Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Использование контейнеров и упаковочного материала с углеродсодержащим покрытием для хранения аллогенных трансплантатов

На правах рукописи

Мусина Альвина Давлетбаевна

Использование контейнеров и упаковочного материала с углеродсодержащим покрытием для хранения аллогенных трансплантатов

14.00.27 - хирургия 14.00.08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Уфа-2006

003067650

Работа выполнена в ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Мулдашев Эрнст Рифгатович

Гапимова Венера Узбековна

Бакиров Анвар Акрамович Азнабаев Равиль Ахметзянович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «_»_2007 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д.208. 006.02 при ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан « » Ученый секретарь диссертационного совета

2006 г.

Р.Т. Нигматуллин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Такие черты современности, как урбанизация, возникновение новых мегаполисов, повышенная опасность и вероятность техногенных катастроф, требуют модернизации служб здравоохранения. Работа современных многопрофильных тканевых банков, которые бы обеспечивали необходимым количеством качественного донорского материала, особенно на случаи массовых ургентных операций, является главным условием развития трансплантологии и пластической хирургии. Известно, что одним из перспективных направлений современной хирургии является трансплантация тканей (Шумаков В.И., 2000, Коваленко П.П., 2000). Достижения в области физики, химии, биологии, медицины, инженерии, компьютеризации и математического моделирования открывают новые возможности в разработке способов сохранения донорского материала. В последнее время мы наблюдаем за успехами в области нанотехнологий, возникших и развивающихся на стыке наук. Применение нанотехнологий в медицинской и клинической практике, кроме познаний в области физиологии клеточных мембран, молекулярной биологии, регенеративной медицины, требует фундаментальных знаний, например в материаловедении, химическом синтезе.

Итак, полноценное сохранение жизнеспособных тканей и органов для успешной дальнейшей пересадки является актуальной проблемой современной трансплантологии. Методы, используемые современными тканевыми банками: низкотемпературная криоконсервация, силиконовысушивание, хранение в питательных средах и другие (Филатов В.П., Брошевский Т.И., Коваленко П.П., 1975, 2000), не всегда позволяют достичь длительного сохранения биопластических свойств аллогенных трансплантов. Консервация донорских тканей и органов, обеспечивающая снижение метаболических, ферментативных аутолитических процессов и сохранение изолированных тканей и органов в состоянии структурной целостности и жизнеспособности - достаточно трудная задача, и поиск более совершенного метода консервации продолжается.

Тенденция использования средств разового применения в современной медицине, продиктованная достижениями научно-технического прогресса и санитарно-гигиеническими требованиями, связана с широким применением в медицине различных полимеров. Однако, как это ни парадоксально, широкое применение различных полимеров, отчасти и в гигиенических целях, стало причиной возникновения другой, не менее опасной проблемы заболеваемости инфекциями, вызванными микробами, происходящими из биопленок, непременно образующихся на поверхности любых полимеров, и стало настолько угрожающим, что выделен класс заболеваний, «вызванных микробами биопленки». Для обеспечения биосовместимости различных изделий из полимерных материалов с живыми тканями, а также с целью предупреждения образования биопленки на них в конце 90-х годов в медицине начали применяться различные способы модификации поверхности полимеров, в частности наномодифицирование поверхностей с помощью нанесения углеродсодержащих покрытий: алмазоподобных, нанотрубы, фуллеренсодержащих, карбиновых.

Различные упаковочные материалы и системы, применяемые в биологии, медицине и изготовленные из синтетических полимерных материалов, должны обладать определенным комплексом свойств, в том числе: биосовместимостью, асептическими свойствами, антибактериальной активностью, при необходимости обеспечивающими феномен биоэпитаксии. Эти качества могут быть обеспечены путем наноструктурирования и модифицирования поверхности материалов.

Поэтому, разрабатывая данную проблему на базе Тканевого банка Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г.Уфа), мы обратились к достижениям современных нанотехнологий. В рамках совместного проекта с кафедрой наукоемких технологий МАТИ и радиоэлектроники МГУ нами были отработаны различные технологии получения наноструктурированной поверхности (НСП) с различными физико-химическими свойствами. Полученные результаты позволили первоначально создать контейнер для асептического хранения контактных и интраокулярных линз (Российский патент № 2120807; 27.10.1998г.).

Предварительные исследования показали, что контейнеры с асептической НСП могут также длительно поддерживать жизнеспособность донорских тканей, в - ом числе донорской роговицы.

Исходя из приведенных данных, нами сформулирована следующая нель настоящей работы: совершенствование способа длительной консервации аллогенных трансплантатов путем создания контейнеров и пленочных упаковочных материалов с наноструктурированным углеродсодержащим покрытием для их хранения.

Задачи

1. Изучить основные физико-химические характеристики асептических углеродсодержащих покрытий с целью создания специального контейнера и упаковочного материала для хранения донорских тканей.

2. Изучить антибактериальные и адгезивные свойства наноструктурирова гшых покрытий и провести тесты на их токсичность.

3. Разработать специальные контейнеры и упаковочные пленки с наноструктурированым покрытием для хранения донорских тканей.

4 Провести сравнительный морфологический анализ нативных трансплантатов на примере донорской роговицы при различных способах консервации.

5. Оптимизировать параметры системы донорская роговица наноструктурированная поверхность - питательная среда.

Научная новизна

1. Установлены, подробно исследованы и объяснены эффекты, возникающие на НСП полимеров при их обработке потоками энергетических частиц инертных и химически активных газов и их смесей, а также при нанесении углеродсодержащих пленок; исследовано влияние НСП на подлежащие биологические ткани, в том числе различные аллотрансплантаты и донорскую роговицу.

2. Экспериментальные исследования, проведенные на полимерных материалах: полиэтилентерефталат (ПЭТФ), политетрафторэтилен (ПТФЭ) и поливинилиденфлюорид (ПВДФ) с НСП, сформированной методами ионно-

5

плазменной технологии, показали, что химический состав, заряд на поверхности, степень ее дисперсности и способ ее модифицирования определяют наличие и эффективность антибактериальной активности, биосовместимости и адгезивности НСП.

3. Установлена возможность управления в широких диапазонах зарядовыми характеристиками поверхности полимеров покрытых углеродсожержащими пленками и используемых для изготовления контейнеров с целью длительного хранения аллотрансплантатов Показано, что биосовместимость углеродных пленок прямо пропорциональна величине электростатического потенциала, а антибактериальная активность определяется структурой и рельефом поверхности.

4 Впервые разработана система донорская ткань - наномодифицированная, биосовместимая, асептическая поверхность - питательная среда, которая по результатам проведенных исследований является более совершенной динамической моделью для хранения жизнеспособного донорского материала.

Практическая значимость

1. Разработанные упаковочные материалы для хранения аллотрансплантатов и специальный контейнер для хранения донорской роговицы с биосовместимой асептической наноструктурироваиной поверхностью могут использоваться в работе тканевых банков. Углеродсодержащее покрытие, модифицирующее поверхность обрабатываемого полимера, обеспечивает асептические условия хранения аллоплантов, а также донорской роговицы и поддерживает метаболические процессы в донорских тканях. Возможность длительного хранения жизнеспособных донорских тканей, в том числе донорской роговицы в асептических пленках и контейнерах с биосовместимой поверхностью, а также безопасная их транспортировка позволят иметь запасы донорского материала.

2. Использование для трансплантации сохранившего жизнеспособность качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений, гарантирует успешное приживление трансплантата.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биосовместимая НСП, имея физико-химические характеристики широкого диапазона, предполагает заданный химический состав, атомную структуру, заряд на поверхности и способна обеспечивать эффект поляризации клеточных мембран, форму и функционирование клеток живых тканей когда они находятся в контакте с ней

2. Асептическая НСП специального контейнера, создавая в консервирующем растворе слабую катионическую среду, исключает существование каких табо контаминаций в ней, способствует поляризации клеточных структур донорского материала, восстанавливая тем самым потенциалы ее клеточных мембран, что, например, задерживает потерю эндотермальных клеток (ЭК) и обеспечивает длительное хранение жизнеспособной роговицы.

3. Бактерицидная активность НСП определяется её физико-химическими свойствами и степенью рельефа, то есть взаимодействие НСП с микроорганизмами протекает по двум механизмам: первый связан с электростатическим свойствами НСП, второй - со степенью дисперсности НСП.

4 Адгезивные свойства НСП позволяют обеспечить оптимальное взаимодействие в системе донорская ткань - НСП углеродсодержащей пленки.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на следующих научных форумах, на Европейских конференциях «Diamond, Diamond-like and Related Materials» по алмазным и алмазоподобным пленкам и родственным им материалам: Барселона, Испания, 1995; Альбуфейра, Тур, Франция, 1996; Эдинбург, Шотландия, 1997; Крит, Греция, 1998; Прага, Чехия, 1999; Порто, Португалия, 2000; Зальцбург, Австрия, 2003; "XIII International Congress of Eye Research», международном конгрессе по теоретическим и фундаментальным исследованиям в офтальмологии, Париж, Франция, 1998; "9-th International Conference on Modern Materials & Technologies", конференции по современным материалам и технологиям, Флоренция, Италия, 1998; « 5th International Conference on the Applications of Diamond Films and Related Materials», «1st International Conference on Frontier Caibon Technology»; международной конференции по применению

алмазоподобных пленок и родственных им материалов, Цукуба, Япония, 1999; международной научно-технической конференции "Вакуумная наука и техника". Москва, 2002; " The First UAE International Conference on Biological and Medical Physics", международной конференции по биологической и медицинской физике, Аль-Аин , Объединенные Арабские Эмираты, 2005; "XXX International World Ophthalmology Congress, Sào Paulo, Brasil", всемирный офтальмологический конгресс, Сан -Пауло, Бразилия, 2006; "Le 112 Congres De La SFO", конгрессе ассоциации французских офтальмологов, Париж, Франция, 2006; «1st International Conference for Ocular Cell Biology», международной конференции по клеточной биологии в офтальмологии, Кембридж, Великобритания, 2006.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ в международной и центральной печати. Получен 1 патент на изобретение и подана 1 международная заявка на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками, 6 таблицами. Список литературы содержит 206 источников (113 отечественных и 93 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Следуя названной цели диссертационной работы, в ней были выделены 2 основных раздела. Это физико-химические исследования характеристик асептических биосовместимых углеродсодержащих покрытий на поверхности полимерных материалов (ИК-спектроскопия, рентгено-фотоэлектронная спектроскопия, исследования электростатических свойств, исследования электрохимических свойств) и морфологические исследования: исследования антибактериальной активности углеродсодержащих пленок и их токсикология, исследования адгезивных свойств углеродсодержащих покрытий, а также биомикроскопические, бактериологические методы исследований

8

аллотрансплантатов на примере донорской роговицы, хранившейся в специальном контейнере с наноструктурированным углеродсодержащим покрытием.

