 2013

005058860

005058860

Работа выполнена на кафедре общей хирургии и анестезиологии им. профессора Н.И. Атясова ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва» и кафедре ЮНЕСКО «Здоровый образ жизни - залог успешного развития» ГБОУ ВПО МГМСУ им А.И. Евдокимова Минздрава России

Научные руководители: доктор медицинских наук,

Официальные оппоненты:

КИНЗИРСКИЙ Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженньїй деятель науки РФ, заведующий лабораторией фармакологии ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» РАН

БЕЛОУСОВ Юрий Борисович, доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАМН, заведующий кафедрой клинической фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ-им. Н.И.Пирогова Минздрава России

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, г. Москва

Защита состоится «*/ 2013 года в « » часов на заседании дис-

сертационного совета Д 208.041.01 при ГБОУ ВПО МГМСУ им А.И. Евдокимова Минздрава России (127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20, стр.1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО МГМСУ им А.И. Евдокимова Минздрава России (127006, г. Москва, ул. Вучетича, 10а).

профессор Пятаев Николай Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Гуревич Константин Георгиевич

2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.Г.Лобанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Проблема рациональной терапии пневмонии не теряет актуальности многие годы из-за широкой распространенности и высокой летальности, которая у пожилых пациентов и при тяжелом течении достигает 20% (Чучалин А.Г. и соавт., 2010; Ноников В.Е., 2010; Фесенко О.В., Сино-пальников А.И., 2011). Основным компонентом лечения пневмоний по материалам согласительных рекомендаций Европейского респираторного общества и Европейского общества клинической микробиологии и инфекционных заболеваний (2011) является антибактериальная терапия (АБТ). Широкое применение антибиотиков наряду с положительными аспектами создало ряд проблем, среди которых ведущими являются большое распространение антибиотикоре-зистентных форм микроорганизмов и расширение спектра побочных (в т.ч. токсических) эффектов (Козлов P.C. и соавт., 2010; Синопальников А.И., 20102012; Lim W.S. et al., 2009; Hess G. et al., 2010). Все это делает актуальным поиск путей повышения эффективности АБТ пневмонии.

Существенное значение в достижении адекватной концентрации лекарственных средств в очаге инфекции имеют способы их доставки (Яковлев C.B., 2006; Зильбер Э.К., 2009; Белобородое В.Б., 2012; Allewelt M. et. al., 2004; Yu V.L., Chang F.Y., 2006). При тяжелой пневмонии применяются внутримышечный и внутривенный пути введения; введение АБП в легочную артерию не привело к значимому повышению эффекта. При использовании внутрилегочного электрофореза (Шойхет Я.Н. и соает., 2002), эн-добронхиапьного (Чернеховская Н.Е., 2008) и эндолимфатического путей введения (Кабанов С.Н., 2003) получены обнадеживающие результаты, однако эти методы применяются в основном при лечении гнойно-деструктивных осложнений пневмонии.

Одним из путей решения данной проблемы является направленный транспорт (HT) антибактериальных препаратов (АБП). Этот метод позволяет обеспечить максимальную концентрацию препарата в органе-мишени без значительного повышения его концентрации в других органах и тканях (Петров Р.В. и соавт., 2003; Северин Е.С. и соавт., 2005). В настоящее время предложено несколько методик HT, эффективных при пневмонии (Швецов ДА., 1996; Лохвицкий C.B., 1996; Пятаев H.A. и соавт., 2005,2007; Гуревич К.Г. и соавт., 2008).

Одним из нерешенных клинико-фармакологических вопросов, связанных с НТ, является разработка и патофизиологическое обоснование оптимального количества клеток-носителей для обеспечения эффективного транспорта АБП при лечении пневмонии. Т.П. Генинг (1988-1998), И.Г. Левин (1998) и У. НиЬпег а а1. (2005) для направленной доставки препарата в легочную ткань используют аутоэритроци-ты, которые при НТ секвестрируются в капиллярах малого круга, обеспечивая повышение концентрации препарата в легких. Однако секвестрация форменных элементов может оказывать неблагоприятное влияние на орган дыхания, что может поставить под сомнение безопасность метода НТ АБП. Изложенные обстоятельства, требующие уточнения, послужили основанием для данного исследования.

Цель работы. Изучение влияния направленного транспорта некоторых антибактериальных препаратов на морфофункциональное состояние легких и оценка эффективности различных модификаций методики у животных с экспериментальной пневмонией.

Основные задачи:

1. Установить оптимальные параметры инкубации для максимальной нагрузки эритроцитов антибиотиками при проведении направленного транспорта.

2. Изучить особенности системной и локальной фармакокинетики эритромицина при использовании различных модификаций методики его направленного транспорта у интактных кроликов и при экспериментальной пневмонии.

3. Исследовать изменения морфофункционального состояния легких (транскапиллярного обмена жидкости, газообменной функции, гистологической структуры) у интактных животных при проведении направленного транспорта эритромицина и цефотаксима с помощью различных объемов клеток-контейнеров.

4. Проанализировать эффективность различных модификаций метода направленного транспорта эритромицина в дозе 10 мг/кг у кроликов с экспериментальной пневмонией.

