Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Исследование динамики активного состояния в гладких мышцах желудка при калиевой деполяризации

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДРУЖБЫ ПАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ »U.A.A. БОГОМОЛЬЦА

На правах рукописи

ИМИГОЛЬ Анатолия Васильевич

УДК 612.73..3/.5:577.352.5

ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ АКТИВНОГО СОСТОЯНИЯ В ГЛАДКИХ МЫШЦАХ ЖЕЛУДКА ПРИ КАЛИЕВОИ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ.

Специальность: 14.00.17 - Нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КИЕВ

- 1990

Работа выполнена в Киевском медицинском институте им. акад. А.А.Богомольца МЭ УССР. '

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Л.Г.Наливпйко.

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН УССР, профессо[ М.Ф.Иубв, доктор медицинских наук В.А.Иихнев.

Ведущая организация: Институт физиологии животных Кмевскогс государственного университета им.Т.Г.>евченко, г.Киев.

Эацита состоится "_(_/_"_____ 193»? г.

в__часов на-эаседании специализированного совета Д - 016.15.0

при Институте физиологии им.А.А.Богомольца АН УССР по адресу 252024,г.Киев-24,ул.Богомольца,4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фи зиологии им.А.А.Богомольца АН УССР.

Автореферат разослан '[2__*_______________19^0 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Э.А.СОРОКИНА - МАРИНА.

г : - . ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ:

Актуальность проблемы. Фундаментальным свойством мышечных слеток является их способность генерировать механический ответ на возбуждение сарколеммы. В зависимости от режима нагрузки мышцы этот ответ может проявляться либо в виде укорочения, либо в виде изометрического напряжения. Расшифровка механизмов сопряжения возбуждения с сокращением и механо-химического преобразования валяется' одной из важнейших проблем физиологии и биофизики мыяц.

Особенно актуальна эта проблема для изучения гладких мышц, учитывая многообразие проявлений процесса их возбуждения (градуальная деполяризация,"медленные волны",пиковые ПД, ПД типа "пла-»

то" и т.д.),а также способность к поддержание длительного тонического сокращения (Бгигзгвшзкх,1983 . ) .

Для изучения электромеханического сопряжения в гладких мышцах весьма мироко применяется метод "химической фиксации" потенциала с помоцьэ гиперкалиевых растворов.В рамках данного метода исспедуот зависимость сократптепьаого ответа нылцы па деполяризацию мембраны, вызываемую повышением концентрации внеклеточных ионов калия, от величины последней.

Приготовление гиперкалиевых растворов путем добавления в раствор Кребса необходимого количества сухой соли КС1 (прием, используемый многими авторами) приводит к тому, что ионная сипа и осмолярпость . указанных растворов отличаются от таковых раствора Кребса. Однако влияние осмолярвости и ионной силы тест-растворов на характер электромеханической связи в гладких мышцах к настоящему времени мало изучено.

Для исследования способности гладких мымц к укорочению при возбуждении мироко применяют метод быстрого освобождения (Мог1уа,

Miyazaki,1985. Siegnan et al.,1985. Stephens,1985). Чаще всего этот метод используют для исследования активного состояния тета-пиэированннх высокочастотной стимуляцией гладких мнжц. Мембранная потенциал при этом не регистрирует. Последнее обстоательство не позволяет сопоставить динамику активного состояния в ковтрактиль-вом аппарате гладкой мкжцн с характером возбуждения ее поверхностной мембраны. 4

Применение метода "химической фиксации" потенциала в сочетании с быстрым освобождением,обеспечивая одновременную регистрацию мембранного потенциала, изометрического напряжения и скорости изотонического укрочеяия мыацы, позволило бн глубже изучить меха-низмн электромеханического сопряжения в гладких мнкцах.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы бнло исследование динамики активного состояния в гладкомыжечяях клетках (ГИК) фупдального отдела желудка в зависимости от степени деполяризации их поверхностной иеибрапы.Для достижения поставленной цели необходимо бнло реиить следующие задачи:

1. Разработать методику быстрого'освобождения с одновременной регистрацией мембранного потенциала ГИК.

2. Исследовать зависимость амплитуды топического компонента калиевой коптроктуры от концентрации впеялеточпого калия,осмоляр-ности и ионной силы деполяризующих растворов, а также влияние физиологически активных веществ - субстанции Р и кофеина на калиевую контрактуру ГМК фундпльного отдела желудка.

3.Исследовать временной ход активпого состояния в гладких

мммцах, оцениваемый по пачальной скорости укорочения и по изомет-*

ричсскои силе па протяжепии трехминутной калиевой деполяризации

различной величины.

4 . Исследовать влияние- осмолярыости деполяризующего раствора, а также субстанции р и кофеина ва временной »од активного состояния в ГМК фундаяьного отдела желудка при и* максимальной калиевой деполяризации.