Методы физико-химических исследований характеристик асептических биосовместимых углеродсодержащих покрытий на поверхности полимерных материалов (ИК-спектроскопия, рентгено-фотоэлектронная спектроскопия, электронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА); исследования электростатических свойств, топология наномодифицированной поверхности).

Исследовались процессы формирования НСП на полимерных материалах: ПЭТФ, ПТФЭ и ПВДФ, их модифицированные поверхностные характеристики и возможности управления ими. Выбор данных полимеров определялся как широким использованием указанных материалов, так и возможностью обеспечения большого диапазона свойств при модифицировании образованных поверхностей, поскольку ПЭТФ обладает высокоэнергетической полярной поверхностью, а ПТФЭ обладает малыми значениями диэлектрической проницаемости и диэлектрических потерь, низкоэнергетической неполярной поверхностью, а также широким рабочим температурным диапазоном.

НСП на основе ПЭТФ, ПТФЭ, ПВДФ формировалась обработкой исходной поверхности потоками ионов химически активных и инертных газов и их смесей (СР4, Аг, 02) Модифицирование сформированных НСП производилось двумя путями: нанесением пленок углерода толщиной 5-120 им из направленных ионно-плазменных потоков паров углеводородов и магнетронным нанесением высокопористых пленок. В первом случае возможно управление свойствами поверхности за счет управления фазовым и кластерным составом пленки, числом слоев и толщиной слоя при отношении реальной поверхности к геометрической в интервале 8-10, а во втором случае это отношение увеличивается в 100 раз.

Исследовалось влияния предварительной обработки полимерной поверхности пучком ионов азота и кислорода на состав поверхности и ее физико-химические свойства. Для определения изменения химической структуры поверхности проводились исследования химического состава наноразмерного покрытия на основе углерода, сформированного ионно-плазменными методами на поверхности

9

обрабатываемого материала упаковочного пленчатого материала и специального контейнера, это: ИК-спектроскопия, рентгено-фотоэлектронная спектроскопия, электронная спектроскопия для химического анализа (ЭСХА). Измерение заряда поверхности производилось методом динамического конденсатора. Измерение абсолютной величины электростатического потенциала производилось с помощью киловольтметра С 95.

Для топологических исследований структуры НСП использовался атомно-силовой микроскоп «ФемтоСкан» с максимальным полем сканирования 10x10 мкм. Для каждого из образцов были получены снимки поверхности в разных точках и при различном увеличении. Основными определяемыми параметрами являлись: характерный горизонтальный размер-г, периметр-Ь, объем-V, особенности рельефа поверхности, шероховатость поверхности (среднеквадратичное отклонение-Яц), площадь участка поверхности-^, а также фрактальная размерность-ОР.

Для изучения характеристик поверхности образцов использовали также

гониометрический способ измерения контактных углов смачивания (0). Рабочими

жидкостями служили вода (бидистиллят) и глицерин (химически чистый).

Значения контактных углов получали как среднестатистические из 5

экспериментов по 10 измерениям. На основании полученных данных

рассчитывали величины полной поверхностной энергии (у), полярного (уР) и

дисперсионного (ус1) компонентов. Для расчетов использовали величины работы

адгезии, полученные на основании экспериментальных значений смачивания

краевых углов и формулы Дюпре-Юнга применительно к двум жидкостям.

Методы исследования антимикробной активности углеродсодержащих пленок и их токсикология. Исследование антимикробной активности углеродсодержащих пленок. Методы исследования адгезивных свойств углеродсодержащих покрытий

Исследование антимикробной активности алмазоподобных и карбинсодержащих пленок было проведено по стандартной методике методом аппликации испытуемых образцов на зараженную микроорганизмами поверхность мясопептонного агара в чашках Петри. Пластины кремния, покрытые алмазоподобными и карбинсодержащими пленками, использовали как субстраты

10

для культивирования эмбриональных фибробластов мыши. Нанесенные углеродные пленки имели различные значения зарядовых характеристик поверхности, контактного угла смачивания, рельефа и состава поверхности. Изучалась взаимосвязь между данными исследования зарядовых свойств поверхности и данными исследования степени адгезивности клеток соединительной ткани.

При исследовании антибактериальная активность испытуемых наномодифицированных углеродсодержащими покрытиями образцов оценивалась по стандартной методике in vitro. Для этого использовали музейные штаммы грамположительного (Staphylococcus aureus АТСС 29213) и грамотрицагелыюго (Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853) микроорганизмов. Суспендировали 3 -4 колонии 18-20 часовой культуры исследуемых микроорганизмов в 3 мл физиологического раствора. Полученную суспензию доводили до стандарта мутности 0,5 по шкале McFarland (1,5-108 кое/мл). Базовую суспензию разводили в физиологическом растворе методом серийных разведений до концентрации 15 кое/мл. Бактерицидное покрытие разрезали на фрагменты размером 1,5x1,5 см. По одному фрагменту каждого вида помещали в пробирку с жидкой питательной средой (контроль стерильности покрытий). В качестве питательной среды использовался бульон Мюллера-Хинтона. Из каждой пробирки с различной концентрацией кое/мл забирали дозатором по 25 мкл суспензии микроорганизма и наносили на отдельный фрагмент полимерной подложки с покрытием, а также на простую подложку для контроля роста культур. Зараженные таким образом фрагменты покрытий инкубировали во влажной среде в термостате 2 часа при температуре 37°С. После инкубации фрагменты помещали в пробирки с 4 мл питательной среды и ставили в термостат. Пробирки инкубировались при температуре 37°С в течение 48 часов. Бактерицидную активность оценивали по наличию видимого роста в пробирках с питательной средой на 2-е сутки инкубации.

Эффективность образцов условно определяли по "трем степеням".

Санитарно-химические испытания проводились на содержание восстановительных примесей, определяемых по расходу 0,02 Н раствора Na2S203l

И

на содержание органических примесей, определяемых по показателю оптической плотности в области длин волн 220 нм, а также на содержание металлов, таких как Cd, Pb, Sn, Cu, Cr, Ba.

Адгезивность in vitro в отношении культивируемых клеток, эмбриональных фибробластов мыши, исследовалась следующим образом: субстраты обрабатывали 96 % этанолом, промывали дистиллированной водой и после высушивания помещали в культуральные чашки. Чашки с субстратами стерилизовали УФ в течение 1 часа. Клетки суспендировали в культуральной среде 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков, культивировали в течение трех суток при температуре 37°С в атмосфере воздуха с 5 % С02. По окончании культивирования клетки фиксировали 2 % раствором глутарового альдегида, промывали в воде и высушивали; часть препаратов окрашивали 1 % раствором метиленовой сини. Препараты изучали с помощью световой и стереомикроскопии.

Эксперимент in vivo проводился следующим образом: пластинки фторопласта (0,6x2 см2), покрытые углеродными пленками, в стерильных условия к имплантировали подкожно мышам линии СВА х С57В1 (по одной пластинке в оба бока). Через 4 месяца после операции имплантации пластинки с образовавшимися вокруг них капсулами извлекали и фиксировали в 10% нейтральном формалине. Из пластинок с капсулами готовили гистологические препараты по стандартной методике; серийные срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии.

Морфологические исследования донорского материала роговицы в эксперименте в зависимости от способа хранения донорской роговицы, типа консервирующей среды, длительности и температуры хранения донорской роговицы

Для проведения морфологических исследований корнеосклеральные диски были иссечены и хранились в органной культуре по методике, соответствующей стандартам тканевых банков. Диски иссекались после обработки целого глазного яблока (четырехкратное промывание глазного яблока в стерильном 0.9% [wt/vol] NaCl), затем его погружали в 5% раствор йода поливинилпиролидона, после чего глазное яблоко обрабатывалось 2% тиосульфатом натрия (для нейтрализации) и вновь помещалось в раствор 0.9% [wt/vol] NaCl. Корнеосклеральные диски

12

помещались в специальные контейнеры для хранения донорской роговицы, контейнеры за внешний выступ подвешивались на нити 5/0 Mersilk (Ethicon, ААН, Bristol, UK) и помещались в стеклянный флакон емкостью 120 мл, с 100 мл консервирующей среды. Консервирующими средами были выбраны Eagle's minimum essential medium (MEM), Optisol, Dexol (среда McCarey-Kaufman), плазма крови донора. Донорские роговицы хранились в стандартном инкубаторе при температуре 27°С , время хранения - до 30 дней, без замены консервирующей среды.