Научная новизна:

1. Изучены особенности аккумуляции антибактериальных препаратов различных групп форменными элементами крови животных. Показано, что для препаратов, не проникающих во внутриклеточное пространство, эффективность

сорбции повышается с увеличением гематокрита среды инкубации и достигает максимума при значении Ш=75-80%.

2. Показано, что типичными особенностями фармакокинетики эритромицина при введении в ассоциации с аутоэритроцитами являются увеличение его концентрации в легочной ткани в 5-6 раз на фоне снижения плазменной концентрации в 2-4 раза, при этом увеличение количества клеток-носителей свыше 10,5 • 109 клеток/кг не приводит к повышению эффективности транспорта.

3. Исследовано влияние направленного транспорта антибиотиков на функциональное состояние легких. Установлено, что использование большого количества (32,7 • 109 клеток/кг) экстракорпорально модифицированных ауто-эритроцитов оказывает негативное влияние на функциональное состояние легких (увеличивает количество интерстициальной жидкости, ухудшает газообменную и метаболическую функции).

4. Установлено, что при экспериментальной пневмонии направленный транспорт эритромицина (10 мг/кг) с помощью аутоэритроцитов в малых количествах (10,5 • 10 клеток/кг) является более эффективным по сравнению с использованием прототипной методики (с помощью аутоэритроцитов в количестве (32,7 • 109 клеток/кг) и внутривенным введением препарата на изотоническом растворе хлорида натрия. Это подтверждается увеличением частоты эрадикации возбудителя и снижением летальности экспериментальных животных.

Практическая значимость:

1. Установление зависимости экстракорпорального насыщения эритроцитов от типа взаимодействия антибактериальных препаратов с мембраной клетки-носителя позволило сформировать оптимальные технологические параметры для проведения направленного транспорта антибиотиков.

2. Идентичность системной и локальной фармакокинетики при доставке эквивалентных доз эритромицина (10 мг/кг) в интактную легочную ткань и в очаг воспаления при использовании прототипной и модифицированной методик направленного транспорта предоставляет возможность для снижения объемной массы аутоэритроцитов в 3 раза, что значительно расширяет возможности использования модифицированной технологии.

3. Более полноценная эрадикация возбудителя, отсутствие негативных морфофункциональных проявлений со стороны органа дыхания и снижение летальности при лечении экспериментальной пневмонии эритромицином (10 мг/кг) с использованием модифицированной методики направленного транспорта по сравнению с прототипной методикой и внутривенными введениями эритромицина в дозах 10 и 30 мг/кг позволяют считать данную технологию методом выбора.

4. Разработан способ экспериментального исследования общего, клеточного и интерстициального объемов жидкостных секторов в легких.

Положения, выносимые на защиту:

1. Эффективность экстракорпорального насыщения аутоэритроцитов антибиотиками зависит от типа их взаимодействия с мембраной клетки. Для препаратов, проникающих во внутриклеточное пространство эритроцитов, максимум насыщения достигается при использовании клеточной взвеси с максимально возможным гематокритом. Для препаратов, сорбирующихся на поверхности клеток, эффективность насыщения максимальна при обработке клеток растворами антибиотиков с максимально возможной концентрацией препарата.

2. Введение интактным кроликам эритромицина в дозе 10 мг/кг по методике направленного транспорта с помощью эритроцитов сопровождается увеличением концентрации препарата в ткани легкого и снижением его концентрации в крови. В исрледованном количественном диапазоне клеток-носителей изменения фармакокинетики данных препаратов идентичны.

3. Использование для направленного транспорта антибиотиков высоких объемных доз аутоэритроцитов приводит к развитию вторичной легочной дисфункции в виде нарушения жидкостного баланса, оксигенирующей функции легких и морфологическим изменениям легочной ткани.

4. Антимикробный и противововоспалительный эффекты эритромицина при экспериментальной пневмонии наиболее выражены при направленном транспорте с использованием аутоэритроцитов в количестве 10,5 • 109 клеток/кг по сравнению с другими изучаемыми технологиями. Это подтверждается результатами бактериологического исследования, динамикой показателей синдрома системного воспалительного ответа, оксигенирующей функции легких и выживаемости животных.

Внедрение в практику. Результаты проведенных исследований внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс Медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва», а также в практику ГБУЗ РМ «Республиканская клиническая больница № 3» и ГБУЗ РМ «Республиканская клиническая больница № 4». По теме диссертации внедрено рационализаторское предложение.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийском съезде анестезиологов и реаниматологов (СПб, 2006); на международной научной конференции «Актуальные проблемы современных наук: теория и практика» (Днепропетровск, 2006); на Всероссийской научной конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); на VI республиканской научно-практической конференции «Наука и инновации в Республике Мордовия» (Саранск, 2007); на XIII научной конференции молодых ученых Мордовского университета (Саранск, 2008); на научной конференции «Огаревские чтения» (Саранск, 2009); на XVI межгородской конференции молодых ученых СПбГМУ «Актуальные проблемы патофизиологии» (СПб, 2010); на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы хирургии, травматологии и интенсивной терапии» (Саранск, 2011); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2012).

