Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Использование лимфоцитов периферической крови для изучения метаболизма холестерина у пациентов с атерогенными гиперлипидемиями

Ю-ИССЛЕДОНАТЕЛЬСКЛИ ИНСТИТУТ КАРДИОЛОГИИ

') ^ имени А. Л. Мяснихова

КИП РАМН

Еа правах рухописи

ВОЛХОВА Лариса Аиатолъмна

использование лимфоцитов периферической крови для изучения метаболизма холестерина у пациентов с атерогенннми гиперлипидемиями

14.00.06 - Кардиология -03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕвЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Мосхаа 1994

)

Работа выполнена в Научно—исследовательской институте кардиологии имени А.Л.Мясникова КНЦ РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ковечхин Владимир Анатольевич доктор медицинских наук, профессор, чл.—корр.. РАМН Репин Вадим Сергеевич Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Хуковския Георгия Сергеевич Доктор биологических наук, профессор Ланкин Вадим Зиновьевич

Ведущая организация: Российский Университет дружбы народов им. й.Лумумбы

Защита состоится "_" _1994 года в _часов на

заседании специализированного Совета К 001.22.01 по присуждении ученой степени кандидата медицинских наук в Институте клинической кардиологии им. А.Л.Мяснихова КНЦ РАМН (121552. г.Москва, 3-я Черепковская ул.. д. 15). -

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке КШ

РАИН

Автореферат разослан и_"_1994

Учения секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук Полевая Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении этиологии наследственных гиперлипидемия (ГЛП) [Чазов Е.И., 1986; Климов A.B.. 1986; Котечкин В.А. с соавт.. 1989; Brown M.S. & Goldstein J.L.. 1986; Thompson G.R., 1989; Grundy S.M.. 1991]. Установлено, что в основе развития этих клинических состояния могут лежать различные по своей природе генетические аномалии, фенотипическим проявлением многих из которых является повышение уровня холестерина (ХС1 плазмы крови. Считают, что наследственные ГЛП являются одним из ведущих факторов риска ишемичесхоя болезни сердца (ИБС) и других заболевания сердечно—сосудистоя системы (Климов А.Н. и Нихульчева Н.Г., 1984; Перова Н.В. с соавт., 1989; Fredrickson D.S. & Levy R.J., 1972; Castelli W.P., 1990J . Аккумуляция-ХС в интиме сосудистоя ткани происходит за счет образования пенистых клеток из макрофагов и гладкомы- шечных клеток IRoss R.. 1986; Aqel N.M. et al., 1984], что не отражает содержание ХС в других клетках организма. Известно также, что высохия уровень ХС в плазме не всегда сопровождается преждевременным атеросклерозом [Репин B.C. и Смирнов В.Н., 1989; Лопухин Ю.М. и соавт.. 19ВЗ; Thompson R.G., 1989]. Все выше изложенное свидетельствует об актуальности поисков в области диагностики атерогенности ГЛП. Использование культур фибробластов кожи, клеток печени и тонкого кишечника определило значительный прогресс в области изучения этиологии наследственных ГЛП. Однако в широкой клинической практике невозможно использовать эти модели по понятным причинам.

В последние годы лимфоциты периферической крови используются

для изучения механизмов взаимодействия липопротеидов различи! классов с клетками и причин нарушений гомеостаза ХС в организ) человека [Clarke С-Е. et nl. „ 1983;. McNamara D.J.. 1985: Cuthbei J.A. et al., 1989]. Для- клинической практики особую ■ ценное:

приобретает доступность и относительная простота получен» * >

лимфоцитов от каждого конкретного больного и возможность у использования как клеточной модели.

□ель настоящей работы состояла в исследовании информатис ности использования лимфоцитов периферической крови в диагностик атерогенных гиперлипидемий.

В задачи исследования входило: 1)определить содержани холестерина и его эфиров" в лимфоцитах больных с различными типам Г ЛИ: 2)исследовать возможную зависимость между содержанием ХС лимфоцитах и концентрацией общего холестерина, холестерин липопротеидов низкой плотности (ЛНЩ и холестерина липопротеидо высокой плотности (ЯВШ в плазме крови у пациентов с атерогенным ГЛП: 3)сопоставить уровни содержания ХС в лимфоцитах в группа пациентов с умеренно-выраженными и резко-выражеными ГЛП

4)оценить информативные возможности косвенного метода определени. активности ЛНП—рецепторов в культуре пролиферирующих лимфоцитов

5)определить диагностическую значимость косвенного -метод, количественной оценки активности ЛНП-рецепторов при наследственных гиперлипидеыиях.

Научная новизна работы:1) Предложен новый метод первично! диагностики семейной гиперхолестеринемии с помощью определение содержания общего ХС в лимфоцитах. 2) Показано, что в группе пациентов с умеренно-выраженными ГЛП содержание ХС в лимфоцитам возрастает одновременно с увеличением концентрации общего ХС и ХС

П плазмы крови, тогда как в группе о резко-выраженноя ГЛП дергание ХС в клетке снижается при достаточно высоком уровне щего ХС и ХС ЛНП плазмы. 3) Не обнаружено зависимости между нцентрациея ХС лнпопротедов высокой плотности (ЛВШ в плазме и овнем ХС в лимфоцитах пациентов с семейными ГЛП. 4) Уменьшение держания ХС в лимфоцитах больных с семеяноя перхолестеринемиея (СГХС) связано с дефицитом или отсутствием □-рецепторов.