Исследование Эндотелия. После определенного времени хранения донорской роговицы плотность эндотелиальных клеток и их жизнеспособность определялись в зоне площадью 1.54 мм2 с использованием фазово-контрастного светового микроскопа. Роговичный эндотелий окрашивался в 45% растворе трипанового синего (Sigma, UK). Окрашивание длилось 1 минуту, после чего проводились подсчет числа некротизированных клеток и определение характера их распределения. После промывания в стерильном 0,9% (wt/vol) растворе NaCl был использован гипотонический раствор 1,8% sucrose для визуализации границ клеток. Число клеток в центральной зоне роговичного эндотелия определялись на площади в 1 мм2, используя eyepiece graticule калибровку на микроскопе и учитывая градус-степень складки. Качество эндотелия оценивалось по степени от 1 до 5 соответственно возрастающему критерию, по таким критериям, как форма клетки, ее границы и размеры. Исследовано 20 кадаверных глаз, которые хранились с помощью разных способов консервации: во влажной камере, в среде Eagle's, в специальных контейнерах с разными средами (Optisol, Dexol, плазма крови донора). После этого исследования корнеосклеральные диски немедленно помещались в 10% раствор нейтрального буферного формалина и хранились при температуре 4°С.

Для изучения тканей под электронным микроскопом, позволяющим выявить ультраструктуру клеток и их компоненты, применяют методы фиксации (обычно с использованием осмиевой кислоты и глутаральдегида) и среды для заливки (обычно эпоксидные смолы). При этом использовался оригинальный метод заливки роговичной ткани, предложенный Илатовской JI.B. (1980). Для

13

определения необходимого для исследования участка ткани, а также для ориентировки в слоях препарата делались срезы, которые окрашивались (метиленовым синим, гематоксилином, толуидиновым синим). Морфологические исследования проводились при увеличении х200 и х500, в группах исследуемого донорского материала, отличающихся: способом хранения жизнеспособной донорской роговицы, типом консервирующей среды, длительностью и температурой хранения донорской роговицы. Сравнивались такие способы хранения донорской роговицы, как способ хранения во влажной камере по Филатову, в питательной среде Eagle's, в специальном контейнере, в разных консервирующих средах. Консервирующими средами были выбраны Optisol, Dexol (среда McCarey-Kaufman), плазма крови донора.

Полученные результаты и их обсуждение

Исследование заряда на НСП и возможность регулирования его величины и направления открываю новые технологические возможности в создании специальных контейнеров для хранения аллогенных трансплантатов и в том числе донорской роговицы.

Состав и физико-химические свойства поверхности являются важным моментом при формировании НСП и зависят от поставленных исследователями и технологами задач. Исследование антибактериальной активности НСП было нашим первым шагом на пути преодоления формирования биопленки на поверхности полимера и достижения биосовместимости с окружающими тканями. Биосовместимая НСП предполагает определенный химический состав, атомную структуру, заряд на поверхности и способна обеспечивать эффект поляризации клеточных мембран, форму и функционирование клеток живых тканей, находящихся в контакте с НСП (например, бессосудистые структуры роговицы -НСП) (Moussina A.D., 2002).

Так, ИК-спектроскопия указывает на то, что синтезированное из ионного пучка наноразмерное покрытие на основе углерода имеет неоднородную структуру, включающую линейные цепи (-СН2-)п и шестичленные кольца (СН2)6, содержащие в своем составе кетонные группы, а также аморфный углерод а-С. Результаты по исследованию состава пленок на основе углерода при обработке

полимеров потоком ионов аргона показали отсутствие кетонных групп, что приводило к большей вероятности получения биосовместимых материалов. В случае обработки в воздушной смеси и нанесения пленки углерода появлялись антибактериальные свойства.

Электростатические исследования углеродсодержащих пленок показали, что предварительная обработка поверхности полимеров, толщина покрытия, энергия частиц существенно влияют на изменение заряда поверхности полимеров. В процессе нанесения углеродного слоя пленки ПТФЭ, ПЭТФ, ПВДФ приобретают избыточный положительный заряд до нескольких мкКл/м2. Предварительная обработка поверхности пленки ПЭТФ, ПТФЭ, ПВДФ в смесях Аг + О и воздушной приводит к более эффективной зарядке поверхности образца в сравнении с обработкой в плазме CF4. Исследование электрофизических свойств поверхности полимеров после обработки и последующего нанесения углеродных пленок позволило выявить некоторые особенности образования и роста пленок на поверхности полимеров с различной структурой поверхности. Показана также возможность влияния на электрические свойства полимеров путем наноструктурирования их поверхности.

Проведенные топографические исследования (АСМ) наноструктурированной поверхности показали, что после предварительной обработки образцов ПЭТФ, ПТФЭ, ПВДФ и после нанесения на их поверхность покрытий в первый момент происходит сглаживание микронеровностей поверхности (шероховатость уменьшается). Далее, с ростом толщины пленки, высота неровностей начинает увеличиваться, причем диаметр конгломератов почти не изменяется, однако при достижении некоторой толщины покрытия размер характерных особенностей рельефа увеличивается. Предварительная обработка поверхности подложки с помощью CF4 приводит к развитию рельефа. При достаточно длительной обработке поверхность после нанесения покрытия имеет большую шероховатость, чем без предварительной обработки. Увеличение длительности предварительной обработки увеличивает шероховатость поверхности, получаемой уже после осаждения покрытия. Шероховатость поверхности при этом увеличивается почти в 100 раз по сравнению с пленкой, наносимой без предварительной обработки. Все

15

эти изменения в структуре поверхности вызывают однозначное изменение фрактальной размерности. В дальнейшем при проведении исследований асептических свойств НСП и ее биосовместимости было установлено, что наибольшая бактерицидная активность проявляется у образцов с максимально развитым рельефом (отношение реальной площади к геометрической ~ 100). Взаимодействие НСП с микроорганизмами протекает, по-видимому, двумя путями. Один из них связан с эектростатическим взаимодействием, когда реальная поверхность может быть увеличена в 5-8 раз. Второй механизм связан со степенью дисперсности НСП.

Таким образом, физико-химические свойства НСП позволили определить оптимальные параметры характеристик углеродсодержащих пленок для получения специальных контейнеров и упаковочных пленок, обработанных асептическими биосовместимыми покрытиями. Толщина наносимых на поверхность пленок варьирует от 5 до 120 нм и зависит как от материала подложки (ПЭТФ, ПТФЭ, ПВДФ), так и от заданных свойств готового изделия. Нанесение пленки из С6Н|2 уменьшает заряд на поверхности пленок, а с увеличением содержания N (азота) в газовой смеси приводит к увеличению заряда НСП. Предварительная обработка поверхности, например с помощью СР4, приводит к развитию рельефа, а предварительная обработка поверхности пучками ионов 02 и N - к разрушению карбонильных связей с формированием гидрофобной поверхности. То есть технологический режим нанесения углеродсодержащих пленок определяется заданными свойствами поверхности асептического биосовместимого специального контейнера или упаковочной пленки.

Разработка специальных контейнеров и упаковочных пленок с наноструктурированым покрытием для хранения донорских тканей

При разработке специального контейнера для асептического хранения и

транспортировки нативных тканей и донорской роговицы помимо антибактериальных, определенных барьерных свойств, обнаруженных ранее, в ходе экспериментальных и клинических исследований, выявлены были и другие свойства наномодифицированной поверхности полимера, полученной с помощью нанесения углеродсодержащего покрытия (УП), например моделирование электростатических свойств поверхности полимера формирующего интерфейс с

16

подлежащей биологической тканевой структурой. Это позволило приступить к разработке способа консервации жизнеспособной донорской ткани созданием условий длительного хранения, максимально приближенных к физиологическим.

Специальный контейнер для хранения и транспортировки жизнеспособной роговицы изготовлен из ПВДФ способом прессования. Он имеет чашеобразную форму (форму корнеосклеральной контактной линзы) диаметром 17 мм, толщиной 0,3 мм, с модифицированной НСП. Торсионный край формы контейнера сформирован таким образом, что угол, образующийся между внутренней сферической поверхностью контейнера и внутренним выступом торсионного края, служит пазом для края донорской роговицы, помещаемой в контейнер, а наружный выступ торсионного края контейнера служит для фиксации контейнера во флаконе с консервирующей средой.

Донорские роговицы, иссеченные с 3-4 мм склеральным ободком, помещаются в специальные контейнеры. Модифицирование поверхности специального контейнера может производиться двумя способами: нанесением пленок углерода толщиной 5-120 нм из направленных ионно-плазменных потоков паров углеводородов (V.M. Elinson, V.V. Sleptsov, A.N. Laymin , V.V.Potraysay, L.N.Kostuychenko, A.D.Moussina,1999; V.V Sleptsov, V.M. Elinson, N.V. Simakma, A.N Laymin, I.V. Tsygankov, А A Kivaev, A.D. Moussina, 1996) и магнетронным нанесением высокопористых пленок (В.Т. Гринченко, В.В. Слепцов, С.А. Федоров, 1988). В первом случае возможно управление свойствами поверхности за счет управления фазовым и кластерным составом пленки, числом и толщиной слоя при отношении реальной поверхности к геометрической в интервале 8-10, а во втором случае это отношение увеличивается в 100 раз.

Специальный контейнер прошивается через наружный торсионный выступ подвешивающейся нитью. Донорская роговица аккуратно укладывается в контейнер, который затем помещается во флакон емкостью 120мм с 100мм консервирующей среды. Стерильно закрытые флаконы помещаются в шкафы для хранения при температуре 27-28°С (Мусина А.Д., 2000; 2005).