Научная новизна. Впервые произведена синхронная регистрация мембранного потенциала, изометрической силы и изотонического укорочения и условиях быстрого освобождения гладкой мыяцы при ее калиевой деполяризации. Применение метода быстрого освобождения с

)

одновременной "химической фиксацией" потенциала позволило впервые исследовать зависимость временного хода активного состояния н контрактильном аппарате мымечных клеток фундольного отдела желудка от степени деполяризации их поверхностной мембраны.

Получены новые научные результаты, углубляющие представления о механизмах поддержания тонуса гладких мыщц. Наиболее существен-ныыи из них являются следующие:

1. Покаэаво, что зависимость тонического компонента калиевой контрактуры от величины деполяризации имеет нолоколообрацную форму с максимумом при концентрации внеклеточного калия, равной 40 мыоль/л.

2. Увеличение осиолярности и ионной силы гиперкалиевых растворов приводит к повынепию амплитуды тонического компонента сокращения.

3. Динамика активного состояния в гладких иыицах при калиевой деполяризации,оцениваемая по начальной скорости укорочения,не зависит- от потенциала на мембране,осиояярностя и ионной силы гиперкалиевых растворов и не изменяется под воздействием субстанции

Р, хотя изометрическая сила, развиваемая мыыцея, зависит от перечисленных (акторов.

4. Аппликация кофеина ва фоне установившейся калиевой контрактуры вызывает фаздое сокращение гладкомымечных клеток, сопровождающееся увеличением начальной скорости укорочения при быстрой освобождении. *

Теоретическое и практическое значение работы. Ва основании полученных данных предлагается объяснение малой утомляемости гладкой мыицы при ее тонических сохранениях. Исходя из независимости стационарно» скорости укорочения гладкой мыипы от потенциала па мембрапе, обосновывается предположение о том, что скорость циклировапия поперечных мостиков определяется не уровнем ионизированного кальция в миоплазме, а скоростью его изменения.

Практическая ценность работы закнючается в том, что в ней показана принципиальная возможность влияпия на тонус гладких иыац без сунественпогр изменения скорости их укорочения и, следовательно, АТФ-азноя активности миозина. Это может послужить обоснованием для целенаправленного поиска фармакологических средств, регулирующих сократительную способность гладких мынц при минимальном повышении энергопотребления в коптрактильном аппарате.

Апробация работы. Осповпые полохепия работы выли доложены и обсуждены на заседании Объединенного городского семинара по физиологии пи«еварепия(19П6Г.,Киев),Конференции молодых ученых и специалистов Киевского медицинского илститута (1ЭВ6 и 1989г., Киев), Международном симпозиуме "физиология пептидов" (19ЙВг., Ленинград) ,Всесоюзном симпозиуме "Физиология сфинктеров желудочно-ки-иечного тракта" (1ЭНЯг.,Томск) .

По материалам диссертации опубликовано пять работ. -Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работе иэлохева на 96 страницах маминописного текста, иллвстрирована 18 рисунками и одной таблицей. Список литературы насчитывает 109 источников; из них 18 отечественных и 81 зарубежных авторов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ, Объектом исследования были изолированные мыыечные полоски из циркулярного слоя фундального отдела желудка морской свивки. Часть опытов выполнена на полосках из taenia coli морской свинки. Мирина полосок составляла 200-300 икм, длина - 7-10 мм. До начала эксперимента полоски видерхивали в растворе Кребса при температуре 4* - 6* С не менее 1 часа, .......

Для синхронной регистрации мембранного потенциала и сократительной активности использовали метод одинарного сахарозного мостика. Конструкция камеры сахарозного мостика была аналогична описанной в литературе (Berger,Barr,1969; Артеменко и др.,1983). Изоляция растворов KCl,сахарозы и Кребса производилась с помочью тонких резиновых перегородок. Отведение мембранного потенциала осуществляли с помочью неполяризувцихся хлор-серебряных электродов.

Для измерения мыиечной силы участок полоски, находящийся » тест-отсеке сахарозного мостика,с помоцьп мелковой лигатуры крепили к вертикальному плечу Т-образного рычахка. С одним из горизонтальных плеч рычахна посредством тонкого стеклянного крючка соединяли мехапотрои 6МХ1С.

Для быстрого освобождения мымцы в различные моменты времени

изометрического сокращения использовали электромагнитное реле,к нкорв которого била припаяна металлическая тяга. При пропускании тока через репе тяга отклоняла стекпвпвип крючок и освобождала ммацу от изометрического режима.Перемещение Т-образного рычажка, обусловленвое укорочением мнацы, регистрировали с помощь» вентильного фотоэлемента, снабкенного целевой диафрагмой.Равномерное освещение фотоэлемента осуществляли с помощь» микроосветителя,пи~ таемого от стабилизированного источника постоянного напряжения.