Практическая значимость работы: показано, что одновременно с яснением липидного и липопротеидного профиля плазмы крови пьных с атерогеиными ГЛП. важную информацию можно получить и л определении уровня содержания ХС в лимфоцитах больных. Соот-пение содержания ХС в плазме и в лимфоцитах косвенно отражает гивность процессов притока и оттока липопротеидов у пациентов с иеяными ГЛП различной степени выраженности. Кроме того, зработан гювыя метод определения активности ЛНП-рецепторов по ^становлению пролиферативноя активности лимфоцитов в условиях экированного эндогенного синтеза ХС, который отличается от ггих методов относительной простотой и достаточной информатив— зтью для применения в практике дифференциальной диагностики веяных ГЛП.

Апробация работы: Научные результаты, представленные в :сертации были доложены на 5—ом Международном симпозиуме по эдечно-сосудистоя фармакотерапии (Миннеаполис, 1993); на 62-ом игрессе Европейского общества по изучению атеросклероза !русалим. 1993). Диссертация апробирована на мехлабораторном «шаре в Кардиологическом научном центре РАМН.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и 3

направлено в печать.

Объем работы. Диссертация содержит 125 страниц машинописного текста. 17 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 230 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

\

Настоящая работа основана на анализе результатов хлинико-лабораторного обследования 87 пациентов в возрасте от 35 до 59 лет с гиперлзшидемиями (с 2а типом ГЛП - 47 человек, с 26 типом -24 человека, с 4 типом — 16 человек), находившихся на лечении в КНЦ РАМН. В исследование были включены только больные с наследствен-ными формами ГЛП. отобранные в ходе генетихо-эпидемиологсгаесхого анализа сотрудниками группы генетики лаборатории гемодиализа и плазмафереза ИКК КНЦ РАМН (руководитель - д.м.н.. проф. Кошечхин В.А.).

Диагностика ГЛП включала следующие этапы:

1)фенотипироваиие с использованием стандартизированных подходов;

2) исключение вторичных синдромов и фенохопия;

3)установление наследственности ГЛП.

Фенотипирование ГЛП проводили с использованием стандартизированных подходов к определению концентрации липидов и апопротеинов плазмы крови. Определение концентрация общего и свободного 1С. ТГ, ХС ЛВП и ХС ЛНП производили спектрофотометричесхим методом с использованием тест-наборов фирмы "ВоеЬгапдег МапЬеыГ (Германия) на спектрофотометра "Т^ег-Ъек Ми1Ъ1зкап" (Финляндия). ХС ЛВП определяли в супернатанте после преципитации ЛП других классов декстран сульфатом. ХС ЛНП определяли после выделения ЛНП из крови методом последовательного

б

ультрацентрифугирования.

При типировании ГЛП проводилась оценка присутствия хиломихрон или ЛОНП в образцах липемическоя сыворотки, а также электрофорез липопротеидов в агароэном геле в отдельных случаях.

Критерии для установления диагноза СГЛП [Beaumont J.L., Carlson L.A., Cooper G.R. et al.. 1970] были следующие: 1.Критериями ГЛП 2а типа были: концентрация холестерина плазмы более 6.2 ммоль/л или нормальная, концентрация холестерина ЛНП выше 4.2 ммоль/л. концентрация триглицеридов плазмы не выше 2 ммол/л. 2.Критериями ГЛП 26 типа были: концентрация холестерина плазмы более 6.2 ммоль/л. концентрация холестерина ЛНП выше 4,2 ммоль/л, концентрация триглицеридов плазмы выше 2 мыол/л. 3.Критериями ГЛП 4 типа были: концентрация холестерина плазмы более 6.2 ммоль/л или нормальная, концентрация холестерина ЛНП не выше 4,2 ммоль/л. концентрация триглицеридов плазмы выше 2 ммоль/л. Наличие ГЛП подтверждалось не менее 2-х раз результатами биохимических анализов крови. 4. Отсутствие у пациента "сопутствующих заболевания, -которые могли бы вызвать вторичные нарушения липидного обмена. 5. Наличие ГЛП или хсантоматоза среди родственников 1 степени родства больного (родители, дети, братья, сестры), б. Отягощенный семейный анамнез в отношении сердечнососудистых заболеваний (ИЕС, инсульт, случаи внезапной смерти среди родственников 1 степени родства до 60 лет). 7. Внешние проявления ГЛП (ксантомы. ксантеллазмы, липоидная дуга роговицы).

Больные с вторичными ГЛП не были включены в настоящее исследование. Для установления роли наследственностти и типа наследования были составлены родословные, по которым анализировались данные клинических, биохимических и других

методов обследования.

Диагноз стенокардии ставился при наличии типичной клинической картины, характеризующейся возникновением сжимающих и давящих загрудинных болея при физической, нагрузке .и в покое, приступообразных с четким .эффектом от приема нитроглицерина.

