Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование эффективности направленного транспорта нимодипина в магнитоуправляемых носителях при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга

ЛУНИНА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФЕКТИВНОСТИ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА НИМОДИПИНА В МАГНИТОУПРАВЛЯЕМЫХ НОСИТЕЛЯХ ПРИ СИНДРОМЕ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саранск 2011

005010611

Работа выполнена в медицинском институте Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва» на кафедре общей хирургии и анестезиологии им.Н.И.Атясова

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздравсоцразвития России».

Д 212.117.08 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. НЛ.Огарева». (430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26а)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва»

(430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

Автореферат размещен на официальном сайте ФБГОУ ВПО

«МГУ им. Н. П. Огарёва» www.mrsu.ru и на сайте ВАК Минобрнауки России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Н. А. Пятаев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор Е. Г. Лобанова ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ»

доктор медицинских наук профессор А. В. Зорькина ФГБОУ ВПО «МГУ имени Н.П.Огарева»

Защита состоится

диссертационном совете

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

А. Г. Голубев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сосудистые заболевания головного мозга из-за высокой распространенности и тяжелых последствий для состояния здоровья населения представляют важнейшую медицинскую и социальную проблему (Скворцова В.И., 2004; Gutierrez М., et al. 2006; Olesen J., et al., 2006). Показатели смертности от цереброваскулярных заболеваний в России одни из самых высоких в мире и, в отличие от большинства других экономически развитых стран, они не только не снижаются, но и имеют тенденцию к повышению (Суслика З.А., Варакин Ю.А., 2009). В патогенетической терапии ишемии головного мозга (ГМ) выделяют два основных направления: реперфузию (восстановление нарушенного кровотока в ишемизированном участке с помощью тромболизиса) и нейропротекцию в зоне ишемической полутени (пенумбры). Однако восстановление мозгового кровотока после эпизодов фокальной или глобальной ишемии создает не меньше, а иногда даже больше проблем, чем сама ишемия. Это связано с дополнительным повреждением ГМ под воздействием вторичных повреждающих факторов (активные формы кислорода, глута-мат, ионизированный кальций и т.д.) (Бурцев Е.М., Трошин В .Д., 2005; Румянцева С.А., Федин А.И., 2004; Raabe A., et al., 2005; Rmkel G.J., et al., 2005). Имеется много лекарственных средств, которые могут предупреждать и/или купировать вторичную церебральную альтерацию. Одним из наиболее перспективных нейропротекторов являются антагонисты кальция (Барт БЛ., Беневская В.Ф., 2007; Feigin V.L., et al., 2000; Langham J., et al.,2000). Однако их применение ограничивается тем, что они слабо концентрируются в ткани мозга (в, частности, вследствие феномена no-reflow) и вызывают большое количество побочных эффектов (системная гипотензия, сердечная недостаточность) (Ver-deccia Р., Reboldi G. Et al., 2005). В связи с этим представляет интерес разработка методов избирательной доставки этих препаратов в ткань мозга. Одним из методов, позволяющих значительно увеличивать и длительно сохранять высокой регионарную концентрацию, является направленный транспорт (НТ) с помощью магнитных носителей (Черкасова О. Г., 1991; Чехонин В.П., 2009; Suzuki М., et al., 1995). Последние представляют собой коллоидные растворы ферромагнетиков (магнитные жидкости), которые являются биологически инертными и могут концентрироваться в определенном месте под действием внешнего магнитного поля (МП). Связывание лекарства с магнитным носителем осуществляется либо непосредственно (химическая связь), либо путем помещения лекарственного средства и магнитной жидкости (МЖ) в специальные контейнеры (Брусенцов H.A., 1994-2001; Pulfer S.K., Gallo G.M., 1998; Cheng J., et al., 2006). Имеется опыт применения направленного транспорта лекарств с помощью МЖ в различных областях медицины (Швец Т.М., Кущевская Н.Ф., Клочко Э.В., 1997; Grommelin D. J. A., Schreier H., 1994; Garcia, I., et al., 2003;). Однако опыт использования данного метода при ишемии-реперфузии головного мозга отсутствует, что и послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель работы: разработать методику направленного транспорта нимоди-пина с помощью магнитоуправляемых эритроцитарных теней и изучить ее эффективность при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга.

Задачи исследования:

1. Разработать методику включения нимодипина и магнитной жидкости FLW 001.40 в эритроцитарные тени.

2. Произвести сравнительное исследование токсичности магнитной жидкости FLW 001.40 в свободной и инкапсулированной в эритроциты форме.

3. Исследовать распределение магнитной жидкости FLW 001.40 под влиянием магнитного поля и возможность концентрации магнитоуправляемых эритроцитарных теней в ткани мозга.

4. Изучить влияние направленного транспорта нимодипина на мозговой кровоток и процессы перекисного окисления липидов в мозговой ткани.

Научная новизна

Исследована токсичность магнитной жидкости FLW 001.40 в свободной и инкорпорированной в эритроциты форме. Установлено, что магнитная жидкость, инкорпорированная в эритроциты, является менее токсичной, чем свободная.

Изучено взаимодействие магнитной жидкости с нимодипином in vitro. Продемонстрирована возможность хроматографического разделения смеси нимодипина с магнитной жидкостью FLW 001.40.

В эксперименте изучено распределение магнитоуправляемых эритроцитарных теней у кроликов. Доказана возможность концентрации магнитоуправляемых эритроцитарных теней и инкорпорированного в них нимодипина в ткани головного мозга при воздействии внешнего магнитного поля на область головы.

Изучены изменения мозгового кровотока при различных способах введения нимодипина у кроликов с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга. Показано, что направленный магнитоуправляемый транспорт нимодипина оказывает белее стойкий и выраженный дилатирующий эффект на церебральные сосуды и значимо не изменяет уровень системного артериального давления (по сравнению с внутривенным и внутриартериальным способом введения препарата).