Запись измеряемых параметров осуществляли на диаграммной ленте самописца Н3021 в прямоугольной системе координат.

Для деполяризации и снижения сопротивления клеточных мембран участка мнаечной полоски,находящейся в камере сахарозного мостика , использовали раствор химически чистого КС1 в дистиллированной воде.Тест-участок мынцы омывали раствором Кребса следующего состава (в ммоль/л): NaCl-120,4; KCl-5,9; NaHC0.-15,5; NaH.P0«-l,2; MgCl«-l,2; CaCl»-2,5; глюкоза-ll,5.

Изоляцию деполяризованного участка и тест-участка осуществляли с помощью изотонического раствора сахарозы (318 ммоль/л).. Раствор сахарозы готовили на деионизироваиноА воде к очищали от примесных ионов с помощьв ионообменных колонок. Удельное сопротивление очищенного раствора сахарозы составляло 1-2М0м-си. Для улучшения условий функционирования электрических межклеточных контактов в раствор сахароэн добавляли 0,1-0,5 мкмоль/л СаС1>. Это приводило к снижению удельного сопротивления сахарозы до 200 -400 ком-см.

Для "химической фиксации" потенциала тест-участка мнаечной полоски использовал^ гиперкалиевые растворы, содержащие 10,20,30 40,60,80 и 120 ммоль/л ионов калия.Гиперкалиевые растворы готови-

ли либо путем эквимолярной замени натрия на калия в растворе Кребса, что обеспечивало постоянство осмотического давления и ионной силы, либо путем добавления необходимого количества сухо» соли КС1 к раствору Кребса, что обусловливало постоянство концентрации ионов Ыа'. Температуру растворов поддерживали на уровне 35±1»С. рН растворов равнялся 7,3-7,4. Измерение изучаемых параметров производили с диаграммной ленты самописца.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке по методу Финера-Стьодента. Нуль-гипотезу отвергали при уровне значимости р < 0,05.

)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Зависимость амплитуды тонического компонента сокращения ГНК желудка от концентрации внеклеточного калия.

Для изучения природы электромеханического сопряжения в гладких мымцах чаще всего используют метод калиевой деполяризации. При этом исследуют величину сокращения как функцию концентрации внеклеточных ионов калия ([К]»). Повышение [К], достигается либо путей добавления необходимого количества сухой соли КС1, либо путем эквимолярноя замены Ка* на К' в растворе Кребса. В первом случае переменной величиной является не трлько концентрация ионов калия, но и осмолярность и ионная сила раствора, тогда как во втором случае значения ионной силы и осмолярности деполяризующих растворов остаются в физиологических пределах.

Следует ожидать, что изменения осмолярности и ионной силы

деполяризующих растворов повлияет па зависимость "[К]. - сила сокращения". С целью выяснения характера этого влияния были предприняты эксперименты с изотоническими и гипертоническими деполяризующими растворами.

Изотонические гиперкалиевие раствора. В данной серии экспериментов гиперквлиевые растворы готовили путем эквимолярпой замены натрия на калий в растворе Кребса. Во все растворы добавляли 2 - 2,5 имоль/л тетраэтипаммония для блокирования части калиевых каналов.

Трехминутная аппликация гиперкалиевого раствора приводила к деполяризации мембраны ГНК и активации сокращения. Характер сократительной реакции ГНК зависел от величины деполяризации мембраны. При (К1. = 10 - 20 миоль/л сокращение в подавляющем большинстве случаев было тоническим. При (К). =20-30 миоль/л возникали ПД, которые продолжали генерироваться в течение всего времени действия гиперкалиевого раствора и сокращение имело характер зубчатого или гладкого тетануса (в зависимости от частоты ПД ). При ГК)- = 40 - 120 ммоль/л разряд ПД возникал только в начале деполяризации, затем ПД инактивировались и мембранный потенциал устанавливался на постоянном уровне. Сокращение при этом состояла из двух компонентов - фаэно-тетанического и топического.

Для построения зависимости "(К]. - амплитуда тонического сокращения" во всех случаях амплитуду сокращения измеряли на третьей минуте деполяризации.

Результаты экспериментов показали, что амплитуда тонического компонента сокращения достигала максимума при концентрации наружного калия, равной 40 ммоль/л. Дальнейшее повышение (К), приводило к уменьмепию амплитуды топического компонента сокращения. При

[К]. = 120 ммоль/л тоническое совращение составляло в среднем 20* от максимума.

Гипертонические гиаеркалиевые раствори.Реакции ГИК фундаль-

í

вого отдела желудка на аппликацию гипертонических гиперкалиевых растворов значительно отличались от реакции на изотонические растворы. Самое существенное отличие наблюдалось в сократительны*■ реакциях. *

Амплитуда тонического'компонента сокращения при [К]. = 60 -120 ммоль/л была достоверно нихе (р < 0,01) в изотнических растворах, чей в гипертонических-. Наибольнея величины это различие

i

достигало при полной деполяризации мыиечноя мембраны ( [К]* = 120 ммоль/я).