Диагноз подтверждали данными ЭКГ (депреооия сегмента ST.

* >

патология конечной части желудочкового комплекса), данными анги-ографического обследования. Диагноз постинфарктного кардиосклероза выставлялся пациентам, имевшим достоверные медицинские документы. подтверждающие признаки перенесенного инфаркта миокарда, в том числе ЭКГ с признаками крупноочаговых Рубцовых изменения миокарда. Для оценки степени тяжести стенокардии использовали классификацию ВКНЦ АМН СССР [Аронов Д.М. с соавт. 1982]. Забор крови у больных для исследования осуществляли амбулаторно в стадии ремиссии заболевания на фоне двухнедельной отмены всех препаратов. 25 мл крови у всех обследуемых брали из локтевой вены утром после 12 часового голодания в пластиковую пробирку с раствором ЭДТА ("Sigma", США), конечная концентрация ЭДТА - О.1М. Плазму отделяли центрифугированием при 1500д в течении 20 мин. на центрифуге RC-5 (Sorvall. США). Мононухлеарные клетки выделяли по методу Бойема [Воуиш А., 1968] . Количество клеточного белка определялось по методу Лоури [Lowry О.Н. et al.. 1951]. используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Количество общего, свободного холестерина, трилицеридов и ХС ЛВП спектрофотометрическим методом с использованием тест-наборов фирмы "Boeluringvr Mrnheim" (Германия) на спектрофотометре "Titertek Hultiekan" ("Titertak", ФикЬяхДЬя).

Отдельно измеряли количество общего и свободного ХС в плазме

и в лимфоцитах. Концентрацию общего и свободного ХС в лимфоцитах рассчитывали в мкг холестерина на мг клеточного белка, а в плазме - в ммоль/л. Для определения концентрации зтерифицирозанного ХС измеряли разность между величинами, отражающими уровень общего и свободного ХС.

Лилопротеид-дефицитную сыворотку получали путем двукратного ульграцентрифугирования саежея пулированноя сыворотки здоровых доноров [Goldstein J.L. et al.. 1983: Lindgren F.F.. 1975]. Концентрация апоВ в ДЛС не превышала 0,05 мкг/мл при измерении иммуноферментным методом. Липопротеиды низкоя плотности выделяли из крови здоровых доноров методом последовательного ультрацентр— ифугирования [Goldstein J.L. et al., 1983; Lindgren F.F., 1975). Гомогенность и чистоту выделяемых фракция контролировали аналитическим центрифугированием и электрофорезом в полиакриламидном геле [Stephens R.E., 1975).

Активность ЛНП-рецептора определяли по методу восстановлению пролиферативноя активности лимфоцитоз в условиях блокированного . эндогенного синтеза ХС_ Достоверность, различия определяли по t-критерив Стыдента. Все расчеты производили используя ■статистические программы фирмы "Labtain (Австралия). Результаты в графиках и таблицах представлены как среднее±ошибка репрезентативности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ПОКАЗАТЕЛИ УРОВНЯ СОДЕРХАНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ГИПЕРЛИПИДЕМИЯМИ.

Задачей первой серии проведенного нами исследования явилось выяснение вопроса о том, является ли концентрация холестерина в

лимфоцитах величиной постоянной для разных групп больных, и имеется ли зависимость между увеличением уровня ХС в плазме крови больных с наследственными ГЛП и содержанием ХС в лимфоцитах, выделенных из крови этих больных.. ... ,

Для реаения поставленной задачи было произведено измерение

уровня содержания ХС и его эфиров в лимфоцитах периферичесокя

' >

крови, выделенных у 87 пациентов в возрасте от 29 до 59 лет с типами ГЛП 2а. 26 и 4. В таблице 1 представлены суммарные данные содержания общего и этерифицированного ХС в лимфоцитах больных, в зависимости от типа ГЛП.

Таблица 1.СОДЕРХАНИЕ ЛИПИДОВ В ЛИМФОЦИТАХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ У ПАЦИЕНТОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ТИПАМИ ГЛП И 7 ЛИП КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ.

Тип ГЛП ЧИСЛО ЛИМФОЦИТЫ ПЛАЗМА КРОВИ

наблюдений (мкг/мг белка М±т) (ммольл, М±ш)

ХС общий ХС-этернф. ХС общий ХС лнп

2А 47 68.4± 38.6' 53.7± 25.6 • 7.1 +2.1 5.97± 3.01

2Б 24 63.4± 32.2' 41.5 ±21.2 • 7.7+ 2 Л 6.0+ 1.1

4 16 53.3+ 32.5' 32.5+ 23.5 * 63 ±1.6 3.4+ 0.9

Кокгр.группа 20 80.1± 26.6 -53.3± 24.1 4.1+ 03 3.2+ 0.2 -

• - Р>0.05; достоверность отличия в сравнении с контрольной группой.