Исследовано влияние направленного транспорта нимодипина на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мозговой ткани у кроликов с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга. Установлен фазный характер изменений активности ПОЛ при проведении направленного транспорта нимодипина.

Практическая значимость

Разработана универсальная методика получения магнитоуправляемых эритроцитарных теней, которая может быть использована при проведении направленного транспорта фармпрепаратов различных групп.

Экспериментально разработан способ направленного транспорта нимодипина, который может стать основой для клинически применимой технологии лечения ишемических и реперфузионных повреждений головного мозга.

Положения, выносимые на защиту

Разработана методика включения нимодипина и магнитной жидкости РЬ\У 001.40 в эритроцитарные тени. Возможность создания транспортной системы, содержащей субстанцию нимодипина и магнитную жидкость РЬЛУ 001.40, обусловлена отсутствием образования устойчивых связей между этими субстратами.

Особенностями фармакокинетики нимодипина при его введении по методике направленного магнитоуправляемого транспорта у кроликов с экспериментальной моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга являются увеличение концентрации препарата в ткани мозга, печени и селезенки, снижение пиковой концентрации в плазме и увеличение времени элиминации из системного кровотока.

Обратимая трехчасовая ишемия головного мозга провоцирует развитие ангиоспазма и сопровождается редукцией церебрального кровотока. Болюсное внутривенное введение нимодипина непосредственно после устранения ишемии приводит к снижению тонуса мозговых сосудов, однако не увеличивает мозговой кровоток вследствие развития системной гипотензии. Болюсное внут-риартериальное введение нимодипина оказывает выраженный, но непродолжительный церебровазодилатирующий эффект и менее значимо влияет на системную гемодинамику, чем внутривенное введение препарата. Направленный транспорт нимодипина в магнитоуправляемых эритроцитарных тенях оказывает стойкий дилатирующий эффект на церебральные сосуды и практически не изменяет уровень системного артериального давления.

Церебральная ишемия и последующая реперфузия сопровождаются увеличением интенсивности перекисного окисления липидов в оттекающей от ‘

мозга крови. Внутривенное введение нимодипина не оказывает значимого влияния на активность процессов липопероксидации в мозговой ткани. При введении нимодипина по методике направленного транспорта регистрируется фазность активности перекисных процессов: через 30 минут после прекращения ишемии отмечается интенсификация ПОЛ, а через 180 минут - его торможение.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научнопрактической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2009); конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», (Ярославль, 2009); XV всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2010); 7-й международной научнопрактической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010) ХХХШ-ХЬ конференциях ученых Мордовского госуниверситета «Огаревские чтения» (Саранск, 2007-

2011), заседаниях Мордовского общества анестезиологов-реаниматологов (Саранск, 2010-2011), XII - XV конференциях молодых ученых МГУ им.

Н.П.Огарева (Саранск, 2008-2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ, представляемых на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Исследования по теме диссертации выполнены в рамках федеральной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы 2009-2011».

Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный и научно-исследовательский процесс в ФГБОУ ВПО «Мордовский госуниверситет им. Н.П.Огарева».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 126 источников (из них 73 отечественных и 53 зарубежных). Работа содержит 27 таблиц и иллюстрирована 16 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для решения поставленных в работе задач были произведены опыты in vitro и выполнены экспериментальные исследования. Характеристика основных этапов, материала и методов исследования приведены в таблице 1.

Для исследований использовалась магнитная жидкость FLW 001.40 производства компании «Ferrolabs», США, представляющая собой коллоидный водный раствор магнетита (F3O4) с диаметром частиц 5-10 нм.

Исследование свойств эритроцитарных теней с включенной магнитной жидкостью. Морфологическое исследование эритроцитарных теней проводили методом световой микроскопии в нативном мазке. Исследования гематокрита и распределения теней по объему автоматизированным методом на автоматическом гематологическом анализаторе «Mindrey 2000+», PRC.

Определение концентрации магнитной жидкости в органах и тканях производили методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на ЭПР-спектрометре ESR 70-03 XD/2, Беларусь.

Разделение и детекция нимодипина и магнитной жидкости. Разделение смеси магнитной жидкости и нимодипина производили с помощью гель-фильтрации с использованием в качестве неподвижной фазы сефадекса G 25.

Исследование токсичности магнитной жидкости выполнялись в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических средств», утвержденными М3 РФ (1997). Параметры острой токсичности определяли с помощью программы Probit Analysis.

Таблица 1.

Этапы и методология исследования

Этап исследования Подэтапы Объекты исследова- ния Методология исследования

I. Экспериментальная разработка метода получения магнитоуправляемых эритроцнтарных тенях Разработка метода включення магнитной жидкости Р1ЛУ 001.040в эритроцнтар-ные тени Эритроциты человека, магнитная Количественный анализ эффективности насыщения эритроци-тарных теней магнитной жидкостью в зависимости от технологии процесса

Изучение свойств магнитоуправляемых носителей РІЛУ 001.040 Морфологические исследования, исследование стабильности и устойчивости эрит-роцигариых контейнеров

11 Исследование токсичности аутологичных магнитоуправляемых эритроцнтарных теней с ни-модипнном Исследование острой токсичности ' Исследование хронической токсичности Исследование аллергизи-рующих свойств Белые нелинейные крысы Общепринятые методы исследования токсичности: пробит-анализ, морфологические исследования органов, биохимические анализы биологических сред, кожная и коньюнктивальная пробы.