Часть научно-исследовательской работы выполнена в рамках Аналитической ведомственной целевой программы Минобрнауки Российской Федерации «Развитие научного потенциала высшей школы», тема 2.1.1/3918.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах текста компьютерного набора, содержит 14 таблиц и 17 рисунков. Работа состоит из введения, шести глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка, включающего 122 отечественных и 91 иностранных источника. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом научных

исследований ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва» «Направленный транспорт химиопрепаратов с помощью корпускулярных носителей и молекулярных нано-векторов». Номер госрегистрации 01200907218.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Выполнение работы включало несколько этапов. Первым этапом были опыты in vitro, затем были выполнены исследования фармакокинетики и тканевого распределения эритромицина у интактных животных и животных с моделью пневмонии. Завершающим этапом работы стало исследование влияния направленного транспорта антибиотиков на морфофункциональное состояние легких и изучение эффективности НТ эритромицина в эксперименте на животных с пневмонией.

Материал и методология исследования приведены в таблице 1.

Таблица 1

Этап Материал Методология

1. Исследование особенностей экстракорпорального взаимодействия АБП с форменными элементами крови. Кровь интактных кроликов породы шиншилла Расчет степени насыщения эритроцитов антибиотиками, определение оптимальной дозы клеток-носителей для НТ АБП

2. Исследование фармакокинетики и органного распределения эритромицина при введении по методике НТ. Кролики породы шиншилла (интакт-ные (18) и с моделью пневмонии (36). Определение концентрации эритромицина в крови и гомогенатах органов методом ВЭЖХ и УФ-спектрометрии.

3. Изучение морфофунк-циональных изменений в легких при НТ АБП (цефо-таксим 100 мг/кг и эритромицин 10 мг/кг). Кролики породы шиншилла интакт-ные (30). Исследование оксигенирующей функции, жидкостного обмена и морфологии легких.

4. Исследование эффективности НТ эритромицина при экспериментальной пневмонии. Кролики породы шиншилла с моделью пневмонии (60). Исследование функционально-биохимических показателей, бактериологическое исследование.

Особенности экстракорпорального взаимодействия АБП с эритроцитами оценивали с помощью определения их концентрации в пробах после инкубации с клетками. Концентрацию АБП определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (хроматограф Милихром-5, ЗАО «Научприбор», г. Орел) и спектрофотометрии в УФ-области (СФ-46, АО «JIOMO», СПб). Спек-трофотометрию использовали при исследовании концентраций АБП в стендовых опытах с клетками крови in vitro, ВЭЖХ - в крови и гомогенатах органов в экспериментах in vivo. Фармакокинетические параметры определяли по формулам расчета показателей кинетики препаратов (Соловьев В.Н. и соавт., 1988).

Фармакокинетические исследования, изучение морфофункциональных изменений в легких и эффективности НТ эритромицина выполнены на 144 половозрелых кроликах породы «шиншилла» массой от 2700 до 3600 г. Все манипуляции, причиняющие животным боль, проводили с соблюдением Международных рекомендаций Европейской Конвенции по защите прав животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Для анестезии применяли 2,5% раствор тиопентала натрия в дозе 25 мг/кг. Протокол экспериментального исследования утвержден локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Методика проведения НТ АБП. Из краевой вены уха забирали кровь в объеме 2 мл/кг, стабилизировали 3,8%-ным раствором глюгицира, затем центрифугировали 15 мин при 1000 об./мин. Объем вводимой клеточной массы составлял: при использовании модифицированной методики - 1 мл/кг, количество клеток- 10,5 > 109 клеток/кг; при использовании прототипной методики -3 мл/кг, количество клеток - 32,7 • 109 клеток/кг. В клеточную массу добавляли эритромицин в расчетной дозе, инкубировали 30 мин при 37 °С, после чего реинфузировали в другую ушную вену.

Моделирование пневмонии проводили по методике A.M. Кулика и соавт. (1986). Интратрахеалыю однократно вводили 1 мл взвеси культуры метициллин-чувствительного Staph, aureus, выделенного из бронхо-альвеолярной жидкости больных пневмонией. Инокуляцию суспензии S. aureus суточной культуры микроорганизмов проводили в дозе 1,0 • 106 м.т./мл, (2xLD50). Чувствительность S. aureus к эритромицину определяли на анализаторе «Sensititre ARIS 2Х».

Исследования показателей ра02; раС02; pH; BE; Sat О2; Qs/Qt выполняли на аппарате Easy Blood Gas (Израиль) до введения АБП и через 24 часа после введения. Концентрацию лактата определяли биохимическим методом по реакции с па-раоксидифенилом (Меньшиков В.В. и соавт., 1988).

Уровень интерлейкина-6 определяли методом иммуноферментного анализа на ИФА-спектрометре «ЭФОС-93», Россия, в соответствии с методическими рекомендациями фирмы-производителя набора реактивов. Определение серото-нина в крови производили флюориметрическим методом на флюориметре «Флюо-рат-02-АБЛФ-Т» (ОАО «Биоаналитика», СПб).

