Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Исследование аномалий ядер в популяциях соматических клеток, подвергшихся лучевым воздействиям in vitro и in vivo

На правах рукописи

ИБРАГИМОВА

Наталья Владимировна

ИССЛЕДОВАНИЕ АНОМАЛИЙ ЯДЕР В ПОПУЛЯЦИЯХ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК, ПОДВЕРГШИХСЯ ЛУЧЕВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ IN VITRO И IN VIVO

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в секторе клиническом лабораторно-диагностическом Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Кравцов Вячеслав Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук

Богословский Михаил Михайлович Воробьев Константин Владимирович

Ведущая организация: Институт цитологии РАН

Защита состоится ^йЬ^Я-Яр^ 2004 г. в/3 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01. при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России.

Автореферат разослан « V » /-¿¿Х^^^Ми- 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Алексанин С.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Использование энергии атома наряду с решением проблемы обеспечения цивилизации необходимой энергией имеет негативные последствия из-за угрозы техногенных радиационных катастроф, а также возможностью проведения террористических актов с применением ядерных зарядов. Известно, что радиационный фактор опасен для здоровья человека и вызывает необратимые пагубные изменения в организме. Воздействия ионизирующей радиации на клеточные популяции приводят к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами (Лаптева-Попова М.С. и др., 1959; Bhattathiri N.V. et al., 1998; Thomas P. et al., 2003), которые в клинической цитологии относятся к проявлению лучевых патоморфозов (Агамова К.А., 1997). Возникновение клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер может быть обусловлено хромосомными аберрациями (дицентрическими и кольцевыми хромосомами), являющимися надежными цитогенетическими маркерами лучевых воздействий (Gisclsson D., 2000; Никифоров A.M. и др., 2000). Таким образом, количественный учет клеток с радиоспецифическими аномалиями ядер может стать лабораторным экспресс-методом лучевой биоиндикации и оказаться востребованным в условиях чрезвычайных ситуаций.

Лимфоциты периферической крови являются наиболее изученными, удобными и вместе с тем радиочувствительными клетками для практического использования их в целях биоиндикации лучевых факторов. Стандартным лабораторным методом для оценки влияния мутагенных, в том числе и радиационных факторов, является цитохалазиновый метод оценки микроядер в культуре лимфоцитов человека (Fenech M., Morley A.A., 1985). В настоящее время разработчиками цитохалазинового метода вносятся в протокол существенные дополнения, усиливающие его информативность (Thomas P. et al., 2003; Fenech M., 2003). Предлагается наряду с микроядрами в цитохалазиновом методе учитывать межъядерные хромосомные мосты и ядерные почки (Kimura M. et al., 2004). Справедливым будет отметить, что наряду с перечисленными выше видами аномалий ядер в культуре лимфоцитов цитохалазиновым методом после рентгеновского облучения обнаруживаются клетки с гантелевидными ядрами, возникновение которых может быть обусловлено дицентриками и кольцами (Никифоров А.М. и др., 2000). Однако этот вид аномалий ядер остался не включенным в ныне усовершенствованный протокол цитохалазинового метода.

Поскольку количественный учет клеток с радиоспецифическими аномалиями ядер является лабораторным методом биоиндикации лучевых факторов, практически очень важным представляется изучение радиационно-индуцированных аномалий ядер лимфоцитов не только в условиях культуры in vitro, но и в популяциях Лабораторный метод выявления таких аномалий

I о»" »Iw^i

(из пальца) в отличие от культурального метода требует гораздо меньших временных и материальных затрат. Он вполне может выполняться в условиях медицинских пунктов в случае возникновения чрезвычайных радиационных ситуаций.

Цель исследования. Изучить аномалии ядер в культурах лимфоцитов, облученных в экспериментальных условиях in vitro и в лимфоцитах периферической крови in vivo у лиц, подвергшихся воздействию факторов аварии на Чернобыльской АЭС.

Задачи исследования:

1. В диапазоне малых доз облучения, путем проведения эксперимента в режиме "доза-эффект" в культуре лимфоцитов человека (цитохалазиновым методом) определить характер дозовых зависимостей для клеток с морфологическими аномалиями ядер (и в первую очередь с гантелевидными ядрами). Определить коррелятивные связи между дицентрическими и кольцевыми хромосомами, с одной стороны, и межъядерными мостами, ядерными протрузиями и гантелевидными ядрами - с другой.

2. Определить частоту встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер (гантелевидными ядрами, микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами) в периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии.

3. Изучить особенности расположения протрузий в ядрах лимфоцитов in vivo периферической крови человека.

4. Исследовать in vivo количество ядрышек в ядрах лимфоцитов у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии.

5. Определить частоту встречаемости клеток буккального эпителия с морфологическими аномалиями ядер (микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами) у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии.

Научная новизна. Впервые установлен характер зависимости от дозы рентгеновского облучения для показателя "частота встречаемости клеток с гантелевидными ядрами" в культуре лимфоцитов человека и представлена калибровочная дозо-зависимая кривая в диапазоне малых доз облучения.

Впервые установлено неслучайное расположение протрузий в ядрах лимфоцитов человека.

Впервые выявлены повышенные частоты встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер в периферической крови чернобыльских ликвидаторов через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС.

Впервые обнаружено, что у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии увеличено количество ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови.