Результаты исследования антимикробной активности углеродсодержащих пленок и их токсикология. Результаты исследования адгезивных свойств углеродсодержащих покрытий

Экспериментальные результаты исследований антибактериальной активности наноструктурированных углеродсодержащих пленок представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Результаты экспериментальных исследований антимикробной активности наноструктурированных углеродсодержащих клеток

№ п/п Полимер / условия нанесения HHflHKaT op m/o Иннокуляционная доза (KOE/ml) 105 104 103 102 10

1 PTFE: 1) обработан CF4; 2) а-С:Н (50 нм), 3) Al (pacn из фольги) Ps. aerug. + + + ± ±

S aureus + + ± - -

PTFE, гладкий Ps. aerug. + + + + +

2 1) а-С:Н (50 нм), 2) Al (pacn из фольги) S. aureus + + + + +

3 PTFE: 1) обработан CF4, Ps aerug + + + + +

2) а-С H (50 нм) S aureus + + + + +

4 PTFE гладкий Ps aerug + + + + +

а-С H (50нм) S aureus + + + + +

5 PTFE 1) обработан CF4, Ps aerug + + + + +

2) а-С H (Юнм). S aureus + + + + +

6 PTFE гладкий Ps aerug + + + + +

а-С H (Юнм) S. aureus + + ± - -

7 PTFE Ps aerug + + + + +

обработан CF4 S aureus + - - - -

РЕТ(рельеф+- AI) Ps aerug + + + + +

8 1) "R''/возд 1/, 2)"R"/а-СН Юнм S. aureus + + + + +

РЕТ(рельеф) + А1 Ps aerug + + + + +

9 1) "R"/ возд.1/, 2) "R"/a-C.H 50 нм S aureus + + - - -

PET (рельеф + А1/А1203 Ps aerug + + + + +

10 1 ) "R" / air 1/; 2) "R" / а-С.Н 50нм S aureus - - - - -

PET (рсльефО + 1/А1203 Ps. aerug. + + + - -

11 1)"R''/возд. 3/; 2)"R"/a-С.Н 50 нм S. aureus + - - - -

PET ( рельеф) + А1/А1203 Ps aerug. + + - - -

12 1)"R''/возд. 3/; 2)"R"/a-СН 100 нм S. aureus + - - - -

13 PET. 1) "R''/возд 1,5/; 2) "R"/a-C H (30+20)нм Ps aerug. + + ± + -

14 РЕТ- 1) "Я"/СР4; 2) "Я" / а-С.Н 30 нм Ре аеп^. + + + - -

15 РЕТ- 1) "Я" / возд 1,5/; 2)"Г/а-СН 40 нм РБ аегщ. + - - - -

16 РЕТ "Я" / а-С Н 40 нм Рб. аепщ. + + + + -

17 РЕТ: 1) "Я"/возд 1,5/, 2) "Я"/а-С.Н (20+20)нм Рэ аеп^ + + + + +

Из таблицы видно, что наибольшая бактерицидная активность проявляется у образцов с максимально развитым рельефом (отношение реальной площади к геометрической ~ 100). Корреляция результатов исследования заряда и анализ данных позволяют утверждать, что взаимодействие НСП с микроорганизмами протекает, по-видимому, по двум механизмам, причем один из них связан с электростатическим взаимодействием, а интенсивность второго механизма связана со степенью дисперсности НСП. Основными факторами, влияющими на антибактериальную активность изделий с углеродными покрытиями, являются: состав и структура исходного соединения, условия и метод формирования пленок, состав материала и вид изделия.

Результаты исследования адгезивных свойств углеродсодержащих покрытий

В табл. 2. представлены результаты по адгезивности эмбриональных фибробластов мыши на гладком ПЭТФ и мембранах на его основе при нанесении пленок различными методами в различных условиях.

Таблица 2.

Адгезивность для клеток соединительной ткани (фибробластов мыши)

углеродных пленок, нанесенных на ПЭТФ различными методами

№ п/п Подложка Метод нанесения Условия нанесения Среднее число клеток наБ = 0,6 мм5 Содержание слабо распластанных клеток, % (<р)/В, ±25%

1 Покровное стекло (контроль) - - 300,0 5 -

2 ПТЭФТМ 2 С6Н12 11,0 51,6 1200

3 ПЭТФ, 0,1 мм 2 С6Н12 (1С = 0,5 мкм 13,2 27,2 1300

4 ПЭТФ, 0,1 мм 2 С6Н12 15,2 75,9 1500

5 ПЭТФ, 0,1 мм 1 С6Н12 + Ы2 3 1 34,6 13,6 30

6 ПЭТФ, 0,1 мм без покрытия (контроль) - - 46,5 14,6 10

7 ПЭТФ, 0,1 мм 1 С6Н12 82,7 76,7 5

8 . ПЭТФ, 0,1 мм 1 C6H12 + N2 1 1 92,4 29,6 0

9 ПЭТФ, 0,1 мм 1 С6Н12 189,4 35,3 5

10 ПЭТФ, 0,1 мм1 2 С6Н12 d > 3 мкм 196,7 12,2 -100

Показано среднее число клеток и процентное содержание слабораспластанных клеток, к которым относили клетки с сильно редуцированной цитоплазмой. Общее число прикрепившихся клеток (как распластанных, так и слабо- или нераспластанных) характеризует адгезивные свойства материала, его способность относительно прочно связывать клетки, осевшие из взвеси на поверхность материала. Процентное содержание клеток, достигших достаточно выраженного распластывания, характеризует комплекс свойств данного материала: адгезивность для клетки, способность связывать определенные белки из сыворотки, характер микрорельефа поверхности, а также отсутствие цитотоксичности, препятствующей распластыванию клеток и вызывающей их последующую гибель. Результаты указывают также на то, что чем меньше ф(значение электростатического потенциала), тем выше адгезивность для клеток, при этом процентное содержание слабораспластанных клеток не изменяется монотонно в соответствии с зарядовой закономерностью. Основными факторами в этом случае являются структура и состав поверхности.

При исследовании адгезивных свойств результаты эксперимента in vivo с имплантацией углеродсодержащей пленки (УП) показали, что спустя 4 месяца после имплантации вокруг пластинок с НСП сформировалась соединительнотканная капсула, что является стандартной реакцией на биосовместимость имплантата, её толщина вокруг одной и той же пластинки значительно варьировала: в отдельных участках капсула была тонкой (не более 2-4 рядов клеток), в других местах выглядела многослойной. Тонкие участки капсулы состояли из молодых малодифференцированных фибробластов, иногда непосредственно соприкасающихся с поверхностью пластинки; между клетками определялись тонкие коллагеновые волокна. В толстых участках капсулы можно

20

было различить три слоя: внутренний, примыкающий непосредственно к пластинке, морфологически сходной с описанными выше тонкими участками капсулы; средний слой, состоящий из зрелых фибробластов и коллагеновых волокон, ориентированных параллельно поверхности пластинки; наружный слой, состоящий из фибробластов разной степени зрелости и рыхло расположенных коллагеновых волокон. Ни в одном случае не наблюдалось лейкоцитарной инфильтрации, что указывает на отсутствие воспалительной реакции. Описанная морфологическая картина строения капсулы была сходной у всех имплантированных пластинок.

Экспериментальные исследования, проведенные на ПЭТФ, ПТФЭ, ПВДФ с НСП, сформированной методами ионно-плазменной технологии, показали, что степень дисперсности поверхности и способ ее модифицирования определяют наличие и эффективность поверхностных характеристик, в частности биосовместимости, антибактериальной активности, отсутствия токсичности развитой поверхности с хорошими адгезивными свойствами для клеток. При исследовании НСП были открыты такие феномены, как слежение, исправление, конструирование и контроль над биологическими системами на молекулярном уровне. Все природные материалы и системы построены из нанообъектов. Именно в интервале наноразмеров на молекулярном уровне природа определяет основные характеристики веществ, явлений и процессов. Особенности свойств веществ и материалов в нанометровом диапазоне определяются не только уменьшением размеров структурных элементов, но и проявлением квантовомеханических эффектов, волновой природой процессов переноса и доминирующей ролью поверхностей раздела. Управляя размерами и формой наноструктур, можно придавать материалам совершенно новые функциональные характеристики, значительно отличающиеся от характеристик массивных материалов. Кроме того, в отдельных случаях НСП должны обладать особыми физико-химическими или химическими свойствами, например, биодеградируемостью, либо особой прочностью, либо гибкостью, либо иметь пористую структуру для формирования межклеточного вещества (матрикса). На основе НСП, модифицированных

соответствующим образом, также могут быть реализованы биокатализаторы для различных процессов биотехнологий.

Полученные экспериментальные результаты открывают новые технологические подходы к созданию биологически активных систем.

В результате морфологических исследований донорского материала роговицы было констатировано, что после её хранения в течение 1-2 суток не выявлялись какие- либо существенные морфологические изменения со стороны ЭК донорской роговицы, независимо от способа ее хранения: типа консервирующей среды, длительности и температуры. Патологические морфологические изменения выявлялись на 4"й день хранения донорской роговицы во влажной камере и на 5-6 день хранения в среде Eagle's. В специальных контейнерах, в консервирующих средах Optisol, Dexol донорские роговицы хранились при температуре 25-27°С, сохраняя должное качество до 17 дней. Обнадеживающие результаты были получены при хранении донорской роговицы в специальном контейнере в плазме крови донора. До 20 суток и более сохранялась структура стромы роговицы, четко контурировали границы эндотолиальных клеток. Как известно, состояние латеральных границ клеточных мембран ЭК весьма важно для осуществления механизма транспорта жидкости через ЭК (J.Fischbarg, 1997). При хранении донорской роговицы в плазме мы не наблюдали появления осадка в консервирующей среде, что имело место при хранении в средах Optisol, Dexol после 15 дней хранения донорской роговицы в 10% случаев. Плотность и количество ЭК определялись и сравнивались до начала консервации и через 5, 10,15, 20 дней хранения 20 донорских роговиц, разделенных на 5 групп по способу хранения. Данные исследования приведены в табл.3.