Как видно из таблицы, между показателями содержания общего и этерифицированного ХС в лимфоцитах пациентов с различными•типами ГЛП не имелось достоверных различия (Р>0.05). При сравнениями с результатами измерения содержания ХС в лимфоцитах здоровых лиц привлекает внимание тенденция к уменьшению уровня ХС в лимфоцитах у пациентов с гиперлипидеыиея. независимо от фенотипа ГЛП. При сравнении содержания этерифицированного ХС в лимфоцитах выше указанных групп обследованных также не выявлено достоверных

различия (Р>0,05).

На графике (рис.1) представлены результаты измерения содержания общего ХС в. лимфоцитах пациентов с различными типами ГЛП и у.лиц.контрольной группы. Можно видеть, что индивидуальные показатели у лиц с ГЛП колеблются в значительно больших пределах, чем у здоровых. Эти данные заслуживают особого внимания. Предварительное сопоставление данных о содержании общего ХС и ХС ЛНП в плазме крови с результатами измерений уровня ХС в лимфоцитах позволило предположить, что у пациентов с семейными гиперлипидемиями. одновременно с увеличением уровня общего ХС и ХС ЛНП в плазме крови наблюдается некоторое снижение содержания ХС в лимфоцитах. Для проверки правомерности такого предположения мы сравнили индивидуальные показатели "содержания ХС в лимфоцитах с липидным профилем плазмы крови в разных группах обследованных.

Рис.1. ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ СОДЕРХАНИЯ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРИНА В ЛИМФОЦИТАХ ПАЦИЕНТОВ С 2А. 2Б, 4 ТИПАМИ ГЛП И ЛИП

КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ.

"О* □

е- о М I. Ч о

га о н

о ® X

к

15

з и

I"

О к

X

3

Т

I

а В

о

ч

□

• а

в

а а

В

о

2Б 11

Контрольная группа

□

На рмс. 2.приведены индивидуальные показатели содержания ХС в лимфоцитах и в плазме у больных с 2а типом ГЛП.

Рис.2. ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ОЕШЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ ПАЦИЕНТОВ С ТИПОМ ГЛП 2А ОТ УРОВНЯ ОБЩЕГО ХС ПЛАЗМЫ. 13<Н

100

х

\ (_

к X

Ы

v

Р

ш

5 а и

X

с

со о

50

г-0.57 р-0.001

t—0.69 р-0.02

V rv v v ™

У»

its

5.0 7.5 10.0 12.5

ОБЩИЙ ХС В ПЛАЗМЕ (ммоль/л)

Можно видеть, что в группе с пограничной ГХС (ХС плазмы от 3.2 до 6.5 ммоль/л) и умеренно-выраженноя ГХС (ХС плазмы от 6.5 до 7,8- ммоль/л) содержание общего ХС в лимфоцитах увеличивается одновременно с увеличением уровня ' общего ХС и ХС ЛНП в плазме крови. В то же время в группе больных с резко-выраженной ГХС (ХС плазмы suae 7.8 ммоль/л) отмечается тенденция к обратной

I 3

зависимости между этими показателями. У пациентов, имеющих довольно высокие концентрации ХС в плазме (от 7.8 ммоль/л до 15 ммоль/л), концентрация ХС в лимфоцитах . постепенно снижается, составляя 30 мкг/мг белка у Сольного, у которого концентрации общего ХС и ХС ЛНП были наибольшими. Данные, отражающие соотношения индивидуальных показателен этерифицкрованного ХС в лимфоцитах с содержанием общего ХС в плазме крови пациентов с типом ГЛП 2а имеют аналогичный характер распределения показателей.

При сравнении показателей содержания ХС в лимфоцитах с уровнем ХС плазмы у пациентов с типом ГЛП 26 была выявлена аналогичная зависимость (рис.3).

Рис.Э. ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРХАНИЯ ОБЩЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ

ПАПИЕНТОВ С ТИПОМ ГЛП 26 ОТ УРОВНЯ ОБЩЕГО ХС ПЛАЗМЫ.

ISO - - - -......- -

loot

II

w !р

и ч к

0 и X в

1

[9

о

50

г-0.69 р-0.002.

г—0.69 р-0.016

2.5

5.0 7.5 10.0 12.5

ОБЩИЙ ХС В ПЛАЗМЕ (миоль/л)

15.0

Как и в группе с ГЛП 2а ,типа. у больных с умеренно-вырахенноя ГДП 26 типа имеет место прямая зависимость между показателями общего ХС плазмы и общего ХС лимфоцитов. Тогда как у . больных о резко—виражекнор. ГЛП 26 типа эта' зависимость носит обратный характер. Данные, отражающие соотношения индивидуальных показателей этерифкцированного ХС в лимфоцитах с содержанием общего ХС в плазме крови пациентов с ГЛП типа 26 имеют аналогичный характер распределения показателей.

Еа основании изучения данных о содержании ХС в плазме и в лимфоцитах пациентов с 4 типом ГЛП можно также увидеть, что в группе с умеренно-выраженной ГХС (общий ХС плазмы до 7.8 ммоль/л) существует прямая зависимость между этими показателями (рис. 4).