В связи с тем, что в изотоническом 120-миплимопарной растворе КС1 концентрация ионов натрия весьма незначительна, возникает вопрос - не опосредовано ли понижение тонуса мыицы падением концентрации ионов натрия и уменьмением вследствие этого симпорта глюкозы. Для ременин этого вопроса были поставлены опыты с гипертоническими гиперкалиевыми растворами, в которых ионы натрия заменяли ионами Tris*. Опыты показали, что тонические компоненты сокращения в иэоосмолярицк растворах достоверно нихе, чем в ги-перосмолярннх,причем независимо от вида ионов, создающих избыточное осмотическое давление (Na* или Tris*).

Влияние субстанции Р и кофеина на калиевую контрактуру. Согласно современным представлениям (>уба,1981; Bolton,1979) сокращение гладких ыыиц при калиевой деполяризации обеспечивается

ионами кальция, поступающими главным образом из внеклеточной сре-

N '

ды по электроуправляемым кальциевым каналам плазматической мембраны. Гладкие мыицы обладают и другими источниками понимания кон-

центрации свободного кальция в миоплазме: хемоуправпяемыми кальциевыми каналами и внутриклеточными запасниками кальция

(Bolton,1979;.Karaki,1988).

В данной серии опнтов изучено влияние субстанции Р и кофеина на параметры калиевоя контрактуры.

Аппликация субстанции Р (1-10~* - 1-10-* моль/л) на мембрану мыиечяых клеток вызывала их тоническое сокращение без существенных изменения мембранного потенциала. Этот факт означает,что в повмщении концентрации внутриклеточного кальция принимает участие ае электроуправляемыя вход ионов кальция, а имеет место фармако-мехвническое сопряжение. Тоническое сокращение мышцы продолжалось в течение всего времепи деяствия субстанции Р.

При совместной аппликации гиперкалиевого изотопического раствора <[К). = 120 ммоль/л) * субстанции Р (1-10-* моль/л) наблюдалось их аддитивное действие - амплитуда устаповивщегося тонического сокращения была в 1,5 - 2 раза выме, чем в контроле.

Действие кофеипа на параметры калиевой контрактуры изучено при различных режимах введения препарата. Аппликация изотонического гинеркплиевого раствора, содержащего 20 ммоль/л кофеина, приводила к незначительному увеличению фозпо-тетаничесяого компонента и практически полному подавлению тонического компонента сокращения. Аппликация 20 ммоль/л кофеина на деполяризованную мыщцу при установившемся тонусе вызывала появлсяие нового фазпого сокращения, сменяющегося расслаблением мычцы. При температуре омывающего раствора 35*С величина этого сокращения была незначительной. В некоторых случаях в ответ на аппликацию кофеипа фпзпое сокращение вообще не наблюдалось, а имело место только расслабление мынцы. Снижение температуры до 25*-27*С приводило к зичетному

увеличению амплитуды кофеинового фазного сокращения.

Таким образом, показано, что при физиологических значениях осмолярности и ионпой силы гиперкалиевых растворов зависимость ыехду амплитудой тонического компонента сокращения и величиной деполяризации мембраны ГНК имеет копоколообразную форму. Максимум тонического сокращение наблюдается при [К]. = 40 ммоль/л. Увели-' чение осмодярцости и ионной силы гиоеркалиевмх растворов приводит к статистически достоверному повышении амплитуды тонического компонента сокращения ГНК.

С помощью субстанции Р и кофеина мохпо существенно изменить

>

характер ответной реакции мынцы на деполяризацию. При одновременной аппликации деполяризующего раствора и субстанции Р амплитуда тонического компонента сокращения возрастает. Действие кофеина на фоце устаповивмейся калиевой контрактуры при комнатной температуре приводит к возникновению нового фазного сокращения с последующим снижением тонуса.

2.Кинетические параметры изометрического сокращения деполяризованной гладкой мымцы.

Сократительная реакция гладкой мымци на калиевую деполяризацию при [К)„ = 40 - 120 ммоль/л состоит из двух компонентов: фаз-но-тетанического и тонического. Фазно-тетанический компонент сокращения совпадает во времени с генерацией разряда ПД на мембране ГМК и является результатом суммации фазных сокращений, запускаемых потенциалами действия. В паних экспериментах частота ПД, возникающих при калиевой деполяризации, возрастала с увеличенном [К]-. Однако продолжительность серии ЯД при этом умепьмалась.