III. Исследование распределения магнетита и ни-модиина при направлен* ном транспорте в магнитоуправляемых эритро-цитарных тенях у животных с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга Кролики породы шиншилла, интактные Измерение концентрации магнетита и нимодипина в гомогенатах огранах и тканях методами ЭПР-сиектроскопии и высокоэффективной жидкостной хроматографии

IV. Исследование влияния нимодиина при направленном транспорте в магнитоуправляемых эритроцнтарных тенях на системную и мозговую гемодинамику, процессы ПОЛ в мозговой ткани Кролики породы шиншилла с моделью синдрома ИШЄМИИ- реперфузии головного мозга Исследование мозгового кровотока и системной гемодинамики методом реографии. Исследование активности ПОЛ методом хе-милюминеценции в крови яремной вены.

Также проводилось патоморфологическое исследование внутренних органов павших и выживших животных (по истечении срока наблюдения они за-

бивались). При изучении хронической токсичности, кроме морфологического исследования, оценки веса, потребления воды и корма, исследовали клинические и биохимические показатели крови: содержание гемоглобина, эритроцитов, гематокрит, содержание лейкоцитов, тромбоцитов.

Из биохимических показателей определяли: концентрацию глюкозы, мочевины, билирубина, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфе-раз и альфа-амилазы сыворотки, сывороточное железо.

Моделирование синдрома ишемии-реперфузии головного мозга проводилось в остром эксперименте на кроликах породы «шиншилла» путем окклюзии обеих сонных артерий продолжительностью 3 часа внутрибрюшинным под уретановым наркозом (300 мг/кг). Артерии выделяли на уровне СЗ-С4. Окклюзию артерий моделировали путем временного пережатия с помощью натяжения резиновой держалки-лигатуры.

Проведение направленного магнитоуправляемого транспорта нимо-дипина. Наркотизированных уретаном животных фиксировали в специальном станке, над теменной областью создавали магнитное поле индукцией 0,8 Тл с помощью цилиндрического постоянного магнита марки Р-бО-Об-ЗО-Ы из сплава №РеВ диаметром 40 мм. Магнитоуправляемые эритроцитарные тени вводили внутривенно или внутриартериально (интракаротидно) после фиксации животного и создания магнитного поля.

Определение концентрации нимодипина. Определение концентрации нимодипина в плазме и гомогенатах органов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф «Милихром-5-3», Россия). В ходе исследования измеряли концентрацию нимодипина в следующих органах и тканях: плазма крови, ткань головного мозга, печени, почек, легких, жировая и мышечная ткань.

Исследование системной и церебральной гемодинамики, церебрального метаболизма и процессов перекисного окисления липидов. Состояние церебрального кровотока исследовали методом билатеральной реоэнцефало-графии (реограф Р-4-02, Россия). При анализе реограмм определяли следующие показатели: реографический индекс (РИ); реографический коэффициент (РК); дикротический индекс (ДКИ); время общего кровенаполнения (ВНовщ); р - продолжительность катакроты. Уровень системного артериального давления оценивали прямым методом путем канюляции бедренной артерии.

Исследование процессов перекисного окисления липидов. Активность перекисного окисления липидов исследовали методом хемилюминесценции на флюориметре-хемилюминометре «Флюорат-02-АБЛФ-Т» (Россия) в крови яремной вены. Определяли следующие параметры биохемшпоминесценции: интенсивность максимальной вспышки хемилюминесенции (1тах), светосумму (Б) и тангенс угла наклона кинетической кривой ^ а2).

Статистическая обработка результатов исследования. Полученные данные обработаны статистически. Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилка. При подтверждении гипотезы нормальности распределения и равенстве дис-

персий использовался критерий Стьюдента, в противном случае применялись методы непараметрической статистики (критерий Вилкоксона). При сравнении качественных эффектов применялся критерий %. Критическое значение уровня значимости различий принималось равным 5% (р<0,05).

Результаты исследования

Первым этапом исследования стала разработка методики получения магнитоуправляемых эритроцитарных теней с нимодипином. В качестве прототипа нами была использована методика приготовления эритроцитарных теней, разработанная на кафедрах физиологии и госпитальной хирургии Ульяновского государственного университета (Генинг Т.П., Левин И. Г. и соавт.). Методика включает в себя следующие этапы: приготовление отмытых эритроцитов, приготовление эритроцитарных теней, загрузка теней магнитной жидкостью РЬАУ 001.40 и нимодипином. Нами была предложена дополнительная очистка полученных эритроцитарных контейнеров путем повторного центрифугирования их взвеси и удаления невключенного препарата. Кроме того, для повышения эффективности методики было подобрано оптимальное соотношение объемов теней и инкорпорируемого препарата (Кт/„). Для этого исследована эффективность загрузки при разных значениях Кт/„ — от от 2:1 до 1:10. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристики эритроцитарных контейнеров с магнитной жидкостью при различ-

ных технологиях насыщения

Показатель Значения показателя при различном соотношении объема теней к объему вводимого препарата (Кт/„)

2:1 (2) 3:2 (1,5) 1:1 (1) 1:2 (0,5) 1:3 (033) 1:5 Ш- 1:10 (ОД)

т, % 54±3,7 41±2,8 35±2,4 15±1,05 11±0,7 6±0,4 3,5*0,2

Средний диаметр контейнеров, мкм 5,6±0,4 7,5±0,5 10,4±0,7 9,9±0,69 10,7±0,7 10,8*0,8 10,5*0,8

% теней диаметром > 7,0 мкм 8,3±1,2 51±3,5 65±43 60±4,2 67±4,7 71*4,9 68*4,5

% включенного препарата 67±4,6 58*4,06 54±4,3 31±2,1 25±1,7 15*1,2 8*0,6

Число фрагментов эритроцитов, %• 24,5±1,7 19,8±1,4 23,9±1,6 17,6±1Д 18,3*1,3 15,8*1,1 20,5*1,4

Доказательством включения магнитной жидкости РЬ\У 001.40 в тени был факт ее определения в экстракте из контейнеров после их повторного центрифугирования. Как видно из таблицы, доля препарата, включенного в тени, сни-

жалась пропорционально уменьшению Кт/П и гематокрита, составляя 67% при Кт/п= 2, 54% при Кт/п=1 и 8% при Кт/П=0,1. При максимальных значениях концентрации теней (соотношениях тени/препарат 2,0 и 1,5) средний диаметр получаемых контейнеров был низким, составляя 5,6±0,4 и 7,5±0,5 мкм соответственно. При соотношении, равном 1, диаметр получаемых контейнеров достигал 10,4±0,7 мкм и не изменялся при дальнейшем снижении Кт/П.