Исследование объемов жидкостных секторов в легких проводили по оригинальной методике (рацпредложение № 1059 от 5.05.2008 г.).

Общий анализ крови выполняли по стандартной методике; капиллярную кровь забирали путем скарификации края уха кролика; венозную и артериальную — пункцией бедренных сосудов. Для морфологического исследования забирали по 2 кусочка ткани из каждого легкого, гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Посев мазка из пневмонических очагов проводили на молочно-желточный солевой агар. Идентификацию микроорганизмов проводили на бак-анализаторе «Sensititre ARIS 2Х» (Trek Diagnostic Systems Ltd., США).

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП "Современные оптические системы" НЦКЭМ СО РАМН и ЦКП "Постгеномные и ме-таболомные методы исследования в молекулярной биологии" НТЦ БиоКлини-кум в рамках ГК 16.522.11.7057.

Для исследования статистической значимости различий между показателями использованы методы параметрического и непараметрического анализа. Вычисляли среднее значение показателя (М), стандартное отклонение (о) и ошибку среднего (ш). Затем проверяли нормальность распределения признака. При нормальном распределении значений для оценки достоверности различий между массивами использовали критерий t Стьюдента. Если гипотеза о нормальном распределении не подтверждалась, использовали критерий W Вилкок-сона. Для сравнения качественных признаков применяли критерий хи-квадрат.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы изучены особенности аккумуляции АБП антибактериальных препаратов эритроцитами in vitro. Для оценки предполагаемой эффективности направленного транспорта было введено понятие «эффективная транспортируемая доза (ЭТД)» - отношение дозы, связанной с клетками, к дозе, введенной в среду инкубации. Был произведен расчет ЭТД для различных классов антибиотиков в зависимости от коэффициента распределения клетка/внеклеточное пространство и гематокрита среды инкубации. Установлено, что для антибактериальных препаратов групп аминогликозидов, фторхинолонов и линкозамидов, эффективная транспортируемая доза прямо пропорциональна гематокриту среды инкубации, при этом объем клеток-носителей должен составлять 4-10 • 109/кг, а объем растворенного препарата в среде инкубации с клетками должен быть в 7 - 8 раз меньше объема клеточной массы. При использовании для HT бета-лактамных антибиотиков для эффективного насыщения эритроцитов-носителей необходимо добавление в среду инкубации диметилсульфоксида (ДМСО). На основании проведенных расчетов была модифицирована методика направленного транспорта АБП с помощью аутологичных эритроцитов. Отличительной особенностью предложенной методики является подбор оптимальной дозы клеток-носителей для каждого конкретного препарата, основанный на особенностях его взаимодействия с клеточной мембраной. Вариант методики для HT эритромицина (ЭМ) приведен в разделе «материалы и методы исследования».

На втором этапе работы исследовали системную кинетику и тканевое распределение эритромицина. Системная кинетика изучена на 18 интактных кроликах, которые были разделены на 3 равные группы. В 1-й группе (контроль) АБП вводили внутривенно; во 2-й группе - по методике HT в модификации C.B. Лохвицкого и в 3-й - по модифицированной методике. Доза эритромицина во всех группах составляла 10 мг/кг. Фармакокинетическая кривая, полученная при внутривенном введении ЭМ, хорошо аппроксимировалась одночастевой моделью (R2 = 0,998): С = 11,6 е где время в минутах.

При введении эритромицина по методике НТ как во второй, так и в 3-й группах его пиковая концентрация заметно (на 40 — 60%) снижалась; кроме того, значимо уменьшалась скорость выведения препарата. Зависимость концентрации препарата от времени лучше описывалась двухчастевой моделью: С =

А 1 I „ -0.009591 , 1 -0.0018X1__-> , -0,009521 , т -0.001751 ..

4,21 е + 2,63 е во 2-й и С = 4,47 е + 2,92 е в 3-й группе.

Близость значения констант элиминации ЭМ во 2-й и 3-й группах позволяет заключить, что при уменьшении объема клеток-носителей с 32,7 • 109/ кг до 10,5 • 109/л, сохраняются главные фармакокинетические эффекты метода: уменьшение пиковой концентрации вводимого препарата и увеличение времени его выведения из плазмы.

Для изучения тканевого распределения эритромицина было сформировано 3 группы животных с моделью пневмонии - контрольная и 2 опытных, по 12 особей в каждой. В контрольной группе эритромицин в дозе 10 мг/кг вводили внутривенно; в 1-й опытной группе - по прототипной методике НТ и во 2-й опытной - по модифицированной методике. В каждой из групп исследование распределения проводили через 30 мин и 3 часа (у 6 животных для каждого из этапов). Концентрацию ЭМ определяли в плазме крови и ткани внутренних органов (легкие, печень, селезенка, поперечно-полосатая мускулатура и жировая ткань), причем в легких исследовали интактную и воспалительно-измененную ткань. Для каждого исследованного органа/ткани рассчитывали концентрационное отношение ткань/плазма.