Серость нарастания изометрической силы пряно пропорционально зависела от частота ПЛ. В результате этого время достижения максимума изометрической силы уменьшалось с повышением [К].. После достижения максимума сила, развиваемая мницей, постепенно умевьмапась и фазпо-тетаническое сокращение переходило в тоническое. Скорость перехода фазно-тетанического компонента в тонический била прямо пропорциональна степени деполяризации мембраны. Так при |К). = 40 имоль/я спад изометрической силы, продолжался я течение всего времени аппликации гиперкалиевого раствор'а, хотя к третьей минуте оя значительно замедлялся. При (К)- - 120 ммоль/л переход от #азно-тетанического сокращения к топическому завершался на протяжении первой минута деполяризации и в дальнейшем тонус мнацы оставался на постоянном уровне.

Согласно современным представлениям переход фаэно-тетаничес-кого компонента калиевой контрактуры в топический обусловлен инактивацией потенциалозависимого входа кальция внутрь ГНК и снижением внутриклеточной концевтрации ионов Са2* путем удаления их из миоплаэмн. С целью получения дополнительной информации о механизме расслабления деполяризованной гладкой мнацы вами были изучены кинетические параметра спада изометрической сила во времк перехода фвзно-тетанического сокращения в тоническое при [К]. = 120 ммоль/л. Была также изучена кинетика спада изометрической сипи при реполяризации мымцы, деполяризованной 30-миллимелярпыы

раствором КС1. В последнем случае сокращение мыкцы имело характер

\

гладкого тетануса, тая как генерация ПД высокой частоты продолжалась в течение всего времени деполяризации.

При (К]. = 120 ммоль/л спад сини после достижения максимума удовлетворительно описывался одной экспопентоя с постоянной вре-

мени 11 с. Спад сипы при реполяризации ыыицы также моноэкспоненциален с постоянной времени 11 с. Такое сходство кинетики расслабления позволяет предположить, что спад сияя в обоих случаях определяется одпим и тем же механизмом, а именно - снижением концентрации ионов кальция вмиоплпзме. Действительно, реполяриэация мымцы, находящейся в состоянии тетануса приводит к прекращение генерации ПД й; следовательно, поступления ионов кальция внутрь ГНК. В этом случае кинетика расслабления мншци будет определяться кинетикой удаления кальцин из миоплазмн.

Если спад изометрической силы деполяризованной мышцы определяется тем же механизмом, что и расслабление при реполяризации, То константы скорости обоих процессов должна бнть ве только близкими по значению, но, и иметь сходнув температуриув зависимость. Опыты, проведенные при различной температуре.деполяризующих растворов, показали, что термокинетические коэффициенты Вант -Гоффа рассматриваемых процессов практически одинаковы в диапазоне 33* -37-С.

Таким образом, анализ кинетики расслабления деполяризованной гладкой мымцы является косвенным подтверждением того, что изометрическая сила, поддерживаемая гладкой мышцей после достижения максимума, в каждый момент времени определяется балансом процессов поступления ионов кальция в миоплазму и удаления его оттуда.

3.Исследование динамики активного состояния а контрок-тильном элементе гладкой мышцы при калиевой деполяризации.

Сила, регистрируемая в каждый момент времени на концах мышцы

при ее сокращении, определяется двумя Переменными: интенсивность» активного состояв«« в контрактильиом элементе и податливостью последовательного эластического элемента. Ввиду этого, по динамике силы нельзя судить об изменениях интенсивности активного состояния в контрактильиом элементе мнмцы, так как свойства последовательного элемента не известны и могут изменяться в процессе сохранения.

Учитывая фундаментальность связи между АТФ-азпоя активностью миоЗина и скоростью укорочения контрактипьного элемента мымцы (Вагапу,1367;Mars ton,Taylor,1985), можно попытаться оценить временной ход активного состояния, изучая начальную скорость укорочения ыыыцц при быстрой освобождении как функцию времени от начала стимуляции. Если величина груза, поднимаемого мымцея при укорочении, является постоянной, то начальная скорость укорочения в любой момент времени будет определяться интенсивностью активного состояния в контрактильиом элементе и не будет зависеть от свойств последовательного упругого элемента.

Временной ход активного состояния ори максимальном тоническом сокращении я максимальной деполяризации. Быстрое освобождение изометрически сокращающейся мымцы приводит к резкому скачку длина,. обусловленному укорочением растянутого эластического элемента, и дальнейшему активному укорочению, начальная скорость которого отражает интенсивность активного состояния в контрактильном элементе (Hill,1972iUoriya.Miyazaki,1985). В намих опытах активное состояние в контрактильном элементе мымцы достигало максимума в течение первых двух секунд от начала сокращения. Со второй секунды начинался спад интенсивности активного состояния, имевния сложную кинетику. Сила, развиваемая мнмцей, достигала максимума

только к 20-Я секунде сокращения. Таким образом, время достижения максимальной силы на порядок превыщает время достижения максимума интенсивности активного состояния в контрактильном элементе мынцы. На протяжении трехминутной калиевой деполяризации интенсивность активного сотояния в контрактильном элементе мышцы, оцениваемая по начальной скорости укорочения, падала примерно на BOX по отношении к максимальной. Падение сила сокращения в этих условиях составляло около 40Х. Иными словами,.на поздних стадиях калиевоя контрактуры ммнца в больней степени теряла способность к укорочению (а, следовательно, и к выполнению внемнея работы), чем к поддержанию изометрической силы. Аналогичная зависимость наблюдалась в ГНК taenia coli морской свинки.