Рис. 4. ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ

ПАЦИЕНТОВ С ТИПОМ ГЛП 4 ОТ УРОВНЯ' ОБЩЕГО ХС ПЛАЗМЫ. 150т

т

5 too' U

! X

! \

I Й ' ; ¿

ш

р5

м

§ »

в и

X «

s 3

ю О

г-0.46 р-0.008

2.S

S.» 7Л 10.0

ОБЩИЙ ХС В ПЛАЗМЕ (толь/л)

12.5

Однако сделать кахие-либо выводы о взаимосвязи изучаемых величин при резко-выраженной ГЛП 4 типа было бы преждевременно из-за недостаточного числа наблюдения. Следует таете напомнить, что для 4 типа ГЛП не характерны высокие значения концентрация общего ХС и ХС ЛНП в плазме крови (Grundy З.М.. 1991] .

Остается неясным, какие причины могут лежать в основе описанного выае феномена. При измерении содержания общего ХС в лимфоцитах лиц контрольной группы и сравнении этих показателей с величинами, отражающими содержание общего ХС в плазме крови, не было выявлено какой-либо зависимости (рис.5). что согласуется с современными представлениями о гомеостаэе холестерина в неизмененных лимфоцитах (Bilheimer D.W.- et al.. 1978; Cuthbert J.A. et . al.. 1984. 1987: Hagemanas D.R.. 1989].

Рис.5. ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ

ЛИЦ КОНТРОЛЬНОЙ ГРУППЫ ОТ УРОВНЯ ОБЩЕГО ХС ПЛАЗМЫ.

190т

и

X

5 •

ЧЭ

о

ь.

О

9 •

о

140-

w

15

ta

4 и и о к

«5

5

В в о

90

г-0.16 р-0.25

□ □

. □ а

□ оа .

DO

ОБЩИЙ ХС В ПЛАЗМЕ (таль/л)

2.0

3.S

5-2

6.S

8.4

10.0

Данные, отражающие соотношения индивидуальных показателей этерифицированного ХС в лимфоцитах с содержанием общего ХС в плазме крови пациентов с ГЛП 4 типа и лиц контрольной группы имеют хаотичный характер распределения показателей (г-0,008).

Мы предположили, что возрастание уровня внутриклеточного ХС .. в лимфоцитах в группе Сольных с умеренно-выраженными ГХС и, с другой стороны, уменьшение этого показателя в группе больных с резко-выраженными ГХС (главным образом 2а и 26 типа) может быть обусловлено нарушениями процессов поглощения ЛНП этими клетками. Для проверки этой гипотезы мы выполнили серию исследований, в которых результаты измерения содержания ХС в лимфоцитах были сопоставлены с показателями содержаний ХС ЛНП в плазме крови у больных с гиперлипидемиями 2а. 26 и 4 типов.

СРАВНЕНИЕ СОДЕРХАНШ ХОЛЕСТЕРИНА В ЛИМФОЦИТАХ С УРОВНЯМИ ХС ЛНП И ЛВП ПЛАЗМЫ КРОВИ 7 ПАЦИЕНТОВ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ГИПЕРЛИПИДЕМИЯМИ.

Оновыв'аясь на выше изложенных фактах мы сочли необходимым провести дополнительный анализ полученных данных, сопоставив результаты измерений содержания ХС в лимфоцитах и в липопротеидах низкой плотности плазмы крови у пациентов с 2а, 26 и 4 типами ГЛП.

При изучении взаимосвязи между содержанием ХС в лимфоцитах и концетрацией ХС ЛНП плазмы крови у пациентов с типом ГЛП 2а. 26, 4 и лиц контрольной группы можно было видеть, что закономерность обнаруженная нами при сравнении содержания ХС в лимфоцитах с уровнем общего ХС плазмы повторяется (рис.2.3.4.5). В пределах

значения ХС ЛНП плазмы от 4,3 до б.О ммоль/л наблюдалось постепенное увеличение содержания ХС в лимфоцитах, тогда как при уровне ХС ЛНП выше 6,0 происходит уменьшение содержания ХС в лимфоцитах в группе больных с ГЛП 2а и 26. При сравнении содержания этерифицированного холестерина в лимфоцитах с концентрацией ХС ЛНП плазмы ни в одноя из групп обследованных не было обнаружено никаких корреляция (при вычислении коэффициента корреляции были обнаружены значения близкие к нулю).

Уровень содержания внутриклеточного ХС, как известно, зависит не только от поступления его в клетку в составе ЛНП и ЛОНП, но и удаления избытка ХС при помоци ЛВП [Перова Н.В., 1986: Климов А.Н., 1987: Gotto A.M.. 1989: Brown M.S. & Goldstein J.С.. 1989]. Мы сочли целесообразным сравнить содержание ХС в лимфоцитах с уровнем содержания ХС ЛВП в плазме (рис.б).

На представленных на рисунке б графиках можно видеть, что не • выявляется никакой зависимости между содержанием ЛВП. в плазме и содержанием ХС в лимфоцитах. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженные нами изменения содержания клеточного ХС у больных с семейными ГЛП не связаны с уменьшением уровня ЛВП. Тогда как выявленная зависимость между степенью выраженности гипербеталипопротеидемии и уровнем содержания ХС в лимфоцитах у обследованных нами пациентов может свидетельствовать об определенной роли ЛНП в накоплении ХС клетками при умеренно-выраженноя и снижении содержания ХС в лимфоцитах при резко-выраженных гиперхолестеринемиях. При сравнении содержания этерифицированного ХС с концентрацией ХС ЛВП плазмы также не было обнаружено никакой зависимости между этими показателями ни а одноя из групп обследованных лиц.