Таблица 3.

Результаты определения количества эндотелиальных клеток донорских роговиц, консервированных различными способами

„ Через 5 Через 10 Через 15 Через 20

Среда До консервации у „ 1 „ F „ „

дней дней дней дней

Влажная камера 2260 1490

Eagle's 2190 1740 1320

Optisol 2360 2200 1930 1880 1740

Dexol 2280 2150 1950 1860 1770

Плазма донорской ^ 2240 ^ то

крови

Наибольшая потеря числа ЭК донорской роговицей происходит в течение первых 5-10 дней консервации донорского материала. Донорские роговицы хранившиеся во влажной камере и среде Eagle's, через 5 и 10 дней структурно морфологически изменились, что не позволило использовать для их дальнейшего исследования. Донорские роговицы, хранившиеся в специальных контейнерах с консервирующими средами, сохраняли структурность и плотность ЭК, т.е. оставались жизнеспособными на более длительный срок консервации. Электростатические свойства НСП могут способствовать либо адгезии на поверхности химических соединений, белковых структур, клеток, клеточных структур, либо НСП может проявлять себя как интактная в отношении определенных соединений. Поэтому потерю ЭК донорской роговицей можно предупредить помещением её в специальный контейнер, который кроме бандажной выполняет функцию биологически активной системы, так как НСП специального контейнера способствует восстановлению потенциала клеточных мембран структур роговицы.

Как известно поляризация клеточных мембран обеспечивается постоянной векторной трансфузией гуморальных жидкостей, при этом направление вектора движения определяется градиентом концентрации.

На базе Тканевого банка Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г. Уфа) разработаны и внедрены в производственную практику методы консервации в контейнерах с углеродсодержащим покрытием различных видов аллотрансплантатов (сухожилий, фасций, жировой клетчатки, перикарда и др.). Разработанная нами система донорская ткань - наномодифицированная, биосовместимая, асептическая поверхность - питательная среда, по результатам проведенных исследований, является более совершенной динамической моделью для хранения жизнеспособного донорского материала.

ВЫВОДЫ:

1. Применение полимерных пленок с углеродсодержащими покрытиями на основе НСП и имеющих заданные физико-химические свойства, позволяет пролонгировать жизнеспособность консервируемых донорских материалов при сохранении их биопластических свойств.

2. Биосовместимость углеродных пленок пропорциональна величине их электростатического потенциала. На данном принципе разработаны покрытия с НСП, которые могут использоваться для обработки специальных контейнеров и упаковочных пленок с целью длительного хранения различных видов донорского материала.

3. Углеродсодержащие покрытия обладают антибактериальными свойствами. НСП специального контейнера, создавая в физиологическом буферном растворе слабую катионическую среду, исключает существование каких-либо контаминаций в ней; способствует поляризации клеточных структур, восстанавливая потенциалы клеточных мембран, тем самым сохраняет форму и структуру донорской ткани.

4. Адгезивные свойства предлагаемых покрытий определяются электростатическими свойства НСП и могут способствовать либо адгезии на поверхности химических соединений, белковых структур, клеток, клеточных структур, либо НСП может проявлять себя интактной в отношении биологического материала.

5. Применение асептических специальных контейнеров и упаковочных пленок с биосовместимой поверхностью позволяет увеличивать сроки консервации и запаса донорского материала. Использование для трансплантации сохранившего жизнеспособность качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений.

6. Создание биологически активной системы с помощью формирования НСП -это решение проблемы длительного хранения жизнеспособных донорских тканей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Для асептического хранения и транспортировки донорского материала, используемого в общей хирургии, впервые разработаны специальный контейнер и упаковочные пленки с биосовместимой асептической НСП. Разработанные для обработки поверхности контейнеров и пленок углеродсодержащие покрытия с НСП способствуют поддерживанию метаболических процессов донорских тканей, обеспечивая тем самым увеличение сроков их жизнеспособности во время консервации. Изготовленные таким образом контейнеры и пленки могут быть использованы для длительного хранения жизнеспособных донорских тканей в условиях многопрофильных тканевых банков, а также при необходимости для безопасной транспортировки донорского материала.

Для консервации донорской роговицы предлагаемый способ консервации обеспечивает:

1. Бандажную функцию для донорской роговицы, которая защищает ее от деформации и возможных механических повреждений.

2. Физико-химические свойства НСП обеспечивают асептическое хранение донорской роговицы, поляризацию клеточных мембран, а также способствуют поддержанию метаболических процессов.

3. Хранение донорской роговицы в специальном контейнере не требует периодической замены питательной среды, тем самым избавляет клетки донорской роговицы от возможных стрессов и исключает возможность инфицирования питательной среды.

4. Увеличение срока хранения донорской роговицы до 30 дней и более.

5. Возможность транспортировки донорских роговиц в контейнерах.

6. Многократное использование контейнеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДЕССЕРТАЦИИ

1. Ophthalmologic application of contact lenses modified by means of ionassisted carbon films / V.V. Sleptsov, V.M. Elinson, N.V. Simakina [et al.] // Diamond and Related Materials. - 1996. - Vol. 5 - P. 483-485.

2 Moussina, A. The improvement in contact lens quality with contact lens cases surface modified by diamond-like and carbyne films covering / A. Moussina // Adv Sci. Technol Italy. - 1999. - Vol. 21. - P. 425-432.

3. Barrier properties of carbon films deposited on polymer-based devices m aggressive environments / V.M. Elinson, V.V. Sleptsov, A N. Laymin [et al ] // Diamond and Related Materials. - 1999. - Vol. 8. - P. 2103-2109.

4. Модификация поверхности офтальмологических жестких контактных линз с помощью углеродсодержащих пленок, нанесенных ионно-плазменными методами / В.М. Елинсон, В.В. Слепцов, А.Н. Лямин [и др.] // Инженерный журнал - 1999 - № 11 (32). - С. 59-60.

5. Барьерные свойства углеродных пленок, нанесенных на полимерную основу, в условиях агрессивной окружающей среды / В.М. Елинсон, В.В. Слепцов, А.Н. Лямин [и др.] // Инженерный журнал. - 1999. - № 11 (32). - С. 61-64.

6. Формирование контейнеров для контактных линз с бактериостатической поверхностью / А.Д. Мусина, В.М. Елинсон, В.В. Потрясай [и др.] // Вакуумная наука и техника: матер, медународ. науч.-технич. конф. — М.: МИЭМ, 2002. - С. 275-281

7. Moussina, A.D. Artificial iris surface modification by means of carbon film deposition for providing the eye diaphragm loss compensation / A. D. Moussina // The

25

First UAE International conference on biological and medical physics- conf. proc. - A1 Am, 2005. - P. 78 .

8. New method of donor cornea storage and transportation providing donor tissue quality and biocompatibility / A.D Moussina, EA Egorov, V.U. Galimova, RT Nigmatullin // WOC, Brasil,; Conference Proceedings, 2006.

9. Moussma, A.D. L'application des nanotechnologies pour une concervation de la comee du donneur / A.D. Moussina // Le 112 Congres de la SFO' conf. proc - Paris, 2006. - P. 24 .

10. Moussina, A.D. The Application of Nanostructured Surface for the Recovering of the Cornea / A.D. Moussina // 1st International conference for ocular cell biology, 610 September, Homerton College, Cambridge. - Cambridge, 2006 - P. 40 .

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ асептического хранения и транспортировки контактных и интраокулярных линз: Патент на изобретение № 2120807, 27.10.98, Российская Федерация, автор А.Д.Мусина, по заявке № 97112484, дата поступления: 31.07.97; приоритет от 31.07.97.

2. A D. Moussina "Maintenance of aseptic storage and transportation donor cornea" PCT/RU00/00229, 20.10.2000.

Использованные в работе основные термины и их сокращения

ПЭТФ - полиэтилентерефталат

ПТФЭ - политетрафторэтилен

ПВДФ - поливинилиденфлюорид

НСП - наноструктурированная поверхность

УП - углеродсодержащая пленка

ИК-спектроскопия - спектроскопия в инфракрасном спектре ЭСХА - электронная спектроскопия для химического анализа АСМ - атомно-силовой микроскоп ВЧ - высокие частотны

Staphylococcus aureus АТСС 29213 - музейный штамм грамположительного микроорганизма

Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 - музейный штамм грамотрицательного

микроорганизма

УП - углеродное покрытие

R - горизонтальный размер

L - периметр, S - площадь

V - объем рельефа поверхности, шероховатость поверхности

Rq -среднеквадратичное отклонение

DF - фрактальная размерность.

9 - контактный угол смачивания

у- величина полной поверхностной энергии

уР - полярная компонента у

yd - дисперсионная компонента у

ЭК - эндотелиальная клетка

Мусина Альвина Давлетбаевна

Использование контейнеров и упаковочного материала с углеродсодержащим покрытием для хранения аллогенных трансплантатов

14.00.27 - хирургия 14.00.08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 25.12.2006 г. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Отпечатано на ризографе. Формат 60(84 '/,«. Усл.-печ.л. 1,4. Заказ № 194. Тираж 100.

Отпечатано ООО «Плакат» 450112, Уфа, ул. Калинша, 19, т. 264-86-39

Идеальными материалами для замены тканей и органов, утративших по какой-либо причине свои функции, могут быть точно такие же донорские ткани или целые органы. Первые и впечатляющие успехи на этом пути были достигнуты 100 лет тому назад с первой пересадкой роговицы человеку, выполненной Dr. Eduard Zirm в 1905 году.