Описанное здесь соотношение между динамикой начально« скорости укорочения и изометрической сила подучено на максимуме тонического сокращения. Кок было показано нами ранее, максимум тонического сокращения наблюдается при умеренной деполяризации ГМК (ГК|- = 40 ммоль/л). Учитывая то, что при дальнейшем увеличении |К ) - амплитуда тонического сокращения падает, представляло интерес изучение динамики актинпого состояния при полноя деполяризации мембраны ГМК, Проведенные опыты показали, что зависимыми от потенциала на мсмбрапе ГМК являются установившиеся значения силы, но я»> скорости укорочепил. Скорость укороЧеяия мышц» по Я й мину те деполяризации стремится и пекотороя постоянной величине, рвв ной примерно 0,4 - 0,5 мышечной длинн в секунду.

Влияние осмолярности и ионной сипи гиперкалиевих растворов на премениой ход активного состояния в полностью депо.чяризовяпной гладкой мышце. Ранее нпми было показано, что в гипсросмолярном гинеркалиепом растворе(|К 1„ = 120 ммоль/л) амплитуда тонического

компонента сокращения достоверно больне, чем в изоосмолярном. Bj свази с этим небходиио было изучить влияние осмолярности и ионной силы на временной ход активного состояния в контраКтильном элементе мннцн. В результате проведенных опытов установлено, что повышение осмотического давления и ионной силы деполяризующего раствора практически ее влияет на динамику активного состояния, оцеяиввемув по начальной скорости укорочения. Вместе с тем, временной ход изометрической сипы существенно зависел от осмолярнос-. ' 1 ти гиперкалиевых растворов.

Таким образом, в данной серии опытов показано, что осмотическое давление деполяризующего раствора и его ионная сила имеют существенное значение для поддержания изометрической силы, но не влияет на скорость укорочения мыкан, то есть на скорость циклиро-вания поперечных мостинор.

Влияние субстанции Р и кофеина на временной ход активного состояния деполяризованной гладкой нряцн.' Как было показано выще, с помощью субстанции Р и кофеина можно существенно модифицировать калиевув контрактуру: субстанция Р, апплицируемая одновременно с изотоническим гицерквлиевым раствором ([К]. = 120 ммоль/л) увеличивает амплитуду тонического компонента, сокращения, а кофеин, ап-плицируемый на фоне установившейся калиевой контрактуры, вызывает новое фазное сокращение путем освобождения кальция из СОР. Представляло интерес изучить, как скажется такая модификация на временном ходе активного состояния в контрактильном элементе ГИК. Для рещевия этого вопроса была исследована начальная скорость укорочения мымцы после быстрого освобождения при деполяризации изотоническим раствором с [К]. = 120 ммоль/л,содержащим 7,4-Ю.-» моль/л субстанции Р. В присутствии субстанции Р замедлялся спад

изометрической силы деполяризованной мницв. Вследствие этогоамп-литуда тонического компонента сокращения на 3-я минуте деполяризации била примерно в два раза выме по сравнению с контрольным сокращением. Однако, динамика начальной скорости укорочения в обоих случая* практически одинакова-, к 3-й минуте деполяризации она уменьшается в средпем на 80*. Данный результат является еще одним доказательством в пользу того, что интенсивность активного состояния, оцениваемая по начально« скорости укорочения не зависит от стационарной концентрации ионов кальция в миоплазме.

В связи с этим представляло интерес изучить влияние повторного увеличения уровня ионизированного кальция на интенсивность активного состояния в деполяризованной гладкой мымце. Кофеин яв-ляётся наиболее доступным средством для такого рода экспериментов, благодаря своей способности'вызывать фазное сокращение деполяризованной гладкой мымцы путем освобождения кальция из СПР.

Опыты с кофеином проводились на деполяризованной изотоническим раствором ([К]« = 120 ммоль/л) гладкой мымце фундального отдела желудка при комнатной температуре. Кофеин (20 ммоль/л) добавляли в гиперкалиевыя раствор после установления тонического компонента калиевой контрактуры. Аппликация кофеина на фоне установившегося тонуса приводила к значительному возрастание начальной скорости укорочения, а также изометрической силы. Такой же эффект воспроизводился при повторных аппликациях.кофеина, причем увеличение начальной скорости укорочения предшествовало нарастании изометрической силы.