р,и . 6. ЗАВИСИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ ОТ УРОВНЯ ХС ЛЕИ ПЛАЗМЫ

Ъ

г—0.4 р-0.05

V

и

г—0.3 . р-0.05

.1 Ы 1.8 Х4

Концентрация ХС ЛВП в плазме (м-юль/л)

1 1- вацмакта е ГЛП типа 2«; Э— вацмаиты с ГЛП 4 тмпа

2- пациенты с ГЛП ткаа 28; 4— контрольная 1 уушха

Как известно, в неактивированных лимфоцитах основным источником ХС являются ЛНП. поступающие в клетку при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза. Биосинтез ХС в неактивированных лимфоцитах протекает с крайне низкой скоростью и резко возрастает при их антигенной стимуляции IСиЪЬЬвг!- Л. А. а1., 1984; Надетапаз Р.С. е! а1.. 1989]. Двадцати-тридцати кратное увеличение скорости синтеза эндогенного ХС наблюдается в лимфоцитах, пролиферирующих под влиянием фитогемагглютинина (4ГА) [СиЪЬЬеП Л. А. & ГЛрвкуР.Е., 1989]. Однако и в этих экспериментальных ситуациях основным источником ХС, необходимого

1.1

и

для построения мембран делящихся клеток являются ЛНП и ЛОНП. По данным Си-ЬЬег1 Л. с соавт.. при добавлении очищенных ЛНП и ЛОНП в культуральную среду, скорость синтеза ХС в пролиферирущих лимфоцитах резко снижается.

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛНП-РЕПЕПТОРОВ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ С СЕМЕННЫМИ ГИПЕРЛИПИДЕМИЯМИ.

Изучение скорости ЛНП-опосредованного зндоцитоза лимфоцитами периферической крови больных с наследственными ГЛП проводилось по-методике, предложенной Л.А.СиЪЫзег! с соавторами в 1986 г. Она основана на измерении ответа лимфоцитов на стимуляцию фитогем-агглютинмном в условиях подавления синтеза эндогенного ХС мевинолином (хорошо известный ингибитор ГМГ-Ко-А-редуктазы). Пролиферацию лимфоцитов оценивали по включению меченных предшественников ( Н-тимидина) в ДНК лимфоцитов в липопротеид-дефицитноя среде при добавлении стандартных количеств очищенных ЛНП (см* главу. "Материалы и методы".). Исследование, было проведено на лимфоцитах 15 больных с 2а типом ГЛП. в том числе на лимфоцитах больной с достоверно-установленным диагнозом СГХС (гомозиготная форма). У этой больной (И. X.. 14 лет) имелись характерные клинические признаки СГХС: кожные ксантомы. ксантомы сухожилия, высокий общий ХС плазмы (15-24 ммоль/л) и ХС ЛНП (14-20ммоль/л). загрудинные боли ангинозного характера, ангиогра— фически определяемое сужение корня аорты. Диагноз гомозиготный формы СГХС был подтвержден в лаборатории культуры клеток и тканей КЕН РАМН при изучении фибробластов кожи этой больной, полученных при биопсии. Ныло установлено, что у этоя больной полностью отсутствовали ЛВП-рецепторы в культивируемых фибробластах. У

остальных 14 пациентов изучение рецепторов до нашего исследования не проводилось. В таблице 3. представлены данные липидного и липопротеидного профиля плазмы крови, а также данные по содержанию ХС в лимфоцитах этих больных. Для контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых лиц.

Таблица 2. СОДЕРЖАНИЕ ЛИЩЦОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И В ЛШШТГАХ ( - У ПАЦИЕНТОВ С ПРЕШАРИГЕПЫЬМ ДИАГНОЗОМ: СЕМЕЙНАЯ ГХС

Пациент ПЛАЗМА ЛИМФОЦИТЫ Активность

(ммоль/л) (мхг/нг белка)

N ХС общий Триглкц. ЛНП ХС общий ЛНП-рецепторов

1 6.65 2 5.25 122.3 не изменена

2 6.81 и 5.65 134.67 не изменена

3 6.84 1 5.74 93 не изменена

4 6.94 1.8 5.38 125 ве изменена

5 6.96 1.46 5.62 99 не изменена

б 7 1.5 4.5 .90 ве изменена

7 7.41 0.79 6.26 60.19 не изменена

8 7.75 2.1 6.53 82:22 ве изменена

9 9.32 1 7.66 72.12 ' ве изменена"

10 9.77 1.6 8.34 49.12 снижена

11 9.9 1.3 8.72 61.7 не изменена

12 10.79 и 9.54 24.98 снижена

13 11.76 0.6 10.89 " 28.62 " снижена

14 12.08 2.5 10.17 50 снижена

15 14.99 1.9 10.18 30 отсутствует

На рис. 7 отражены результаты .измерения индуцированного фитогемаагглютинином включения ^Н-тимидина в лимфоциты здоровых людея и больноя с гомозиготной формой СГХС. Можно видеть, что в среде с концентрацией ХС ЛНП от 0 до 1 ккг/мл. мевинолин почти полностью блокирует синтез ДНК в лимфоцитах как здоровых лиц, так и у больноя с СГХС. Известно, что ингибирующия эффект мевинолина может быть предотвращен добавлением в культуральную среду очищенных ЛНП. эффективность влияния которых на восстановление пролиферации лимфоцитов зависит от концентрации добавленных ЛНП.