Широкое применение в клинической практике кадаверных тканей и органов составляет неоспоримый приоритет отечественной медицины. Советские ученые проводили многочисленные исследования по трансплантации кадаверных тканей и органов. В 1936г. академик В.П. Филатов впервые в мире предложил способ криоконсервации кадаверной роговицы, после чего трансплантация ее стала довольно обыденной операцией. Филатов В.П. также успешно занимался трансплантацией и других кадаверных тканей — слизистой оболочки (1935) и кожи (1937). Михельсон Н. М. (1935) первым в мире использовал в клинической практике трансплантацию кадаверного хряща. Арапов Д. А. (1931-1934) осуществлял в эксперименте и клинике пересадки кадаверных эндокринных желез, Ю.Ю. Вороной еще в 1933г. впервые в мире произвел в клинике пересадку кадаверной почки. То есть, в начале 30-х годов прошлого столетия советская медицина уже уверенно вступила в эру трансплантации, успехи которой способствовали ее плодотворному развитию и прогрессу отечественной клинической трансплантологии.

В современных условиях развитие трансплантологии невозможно без работы Банков Донорских Тканей. Такие черты современности, как урбанизация, возникновение новых мегаполисов, повышенная опасность и вероятность техногенных катастроф, требуют модернизации служб здравоохранения. Одним из направлений деятельности является создание сети Тканевых Банков располагающих современными технологиями длительной консервации донорского материала. Продукция таких банков востребована как в общей хирургической практике (травматология, абдоминальная хирургия, пластическая хирургия), так и в специализированных областях медицины и, в частности, в офтальмологии. Не случайно, что первые Тканевые Банки донорского материала были созданы именно при офтальмологических учреждениях (Филатов В.П., 1936), для их обеспечения запасами донорских глазных тканей. В настоящее время ухудшение экологии, в том числе повышенное воздействие ультрафиолетовых лучей, способствует возникновению атипичных, не встречавшихся до этого, нарушений со стороны глаз. Увеличение частоты ранее относившихся к редким глазным заболеваниям, как «Синдром сухого глаза», симптомы которого теперь можно обнаружить почти у каждого второго жителя большого мегаполиса старше 40- летнего возраста, значительный рост в последнее десятилетие заболеваемости кератоконусом, ранее считавшимся довольно редким заболеванием, - все это диктует необходимость в банках для постоянного- наличия трансплантационного материала в случаях ургентных и массовых операций. И потребность в донорском материале постоянно возрастает во всем мире.

Полноценное сохранение тканей и органов для успешной дальнейшей пересадки является актуальной проблемой современной трансплантологии. Консервация донорских тканей и органов, обеспечивающая снижение метаболических, ферментативных аутолитических процессов и сохранение изолированных тканей и органов в состоянии структурной целостности и жизнеспособности — достаточно трудная задача. Поиск более совершенного метода консервации жизнеспособной донорской ткани продолжается. При этом остается актуальным существование методов как краткосрочного, так и долгосрочного хранения трансплантатов.

Дальнейшее разрешение проблемы консервации донорских тканей возможно путем всестороннего изучения существующих методов и рационального их использования для создания на основе старых, испытанных и изученных разработок, новых, более совершенных способов длительной консервации.

Создание запасов консервированных донорских тканей в многопрофильных тканевых банках, которые бы сохраняли жизнеспособность при длительном хранении, и донорских тканей без сохранения жизнеспособности, но с высокими трансплантационными свойствами является необходимым в службе трансплантации.

Совершенствование операционной техники, усложнение задач реконструктивной и восстановительной хирургии, расширение показаний к операциям трансплантации в настоящее время испытывают потребность в новых, улучшенных методах консервации донорских тканей, которые позволили бы, в частности, поддерживать жизнеспособность тканей как можно на более длительный срок.

Применяемые в настоящее время способы консервации донорских тканей развиваются по трем направлениям и имеют свои преимущества и недостатки в отношении сохранности структуры и биопластических свойств трансплантатов — главного критерия качества донорского материала: ^

1. Методы краткосрочной консервации (по Филатову В. П. и др.) в финансовом отношении наиболее экономичны, но ограничены максимальным сроком консервации роговиц, трансплантатов дермы, слизистых оболочек до 5-х суток, и, практически, трудно применимы в условиях современной трансплантологии. Увеличение времени хранения донорской ткани удобно не только для пациента и хирурга, оно дает возможность проведения необходимых биомикроскопических исследований донорских тканей, а также ее иммунологических и вирусологических исследований.

2. Методы долгосрочного консервирования в различных жидких средах, содержащих вещества, необходимые для поддержания жизнеспособности и размножения клетки вне организма, позволяют заметно удлинять срок хранения донорских материалов. Для поддержания жизнеспособности необходимо добавление в среду аминокислот, углеводов, витаминов в такой же концентрации, как в сыворотке крови; рН среды также должен быть близким к рН крови (7,2 — 7,4); солевой состав питательных сред должен быть близким к концентрации солей в организме. С целью предупреждения роста микробов в консервирующую среду добавляются антибиотики. Среда, предназначенная не: только для поддержания; метаболических процессов и стабилизирующих процессы аутолиза в донорской ткани, но и для размножения клеток, должна содержать сыворотку. Так,: например, органная, культура для хранения донорских роговиц была предложена еще в 1973 г. Summerlin W. Т., Miller G. Е., Harris J. Е., Good R. А. Большинство Европейских Тканевых Банков пользуются; способом хранения^ донорских роговиц в органных культурах; в Великобритании он используется с 1986 г. У этого способа хранения тоже есть свои недостатки: при консервации, со временем, органная культура меняется в результате клеточных метаболических процессов: утилизации ингредиентов питательной среды и выхода отработанных катаболитов. Поэтому для поддержания стабильности питательной; среды необходимо проводить, ее замену каждые 5-15 дней, в зависимости: от композиции среды и ее объема. Смена питательной среды опасна также возможностью инфицирования: донорского материала и возможностью травмы самого донорского материала, что является существенным недостатком такой консервации.

3. Метод низкотемпературного консервирования широко распространен в, США и Японии, входит в номенклатуру методов тканевых банков и позволяет хранить донорские ткани до 5-ти лет. К недостаткам этого метода следует отнести его дороговизну, длительность подготовки материала к замораживанию, необходимость тщательного отмывания деконсервированной ткани от криопротектора, повышенную хрупкость: клеток, например, заднего эпителия роговицы после отогрева, с потерей их во время последующей кератопластики.

Каждый из многообразия способов консервации донорского материала, более или менее успешно применяемый в хирургии, имеет право на существование и является предметом выбора.

Критериями успешного хранения донорского материала являются сохранение его жизнеспособности, структурности при относительно длительном его хранении, с последующим приживлением и биологическим эффектом; поэтому главным в консервации донорских тканей должно быть создание условий, максимально приближенных к физиологическим.

Решать проблему длительного сохранения донорских тканей, совершенствуя только гипотермические методы консервации, не представляется перспективным. Длительное воздействие низкой температуры среды на донорскую ткань вызывает метаболический дисбаланс, который лежит в основе постепенного накопления клетками критической величины «энергетического долга» (Шумаков В. И. и др., 1983). Анализ патофизиологических механизмов пролонгирования клеточного; гомеостаза позволяет считать наиболее оптимальным температурный режим консервации донорской ткани и сохранения ее жизнеспособности в режиме гипобиоза — при температуре 27С (Мороз 3. И., Борзенок С. А., 1988). При таком температурном режиме донорская роговица, например, теоретически может храниться только в питательной среде, поэтому необходимо также создание условий адекватной оксигенации, снабжения субстратами и удаления продуктов катаболизма для протекания клеточных реакций, что поддержало бы изолированные ткани и органы в жизнеспособном состоянии длительное время. В Европейских Тканевых Банках, где реализация, например, донорских роговиц, консервируемых в органных культурах, достигает 2500 в год и более, исследования, направленные на улучшение качества и времени хранения донорских роговиц, продолжаются.

Главная цель в оценке донорского материала, как известно, - состояние клеточных компонентов, волокнистых структур и аморфного матрикса,

• '. 9 морфологические изменения которых указывают не только на качество трансплантата, но и на его функциональный резерв. Отдельно следует остановиться на специфических требованиях предъявляемых к донорскому материалу в офтальмохирургической практике, широко использующей донорскую роговицу. Известно, что гибель клеток происходит вследствие апоптоза или некроза. В результате исследований, проведенных Julie Albon , Andrew В. Tullo, 2000, было установлено, что потеря эндотелиальных клеток донорской роговицы в течение хранения происходит в результате апоптоза клеток и количество апоптически измененных клеток и их скопление в эндотелиальном слое соответствует складчатости донорской роговицы. Степень апоптоза зависит от возраста донора и в меньшей мере - от времени хранения-донорской роговицы. Деформация роговицы и нарастающее натяжение ее структур стимулирует механические разрывы между клетками и отрывы клеток от клеточной матрицы. Результаты исследований, проведенных в. Российском онкологическом центре им. Hi H. Блохина, выявили, что живые клетки обладают способностью ощущать кривизну поверхности; причем величина микронеровностей, на которые реагирует клетка, может быть ничтожна по сравнению с размерами самой клетки; более того, форма и функциональная активность клетки определяется рельефом поверхности,, то есть, состоянием внеклеточного матрикса (Ровенский Ю. А., 2001). При утрате клеткой контактов с внеклеточным матриксом прерывается цепь передачи сигналов внутрь клетки, и такие клетки могут подвергаться генетически запрограммированному самоубийству - апоптозу (Агол В; И., 1996)

Может быть, поэтому в результате многолетнего опыта многие: хирурги до сегодняшнего дня предпочитают использовать для кератопластики донорские роговицы свежеэнуклеированных глаз или донорские роговицы, иссеченные из консервированного цельного глазного яблока непосредственно перед трансплантацией, что исключает деформацию донорской роговицы. Последние данные морфологических исследований указывают на тот факт, что качество донорской роговицы определяется не только возрастом донора, условиями забора донорского материала, среды консервации, а. также сохранением изначальной формы роговицы. .То есть, донорская роговица требует бандажа после ее иссечения; Это может быть достигнуто помещением донорской роговицы в специальный контейнер, изготовленный из полимера, поверхность которого модифицирована. Форма такого контейнера, для донорской роговицы имитирует форму роговицы и имеет вид корнеосклеральной контактной линзы.