ОБСУЖДЕНИЕ.

В настоящее время твердо установлено, что механическое состояние ГИК фундального отдела желудка регулируется уровнем меВ-радного потенциала (Ыогкап at.oX,1981; Szurszeirski , 1984). Деполяризация мембраны мыщечнт клеток в результате действия неяромедчаторов, электрического тока или гиперкалиевого раствора приводит к повыиепив тонического напряжения. Ори длительной деполяризации тоническое напряжение устанавливается на некотором постоянном уровне, зависшем от величины этой деполяризации (Boev,1978; Ifordan et.al,1981). Учитывая противоречивость литературных данных относительно потенциапозависимости тонического компонента сокращения гладких мышц при стопяоя деполяризации, мы предприняли попытку изучить зависимость "(К]. - тонус" и влияние

s

на нее асмолярности и ионноя силы гиперкалиевых растворов.

Результаты проведенных опытов показали, что при физиологических значениях оснолярности и иоввоя силы деполяризующих растворов потенциалозависимость тонического компонента сокращения ГМК фундального отдела желудка, полученная методом калиевоя деполяризации, качественно совпадает с потенциалозависимостьв, полученной методом электронной фиксации потенциала в кофигурвции двойного сахарозного мостика (Рекалов и др.,1985).

Сочетание метода "химической фиксации" потенциала с быстрым освобождением позволило нам изучить связь между уровнем деполяризации поверхностной мембраны и механическими процессами, протекавшими в контрактильном элементе ГМК фундального отдела желудка. Такого рода эксперименты представляется актуальными, поскольку в подавляющем большинстве электрофизиологических работ, ваправлен-ных на изучение сопряжения возбуждения с механическим ответом

ГНК, авторы ограничиваются регистрацией только линь изометрического или изотонического сокращения. Вместе с тем, результаты опытов с быстрым освобождением гладки» мышц, находящихся в состоянии тетануса, показывают, что сипа мышцы и скорость ее укорочения находятся в сложном взаимоотношении ( Moriya, Miyazaki,1985; Schonenberg,1985; Stephens,1985) .

Данные о динамике начальной скорости укорочения мымпн, полученные нами на максимуме зависимости "[К]. - тонус", качественно совпадают с данными других авторов, изучавших максимально активированную гладкую мышцу (Могiya,Miyazaki,1985;Sieenan et al,1985; Stephens et al,1985).

Значительное уменьшение скорости укрочеяяя мышцы при длительном тоническом сокращении коррелирует со снижением степени фосфорилйроВаник легких цепей миозина (üaisbrodt.Merphy,1985) . По данным указанных авторов степень фосфорилирования легких цепей миозина контролирует скорость циклирования поперечных мостиков. Количество работающих мостиков, а, следовательно, и сила мышцы при этом контролируется другим, пока пе идентифицированным механизмом (Kamm.Stull,1985).

Согласно современным представлениям, дефосфорилировавие легких цепей миозина, осуществляемое фосфатаэой, происходит после распада комплекса Са - квльмодулин вследствие снижения уровня ионизированного кальция в'киоплаэмег Следовательно, степень дефос-форилирования легких цепей миозина должна определяться степенью снижения уровня ионизированного кальция я миоплаЗме. Учитывая это, а также то, что степень фосфорилирования легких цепей миозина контролирует скорость укорочения мышцы, можно было ожидать одинаковой зависимости изометрической силы и начальноя скорости

укорочения от степени деполяризации мембраны ГИК. Однако, временной ход начальной скорости укорочения мымцы, в отличие от изометрической силы, оказался, по данным намих опытов, не зависимым от потенциала на мембране. Этот факт, по-видимому, означает, что спад начальной скорости укорочения гладкой мымцы при длительной деполяризации не зависит от стационарного уровня ионизированного кальция в миоцлазме.

Постольку, поскольку мы не располагали возможностью измерения- динамики свободного кальция в миоплазме ГНК во время длительной калиевой контрактуры, небходимо было попытаться получить дополнительные косвенные доказательства независимости временного хода начальной скорости укорочения от уровня ионизированного кальция в миоплазме. С этой целью мы использовали субстанцию Р, которая при совместной аппликации с гиперкалиеаым раствором почти в два раза увеличивает амплитуду калиевой контрактуры; было изучено также влияние на скорость укорочения мнмцн гипертонического гиперкалиевого раствора, учитывая то, что амплитуда тонического компонента сокращения в гипертоническом растворе, значительно больме, чем в изотоническом.