Практическая значимость. Результаты экспериментального исследования с облучением лимфоцитов периферической крови, в котором были установлены калибровочные кривые для морфологических аномалий ядер, указывают на возможность рекомендовать определение частоты встречаемости клеток с гантелевидными ядрами в культуре лимфоцитов цитохалазиновым методом в целях биоиндикации воздействия радиационных факторов на организм человека. В этих же целях рекомендуется определение частот встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер (ядерными протрузиями, межъядерными мостами и микроядрами) в периферической крови in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Рентгеновское облучение в диапазоне малых доз индуцирует образование морфологических аномалий ядер: гантелевидных ядер, ядерных протрузий и межъядерных хроматиновых мостов в цитохалазиновых культурах лимфоцитов человека.

2. Частота клеток с гантелевидными ядрами, ядерными протрузиями, межъядерными хроматиновыми мостами зависят от дозы облучения (характер зависимости линейно-квадратичный) и положительно коррелируют с частотами метафаз с дицентрическими и кольцевыми хромосомами. Основной пул дицентрических хромосом в облученных in vitro и культивированных с добавлением цитохалазина Б лимфоцитах человека трансформируется в гантелевидные ядра.

3. В лимфоцитах периферической крови in vivo у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии (через 13-15 лет) достоверно повышена частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями (р<0,001), микроядрами.(p<0,0l) и межъядерными мостами (р<0.01) по сравнению с контрольной группой.

Апробация и реализация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 2-ом Международном Симпозиуме "Хроническое радиационное воздействие: возможности биологической индикации" . (Челябинск, 2000), 4-ом Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), Международной научно-практической конференции "Медико-биологические последствия чрезвычайных ситуаций" (Санкт-Петербург, 2001), Международной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации: предупреждение и ликвидация" (Минск, 2001).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из 4 глав, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 138 источников, в том числе 46 отечественных и 92 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 25 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследуемые группы ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской атомной электростанции, группы сравнения и доноры.

Обследованная выборка ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС составила 186 человек и была разделена на две группы. Первую группу (ликвидаторы 1) составили 101 человек (мужчины) в возрасте от 39 до 55 лет, подвергшиеся воздействию комплексов неблагоприятных факторов Чернобыльской катастрофы 6-9 лет назад (исследование в этой группе было проведено в период с 1995 г. по 1998 г. В.Ю.Кравцовым и сотрудниками в г. Санкт-Петербурге). По данным истории болезни, все они получили малые дозы облучения (до 0,25 Гр). Вторая группа ликвидаторов (ликвидаторы 2) была представлена 85 мужчинами в возрасте от 42 до 60 лет, также находившихся в зоне аварии на ЧАЭС. Обследование группы ликвидаторов 2 выполнялось нами в период с 2000 г. по 2002 г., т.е. через 13-15 лет после аварии. Цитологические препараты от группы ликвидаторов 2 были получены для исследований из банка биоматериалов, созданного во ВЦЭРМ МЧС России в рамках проекта Я88 N 2145/1705/2000.

Контрольную группу составили 114 здоровых мужчин в возрасте от 19 до 60 лет, не подвергавшихся ранее (по анкетным данным) радиационному воздействию.

Для проведения экспериментов с культурами лимфоцитов был привлечен донор-доброволец, клинически здоровая женщина в возрасте 21 года.

Приготовление гематологических препаратов. Гематологические препараты периферической крови готовили обычным способом с окрашиванием азур 2-эозином по Романовскому.

Определение частоты встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер (ядерными протрузиями, межъядерными мостами и микроядрами) определяли в выборках из 500 лимфоцитах.

Получение препаратов мстафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови человека проводили по методике, описанной Г.Макгрегором и Дж.Варли (Макгрегор Г., Варли Дж., 1986) путем культивирования ФГА-стимулироваппых лейкоцитов через 48 часов.

Получение препаратов лимфоцитов периферической крови человека в цитохалазиновом блоке проводили по методу М.Фенеча (Fenech M, Morly A.A., 1985). Подсчитывалось от 500 до 3000 двуядерных клеток.

Схема проведения эксперимента с рентгеновским облучением культур лимфоцитов человека in vitro для определения домовых зависимостей. В эксперименте использовали венозную кровь клинически здорового донора-женщины 21 года. Гепаринизированную кровь поместили стерильно в 10 пластиковых шприцов объемом 3 мл. В течение часа после взятия крови 9 шприцов с кровью были облучены соответственно дозами 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5 и 2.0 Гр при комнатной температуре на аппарате РУМ-17, 200 кВ, 13мА, фильтр 1,0 мм Си, фокусное расстояние 30 см при мощности дозы 77,4 Р/мин., а один (0.0 Гр) облучен не был. Эксперимент был проведен таким образом, что все содержимое каждого шприца (3 мл) было распределено по 6 флаконам, 3 из которых использовались для культивирования с BrdU с целью получения препаратов метафазных хромосом, а другие 3 флакона - для культивирования с цитохалазином Б с целью получения препаратов двуядерных клеток. Схема проведенного эксперимента представлена на рис. 1. На каждую дозу анализировали 20006000 двуядерных клеток и не менее 400 метафазных пластинок. Хромосомные аберрации учитывали в метафазах первого деления. В порядке убывания дозы было подсчитано от 2500 до 5500 двуядерных лимфоцитов. Микрокопирование проводили под иммерсией (об. 100х, ок. 10х) на зашифрованных препаратах. Цитогенетические исследования проводились совместно с Н.М.Ярцевой и Р.Ф.Федорцевой.