Процент клеток, имеющих диаметр более 7,0 мкм и наиболее эффективно выполняющих транспортную функцию увеличивался при уменьшении Кх/П от

2,5 до 1 и в дальнейшем не изменялся.

Следует отметить, что несмотря на большой процент включения препарата в тени при высоких значениях Кт/П, возможности использования эритроцитов как контейнеров использовались не полностью. Среда содержала большое количество не заполненных препаратом теней, масса включенного в тени препарата (в расчете на 1 клетку) была низкой.

Таким образом, проведенные исследования доказали возможность получения магнитоуправляемых эритроцитарных теней (МУЭТ) и позволили разработать методику, обеспечивающую максимально эффективное насыщение контейнеров путем оптимизации соотношения объемов теней и включаемого в них вещества. Это соотношение оказалось близким к единице. При больших значениях отношения «тени/препарат» было низким количество полноценных контейнеров, а при уменьшении Кт/П значимо снижался процент включенного в тени препарата, что приводило к значимому перерасходу включаемого в тени вещества.

Вторым этапом исследования стала оценка возможности создания многокомпонентной транспортной системы, содержащей лекарственный препарат (нимодипин) и магнитный наполнитель (магнитную жидкость РЬ\>/ 001.40). Для этого изучена эффективность разделения смеси данных реагентов с помощью гель-хромаггографии с последующим количественным определением каждой субстанции. Проведено 3 серии экспериментов. В 1-й серии экспериментов хроматографированию подвергали субстанцию нимодипина, во 2-й - магнитную жидкость РЬЛУ 001.40, в 3-й -смесь субстанции ни-модипина и магнитной жидкости в массовом соотношении 1:10. Соотношение соответствует дозам препаратов, в которых предполагалось включать их в эритроцитарные тени. На рис. 1. приведены хроматограммы нимодипина, магнитной жидкости 001.40 и смеси нимодипина с магнитной жидкостью РЬУ/ 001.40. При хроматографировании субстанции нимодипина регистрировался единственный пик, время удержания которого составило 1,22±0,03 мин. Концентрации примесей в субстанции находились вне пределов разрешения метода.

Зависимость площади пика от концентрации в диапазоне концентраций нимодипина 1-50 мкг/мл была практически линейной, что позволило построить калибровочную кривую для его количественного определения. При хроматографировании магнитной жидкости также регистрировался единственный пик, время удержания для него было равно 7,44±0,13 мин.

Nimodipine

б.

FLW 001.40

В.

PimodipIne+fLW 00/40

Рис. 1 Хроматограммы: а) ннмодипнна (25 мкг/мл); б) магнитной жидкости FLW

001.40 (200 мг/мл Fe); в) смеси Нимодипина (25 мкг/мл)с магнитной жидкостью FLW

001.40 (200 мг/мл Fe)

В пределах исследованных концентраций (10 — 500 мкг/мл по Ре) отмечалась линейная зависимость площади пика от концентрации с Якорр-0,997.

При хроматографировании смеси нимодипина с магниитной жидкостью регистрировалось 2 пика. Время удержания первого составило 1,26±0,04 мин, второго - 7,49±0,09 мин, что позволило идентифицировать их как пики соответственно нимодипина и МЖ Р1_Л№ 001.40. Площади пиков соответствовали взятым для исследования концентрациям субстанций, что свидетельствует об отсутствии расходования компонентов смеси. Последнее является косвенным подтверждением отсутствия образования ковалентных связей между нимоди-пином и компонентами МЖ при выбранных условиях совместной инкубации.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали возможность хроматографического разделения смеси нимодипина с магнитной жидкостью РЬ\У 001.40, что указывает на отсутствие образования устойчивых связей между нимодипином и компонентами магнитной жидкости и свидетельствует возможности совместного включения данных субстанций в клеточные контейнеры (эритроцигарные тени).

Третьим этапом работы стало сравнительное токсикологическое исследование магнитной жидкости РЬ\У 001.040 в свободной и инкапсулированной в

эритроцитарные тени форме.

При исследовании острой токсичности были определены летальные и максимально-переносимые дозы для свободной магнитной жидкости РЬ\У 001.040. и эритроцитарных теней. В таблице 3 приведены токсикологические характеристики исследованных субстанций в пересчете на магнетит (Ре304). В скобках указаны объемы магнитной жидкости, соответствующие указанным значениям.

Таблица 3

Характеристики эритроцитарных контейнеров с магнитной жидкостью при различных технологиях насыщения

Показатель Значения показателей для различных субстратов

Свободная МЖ Эритроцитарные тени с МЖ

ЬИя 548 мг/кг (1,89 мл/кг) 812 мг/кг (2,8 мл/кг)

Ш 50т'т 412 мг/кг (1,42 мл/кг) 522 мг/кг (13 мл/кг)

1Л) Пли 737 мг/кг (2,54 мл/кг) 928 мг/кг (3,24 мл/кг)

При проведении патологоанатомического исследования наиболее часто выявлялись токсические повреждения легких, печени, поджелудочной железы и почек. Полученные результаты свидетельствуют о том, что магнитная жидкость, инкорпорированная в эритроцитарные тени, оказывает меньшее токсическое действие на исследованные биологические объекты, нежели чем вводимая в чистом виде, о чем свидетельствует увеличение Ш» на 42% и полуторократ-ное расширение диапазона переносимости.