Полное восстановление пролиферации лимфоцитов с неизмененными ЛНП-рецепторами достигается при добавлении в хультуральную среду от 3 до 4 мкг ХС ЛНП на мл. что хорошо видно на рис.7. В тоже время при добавлении ЛНП х лимфоцитам больной с' гомозиготноя формой СГХС в концентрациях 3-4 и более (до 10)' мхг/мл не восстанавливало пролиферативную активность лимфоцитов. Дажг при хонцентрации ХС ЛНП 50 мхг/мл во внеклеточной жидкости пролиферативный ответ этих лимфоцитов, обработанных мевинолином. был значительно ниже чем у тех же клеток в среде без мевинолина. Таким образом, можно говорить о том. что у больной с гомозиготной формой СГХС низкие концентрации ХС-ЛНП не восстанавливают пролиферацию лимфоцитов в среде с мевинолином. Другими словами, при отсутствии в клетке рецепторов х ЛНП и в условиях подавления эндогенного синтеза ХС. низкие концентрации ХС ЛНП во внеклеточной жидкости не способны обеспечить уровень ХС в клетке, достаточный для нормального пролиферативного ответа лимфоцитов.

Реакция лимфоцитов 10 больных с ГСХ_ неуточненного генеза. отличалась от реакции . клеток больной с СГХС. Пролиферативная активность этих клеток не отличалась от реакции лимфоцитов лиц контрольной группы. Вероятно, высокий уровень содержания УС в плазме крови этих больных обусловлен какой-либо другой генетической аномалией, не связанной с изменением ЛНП-рецептора.

Реакция лимфоцитов остальных 4 пациентов отличалась от реакции здоровых клеток, но и не была такой-же как . у больной с гетерозиготной формой СГХС. Для восстановления пролиферативного ответд лимфоцитов этих больных а условиях подавления эндогенного синтеза ХС мевинолином било необходимо введение в культуральную среду более высоких хонц««трация ЛНП. Если для полного

восстановления пролиферации нормальных лимфоцитов было достаточно добавить 3-4 мкг/мл ЛНП, то в этой группе больных при таких концентрациях ЛНП пролиферация восстанавливалась не полностью. Однако при увеличении количества ЛНП в культуральноя среде от 5 до 10 мкг/мл пролиферативныи ответ этих лимфоцитов достигал исходного уровня. МОт

к

о О.

о

2 С

X

I

И о

а -

х

и

Концентрация ХС ЛНП во внеклеточной среде ( мкг/мл ).

Рис. ? СПОСОБНОСТЬ ЛНП ВОССТАНАВЛИВАТЬ ПРОЛИ4ЕРАТИВНУТО АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКИРОВАННОГО ЭНДОГЕННОГО СИНТЕЗА ХС У ЗДОРОВЫХ ЛИП И ПАЦИЕНТОВ С Г0М03ИГ0ТН0И СГХС.

Пролиферативная активность оценивалась по включению Н-тимидина в ДНК пролиферирующих лимфоцитов- За 1003: для каждой концентрации ХС ЛНП принимали включение Н-тимидина в лимфоциты в среде без мевинолина (контроль).

- здоровые доноры. Ж - пациент с гомозиготной формой СГХС. 2£

Можно видеть, что из 15 обследованных нами больных с 2а типом ГЛП у 5 больных диагностирована СГХС. У остальных -активность ЛНП—рецепторов была сохранена и природа генетических аномалия, лежащих в основе умеренно-выраженной гиперлипидемии установлена не была. Особого внимания заслуживает факт, о возможности использования описанной СипЪЬегЪ еЪ а1. системы для диагностики СГХС.

Мы сравнили данные о наличии дефицита ЛНП-рецепторов с результатами оценки содержания ХС в лимфоцитах. Результаты этого гравнения отражены на рис. 8.

Рис.8. ЗАВИСИМОСТЬ СОЛЕРХАНИЯ ОБЩЕГО ХС В ЛИМФОЦИТАХ

1АШЕНТ0В С ТИПОМ ГЛП 2А ОТ УРОВНЯ ОБЩЕГО ХС ПЛАЗМЫ. 15<Н .

>с с

= 100

£

Ы р

ы

ч

4«

в и

X

с

с с

50-

2.5

+ +

5.0

—I—

12.5

7.5 Ю.О

ОБЩИЙ ХС В ПЛАЗМЕ (ммоль/л) + пациенты с яормалъиой активностью ЛНП-реаептпроа О пациенты со спасенной активностью ЛНП-репепторов

23

—г 15.0

Можно видеть, что у всех больных с СГХС отмечалось уменьшение содержания ХС в лимфоцитах, тогда хах у больных с неизмененной активностью ЛНП-рецепторов наблюдались и высокие (7 человек) и низкие (3 человека) цифры содержания ХС в лимфоцитах. Можно думать о том. что на фоне значительно сниженного поступления ХС в составе ЛНП процессы эндогенного синтеза ХС в не стимулированных лимфоцитах не активизируются [ВИЬе1тег О.К. еЪ а1.. 1980; Надетапаз Г.С. et а1.. 1989: 11Ипдтог«1 0.11.. 1989].