Выявление ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови проводили по методике, рекомендованной Н.Н.Мамаевым (1984) путем окрашивания ядрышковых организаторов нитратом серебра. Ядрышки в ядрах лимфоцитов периферической крови были изучены у 84 человек из группы ликвидаторов 2.

Исследование морфологических аномалий ядер в сквамозных клетках буккального эпителия. Препараты клеток плоского эпителия ротовой полости (буккального эпителия) получали шпателем по стандартному методу. Окрашивание проводили флуорохромом Хехст 33258, микроскопировали под иммерсией (об. 100х, ок. 10х). От каждого обследуемого изучали 3000-5000 клеток плоского зрелого эпителия без признаков дегенерации. Частоту встречаемости клеток с морфологическими аномалиями ядер выражали в процентах.

Статистическая обработка экспериментальных данных. Проводилась с использованием пакета программ Statistica 5.1 для параметрической и непараметрической статистик.

Рисунок 1. Схема эксперимента

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование морфологических аномалий ядер в культуре лимфоцитов периферической крови человека in vitro в эксперименте с рентгеновским облучением. Был исследован характер дозовой зависимости для ядерных протрузий в эксперименте с облучением лимфоцитов человека дозами О О, ОЛ; 0.2; 0 4; 0 5; 0 7; 1.0; 1.5 и 2 0 Гр, а параллельно с ядерными протрузиями исследовалась частота метафаз с дицентрическими и кольцевыми хромосомами, индуцированными дозами 0 0, 0 2; 0.4; 0.7; 1.0, 1.5 и 2 0Гр.

Протрузий ядер лимфоцитов в наших наблюдениях выглядели как выросты хроматина ядра в цитоплазму. Кривая, иллюстрирующая зависимость частоты встречаемости клеток с ядерными протрузиями от дозы рентгеновского облучения, представлена на рис. 2.

О 0,2 04 Об 0,8 1 12 14 16 IB I 22

Доза (Гр)

Рисунок 2 Зависимость частоты встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями от дозы рентгеновского облучения

По вертикали - частота лимфоцитов с ядерными протрузиями (%), по горизонтали - доза облучения (Гр)

Кривая "доза-эффект" для признака "частота метафаз с дицентриками и кольцами" проиллюстрирована на рис. 3. Очевидно, что характер этой зависимости линейно-квадратичный и описывается функцией вида: у(0)=0.007+0 0Ш+0 0460 2, где у - частота метафаз с дицентриками и кольцами, D - доза облучения В исследованном диапазоне доз Х-облучения наблюдается положительная корреляция между частотой клеток с ядерными протрузиями и частотой метафаз с дицентриками и кольцами (г=0.88, р<0 05), поэтому гипотезу о связи между дицентриками и ядерными протрузиями на основании полученных результатов отвергнуть нельзя.

Рисунок 3. Зависимость частоты встречаемости метафаз с дицентриками и кольцами от дозы рентгеновского облучения в культуре лимфоцитов человека. По вертикали - частота метафаз с дицентриками и кольцами (%); по горизонтали - доза облучения (Гр)

1,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2

Доза (Гр)

Рисунок 4 Зависимость частоты встречаемости лимфоцитов с межъядерными хромосомными мостами от дозы рентгеновского облучения. По вертикали - частота лимфоцитов с мостами (%), по горизонтали - доза облучения (Гр)

В популяциях двуядерных лимфоцитов встречаются клетки с мостами, которые в виде хроматинового тяжа соединяют ядра двуядерной клетки между собой. Частота встречаемости клеток с мостами прямо пропорционально зависит от дозы облучения (рис. 4). Уравнение, которое описывает зависимость частоты клеток с мостами от дозы Х-облучения в проведенном нами эксперименте, приняло вид: у(0)=0.000722+0.004ЕН-0.00Ш 2, где у - частота клеток с мостами, D - доза облучения. Коэффициент корреляции между дицентриками и мостами составил 0.97 (р<0.05).

Отметим некоторое количественное несоответствие между частотой дицентриков и колец, с одной стороны, и частотой ядерных протрузий и мостов - с другой. Дицентрик может сформировать мост в митозе, если центромеры дицентрика ориентируются к разным полюсам. Дицентрик также может разойтись в митозе без формирования моста, если обе центромеры дицентрика ориентированы к одному из двух полюсов. Вероятность каждого из этих событий оценивается как 1/2. Таким образом, на одну двуядерную клетку, прошедшую первый митоз и имеющую ядро с протрузией или межъядерный мост, должны приходиться две метафазы первого митоза с дицентриком (или центрическим кольцом). По фактическим данным проведенного эксперимента после облучения дозой 2.0 Гр в первом митозе возникло 21,8% метафаз с дицентриками и кольцами, следовательно, процент двуядерных клеток с ядерными протрузиями и мостами должен составить 10,9%. В реальности после облучения этой дозой и прохождения первого постлучевого митоза образовалось 3,97% клеток с ядерными протрузиями и 1,5% клеток с мостами, т.е. в сумме 5,47%, а не 10,9%, как ожидалось. Можно предположить, что значительная часть анафазных мостов реализуется в какие-то другие формы аномалий ядер, морфологически отличающиеся от ядерных протрузий и мостов. Наиболее вероятной формой аномалий интерфазных ядер, в которую чаще всего трансформируются анафазы с мостами, являются на наш взгляд гантелевидные ядра. Размеры клеток с гантелевидными ядрами, как правило, соответствовали размерам двуядерных клеток, а общая площадь одного гантелевидного ядра соответствовала сумме площадей двух ядер двуядерной клетки. Почти в половине случаев в цитоплазме клеток с гантелевидными ядрами находились одно или более микроядер. Частота метафаз с дицентриками и фрагментами абсолютно коррелирует с частотой клеток с гантелевидными ядрами и микроядрами (г=1.0) Возможно, решающим фактором того, что дицентрики чаще образуют гантелевидные ядра, а не мосты и ядра с протрузиями, является применение в проведенном эксперименте цитохалазина Б.