Следующим этапом исследования стало изучение распределения и кинетики магнитоуправляемых эритроцитарных теней при различных тех-

нологиях введения. Распределение МУЭТ оценивалось по тканевой концентрации магнетита (Ре304), определяемой методом ЭПР-спектроскопии. Было выполнено исследование на 24 интактных кроликах породы шиншилла. Исследовались 2 режима введения МУЭТ - внутривенный и внутриартериальный (интракаротидный). Для каждого из этих режимов распределение изучалось при отсутствии и воздействии внешнего магнитного поля. В соответствии с этим было сформировано 4 группы животных по 6 особей в каждой: 1-я группа— внутривенное введение МУЭТ, без создания МП; 2-я группа— внутриар-териальное (интракаротидное) МУЭТ, без создания МП; 3-я группа — внутривенное введение МУЭТ, локальное воздействие внешнего магнитного поля; 4-я группа — внутриартериальное введение МУЭТ, локальное воздействие внешнего магнитного поля. Доза эритроцитарных теней во всех группах была одинаковой и составляла 1 мл/кг веса животного (290 мг/кг в пересчете на магнетит). Забой животных производили через 1 час после введения МУЭТ.

При исследовании тканевого распределения МУЭТ были получены следующие результаты. При введении контейнеров в 1-ой группе наибольшая концентрация магнетита отмечалась в легком - 51,1 ±6,8 мкг/г. В плазме крови содержание определяемого вещества бьшо ниже почти в 5 раз (10,4±2,0 мкг/мл). В головном мозге, сердце, мышцах концентрация вещества была близка к таковой в плазме крови— 9,67±1,6 мкг/г, 10,4±2,1 мкг/г и 10,3±1,9 мкг/г соответственно.

Во 2-й группе (интракаротидное введение контейнеров без использования магнитного поля) отмечалась тенденция к аккумуляции теней в ткани головного мозга, в которой концентрация магнетита составила 32,3±3,3 мкг/г. Распределение вещества в паренхиматозных органах бьшо равномерным. В сердце, мышечной, жировой ткани регистрировалась минимальная концентрация ферромагнетика.

Характер распределения ферромагнетика при введении внутривенно в условиях магнитного поля в 3-ей опытной группе напоминал таковой в 1-ой группе. Обращало на себя внимание накопление магнетита в мозге, где его концентрация достигала 55,4±6,7 мкг/г, что в 5 раз больше чем, в плазме крови. Высокая концентрация регистрировалась в легком - 30,7±4,4 мкг/г, что в 2,5 раза больше, чем в плазме. В паренхиматозных органах концентрация вещества была в 2 раза выше плазменной - 22,4±3,6 мкг/г в печени и 28,0±3,6 мкг/г в почках, а в мышцах и жировой ткани минимальной - 9,4+1,2 и 4,2±0,7 мкг/г соответственно.

Распределение МУЭТ при внутриартериальном введении с дополнительным воздействием магнитного поля отличалось от вышеописанного. Концентрация магнетита в головном мозге в более чем 10 раз превышала плазменную (69,1±8,7 мкг/г и 6,3±1,1 мкг/мл соответственно). В данной группе не отмечалось аккумуляции контейнеров с ферромагнетиком в легочной ткани. Напротив, концентрация магнетита в легких была ниже таковой в печени и почках.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможное! концентрации носителей с МЖ в заданном месте с помощью внешнего МП. Так, при введении эритроцитарных теней без применения МП происходит их задержка в капиллярном русле при первом пассаже, что и определяет место аккумуляции (при внутривенном введении - легкие, при интракаротидном ткань мозга). Локально создаваемое МП обеспечивает концентрацию носителей, содержащих МЖ, на заданном участке. При этом наилучший результа достигается в случае, когда суммируются эффект первого прохождения и эффект концентрирования в магнитном поле.

Следующим этапом работы стало исследование фармакокинетики ни-модипина при различных методах введения. Оно выполнено на 24 кроликах породы шиншилла, разделенных на 4 группы по 6 особей в каждой: 1) внутривенное на изотоническом растворе ЫаС1; 2) внутриартериальное на изотоническом растворе ИаС1; 3) внутриартериальное введение в МУЭТ без магнитного поля; 4) внутриартериальное введение в МУЭТ + локальное воздействие внешнего магнитного поля.

Значения основных кинетических констант нимодипина при различных режимах введения представлены в таблице 4.

Таблица 4

Особенности фармакокинетики нимодипина при различных методах введения

Показатель Значения показателей в группах

1-я опытная (В/в) 2-я опытная (В/а на 0,9% N80) 3-я опытная (В/а в МУЭТ) 4-я опытная (В/а в МУЭТ + МП)

С„ах, 11 Г/МЛ 142,7±2,3 137,1*4,2 76,1±2Д 69Д±1,8

к, мин-1 0,0139±0,0009 0,0157±0,0011 0,0079±0,0004 0,0073±0,0008

Т„2, мин 49,5±3,6 44,15±2,3 87,74±3,2 79,76*3,0

У«1, л/л 0Д13±0,016 0,225±0,013 0,397±0,031 0,44б±0,025

С1ы, мл/мин 2,93±0,11 3,44±0,14 3,11±0,10 3,77±0,16

/ШСрмао), мкг/мл*ч 565±21 493±19 445±18 458±25

ка, МИН ■' - - 0,0181±0,0013 0,0202±0,0014

кр, мин'' - - 0,0019±0,0001 0,0018±0,0002

Тщ (а), мин - - 38,3±1,1 44,5±1,4

Тт(Р), мин - - 364±19 403±21

Примечание: В/в - внутривенное введение; В/а - внутриартериальное введение; МП - магнитное поле; Стах - пиковая концентрация, к - константа элиминации, Т^, - период полувы-ведения, \М - объем распределения, С1Ш — общий клиренс, АиСф-ту, - площадь под фарма-кокиненитческой кривой в интервале 0-180 мин.