Как известно, различные полимеры очень широко применяются в медицине, что также связано с тенденцией использования средств разового применения. Однако проблема заболеваемости инфекциями, вызванными микробами, происходящими из биопленок, непременно образующихся на поверхности любых полимеров, стала настолько угрожающей, что выделен; класс заболеваний «вызванных микробами биопленки». Для обеспечения биосовместимости различных изделий из полимерных материалов с живыми тканями, а также с целью предупреждения образования; биопленки на них, в . конце 90-х годов в медицине начали применяться различные способы, модификации поверхности полимеров, в частности - наномодифицирование поверхностей с помощью нанесения. углеродсодержащих покрытий:: алмазоподобных, нанотрубы, фуллеренсодержащих, карбиновых. В Институте Склифосовского для парентерального питания пациентов применяются зонды, обработанные углеродными пленками. В Институте урологии успешно проводятся, операции протезирования мочеточников с применением пластиковых протезов, обработанных углеродными пленками. В Институте Бакулева используются протезы сосудов и клапанов сердца, обработанные также углеродными пленками.

Важную роль в биологии; медицине играют упаковочные материалы и системы, изготовленные из синтетических полимерных материалов; Такие материалы должны обладать определенным комплексом свойств, в: том числе: биосовместимостью, гемосовместимостью,. асептическими свойствами, антимикробной активностью, при необходимости обеспечивающими феномен биоэпитаксии. Эти качества могут быть обеспечены путем наноструктурирования и модифицирования поверхности материалов.

В 1998 г., в результате совместной работы с кафедрами наукоемких технологий МАТИ и радиоэлектроники МГУ, был предложен способ асептического хранения и транспортировки контактных и интраокулярных линз в контейнерах с углеродсодержащим покрытием (Российский Патент № 2120807 от 27.10.1998г Мусина А.Д.)- В ходе экспериментальных и клинических исследований, проведенных в этой работе, помимо антимикробных свойств, обнаружены были и другие свойства поверхности модифицированной с помощью применения нанотехнологий. Это позволило приступить к разработке способа консервации различных видов донорского материала и, в том числе, жизнеспособной донорской роговицы длительного хранения, созданием условий, максимально приближенных к физиологическим (Мусина А.Д., 2000).

Слежение, исправление, конструирование и контроль над> биологическими системами человека на молекулярном уровне с использованием разрабатываемых наноустройств и наноструктур - это задачи наномедицины. Нанометровый диапазон измерений открывает мир новых свойств вещества.

Биология и медицина представляют собой перспективные области для использования синтетических наноструктурных материалов. Все природные материалы и системы построены из нанообъектов. Именно в интервале наноразмеров, на молекулярном уровне, природа определяет основные характеристики веществ, явлений и процессов. Особенности свойств веществ и материалов в нанометровом диапазоне определяются не только уменьшением размеров структурных элементов, но и проявлением квантовомеханических эффектов, волновой природой процессов переноса и доминирующей ролью поверхностей раздела. Управляя размерами и формой наноструктур,. можно придавать материалам совершенно новые функциональные характеристики, резко отличающиеся от характеристик массивных материалов.

Материалы с наноструктурированными поверхностями (НСП) являются отдельным классом синтетических наноматериалов. Формирование НСП необходимо на поверхности имплантатов и матриц для культивирования клеток, особенно при внедрении в костную систему; для создания медицинских препаратов и лечебных систем наружного применения, в частности, трансдермальных форм, обеспечивающих подачу лекарств через кожу; для формирования; матриц для внутренней адресной доставки лекарств; (Штильман М., 2002; Севастьянов В.И., 1999).

Современные терапевтические клеточные технологии представляют собой новую, интенсивно развивающуюся область медицины. Они • связаны, сг имплантацией в органы и ткани соответствующих клеточных культур. Адресная , доставка клеточных культур возможна на соответствующих: подложках, в том числе на двумерных и трехмерных матрицах. Матрицы и подложки для клеточных культур in vitro должны быть пригодны для качественной адгезии клеток: их распластывания, локомоции-и пролиферации, а также для имплантации in: vivo - в организме человека. Поэтому обязательными свойствами матриц и подложек являются: отсутствие токсичности, биосовместимость, развитая поверхность, хорошие: адгезивные свойства для клеток. Кроме того, в ряде специальных случаев они должны обладать особыми: физико-химическими или химическими: свойствами, например биодеградируемостью, либо особой прочностью, либо гибкостью, либо иметь пористую структуру для формирования межклеточного вещества (Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф., 1993; Sergeeva N.S., Sviridova I.K., Kirsanova V.A., Chissov V.l., Novikova E.G., 1995).

В качестве исходных материалов, наиболее широко используются в медицине полимерные материалы: полиэтилентерефталат (ПЭТФ), политетрафторэтилен (ПТФЭ) и поливинилиденфлюорид (ПВДФ). Такой выбор определяется как широким использованием указанных полимерных материалов, так и возможностью обеспечения большого диапазона свойств при модифицировании образованных поверхностей: так ГТЭТФ обладает высокоэнергетической полярной поверхностью, а ПТФЭ обладает малыми значениями диэлектрической проницаемости и диэлектрических потерь, низкоэнергетической неполярной поверхностью, а также широким рабочим температурным диапазоном.

Наноструктурированная поверхность (НСП) на основе ГТЭТФ и ПТФЭ могут формироваться обработкой исходной поверхности потоками ионов химически активных и инертных газов и их смесей (CF4* Ar, 02) (В.М. Елинсон, 2001; В.М. Елинсон, В.В.Слепцов, С.Н.Дмитриев, 1998). Модифицирование сформированных НСП может производиться двумя путями: ; нанесением пленок углерода из направленных ионно-плазменных потоков паров углеводородов (Elinson V.M., Sleptsov V.V., Laymin A.N. , Potraysay V.V., Kostuychenko L.N., Moussina A.D.,1999; Sleptsov V.V., Elinson V.M., Simakina N.V., Laymin A.N., Tsygankov I.V., Kivaev A.A., Moussina A.D.',,,. 1996) и магнетронным нанесением высокопористых пленок (Гринченко В.Т., Слепцов В.В., Федоров С.А., 1988). Исследование образцов ПЭТФ, ПТФЭ и ПВДФ после предварительной обработки и после нанесения покрытий показывает, что наноструктурирование (НС) приводит к сглаживанию микронеровностей поверхности (шероховатость уменьшается), а далее, с ростом толщины пленки, высота неровностей начинает увеличиваться, причем диаметр конгломератов почти не изменяется, однако при достижении некоторой толщины покрытия размер характерных особенностей рельефа увеличивается. Предварительная обработка поверхности подложки с помощью, например CF4, приводит к развитию рельефа. Поверхность после достаточно длительной обработки и нанесения покрытия имеет большую шероховатость, чем без предварительной обработки. Увеличение длительности предварительной обработки способствует увеличению шероховатости поверхности, получаемой уже после осаждения покрытия. Шероховатость поверхности при этом увеличивается почти в 100 раз по сравнению с пленкой, наносимой без предварительной обработки. Все эти изменения в структуре поверхности вызывают однозначное изменение фрактальной размерности.

Исследование заряда на НСП и возможность ре1улирования его величины и направления дают возможность предполагать о перспективности применения модифицированных поверхностей в медицине будущего (Moussina A.D., 2005).

Предварительная обработка поверхности полимеров, толщина покрытия, энергия частиц влияют на изменение заряда поверхности полимеров. Это свойство было использовано при изготовлении пластмассовых контейнеров для асептического хранения контактных и интраокулярных линз, а также при изготовлении специальных контейнеров для хранения жизнеспособной донорской роговицы.

Исследование заряда на поверхности полимеров после обработки и последующего нанесения углеродных пленок свидетельствует о некоторых особенностях образования и роста пленок на поверхности, полимеров с различной структурой поверхности. То есть, существует возможность влияния на электростатические свойства полимеров путем наноструктурирования их поверхности (Елинсон В.М., Слепцов В.В., Лямин А.Н., Потрясай В.В., 2002).

Состав и физико-химические свойства поверхности являются важным моментом при формировании НСП и зависят от поставленных исследователями и технологами задач. Так, например, предварительная обработка поверхности пленки ПЭТФ пучком ионов азота и кислорода приводит к разрушению карбонильных связей в поверхностном слое полимера и образованию поперечных С-О-О-С связей между цепями макромолекул. При этом поверхность пленки ПЭТФ становится неполярной и гидрофобной с высокими значениями контактных углов смачивания, что в практике применения изделия с такими характеристиками поверхности обеспечивает асептические свойства и биосовместимость такой пленки.

Исследование антимикробной активности НСП были нашими^ первыми исследованиями на пути преодоления формирования биопленки на поверхности полимера и достижения биосовместимости с окружающими живыми тканями (Elinson V. M., Sleptsov V. V., Laymin A. N., Potrasay V. V., Kostuychenko L. N., Moussina A. D., 1996).

Экспериментальные исследования, проведенные на ПЭТФ, ПТФЭ? и ПВДФ с НСП, сформированной методами ионно-плазменной технологии, указывают, что степень дисперсности поверхности , и способ ее модифицирования определяет возможности и эффективность применения полимеров с модифицированной поверхностью в медицинских целях (Elinson; V. M., Sleptsov V. V., Laymin A. N., Potrasay V. V., Kostuychenko L. N.,. Moussina A. D, 1999). Биосовместимая: НСП предполагает определенный: химический составу атомную? структуру, заряд на-поверхности и способна обеспечивать эффект поляризации ; клеточных мембран, форму и функционирование клеток живых тканей, когда они находятся в контакте с НСП — interface взаимодействие -(например: бессосудистая структура роговичной ткани - НСП).