График зависимости частоты клеток с гантелевидными ядрами представлен на рис. 5. Зависимость линейно-квадратичная и описывается функцией вида: где у - частота клеток с

гантелевидными ядрами, D - доза облучения. Справедливо будет отметить,

что по форме (по контуру) кривая для "гантелей" в большей степени, чем кривые для ядерных протрузий и мостов соответствует кривой для дицентриков и колец. Коэффициент корреляции между дицентриками и гантелевидными ядрами составил 0.98 (р<0.05)При всех исследованных дозах абсолютные значения частоты клеток с гантелевидными ядрами меньше абсолютных значений частоты метафаз с дицентриками и кольцами.

Рисунок 5 Зависимость частоты встречаемости лимфоцитов с гантелевидными ядрами от дозы рентгеновского облучения.

По вертикали - частота лимфоцитов с гантелевидными ядрами (%), по горизонтали - доза облучения (Гр)

Главными результатами исследования с экспериментальным облучением культуры лимфоцитов человека стали.

1. Построены дозо-зависимые калибровочные кривые для показателей "частота двуядерных клеток с ядерными протрузиями", "частота двуядерных клеток с межъядерными мостами" и "частота клеток с гантелевидными ядрами"в эксперименте с рентгеновским облучением лимфоцитов человека дозами 0.0; 0.1; 0.2; 0.4; 0.5; 0.7; 1.0; 1.5 и 2.0 Гр и последующим культивированием с цитохалазином Б;

2. В одном и том же диапазоне доз экспериментального облучения сопоставлены дозо-зависимые кривые для частоты клеток с ядерными протрузиями и для частоты метафаз с дицентриками и кольцами. Проведенное сопоставление не опровергло выдвинутого ранее предположения о том, что в облученных клеточных популяциях образование ядерных протрузий сопряжено с возникновением дицентрических хромосом. Положительная корреляция между ядерными протрузиями и дицентриками наблюдается и в диапазоне малых доз Х-облучения,

3. Изучая ядерные протрузии, мы наткнулись на другой, не менее интересный и не менее важный, феномен - гантелевидные ядра.

Результаты проведенного исследования позволяют обосновать предположение о том, что в популяциях облученных и культивированных с цитохалазином Б лимфоцитах основной пул морфологических аномалий ядер, возникающих из дицентрических (и кольцевых) хромосом, представлены гантелевидными ядрами.

Морфологические аномалии ядер лимфоцитов в периферической крови человека in vivo. Микроядра в лимфоцитах, которые мы наблюдали и регистрировали в мазках периферической крови человека, представляли собой округлые хроматиновые образования размерами от 0,5 до 4,0 мкм. Как правило, в цитоплазме лифоцитов находилось только одно микроядро, хотя были случаи, когда в цитоплазме одного лимфоцита было два и более микроядер. Межъядерные хромосомные мосты в лимфоцитах периферической крови человека наблюдались в двуядерных клетках. Они представляли собой хроматиновые тяжи толщиной от 0,5 до 1,5 мкм, которые соединяли ядра между собой. Иногда в цитоплазме клеток с межъядерными мостами находились микроядра. Гантелевидные ядра наблюдались только в одноядерных лимфоцитах, по размерам соответствующих двум слившимся лимфоцитам. Гантелевидные ядра в лимфоцитах периферической крови человека - события крайне редкие (удалось пронаблюдать и зафиксировать не более десятка таких случаев за все время исследования). Ядерные протрузии представляли собой выпячивания хроматина из ядра в цитоплазму. Как правило, они имели булавовидную форму, т.е. были с расширением на конце в виде овального или круглого микроядра. Величина ядерных протрузии (точнее сказать длина) варьировала от 2 мкм до 7 мкм.

В процессе изучения и регистрации лимфоцитов с ядерными протрузиями было сделано наблюдение, указывающее на определенную закономерность в пространственном расположении протрузии в ядрах. За время проведения исследования морфологических аномалий ядер нами было обнаружено и запротоколировано в виде схем, изображающих во всех деталях контуры ядер с протрузиями, 169 лимфоцитов. Оказалось, что 113 из них (42%) имели бобовидное ядро. Поверхность бобовидных ядер можно условно подразделить на участки - вогнутая поверхность, выпуклая поверхность и два вершинных участка. Оказалось, что в 81,4% случаев ядерпые протрузии располагались на вогнутой части бобовидного ядра. Значительно реже ядерные протрузии располагались на лопастях (15%) и только в 3,6% случаев ядерные протрузии находились на выпуклой поверхности бобовидного ядра. Представленные результаты однозначно указывают на неслучайный характер распределения ядерных протрузии в ядрах лимфоцитов человека.

Частота встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер в периферической крови у здоровых доноров и у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.

Частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями в периферической крови у здоровых доноров и у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.

Частоту встречаемости лимфоцитов с морфологически аномальными ядрами исследовали в выборке необлучавшихся (судя по анамнезу) здоровых на момент обследования мужчин-доноров (контроль), в выборках ликвидаторов, обследованных через 6-9 лет (ликвидаторы 1) и обследованных через 13-15 лет (ликвидаторы 2) после участия в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС.