При внутривенном и внутриартериапьном введении изменение плазменной концентрации хорошо описывалось одночастевой моделью с = 0 997 -

0,998.

При введении по методике направленного транспорта кинетический профиль нимодипина в плазме заметно отличался от такового при внутривенном и внутриартериальном введении. Во-первых, пиковая концентрация препарата в

3-й и 4-й группах была ниже таковой в 1-й и 2-й группах почти в два раза. Кроме того, отмечалось удлинение времени выведения препарата из плазмы. Точность аппроксимации экспериментальных кривых значительно повышалась использовании для описания кинетики двухчастевой модели: для одночастевой модели Якорр составил 0,9531 и 0,944 а для двухчастевой - 0,998 и 0,996 соответственно в 3-й и 4-й группах.

Наряду с изучением системной кинетики было проведено исследование тканевого распределения нимодипина в тех же группах сравнения.

При внутривенном и внутриартериальном введении нимодипина на изотоническом растворе распределение препарата было весьма схожим. Его содержание в ткани мозга и в паренхиматозных органах в 2-3 раза превосходило таковое в плазме. Максимальная концентрация регистрировалась в наиболее васкуляризованных тканях (легкие, почки, головной мозг), а также в почках, что отражало почечный путь экскреции препарата. В мышечной ткани концентрация препарата соответствовала плазменной, а в жировой бьиа ниже ее в 2-4 раза. Примечательно, что концентрация препарата в мозговой ткани в данных группах достоверно не различалась.

При введении в МУЭТ неравномерность распределения нимодипина была выражена значительно сильнее. В 3-й (внутриартериалыюе введение без МП) и

4-й (внутриартериальное введение + МП) опытных группе наиболее высокая его концентрация регистрировалась в ткани головного мозга, а также в печени и селезенке. В 3-й группе содержание нимодипина составляло 77,8+8,26 в мозге, 41,5±1,94 в печени и 44,74±3,64 нг/мл в селезенке (что соответственно в 4,6,

2,5 и 3 раза выше аналогичных значений 1-й опытной группы). В ткани легких, почек, а также в мышечной и жировой ткани содержание препарата было ниже, чем при введении на изотоническом растворе, на 50-80%. Воздействие магнитного поля значимо повышало эффективность аккумуляции нимодипина в ткани мозга: его концентрация у животных 4-й группы был а выше, чем в 3-й группе, почти в 3 раза, ив 16 раз превышала аналогичный показатель в 1-й |руппе.

Полученные результаты косвенно подтверждают возможность локальной концентрации нимодипина в ткани мозга под воздействием магнитного поля при введении в магнитоуправляемых эритроцитарных тенях.

После исследования кинетики нимодипина была произведена оценка его фармакодинамики, а именно - влияния на тонус мозговых сосудов, церебральный кровоток и изменения системных гемодинамических показателей у 24 кроликов с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга. Исследование проводилось в следующих группах: 1) контроль (без лечения); 2) внутри-

венное введение нимодипина на изотоническом растворе ЫаС1; 3) внутриарте риальное введение нимодипина на изотоническом растворе ЫаС1; 4) внутриар териальное введение нимодипина в МУЭТ + локальное воздействие магнитног поля. Во всех группах п=6. Результаты исследования церебрального кровоток и системной гемодинамики приведены в таблице 5.

Таблица

Изменения некоторых параметров реоэняефалограммы н системной гемодинамики пр различных режимах введения нимодипина

Пока- за- тель Значения показателей в различные временные интервалы

Группы Исходный этап 1 мин 30 мин 180 мин

РИ*, ед. Контрольная (без лечения) 1,45±0,15 0,83±0,121 0,85±0,11 0,86±0,09

1-я опытная (в/венно) 135±0,11 0,91±0,062 0,69±0,04 0,89±0,05

2-я опытная (в/артериально) 109±0,10 0,82±0,081 133±0,05 11 0,91±0,042

3-я опытная (НТв МУЭТ) 1,33±0,09 0,81*0,112 1,17*0,16 1,2 1,13*0,121

ВОК* мс Контрольная (без лечения) 44,9±4,8 763*3,4 2 69,9*4,5 683±5,4

1-я опытная (в/венно) 54,7±3,9 81,0*4,9 1 600*4,1 2 64,6*60

2-я опытная (в/артернально) 510*30 740*5,1 2 49,9*3,3 1,2 58,8*4,6

3-я опытная (НТв МУЭТ) 46,6*2,5 79,5*6,0 1 53,0*3,1 2 46,1*331,1

АДср, мм н8 Контрольная (без лечения) 60,6*3,6 63,9*6,0 68,4*3,7 62,1*3,1

1-я опытная (в/венно) 55,5*3,3 54,9*30 40,7*2,8 иг 53,4*2,41

2-я опытная (в/артериально) 51,9*2,8 51,6*2,4 513*3,2 55,8*2,8

3-я опытная (НТв МУЭТ) 63,3*1,9 60,3*3,6 580*2,5 57,6*3,1

ЧСС, мин'1 Контрольная (без лечения) 178,0*6,2 180,1*80 182,7*5,4 189,2*5,9

1-я опытная (в/венно) 196,5*5,0 188,0*53 1663*40 180,1*5,6

2-я опытная (в/артериально) 185,0*6,1 186,4*4,9 1920*4,0 183,4*6,4

3-я опытная (НТв МУЭТ) 197,4*5,6 187,1*4,7 188,5*6,1 195,5*53

Ц^ПИ^1апп^. & *1 а-—.»-—--» » ■

затель достоверно отличается от аналогичного в контрольной (1-й) группе; 2 - показатель достоверно отличается от аналогичного на предыдущем этапе (внутри группы).