В контрольной группе через 30 мин после инфузии отмечали равномерное распределение эритромицина в плазме и в исследованных тканях, а через 3 часа регистрировали незначительное преобладание тканевых концентраций над плазменной. В воспалительном очаге легкого концентрация эритромицина была ниже на 12,5% по сравнению с интактной легочной тканью.

При введении ЭМ по методике направленного транспорта (прототипный вариант) характер распределения препарата существенным образом изменялся. Прежде всего, обращало на себя внимание увеличение содержания препарата в легочной ткани, а также в ткани селезенки и печени. Концентрации антибиоти-

ка в этих органах были в 4-6 раз больше по сравнению с аналогичными показателями группы внутривенного введения. В других исследованных органах содержание антибиотика было ниже, чем в группе внутривенного введения, в среднем в 1,5-2 раза. Нами не было установлено различий в содержании антибиотика между воспалительно-измененной и здоровой легочной тканью. Этот факт свидетельствует о том, что основную роль в изменении фармакокинетики АБП при их направленном транспорте играет не хемотаксическая миграция лейкоцитов в очаг воспаления, а секвестрация нагруженных препаратом эритроцитов в сосудах микроциркуляции.

Тканевое распределение эритромицина при его введении по модифицированной методике (2-я опытная группа) напоминало таковое в 1-й опытной группе. Через 30 мин после окончания инфузии плазменная концентрация эритромицина была более чем в 2 раза меньше аналогичного показателя контрольной группы. В интактной легочной ткани концентрация антибиотика была на 11% ниже, чем в 1-й опытной группе (р > 0,05), но значимо (более чем в 4 раза, р < 0,01) превышала аналогичный показатель группы контроля. Как и методика C.B. Лохвицкого, модифицированная методика не обеспечивала избирательного накопления АБП в воспалительно-измененной ткани: во 2-й опытной группе не регистрировали достоверных различий между концентрациями препарата в интактной легочной ткани и пневмоническом фокусе. Как и в 1-й опытной группе, отмечалось накопление эритромицина в органах естественного эритродиереза (печени и селезенке).

После трехчасовой экспозиции в обеих опытных группах отмечали снижение плазменной и тканевых концентраций антибиотика, однако отношения концентраций «ткань/плазма» для большинства органов оставались неизменными.

Для изучения влияния HT АБП на состояние легких нами выполнены эксперименты на 30 кроликах, которые были разделены на 3 равные группы. В контрольной группе животным вводили цефотаксим 100 мг/кг и эритромицин 10 мг/кг внутривенно; в 1-й опытной - по прототипной методике HT (доза клеток-

носителем 32,7 • 109/кг), во 2-й - по модифицированной методике (доза клеток-носителей 10,5 • 109/кг).

При оценке жидкостного обмена в легких установлено следующее. На фоне НТ АБП в 1-й опытной группе отмечалось увеличение общего объема жидкости в легких (ООЖЛ) на 11,5 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,01), в основном за счет объема интерстициальной жидкости легких (ОИЖЛ), уровень которой возрастал на 52,7% (р < 0,001) (рис. 1).

Контроль

1 группа

И ООЖЛ

т ¡ЭОИЖЛ □ ОКЖЛ т

±

.-"¿"-У-!'

2 группа

Рис 1. Изменение водных секторов легочной ткани при НТ с использованием различных доз клеток-носителей, мл/г. (* - р<0,01 по отношению к показателю группы контроля).

Интерстициальный отек в 1-й группе сопровождался снижением комп-лайнса на 33,3% (р < 0,05) и уменьшением воздушности легочной ткани на 20,6 % (р < 0,05) по сравнению с группой контроля. Данные изменения, на наш взгляд, ухудшают состояние микроциркуляторного русла легкого за счет сдавле-ния капилляров интерстициальной жидкостью, а также нарушают функцию аль-веолоцитов вследствие их компрессии.

Во 2-й группе достоверных различий изучаемых показателей по отношению к контрольной группе не было. Объем клеточной жидкости в легких (ОКЖЛ) оставался на уровне контрольной группы (р > 0,05). Отмечено недостоверное увеличение ОИЖЛ на 19,9%. Отклонение комплайнса было недостоверным и составляло не более 15% от аналогичных значений в контрольной группе.

При оценке оксигенирующей функции легких было выявлено, что в контроль-

ной группе она не изменялась; в 1-й опытной группе наблюдали увеличение ЧД на 24,7%, снижение р02 на 18% (р < 0,05) и увеличение легочного шунтирования в 3 раза (р < 0,01). Увеличение ЧД сопровождалось незначительным снижением рС02, которое не влияло на уровень рН и ВЕ. Концентрация лактата достоверно не изменялась. Во 2-й опытной группе животных параметры газообмена не отличались от показателей контрольной группы.

Наряду с оценкой функциональных изменений было произведено исследование морфологических изменений в легких у животных сравниваемых групп. В 1-й опытной группе при микроскопии у 5 из 10 кроликов гистологическая картина не отличалась от нормы. У двух животных легкие были полнокровными, с субплевральными геморрагиями; здесь же наблюдали изменения, соответствующие I стадии ОРДС: интерстициальный отек легких, полнокровие капилляров с явлениями стаза эритроцитов, внутриальвеолярное скопление эритроцитов и фибрина. Кроме того, зафиксированы полиморфноклеточная лейкоцитарная инфильтрация межальвеолярных перегородок, круглоклеточные лимфоцитарные перибронхиальные инфильтраты. В 3 наблюдениях встретились полнокровие венул и участки дистелектазов, чередующихся с участками эмфизематозно расширенных альвеол.