Данные исследования частоты встречаемости в периферической крови лимфоцитов с ядерными протрузиями у здоровых мужчин (п=114), не подвергавшихся ранее лучевым воздействиям (судя по анамнезу), представлены на рис. 6. Гистограмма распределения доноров по показателю "частота встречаемости клеток с ядерными протрузиями" в этой контрольной группе, как видно, не соответствует нормальному распределению. Модальный класс (более 53%) составляют доноры, у которых лимфоциты с ядерными протрузиями обнаружены не были. Средняя частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями в контрольной мужской выборке составила 0,14%. На рис. 6 также представлена гистограмма распределения мужчин-ликвидаторов (п=101), пребывавших в зоне радиационного загрязнения 6-9 лет назад (ликвидаторы 1), по признаку "частота лимфоцитов с ядерными протрузиями". Модальный класс в этом распределении был представлен ликвидаторами, имевшими 0,2% клеток с ядерными протрузиями. Ядерные протрузии в лимфоцитах были встречены у подавляющего большинства (более 85%) ликвидаторов; максимальная частота лимфоцитов с ядерными протрузиями достигла 1,8%, а средняя составила - 0,43%. Различие между 1-ой группой ликвидаторов и контрольной группой по исследованному показателю было достоверным (р<0.001, по критерию и-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни). Распределение 85 мужчин-ликвидаторов, пребывавших в зоне радиационного загрязнения в результате аварии на ЧАЭС 13-15 лет назад (ликвидаторы 2), по признаку "частота лимфоцитов с ядерными протрузиями" представлено на том же рис. 6. Как и в предшествующей 1-ой группе ликвидаторов (обследованных через 6-9 лет) модальный класс представляют лица, у которых частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями составила 0,2%. Средняя частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями в выборке ликвидаторов через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии не только не понизилась, а наоборот, даже несколько повысилась до 0,56% (по сравнению с данными аналогичного обследования через 6-9 лет после пребывания в зоне аварии).

Различие между выборкой здоровых мужчин-доноров и 2-ой группой ликвидаторов, обследованных через 13-15 лет после пребывания в зоне ЧАЭС было аргументировано И-критерием Вилкоксона-Манна-Уитни (р<0.001). Достоверные различия между двумя рассматриваемыми группами ликвидаторов по этому критерию выявлены не были (р>0.05). Очевидно, что даже через 13-15 лет после пребывания в зоне радиоактивно загрязненной в результате аварии на ЧАЭС, повышенный уровень аномалий ядер типа ядерных протрузий не снижается.

Рис 6. Гистограмма распределения лиц контрольной группы (контроль), ликвидаторов через 6-9 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭГ (ликвидаторы 1) и ликвидаторов, через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС по признаку "частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями в периферической крови". По вертикали - число обследованных лиц (%); по горизонтали - частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями (%)

Частота встречаемости лимфоцитов с межъядерными хромосомными мостами в периферической крови у здоровых доноров и у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. Результаты наших исследований, выполненных в популяциях лимфоцитов периферической крови человека in vivo, показали, что в выборке здоровых необлучавшихся доноров средняя частота встречаемости лимфоцитов с мостами составила 0.005% + 0.001%, в группе ликвидаторов 1 - 0.033% + 0.01%, а в группе ликвидаторов 2 -0.042% + 0.008%. Различия между этими средними показателями в 1-ой и 2-ой группах ликвидаторов, с одной стороны, и в контрольной группе - с другой были достоверными (р<0.01, по t-критерию Стьюдента в обоих случаях). Средняя частота встречаемости лимфоцитов с межъядерными мостами, определенная в 1-ой группе ликвидаторов, не отличалась достоверно от таковой, определенной во 2-ой группе ликвидаторов (р>0.05, по t-критерию Стьюдента).

Частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами в периферической крови у здоровых доноров и у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. Гистограмма распределения 89 мужчин контрольной группы (необлучавшихся доноров) по показателю "частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами" представлена на рис. 7. Выраженный модальный класс (74,2%) составили лица, у которых микроядра не были обнаружены. Максимальная частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами в выборке необлучавшихся мужчин достигала 0,6%. Средняя величина этого показателя составила 0,07%. Распределение 101 ликвидатора 1-ой группы (ликвидаторы 1), обследованного через 6-9 лет после пребывания в радиационно-загрязненной зоне, также представлено на Рис. 7. Модальный класс составили ликвидаторы (46%), у которых микроядра в лимфоцитах не были обнаружены; а средняя частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами составила 0,19%. U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни выявил достоверные различия по частоте лимфоцитов с микроядрами между исследованной 1-ой группой ликвидаторов (через 6-9 лет после пребывания в зоне аварии) и выборкой необлучавшихся доноров-мужчин (р<0.01). На рис. 7 также представлена аналогичная гистограмма распределения по частоте встречаемости лимфоцитов с микроядрами 2-ой группы ликвидаторов (n=85), обследованных через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС. Модальный класс составили лица, у которых микроядра в лимфоцитах обнаружены не были, а средняя величина этого показателя составила 0,17%. Различия между 1-ой и 2-ой группами ликвидаторов (обследованных через 6-9 лет и через 13-15 лет после облучения) по непараметрическому U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни выявлены не были (р>0.05). Однако, этим же критерием были аргументированы достоверные различия между ликвидаторами группы 2 и выборкой необлучавшихся доноров контрольной группы (р<0.01).