Во всех группах отмечалась однотипная реакция на пережатие артерии, заключающаяся в развитии ангиоспазма и редукции кровотока. Регистрировалось уменьшение реографического индекса и увеличение тонуса мелких сосудов. После восстановления кровообращения состояние регионарного кровотока в группах различалось. У животных, не получавших лечения, ангиоспазм и церебральная гипоперфузия сохранялись в течение всего периода наблюдения. В 1-й опытной группе животных (при внутривенном введении нимодипина) обращала на себя внимание низкая избирательность вазодилатирующего эффекта препарата. В данной группе регистрировалось снижение тонуса мозговых сосудов, однако кровенаполнение мозга также уменьшалось. Уменьшение мозгового кровотока было связано с системной вазодилатацией и гипотензией: на 30-й минуте после введения препарата у животных регистрировалось достоверное снижение АД на 30% от исходного. Через 3 часа показатели гемодинамики и реограммы возвращались к значениям, имевшимся после ликвидации ишемии.

Болюсное внутриартериальное введение нимодипина оказывало выраженный церебровазодилатирующий эффект, который проявлялся увеличением реографического индекса на 62 и уменьшением времени кровенаполнения на 30% по сравнению с предыдущим этапом. Однако эти сдвиги были нестойкими: через 3 часа после введения препарата все исследованные показатели рео-грамм возвращались к значениям, зарегистрированным сразу после ликвидации ишемии. Изменения системной гемодинамики в данной группе животных также имели место, но были выражены в меньшей степени, чем во 2-й группе.

Направленный транспорт нимодипина оказывал несколько меньший по выраженности на раннем этапе, но более стойкий вазодилатирующий эффект. На 30-й минуте, как и при болюсном внутриартериальном введении нимодипина, отмечалось увеличение мозгового кровотока. Географический индекс увеличивался на 44% по сравнению со значением данного показателя на предыдущем этапе, время кровенаполнения уменьшалось на 33%. Через 3 часа после введения препарата значения исследованных показателей сохранялись на прежнем уровне. Примечательно, что при НТ нимодипина не регистрировалось колебаний уровня системного артериального давления.

При исследовании динамики маркеров интенсивности ПОЛ в крови яремной вены получены следующие результаты (табл. 6).

Непосредственно после восстановления кровотока интенсивность ПОЛ практически не изменялась. Через 30 минут после ликвидации ишемии значимо возрастала перекисная активность во всех группах. При внутривенном введении нимодипина прирост интенсивности хемилюминесценции не отличался от такового в контроле и составил 55%. При болюсном внутриартериальном введении нимодипина регистрировалась более выраженная активация ПОЛ: интенсивность люминесценции в 2-й опытной группе увеличилась на 102% по сравнению со значением данного показателя на предыдущем этапе. В группе ЖИВОТНЫХ, которым проводился НТ, прирост Бшм был менее выраженным и составил 57 %.

Таблица 6

Некоторые показатели интенсивности ПОЛ в югулярной крови на фойе различных ре__________________________ жимов введения нимодипина________________________________

Пока- затель Г руппы Значения показателей в различные временные интервалы

Исх. этап 1 мин 30 мин 180 мин

шУ Контрольная (без лечения) 65,5*7,1 74,2*6,8 129,4*2 и 2 217,0*14,1

1-я опытная (в/венно) 81,7±8,9 86,8*7,3 134,5*12,6 2 109,4*6,9 2

2-я опытная (в/артериально) 68,3*4,4 81,5*4,7 164,7*15,9 "'2 88,0*9,21>2

3-я опытная (НТ в МУЭТ) 76,5*5,9 92,7*7,4 1,2 145,8*14,4 12 75,6*5,4'’2

^ «2 Контрольная (без лечения) 1,15*0,21 1,17*0,21 1,22*0,08 1,27*0,12

1-я опытная (в/веино) 1,12*0,06 1,14*0,10 1,18*0,09 1,18*0,09

2-я опытная (в/артериально) 1,04*0,05 1,10*0,09 1,20*0,10 1,28*0,10

3-я опытная (НТ в МУЭТ) 1,20*0,07 1,25*0,09 1,37*0,12 1,39*0,21

Примечание: 1- показатель достоверно отличается от аналогичного в контрольной (1-й) группе; 2 - показатель достоверно отличается от аналогичного на предыдущем этапе (внутри группы).

Во всех группах животных, получавших нимодипин, на 180-й минуте активация процессов ПОЛ сменялась ее торможением: интенсивность 8ШМ снизилась по сравнению с предыдущим этапом на 47,48 и 33% соответственно 2-й, 3-й и 4-й группах (в контрольной группе степень уменьшения данного показателя составила 9%). Достоверных изменений анитоксидантной активности во всех группах зарегистрировано не было.

ВЫВОДЫ:

1. Нимодипин не образует устойчивых связей с компонентами магнитной жидкости 001.40. Эта субстанции могут быть совместно включены в эритроцитарные тени. Максимально эффективное насыщение клеточных контейнеров обеспечивается при равных объемах клеточных теней и включаемого препарата.

2. Инкапсулированная в эритроцитарные тени магнитная жидкость

001.40 является менее токсичной, чем свободная. Снижение токсичности

проявляется увеличением иэ50 на 40%, а также уменьшением частоты и выраженности дистрофических изменений паренхиматозных органов при длительном введении.

3. Особенностями фармакокинетики нимодипина при его введении по методике направленного магнитоуправляемого транспорта у кроликов с экспериментальной моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга являются

увеличение концентрации препарата в ткани мозга, печени и селезенки, снижение пиковой концентрации в плазме и увеличение времени элиминации из системного кровотока.