В результате этих опытов было установлено, что времепной ход* пачальвой скорости укорочения стастически достоверно не изменялса ни под влиянием субстанции Р, пи под влиянием повыменной осмоляр-, ности гиперкалиевого раствора. Таким образом, получены дополнительные доказательства того, что динамика начальной скорости укорочения гладкой мымцы не зависит от стационарного уровня ионизированного кальция в миоплазме.

Вами данные согласуются с данными, полученными в опытах на taenia coli кролика (Sieeman et al,1986). Авторы показали, что на

40-Я секунде стимуляции скорость укорочения мышцы при быстром освобождении, а также степень фосфорилирования легких цепей миозина пе зависят от концетрации кальция в омывающем растворе.

Вместе с тем, временной'ход изометрической силы, по-видимому, отражает изменения уровня ионизированного кальция в миоплазме ГМК. Косвенным подтверждением этому служит сходство кинетических параметров спада изометрической силы при переходе фаэно-тетани-. ческого комиопенто сокращения в тонический и пря реполяриэвцпп мышцы. Близкие эначепия константы скорости, а также одинаковая температурная зависимость свидетельствуют о том, что спад силы в указанных двух случаях определяется одним л тем же механизмом.

Полученные пами данные свидетельствуют о независимости на-

\

чапъной скорости укорочения гладкой мышцы от стационарного уровня ионизированного кальция в миоплазме при калиевой деполяризации. Представляло интерес выяснить как скажется на скорости укорочения мышцы преходящее повышение концентрации цитоплазматического кальция, вызываемое на фоне установившейся калиевой контрактуры с помощью кофеина. Как показали результаты экспериментов, аппликация кофеина на фоне установившейся калиевой контрактуры вызывает новое фазное повышение изометрической силы, которому предшествует увеличение начальной скорости укорочения.

Следовательно, начальная скорость укорочения мышцы регулируется измепепием уровня ионизированного кальция в миоплазме, но не его стационарным значением.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами установлено, что.скорость укорочения гладких мышц фундального отдела желудка при длительных тонических сокращениях пе зависит от степени активации мышцы и стремится к некоторому постоянному,

очень незначительному по сравнению с максимумом, уровню. Установленное свойство имеет важное значение длн объяснения энергетической экономичности гладкой мыицы при ее тонических сокращениях.

выводи.

, 1. Зависимость тонического компонента калиевой контрактуры ГНК■ фундального отдела хепудка морской свинки от концентрации внеклеточного калия имеет колоколообразну» форму с максимумом при [К]. = 40 ммоль/л. 1

2. Оовнкение осмолярности к конвой силы гиперкалиевнх растворов приводит к увеличению амплитуды тонического компонента калиевой контрактуры.

3. Временной ход активного состояния в ГИК фундального отдела желудка, оцениваемый но изометрической силе и по начальной скорости укорочения, различен. Значительная изометрическая сила может поддерживаться на фоне низкой скорости укорочения.

4. Пиковое значение скорости укорочения ГМК определяется частотой ПД, возникающих в начале калиевой деполяризации и, еле- '

^довагельно, скоростью нарастания концентрации ионов кальция в цитоплазме .'

5. Стационарное значение интенсивности активного состояния в контрактипьном элементе ГМК фундального отдела желудка не зависит от степени деполяризации мембрани, осмолярности и ионной силы деполяризующих растворов и не изменяется под воздействием субстанции Р.

6. Кофеиновое фазное сокращение, вызываемое на фоне устано-

вившейся калиевой контрактуры, сопровождается повышением скорости укорочения мышцы.

7. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности направленного влияния на величину изометрической силы гладкой мымцы без изменения скорости ее укорочения.

Материалы диссертации опубликовапи в следующих работах:

X, Имиголь A.B. Влияние начальной длины гладких мышц на их работоспособность .//Физиология процессов утомпенив и восстановления. - Киев, 1986. - С.46 - 49.

»

2. Имиголь A.B. К1нетичн1 особливост! нейро-гуморапьних вплив1в на гладеньк! м'язи травного каяаяу.// 12-й э'1зд Ук-ра1нського Ф1з1олог1чного товариства. Теэи допов!дей. - Льв1в, 1986. - С.453.

3. Демьяненко B.C., Паливаяко Д.Г., Имиголь A.B. Действие субстанции Р на гладкие мымцы желудка и толстой кишки.// Физиология пептидов. - Ленинград, 1908. - С.53 - 55.

4. Имиголь А.В..Демьяненко B.C. Влияние нейротензина и субстанции Р на активное состояние гладких мышц желудка.// Физиологический журнал СССР. 19В9, т. 25,N6 . - С.829 - 836.

5. Паливайко П.Г..Имиголь A.B. Динамика активного состояния в гладких мышцах пилорического и фундальпого отделов желудка . //Физиология и патология сфинктерннх аппаратов пищеварительной системы. - Томск, 1989. - С.17 - 18.

V

' I I ■

' !¡j

7