Таким образом, представленные выше результаты (раздел 3 3) указывают на тот факт, что после лучевых воздействий малыми дозами (официально документированными для участников последствий аварии на ЧАЭС) частота встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер не снижается со временем, а остается на стабильно повышенном уровне даже через 15 лет после воздействия лучевых факторов.

Рис 7 Гистограмма распределения лиц контрольной группы (контроль), ликвидаторов через 6-9 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС (ликвидаторы 1) и ликвидаторов, через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии ЧАЭС по признаку "частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами в периферической крови".

По вертикали - число обследованных лиц (%); по горизонтали - частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами (%).

Исследование количества ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.

Хромосомные аберрации, возникающие в клеточных популяциях после облучения, могут приводить не только к видимым внешним морфологическим изменениям, но и к изменениям внутри самого ядра. Справедливым будет ожидать пространственные изменения со стороны ядрышек в клетках, в которых произошли хромосомные аберрации в результате облучения. Мы сфокусировали интерес на исследовании

Рисунок 8 Гистограммы распределения ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС (а) и лиц контрольной группы (б) по признаку "среднее количество ядрышек в ядрах лимфоцитов".

По вертикали - количество обследованных лиц (%), по горизонтали - среднее количество ядрышек в ядрах лимфоцитов (шт)

количества ядрышек в ядрах лимфоцитов ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.

В мазках периферической крови после окрашивания методом серебрения ядрышки в лимфоцитах выглядели как округлые образования цвета от бежево-коричневого до черного. Гистограммы распределений группы ликвидаторов (через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС) и контрольной группы сравнения по признаку "среднее количество ядрышек в ядрах лимфоцитов" представлены на рис. 8. Модальный класс представлен персонами, у которых среднее число ядрышек на ядро лимфоцита составляет 1,17. Среднее значение в выборке ликвидаторов по исследованному показателю составило 1,18, при размахе изменчивости от 1,05 до 2,00. В контрольной группе модальный класс составляют лица, у которых среднее число ядрышек в ядре составляет 1,1 ядрышка на ядро; отмечается значительно меньший размах изменчивости по исследуемому показателю. Максимальное количество ядрышек на ядро в группе необлученных составило 1,21, минимальное - 1,01, а среднее - 1,12. Между выборкой ликвидаторов и контрольной выборкой по показателю "среднее количество ядрышек в ядрах лимфоцитов" выявляются достоверные различия (р<0.01). Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о том, что в лимфоцитах периферической крови ликвидаторов количество ядрышек увеличено.

Морфологические аномалии ядер в сквамозных клетках буккального эпителия у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.

Частоту встречаемости клеток с аномальными ядрами в буккальном эпителии мы определяли только в клетках зрелого эпителия без признаков дегенеративных изменений. Все исследования морфологических аномалий в сквамозных клетках буккального эпителиявыполнены в цитологических препаратах окрашенных флуорохромом Хехст 33258. Возможно поэтому нам и удалось увидеть и зарегистрировать ядерные протрузии, основу которых составляла тонкая хроматиновая нить. Справедливым будет признать, что в предшествующих исследованиях, которые выполнялись в препаратах буккального эпителия окрашенных азур 2-эозином, нитевидные ядерные протрузии нами обнаружены не были. Средняя частота клеток с микроядрами в контрольной группе (15 мужчин) составила 0,19% при размахе изменчивости от 0,1% до 0,04%. В выборке ликвидаторов (10 мужчин) вариабельность этого признака была более существенной - от 0,0% до 0,75%, а средняя частота клеток с микроядрами составила 0,18%. Достоверное различие по показателю "частота клеток с микроядрами" между выборкой здоровых доноров и выборкой ликвидаторов U-критерием Вилкоксона-Манна-Уитни выявлено не было (р>0.05). В группе ликвидаторов вариабельность по признаку "частота клеток с ядерными протрузиями" была более существенной (min - 0% , max - 0,54%), чем в

контрольной группе (min - 0%, max - 0,15%). Показатель "частота клеток с ядерными протрузиями" в контрольной группе не превышал 0,15%, в то время как в группе ликвидаторов почти половина исследуемых имела величину этого показателя свыше 0,15%. Средняя частота встречаемости клеток с ядерными протрузиями у ликвидаторов оказалась выше, чем в контроле, и составила 0,19% против 0,10%. Вместе с тем, достоверность различий между сравниваемыми выборками ликвидаторов и лиц контрольной группы по показателю "частота клеток с ядерными протрузиями" не была аргументрирована U-критерием Вилкоксона-Манна-Уитни (р>0.05). Таким образом, в исследованной выборке облученных пациентов, ликвидировавших аварию на Чернобыльской АЭС, в отдаленные сроки после облучения (через 9-11 лет), не отмечается повышенной частоты встречаемости сквамозных клеток с ядерными протрузиями и микроядрами в буккальном эпителии.

В буккальном эпителии тест на аномальные ядра вряд ли можно назвать малозатратным экспрессным лабораторным методом (время занимает не менее 1,5 часа; для микроскопирования под иммерсией требуется люменисцентный микроскоп; для проведения одного теста необходим подсчет и анализ большого числа клеток (не менее 2000), который может длиться 2-3 часа). Главным неудобным обстоятельством для проведения теста на морфологические аномалии ядер в клетках плоского эпителия является присутствие в исследуемых клеточных популяциях клеток зрелого эпителия, которые уже имеют признаки дегенерации, обусловленные естественно протекающим процессом слущивания.