При сравнительном макро- и микроскопическом исследовании легких животных 2-й опытной группы не было выявлено каких-либо патологических изменений.

Таким образом, проведение НТ АБП с помощью аутоэритроцитов в количестве 32,7 • 109 клеток/кг провоцирует развитие интерстициального отека и нарушения диффузионной способности легких, которые проявляются гипоксемией и увеличением внутрилегочного шунтирования. Выявленные изменения подтверждаются морфологически и соответствуют проявлениям острого респираторного дистресс-синдрома, патогенез которого сходен с патогенезом синдрома острого повреждения легких, наблюдаемого при массивных гемотрансфузиях.

Для оценки эффективности НТ АБП при пневмонии проведены эксперименты на 60 кроликах с моделью этой патологии. В 1-й (контрольной) группе кролики

лечения не получали, во 2-й вводился эритромицин 10 мг/кг внутривенно (в 2 приема) ежедневно с 3-го дня после моделирования пневмонии в течение 12 дней; в 3-ей группе - эритромицин в дозе 30 мг/кг внутривенно по той же схеме; в 4-й группе эритромицин (10 мг/кг) вводили по модифицированной методике НТ и в 5-й группе - по прототипной методике. Проводили оценку общего состояния животных, окси-генирующей и метаболической функций легких. Последнюю оценивали по веноар-териальным градиентам биологически активных веществ, образующихся или инак-тивирующихся в легких.

Выраженные клинико-лабораторные признаки пневмонии у животных во всех группах зафиксированы уже на 2-е сутки. Отмечались вялость, одышка, лихорадка. При лабораторном обследовании регистрировались лейкоцитоз с папоч-коядерным сдвигом, гипоксемия, увеличение концентрации лактата и интерлей-кина-6, снижение вено-артериального градиента серотонина.

На 7-е сутки зафиксирована дифференциация показателей между группами. В контрольной группе сохранялись гипертермия и одышка, увеличился лейкоцитоз. Развитие пневмонии приводило к выраженным вентиляционно-перфузионным расстройствам, нарушению детоксицирующей функции легких, снижению оксигенации тканей и декомпенсированному лактат-ацидозу. На данном этапе умерли 9 из 12, а к 10-м суткам - все животные.

Во всех опытных группах антибиотикотерапия была в определенной мере эффективна. При этом наибольшая эффективность терапии регистрировалась в группах животных, получавших ЭМ в дозе 30 мг/кг внутривенно (3 группа) и 10 мг/кг по модифицированной методике направленного транспорта (4 группа). В этих группах у выживших животных регистрировалось более раннее снижение ЧД, уменьшение лейкоцитоза и СОЭ, улучшение показателей оксигенации, купирование лактат-ацидоза, нормализация веноартериальных градиентов серотонина и интерлейкина-б.

Во 2-й и 5-й группах эффективность лечения была несколько меньшей. У выживших животных на 7-14-е сутки сохранялось тахипноэ, повышение количества лейкоцитов и уровня ИЛ-6. Несмотря на определенное улучшение окси-

генации крови, сохранялся лактат-ацидоз; значения веноартериальных градиентов по серотонину и лактату были достоверно ниже аналогичных показателей в 3-й и 4-й группе.

При микробиологическом исследовании секционного материала у всех животных 1-й группы в мазках-посевах был обнаружен S. aureus, что подтверждает его роль в этиологии моделируемой пневмонии. Частота выделения патогена во 2-й группе составила 83,3%, в 3-й и 5-й группе - 41,6%, в 4-й - 33,3%. Таким образом, минимальная частота высева отмечалась в группах 3 и 4, что свидетельствует о более эффективной эрадикации возбудителя при соответствующих режимах АБТ.

Причины недостаточной эффективности терапии и затяжного течения легочного воспаления у животных 2-й и 5-й групп, возможно, были различными. Во 2-й фуппе замедленное разрешение пневмонии, вероятно, связано с недостаточной дозой АБП, которая не позволяла создать в легочной ткани концентрацию препарата, необходимую для подавления данного штамма возбудителя. В 5-й группе неполноценное разрешение пневмонии и замедленное восстановление функции легких объяснить неадекватной дозой антибиотика нельзя, так как данная доза оказалась достаточной для лечения экспериментальной пневмонии, вызванной этим же штаммом микроорганизма у животных 3-й группы. В данном случае причиной персистенции легочной дисфункции могло быть вторичное легочное повреждение, обусловленное воздействием модифицированных клеток-носителей, трансфузи-руемых в достаточно высокой дозе. Косвенным подтверждением этого являются приведенные выше результаты исследования влияния НТ АБП с различными дозами аутоэритроцитов на морфофункциональное состояние легких, а также данные микробиологического исследования.