Наноструктурирование поверхности материалов открывает новые технологические подходы к созданию биологически активных систем. Создание детального механизма воздействия НСП на микроорганизмы; клетки, клеточные структуры, влияние: степени ее дисперсности (фрактальной размернрсти), способов модифицирования требует дальнейших комплексных исследований для более широкого применения в медицине.

Описанные свойства НСП открывают новые, перспективы их применения в области трансплантации тканей и, в. частности, для разработки методов длительного хранения жизнеспособных донорских тканей. Специальных работ ' ' 16 ■ по данной, проблеме до настоящего; времени не выполнялось. Учитывая изложенное, нами сформулирована цель настоящей работы;

Цель работы:

Совершенствование способа длительной консервации аллогенных; трансплантатов путем создания специальных контейнеров и пленочных упаковочных материалов с наноструктурированным углеродсодержащим покрытием для их хранения.

Задачи исследования:

Изучить основные физико-химические характеристики асептических углеродсодержащих покрытий с целью создания специального контейнера' и упаковочного материала для хранения донорских тканей. ^

2.Изучить бактериостатические и адгезивные свойства наноструктурированных покрытий и провести тесты на их токсичность.

3.Разработать специальные контейнеры, и упаковочные пленки: с наноструктурированным покрытием для хранения донорских тканей.

4-Провести сравнительный морфологический анализ нативных трансплантатов на примере донорской роговицы при различных способах консервации.

5.Оптимизировать параметры системы донорская роговица - НСП-питательная среда.

Научная новизна

1. Установлены, подробно исследованы и объяснены эффекты, возникающие на НСП полимеров при их обработке1 потоками энергетических частиц инертных и химически активных газов и их смесей, а также при нанесении углеродсодержащих пленок; исследовано влияние НСП на подлежащие биологические ткани, в том числе различные: аллотрансплантаты и донорскую роговицу. ' 17 '• .■■'

2. Экспериментальные исследования, проведенные на полимерных материалах: полиэтилентерефталат (ПЭТФ), политетрафторэтилен (ПТФЭ) и поливинилиденфлюорид (ПВДФ) с НСП, сформированной методами ионно-плазменной технологии, показали, что химический состав, заряд на поверхности, степень ее дисперсности; и способ ее модифицирования определяют наличие и эффективность антибактериальной активности, биосовместимости и адгезивности НСП.

3. Установлена возможность управления в широких диапазонах зарядовыми характеристиками поверхности полимеров покрытых углеродсожержащими пленками и используемых для изготовления контейнеров, с целью длительного хранения аллотрансплантатов. Показано, что биосовместимость углеродных пленок прямо пропорциональна величине электростатического потенциала, а антибактериальная активность определяется . структурой и рельефом поверхности.

4. Впервые разработана система донорская -ткань -наномодифицированная, биосовместимая, асептическая поверхность питательная среда, которая по результатам проведенных исследований является более совершенной динамической моделью для" хранения жизнеспособного донорского материала.

Практическая значимость

1. Разработанные упаковочные материалы для хранения аллотрансплантатов и специальный контейнер для хранения донорской роговицы с биосовместимой асептической наноструктурированной поверхностью могут использоваться в работе тканевых банков. Углеродсодержащее покрытие, модифицирующее поверхность обрабатываемого полимера, обеспечивает асептические условия хранения аллоплантов, а также донорской роговицы и поддерживает метаболические процессы в донорских тканях. Возможность длительного хранения* жизнеспособных , донорских тканей, в том числе донорской роговицы в асептических пленках и контейнерах с биосовместимой поверхностью, а также безопасная их транспортировка позволят иметь запасы донорского материала.

2. Использование для; трансплантации сохранившего жизнеспособность ' качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений, гарантирует успешное приживление трансплантата. ,

Основные положения^ выносимые на защиту

1., Биосовместимая НСП, имея: физико-химические характеристики широкого диапазона, предполагает заданный химический; состав, атомную структуру, заряд на поверхности и способна обеспечивать эффект поляризации клеточных мембран, форму и функционирование, клеток живых тканей когда они находятся в контакте с ней.

2. Асептическая; НСП специального контейнера, создавая: в консервирующем растворе слабую катионическую среду, исключает существование каких-либо контаминации в ней, способствует поляризации клеточных структур донорского материала, восстанавливая тем самым потенциалы ее клеточных мембран, что, например, задерживает потерю эндотермальных клеток (ЭК) и обеспечивает длительное хранение жизнеспособной роговицы.

3. Бактерицидная активность НСП определяется её физико-химическими свойствами и степенью рельефа, то есть взаимодействие НСП с микроорганизмами протекает по .двум механизмам: первый связан; с электростатическим свойствами НСП, второй - со степенью дисперсности НСП.

4. Адгезивные свойства НСП позволяют обеспечить оптимальное взаимодействие.в системе донорская ткань - НСП углеродсодержащей плёнки.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на следующих научных форумах: на Европейских конференциях «Diamond, Diamond-like and Related Materials» по алмазным и алмазоподобным пленкам и родственным им материалам: Барселона, Испания, 1995; Альбуфейра, Тур, Франция, 1996; Эдинбург,. Шотландия, 1997; Крит, Греция, 1998; Прага, Чехия, 1999; Порто, Португалия, 2000; Зальцбург, Австрия, 2003; "XIII International Congress of Eye Research», международном конгрессе по теоретическим и фундаментальным исследованиям. в: офтальмологии, Париж, Франция, 1998; "9-th International Conference on Modern Materials & Technologies", конференции по современным материалам и технологиям; Флоренция, Италия, 1998; « 5th International Conference on the Applications of Diamond Films and Related Materials», «1st International; Conference: on Frontier Carbon Technology»; международной; конференции по применению алмазоподобных пленок и родственных им материалов, Цукуба, Япония, 1999; международной научно-технической: конференции "Вакуумная наука и техника'1, Москва, 2002; " The First UAE;-International Conference: on Biological and' Medical Physics", международной конференции по биологической и медицинской физике, {Аль-Айн ,. Объединенные Арабские Эмираты, 2005; "XXX. International; World-Ophthalmology Congress, Sao Paulo, Brasil", всемирный офтальмологический/ конгресс, Сан -Пауло; Бразилия, 2006; " Ее 112 Congres De La SFO", конгрессе ассоциации французских офтальмологов, Париж, Франция; 2006; «1st International Conference for Ocular Cell Biology», международной конференции по клеточной биологии в офтальмологии, Кембридж, Великобритания, 2006.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 работ в международной и центральной; печати. Получен. 1 патент на изобретение и подана 1 международная.заявка на изобретение.

Выводы

1. Применение полимерных пленок с углеродсодержащими покрытиями на основе НСП и имеющих заданные физико-химические свойства, позволяет пролонгировать жизнеспособность консервируемых донорских материалов при сохранении их биопластических свойств.

2. Биосовместимость углеродных пленок пропорциональна величине их электростатического потенциала. На данном принципе разработаны покрытия с НСП, которые могут использоваться для обработки специальных контейнеров и упаковочных пленок с целью длительного хранения различных видов донорского материала.

3. Углеродсодержащие покрытия обладают антибактериальными свойствами. НСП специального контейнера, создавая в физиологическом буферном растворе слабую катионическую среду, исключает существование каких-либо контаминаций в ней; способствует поляризации клеточных структур, восстанавливая потенциалы клеточных мембран, тем самым сохраняет форму и структуру донорской ткани.

4. Адгезивные свойства предлагаемых покрытий определяются электростатическими свойства НСП и могут способствовать либо адгезии на поверхности химических соединений, белковых структур, клеток, клеточных структур, либо НСП может проявлять себя интактной в отношении биологического материала.

5. Применение асептических специальных контейнеров и упаковочных пленок с биосовместимой поверхностью позволяет увеличивать сроки консервации и запаса донорского материала. Использование для трансплантации сохранившего жизнеспособность качественного донорского материала обеспечивает благополучный исход операции, уменьшает риск послеоперационных осложнений.

6. Создание биологически активной системы с помощью формирования НСП - это решение проблемы длительного хранения жизнеспособных донорских тканей. Практические рекомендации

Для асептического хранения и транспортировки донорского материала, используемого в общей хирургии, впервые разработаны специальный контейнер и упаковочные пленки с биосовместимой асептической НСП. Разработанные для обработки поверхности контейнеров и пленок углеродсодержащие покрытия с НСП способствуют поддерживанию метаболических процессов донорских тканей, обеспечивая тем самым увеличение сроков их жизнеспособности во время консервации. Изготовленные таким образом контейнеры и пленки могут быть использованы для длительного хранения жизнеспособных донорских тканей в условиях многопрофильных тканевых банков, а также при необходимости для безопасной транспортировки донорского материала.

Для консервации донорской роговицы предлагаемый способ консервации обеспечивает:

1. Бандажную функцию для донорской роговицы, которая защищает ее от деформации и возможных механических повреждений.

2. Физико-химические свойства НСП обеспечивают асептическое хранение донорской роговицы, поляризацию клеточных мембран, а также способствуют поддержанию метаболических процессов.

3. Хранение донорской роговицы в специальном контейнере не требует периодической замены питательной среды, тем самым избавляет клетки донорской роговицы от возможных стрессов и исключает возможность инфицирования питательной среды.

4. Увеличение срока хранения донорской роговицы до 30 дней и более.

5. Возможность транспортировки донорских роговиц в контейнерах.

6. Многократное использование контейнеров.