ВЫВОДЫ

1. В популяциях облученных и культивированных с цитохалазином Б лимфоцитов большинство морфологических аномалий ядер относятся к классу гантелевидных ядер, причиной возникновения которых становятся дицентрические (и кольцевые) хромосомы.

2. В диапазоне малых доз рентгеновского облучения выявлена положительная корреляция между показателями "частота встречаемости ядерных протрузий", "частота встречаемости межъядерных хромосомных мостов", "частота встречаемости клеток с гантелевидными ядрами" в популяциях лимфоцитов человека, культивированных цитохалазиновым методом и показателем "частота встречаемости метафаз с дицентрическими (кольцевыми) хромосомами".

3. Выявлено неслучайное расположение протрузий в ядрах лимфоцитов периферической крови человека. В лимфоцитах с ядрами бобовидной формы ядерные протрузий, как правило (в 81,4%±2,9% случаев)

локализуются на вогнутой части ядра, что вероятно, обусловлено закономерностями движения хромосом в митозе.

4. В периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС частота встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер, которые обусловлены геномной нестабильностью, остается стабильно повышенной в течение длительного срока (13-15 лет) после пребывания в зоне аварии ЧАЭС.

5. В лимфоцитах периферической крови in vivo у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии увеличено количество ядрышек.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При проведении микроядерного теста в культурах лимфоцитов цитохалазиновым методом целесообразно дополнительно учитывать клетки с гантелевидными ядрами, межъядерными мостами и ядерными протрузиями.

2. Метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с морфологическими аномалиями ядер предпочтительнее применять в лимфоцитах периферической крови, чем в клеточных популяциях плоского эпителия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование количества ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС // Цитология. - 2001. - Т.43, № 10. - С.941 - 943 (соавт. Туголукова Л.В., Кравцов В.Ю., Никифоров A.M.).

2. Изучение ядрышек в лимфоцитах периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС // Тез. докл. 4-ого съезда по радиационным исследованиям. - Москва, 2001. - Т. 1. - С. 156 (соавт. Туголукова Л.В.).

3. Банк биоматериалов от ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС как основа перспективного изучения влияния малых доз на организм человека // Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 2002. -№ 4. - С.23 - 26 (соавт. Шантырь И.И., Астафьев О.М., Кравцов В.Ю., Федорцева Р.Ф.).

4. О возможности биоиндикации лучевых воздействий цитологическим экспресс-методом // Чрезвычайные ситуации: предупреждение и ликвидация. Сб. матер. междунар. научн.-практ. конф. - Минск: БГУ, 2001. - С.236 - 237 (соавт. Кравцов В.Ю., Федорцева Р.Ф., Туголукова Л.В., Никифоров A.M.).

Отпечатало в ООО «АкадемПринт». С-Пб. ул. Миллионная, 19 Тел.: 315-11-41. Подписано в печать 01.11.04. Тираж 100 экз.

»212 4 5

Использование энергии атома наряду с решением проблемы обеспечения цивилизации необходимой энергией имеет негативные последствия из-за угрозы техногенных радиационных катастроф, а также возможностью проведения террористических актов с применением ядерных зарядов. Известно, что радиационный фактор опасен для здоровья человека и вызывает необратимые пагубные изменения в организме. Воздействия ионизирующей радиации на клеточные популяции приводят к появлению в них клеток с аномально измененными ядрами (Лаптева-Попова М.С. и др., 1959; Bhattathiri

N.V. et al., 1998; Thomas P. et al., 2003), которые в клинической цитологии относятся к проявлению лучевых патоморфозов (Агамова К.А., 1997).

Возникновение клеток с определенными видами морфологических аномалий ядер может быть обусловлено хромосомными аберрациями (дицентрическими и кольцевыми хромосомами), являющимися надежными цитогенетическими t маркерами лучевых воздействий (Giselsson D., 2000; Никифоров A.M. и др., 2000). Таким образом, количественный учет клеток с радиоспецифическими аномалиями ядер может стать лабораторным экспресс-методом лучевой биоиндикации и оказаться востребованным в условиях чрезвычайных ситуаций.

Лимфоциты периферической крови являются наиболее изученными, удобными и вместе с тем радиочувствительными клетками для практического использования их в целях биоиндикации лучевых факторов. Стандартным лабораторным методом для оценки влияния мутагенных, в том числе и радиационных факторов, является цитохалазиновый метод оценки микроядер в культуре лимфоцитов человека (Fenech М., Morley А.А., 1985). В настоящее время разработчиками цитохалазинового метода вносятся в протокол существенные дополнения, усиливающие его информативность (Thomas P. et al., 2003; Fenech М., 2003). Предлагается наряду с микроядрами в цитохалазиновом методе учитывать межъядерные хромосомные мосты и ядерные почки (Kimura М. et al., 2004). Справедливым будет отметить, что наряду с перечисленными выше видами аномалий ядер в культуре лимфоцитов цитохалазиновым методом после рентгеновского облучения обнаруживаются клетки с гантелевидными ядрами, возникновение которых может быть обусловлено дицентриками и кольцами (Никифоров A.M. и др., 2000). Однако этот вид аномалий ядер остался не включенным в ныне усовершенствованный протокол цитохалазинового метода.