Итогом комплексной оценки эффективности АБТ стали данные по выживаемости/летальности животных. Выживаемость кроликов 1-й группы после развития пневмонии достигла нулевой отметки к 9-м суткам эксперимента, в связи с этим в данной группе животных было возможно рассчитать медиану выживаемости. Значение этого показателя оставило 5 дней (рис. 2).

■о—о—о-

ч

группа4

группа'З

группа 2

3 2

группа 1

О

о

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ДНИ

Р и с. 2. Выживаемость кроликов при экспериментальной пневмонии.

Выживаемость в опытных группах была достоверно выше по отношению к контролю. Во 2-й группе выжило 7 животных (58,3%), в 3-й - 9 (75 %); в 4-й - 11 (91,7%) и в 5-й группе - 10 (83,3%) (р < 0,05). Различия показателей между 3-й, 4-й и 5-й группами статистически незначимы, а во 2-й группе выживаемость была достоверно ниже (р < 0,05), чем в других опытных группах.

Таким образом, можно констатировать, что патофизиологически обоснованной, адекватной, достаточно эффективной и безопасной методикой анти-биотикотерапии экспериментальной пневмонии, вызванной метициллинчувст-вительным стафилококком, является направленный транспорт эритромицина с помощью аутоэритроцитов в количестве 10,5 • 10® клеток/кг, который позволяет создать концентрации АБП в легочной ткани, в 5 раз превышающие таковые при внутривенном введении. НТ АБП с помощью аутоэритроцитов в количестве 32,7 • 10® клеток/кг также обладает выраженной антибактериальной эффективностью, однако он сопровождается выраженными морфофункциональными изменениями в легких, другими побочными эффектами, которые отрицательно влияют на состояние органного и общего гомеостаза.

19

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована методика экстракорпорального насыщения натив-ных эритроцитов антибактериальными препаратами для проведения направленного транспорта последних. Оптимальными параметрами инкубации, обеспечивающими достаточное насыщение аутоэритроцитов антибиотиками, являются Ш = 75 - 80%, соотношение «растворенный препарат/клетка» = 1 : 7,2.

2. Направленный транспорт эритромицина с помощью аутоэритроцитов создает концентрацию препарата в легочной ткани, в 5 - 6 раз превышающую таковую при внутривенном введении. Пиковые концентрации эритромицина в плазме при этом снижаются на 40 - 60%. При использовании модифицированной методики концентрация эритромицина в легочной ткани практически не отличается от прото-типной, несмотря на трехкратное снижение дозы клеток-носителей.

3. Введение кроликам эритромицина и цефотаксима в ассоциации с ауто-эритроцитами (10,5 • 109 клеток/кг) не приводит к существенным изменениям водных сред, оксигенирующей функции и гистологической картины легких. Направленный клеточно-ассоциированный транспорт данных препаратов с помощью аутоэритроцитов (32,7 • 109 клеток/кг) сопровождается увеличением общего объема жидкости в легких за счет внеклеточной воды, нарушениями оксигена-ции, а также морфологическими изменениями легочной ткани в виде интерсти-циального отека, уменьшения диаметра альвеол, полнокровия капилляров.

4. Направленный транспорт эритромицина (10 мг/кг) с помощью аутоэритроцитов в дозе 10,5 • 109 клеток/кг обеспечивает более полноценное восстановление оксигенирующей и метаболической функций легких, а также более быстрое и эффективное купирование проявлений экспериментальной стафилококковой пневмонии по сравнению с внутривенным введением данного антибиотика в эквивалентной дозе.

5. Направленный транспорт эритромицина (10 мг/кг) с помощью аутоэритроцитов в дозе 10,5 • 109 клеток/кг обеспечивает более полноценную эради-кацию возбудителя и достоверно увеличивает выживаемость при экспериментальной стафилококковой пневмонии по сравнению с внутривенным введением данного антибиотика в эквивалентной дозе.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для проведения клинической апробации технологий направленного транспорта антибиотиков рекомендуется использовать в качестве носителя клеточную взвесь аутоэритроцитов в дозе 10,5 • 10ч клеток/кг.

2. Для увеличения степени связывания ß-лактамных антибиотиков с форменными элементами в среду инкубации необходимо добавлять диметилсуль-фоксид в концентрации 1 мг/мл.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пятаев, H.A. Изменения морфофункционального состояния клеток крови при ее экстракорпоральной обработке некоторыми антибиотиками / H.A. Пятаев, М.Д. Романов, О.В. Журова, О.В. Минаева, И.С. Котлов, Т.М. Романова //Общая реаниматология//2006-Том 11- №4/1-С. 57-60.

2. Пятаев, H.A. Изменения морфофункционального состояния эритроцитов при консервации крови и экстракорпоральной гемокоррекции / H.A. Пятаев, О.В. Минаева, А.Н. Беляев, К.Г. Гуревич, Т.М. Романова // Казанский медицинский журнал // 2007. - Т. 88. - № 4. - С. 278 - 281.