4. Нимодипин, вводимый по методике направленного магнитоуправляемого транспорта кроликам с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга, оказывает более стойкий и выраженный дилатирующий эффект на церебральные сосуды и менее значимо влияет на системную гемодинамику по сравнению препаратом, вводимым внутривенно и внутриартериально.

5. Изменения активности перекисного окисления липидов проведении направленного магнитоуправляемого нимодипина у кроликов с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга имеют двухфазный характер: через 30 минут после введения препарата отмечается активация, а через 180 минут -торможение процессов липопероксидации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При изучении эффективности лекарственных препаратов у животных с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга может быть использован метод их направленного транспорта с помощью магнитоуправляемых эрит-роцитарных теней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бурсина (Лунина) О.Е., Абросышн О. И., Куликова H. H., Комков А. П., Пятаева И. А., Романова Т. М. Объёмная компрессионная осциллография - новый неинвазивный метод гемодинамического мониторинга. Вестник мордовского университета. №2,2006, Серия «Медицинские науки». С. 214-217.

2. Бурсина (Лунина) O.E., Минаева О. В., Романова Т. М., Пятаева И. А. Возможности объёмной компрессионной осциллометрии как метода гемодинамического мониторинга при острой несостоятельности кровообращения. XII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине». 25-26 апреля 2007 г. Тезисы докладов. Казань: Отечество, 2007. С. 209-210.

3. Бурсина (Лунина) O.E., Коровина Е. Ю., Грузнов Г. А. Эффективность направленного транспорта нимодипина при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга. Вятский медицинский вестник. Мат. конф. «Молодежь и медицинская наука в XXI веке»”. ГОУ ВПО Кировская государственная медицинская академия, 2009. С. 96.

4. Бурсина (Лунина) O.E., Коровина Е. Ю., Грузнов Г. А.Влияние направленного транспорта антагонистов кальция на мозговой кровоток и липопе-роксидацию при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга. Сборник научных работ молодых ученых всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», 22 апреля 2009 г., Ярославль: Изд-во ООО «ЯрМедиаГруп», 2009. - 310 с. С. 125.

5. Бурсина (Лунина) O.E., Фирсов А. А. Постгипоксическая энцефалопатия: современный взгляд на патогенез. Технические и естественные науки: проблемы, теория, практика: межвуз. сб. науч. тр. — Вып. IX. - Саранск: Ко-вылк. тип., 2009 - 192 с. С. 162-165.

6. Пятаев H.A., Гуревич К.Г., Фирсов А.А, Бурсина (Лунина) O.E. Фармакокинетика и фармакодинамика нимодипина при его направленном транспорте у животных с моделью синдрома ишемии-реперфузии головного мозга. Медицина критических состояний. - 2009. — № 6. С. 50-58.

7. Пятаев H.A., Бурсина (Лунина) О.Е., Коровина Е. Ю., Грузнов Г.А. Направленный транспорт антагонистов кальция в коррекции повреждения мозга при его ишемии-реперфузии. Вестник интенсивной терапии. // 2009, №5 С. 154-157.

8. Пятаев H.A., Бурсина (Лунина) O.E., Грузнов Г.А., Беляев С.А., Чистяков И.С. Оксидантные повреждения при ишемии-реперфузии и их коррекция путем направленного транспорта антагонистов кальция. Revista OzonoterapiaNum.l, Vol 3., September 2009. Нижний Новгород. C. 55-58.

9. Бурсина (Лунина) O.E., Фирсов А. А. Эффективность магнитоуправляемого направленного транспорта нимодипина при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга. Мат. XV Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань, 2-3 апреля 2010. С.210.

10. Бурсина (Лунина) O.E., Фирсов А. А. Направленный транспорт бло-каторов кальциевых каналов с помощью магнитоуправляемых носителей в коррекции ишемических/ реперфузионных повреждений головного мозга. Актуальные проблемы патофизиологии. Сб. науч. тр. СПб.: Издательство СПбГМУ, 2010. - 200 с. С. 40-41.

21. Фирсов А. А., Бурсина (Лунина) O.E., Влияние направленного магнитоуправляемого транспорта нимодипина на мозговой кровоток при синдроме ишемии-реперфузии головного мозга. Астраханский медицинский журнал. 2010. Том 5, №1. С. 171-173.

12. Фирсов А.А., Лунина O.E., Усанова Т.А., Пятаев Н.А. Коррекция гемодинамических показателей синдрома ишемии-реперфузии головного мозга с помощью направленного транспорта нимодипина на магнитоуправляемых эритроцитарных носителях. Медицинский альманах. №1 (14) 2021. С. 54-56.

13. Фирсов A.A., Лунина О.Е., Смирнов М. В., Игнатьева О. И. Когнитивные нарушения в ранний реабилитационный период цереброваскулярной патологии. Мат. Ш-го междунар. конгресса «Нейрореабилитация-2021», 2-3 июня 2021 г., Москва. 2021. С. 178-179.

14. Минаева О.В., Зырняева H.H., Столяров Г.С., Фирсов A.A., Лунина O.E., Плотникова Н.А. Исследование острой токсичности магнитной жидкости на основе магнетита Fe304, стабилизированного олеиновой кислотой. Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», Саратов, 6-7 сентября 2021 г. Интернет-ресурс: http.7/www.rusnor.org/nor/structure/sections/medical-biologic/6706.htm.

Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Таймс. Печать способом ризографии. Уел. печ. л. 1,34. Уч.- изд. л. 1,67. Тираж 100 экз. Заказ № 5

Отпечатано с оригинала-макета заказчика в ООО «Референт».

430000, г. Саранск, пр. Ленина, 21.

Тел. (8342) 48-25-33.