В заключительной части нашего исследования мы пытались получить дополнительную информацию о связи полученных нами данных с выраженностью ИБС у пациентов с ГШ. В частности, при изучении соотношения показателей общего ХС в плазме и общего ХС в клетке по формуле: К-общия ХС в хлетке/обций ХС в плазме, было обнаружено, что при пограничных и умеренно—выраженных ГХС 2 типа имеется тенденция к увеличению этого показателя, а при резко-выраженных ГХС — к его снижению. В контрольной группе значения этого показателя были достаточно высокими.

- • -Мы сочли возможным--сравнить- значения "К"- у- находившихся под нашим наблюдением лиц. страдающих ИБС и у их родственников не имеющих симптомов ИБС. но у которых была обнаружена гип^рлипидемия (табл. 3).

Можно видеть, что у пациентов, страдающих ИБС коэффициент соотношения общего ХС в клетке и общего ХС в плазме достоверно ниже, чем у их родственников 1 степени родства примерно того же возраста, не имеющих симптомов ИБС. С другой стороны, можно предположить, что у молодых пациентов, не имещих симптомов ИБС. у которых коэффициент соотношения достоверно не отличается от

Таблица 3. СООТНОШЕНИЕ ОБ1ПЕГО ХС В КЛЕТКЕ И ОБЩЕГО ХС В ПЛАЗМЕ У ПАЦИЕНТОВ СТРАДАЮЩИХ ИБС И ИХ ЗДОРОВЫХ РОДСТВЕННИКОВ.

Паннепг Возраст Пол Тип ГЛП Диагноз К"

Л.А. 50 ж 2А ИБС 3.1

Ч.М., сестра Л.А. 52 ж 2Б ожирение 1 ст. 9.3

Л.Г. 53 ж 2А ИБС 7.1

Н.Т., сестра Л.Г. 50 ж 2А ксантомы 14.1

Б.А. 55 ж 2Б ИБС 6.5

Б.Е., сыя Б.А. 36 и 2Б ГЛП 8.1

Ш.В. 50 м 2А ИБС 5.8

Ш.Т., дочь Ш.В. 29 ж 2А ГЛП 7.7

коэффициента их родителей, клиника атеросклероза проявится в более преклонном возрасте. Таким пациентам было бы показано применение превентивных мер профилактики атеросклероза. Для более точных выводов необходимо проведение более широкомасштабных исследования, протяженных во времени.

ВЫВОДЫ.

1. Определение содержания ХС в лимфоцитах пациентов с наследственными ГЛП может быть использовано для ранней диагностик/. ГЛП и для дифференциальной диагностики семейноя гиперхолестеринемии.

2. Содержание ХС. в лимфоцитах пациентов с наследственными ГЛП зависит от степени выраженности гиперхолестеринемии. В контрольной группе не было обнаружено никакой зависимости между содержанием ХС в лимфоцитах и содержанием общего ХС и ХС ЛНП в плазме крови. Содержание ХС в лимфоцитах не зависит от содержания ХС ЛВП в плазме крови ни у пациентов с гиперлипидепиями. ни у лиц контрольной группы.

3. Определение пролиферативной активности митоген-

стимулированных лимфоцитов в условиях блокированного эндогенного синтеза ХС и дозированного введения во внеклеточную среду ЛНП позволяет судить об активности ЛНП-рецепторов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. В комплексном обследовании больных с наследственными ГЛП, ' наряду с изучением липидного и липопротеидного профиле» плазмы крови целесообразно производить определение содержания ХС в лимфоцитах периферической крови для первичного выявления пациентов с семейной гиперхолестеринемнея.

2. В дифференциальной диагностике наследственных гиперхолестеринемий рекомендуется использовать непрямой метод определения активности ЛНП-рецепторов с использованием культуры лимфоцитов периферической крови. Определение пролиферативноя активности митоген—стимулированных лимфоцитов в условиях блокированного эндогенного синтеза ХС и дозированного введения во внеклеточную среду ЛНП позволяет судить об активности ЛНП-рецепторов. У здоровых, людей и цациецтрв с.нормальной активностью ЛНП-рецепторов для полного восстановления пролиферации лимфоцитов достаточно внесения в культуральную среду от 3 до 5 мкг/мл ХС ЛНП. У пациентов с гомозиготной формой СГХС добавление а культуральную среду таких количеств ХС ЛНП и даже значительно больших (до 50 мкг/мл) не восстанавливает пролиферацию лимфоцитов. У пациентов со сниженной активностью ЛНП-рецепторов пролиферация восстанавливается полностью при добавлении во внеклеточную среду от 5 до 10 мкг/мл ХС ЛНП.