3. Пятаев, H.A. Роль лейкоцитов в транспорте химиопрепаратов в очаг воспаления при проведении клеточно-ассоциированной фармакотерапии / H.A. Пятаев, О.В. Минаева, Т.М. Романова // Мат-лы конф. «Динаміка наукових досліджень-2006», Т.5.- Медицина-Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2006 - С.6 - 10.

4. Пятаев, H.A. Региональные особенности спектра возбудителей пневмонии / H.A. Пятаев, О.В. Минаева, И.С. Котлов, Т.М. Романова // Мат-лы VI Все-росс. съезда анест. и реаниматол- СПб, 2006. - С. 366 - 367.

5. Журова, О.В. Чувствительность и специфичность диагностических критериев нозокомиальной пневмонии / О.В. Журова, H.A. Пятаев, О.В. Минаева, Т.М. Романова // Мат-лы VI Всеросс. съезда анест. и реаниматол - СПб, 2006. - С. 169 - 170.

6. Минаева, О.В. Физиологические основы и клиническое применение направленного транспорта антибиотиков при пневмонии / О.В. Минаева, О.В.

Калинина, Т.М. Романова // Мат-лы Всеросс. науч. конф. «Молодые ученые в медицине».- Казань, Отечество, 2007 - С. 221.

7. Пятаев, H.A. Особенности спектра возбудителей пневмонии в Мордовии/ H.A. Пятаев, О.В. Минаева, Т.М. Романова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2007 - Т. 9, № 2. - Прил. 1.- С. 35.

8. Пятаев, H.A. Особенности морфофункционального состояния, циркуляции и распределения эритроцитов, подвергшихся консервации и экстракорпоральной обработке / H.A. Пятаев, А.Н. Беляев, М.Д. Романов, О.В. Минаева, Т.М. Романова // Вестник интенсивной терапии - 2007,- Прил. к № 5. - С. 28.

9. Романова, Т.М. Изменения оксигенирующей функции легких при направленном клеточно-ассоциированном транспорте антибактериальных препаратов / Т.М. Романова // Медицинские проблемы жизнедеятельности организма в норме, патологии и эксперименте: мат-лы XIII науч. конф. молодых ученых мед. фак. Мордов. ун-та. Вып.8,- Саранск: ООО «Референт», 2008 - С. 121 -127.

10. Бояринов, Г.А. Фармакокинетическое обоснование применения направленного транспорта антибактериальных препаратов в интенсивной терапии тяжелой пневмонии / Г.А. Бояринов, H.A. Пятаев, О.В. Минаева, Т.М. Романова // Вестник интенсивной терапии // 2008,- № 5 - С. 44 - 47.

11. Романова, Т.М. Морфофункциональные изменения в легких при направленном клеточно-ассоциированном транспорте фармпрепаратов / Т.М. Романова, O.E. Бурсина // Технические и естественные науки: проблемы, теория, практика: межвуз. сб. науч. тр.- Вып. IX. - Саранск: Ковылк. тип., 2009. - С. 150 - 153.

12. Левина [Романова], Т.М. Влияние введения экстракорпорально модифицированных аутоэритроцитов на морфофункциональное состояние легких в эксперименте / Т.М. Левина // Актуальные проблемы патофизиологии / Мат-лы XVI межгород, конф. молодых ученых. - СПбГМУ, 2010. - С. 95 - 96.

13. Левина, Т.М. Направленный клеточно-ассоциированный транспорт антибиотиков при экспериментальной пневмонии / Т.М. Левина // Актуальные вопросы хирургии, травматологии и интенсивной терапии: Мат-лы межрег. науч.-

практ. конф., поев. 85-летию со дня рожд; проф. Н.И. Атясова. - Саранск: тип. «Прогресс».-2011. - С. 217 - 220.

14. Левина, Т.М. Экспериментальное обоснование дозы клеток-носителей при направленном транспорте антибиотиков для лечения пневмонии / Т.М. Левина // Актуальные вопросы медицинской науки: Сб. науч. работ студ. и молод, ученых Всеросс. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Актуальные вопросы медицинской науки», поев. 70-летию проф. A.A. Чумакова. — Ярославль: ООО «Изд.-тип. компл. «Индиго».— 2012. — С. 34.

15. Левина, Т.М. Эффективность направленного транспорта эритромицина при экспериментальной пневмонии / Т.М. Левина, H.A. Пятаев, М.Д. Романов // Актуальные проблемы фундаментальных и прикладных наук: Сб. науч. тр. I Всеросс. студен, науч. форума с участием мол. исследователей / под ред. Л.В. Матвеевой. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. - 2012. - С. 110-112.

16. Гуревич, К.Г. Транскапиллярный обмен жидкости и оксигенирующая функция легких при различных модификациях направленного транспорта антибиотиков / К.Г. Гуревич, Т.М. Левина, H.A. Пятаев // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 1. - URL: http://www.science-education.ru/107-8502.

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ

1. Способ исследования объемов жидкостных секторов в легких / H.A. Пятаев, О.В. Минаева, Е.Ю. Коровина, Т.М. Романова // Удостоверение на рац. предложение № 1059 от 05.05.08 г., выдано ГОУВПО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Подписано в печать 23.04.13. Объем 1,25 п. л. Тираж 130 экз. Заказ № 625. Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24