Поскольку количественный учет клеток с радиоспецифическими аномалиями ядер является лабораторным методом биоиндикации лучевых факторов, практически очень важным представляется изучение радиационно-индуцированных аномалий ядер лимфоцитов не только в условиях культуры in vitro, но и в популяциях соматических клеток in vivo. Лабораторный метод выявления таких аномалий в стандартных мазках крови (из пальца) в отличие от культурального метода требует гораздо меньших временных и материальных-затрат. Он вполне может выполняться в условиях медицинских пунктов в случае возникновения чрезвычайных радиационных ситуаций.

В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования стало изучение аномалий ядер в культурах лимфоцитов, облученных в экспериментальных условиях in vitro и в лимфоцитах периферической крови in vivo у лиц, подвергшихся воздействию факторов аварии на Чернобыльской АЭС.

При этом были поставлены следующие задачи.

1. В диапазоне малых доз облучения путем проведения эксперимента в режиме "доза-эффект" в культуре лимфоцитов человека (цитохалазиновым методом) определить характер дозовых зависимостей для клеток с морфологическими аномалиями ядер (и в первую очередь с гантелевидными ядрами). Определить коррелятивные связи между дицентрическими и кольцевыми хромосомами с одной стороны и межъядерными мостами, ядерными протрузиями и гантелевидными ядрами - с другой.

2. Определить частоту встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер (гантелевидными ядрами, микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами) в периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС через 13 - 15 лет после пребывания в зоне аварии.

3. Изучить особенности расположения протрузий в ядрах лимфоцитов in vivo в периферической крови человека.

4. Исследовать in vivo количество ядрышек в ядрах лимфоцитов у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии.

5. Определить частоту встречаемости клеток буккального эпителия с морфологическими аномалиями ядер (микроядрами, ядерными протрузиями и межъядерными мостами) у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии.

Научная новизна.

Впервые установлен характер зависимости от дозы рентгеновского облучения для показателя "частота встречаемости клеток с гантелевидными ядрами" в культуре лимфоцитов человека и представлена калибровочная дозо-зависимая кривая в диапазоне малых доз облучения.

Впервые установлено неслучайное расположение протрузий в ядрах лимфоцитов человека Впервые выявлены повышенные частоты встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер в периферической крови чернобыльских ликвидаторов через 13-15 лет после пребывания в зоне аварии на ЧАЭС.

Впервые обнаружено, что у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии увеличено количество ядрышек в ядрах лимфоцитов периферической крови.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Рентгеновское облучение в диапазоне малых доз индуцирует образование морфологических аномалий ядер: гантелевидных ядер, ядерных протрузий и межъядерных хроматиновых мостов в цитохалазиновых культурах лимфоцитов человека.

2. Частота клеток с гантелевидными ядрами, ядерными протрузиями, межъядерными хроматиновыми мостами зависят от дозы облучения (характер зависимости линейно-квадратичный) и положительно коррелируют с частотами метафаз с дицентрическими и кольцевыми хромосомами. Основной пул дицентрических хромосом в облученных in vitro и культивированных с добавлением цитохалазина Б лимфоцитах человека трансформируется в гантелевидные ядра.

3. В лимфоцитах периферической крови in vivo у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии (через 13-15 лет) достоверно повышена частота встречаемости лимфоцитов с ядерными протрузиями (р<0.001), микроядрами (р<0.01) и межъядерными мостами (р<0.01) по сравнению с контрольной группой.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 2-м Международном Симпозиуме "Хроническое радиационное воздействие: возможности биологической индикации" (Челябинск, 2000), 4-ом Съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001), Международной научно-практической конференции "Медико-биологические последствия чрезвычайных ситуаций" (Санкт-Петербург, 2001), Международной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации: предупреждение и ликвидация" (Минск, 2001). и

1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

105 ВЫВОДЫ

1. В популяциях облученных и культивированных с цитохалазином Б лимфоцитов большинство морфологических аномалий ядер относятся к классу гантелевидных ядер, причиной возникновения которых становятся дицентрические (и кольцевые) хромосомы.

2. В диапазоне малых доз рентгеновского облучения выявлена положительная корреляция между показателями "частота встречаемости ядерных протрузий", "частота встречаемости межъядерных хромосомных мостов", "частота встречаемости клеток с гантелевидными ядрами" в популяциях лимфоцитов человека, культивированных цитохалазиновым методом и показателем "частота встречаемости метафаз с дицентрическими (кольцевыми) хромосомами".

3. Выявлено неслучайное расположение протрузий в ядрах лимфоцитов периферической крови человека. В лимфоцитах с ядрами бобовидной формы ядерные протрузии, как правило (в 81,4%±2,9% случаев) локализуются на вогнутой части ядра, что вероятно, обусловлено закономерностями движения хромосом в митозе.

4. В периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС частота встречаемости лимфоцитов с морфологическими аномалиями ядер, которые обусловлены геномной нестабильностью, остается стабильно повышенной в течение длительного срока (13-15 лет) после пребывания в зоне аварии ЧАЭС.

5. В лимфоцитах периферической крови in vivo у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после пребывания в зоне аварии увеличено количество ядрышек

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При проведении микроядерного теста в культурах лимфоцитов цитохалазиновым методом целесообразно дополнительно учитывать клетки с гантелевидными ядрами, межъядерными мостами и ядерными протрузиями.

2. Метод, основанный на определении частоты встречаемости клеток с морфологическими аномалиями ядер предпочтительнее применять в лимфоцитах периферической крови, чем в клеточных популяциях плоского эпителия.

107