Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Интраэпителиальные неоплазии и микроинвазивный рак шейки матки. Клинические и молекулярно-биологические особенности.

На правах рукописи

□03489105

Снигур Нина Владимировна

ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ НЕОПЛАЗИИ И МИКРОННВАЗИВНЫЙ РАК ШЕЙКИ МАТКИ. КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ.

14.00.14- Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 ЛЕК 2009

Москва 2009

003489105

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Центральна клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента Р (главный врач - доктор медицинских наук, профессор А.Т. Бронтвейн)

Научные руководители: доктор медицинских наук

Е.Б. Савинова кандидат медицинских наук O.A. Анурова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.П. Козаченко

доктор медицинских наук, профессор Е.А. Коган

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Российский Научный Центр Рентгенорадиологии Министерства Здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится У// 2009 года в 'часов на заседанш

диссертационного совета (Д.001.017.01) Российского онкологического научног центра им. H.H. Блохина РАМН

(115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « /C&Äcföjf 2009

года

Ученый секретарь диссертационного совета РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Рак шейки матки (РШМ) - актуальная проблема для гинекологов и онкологов всего мира. Ежегодно в мире выявляется около 500 тысяч новых случаев, более 270 тысяч женщин умирают от РШМ (Waggoner S.E., 2003). Три четверти всех случаев РШМ регистрируется в развивающихся странах. В России в последние десятилетия наблюдается рост заболеваемости РШМ, отмечается высокий показатель запущенности и увеличение числа больных молодого возраста (Морхов К.Ю., Кузнецов В.В., 2009). В 2006 году в России РШМ занял первое место в структуре онкологической заболеваемости среди женщин 15-39 лет и второе место среди женщин 40-54 лет, уступив лишь раку молочной железы (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). В структуре смертности женщин от онкологических заболеваний в России в 2006г. РШМ находился на втором месте в возрастных группах 25-49 лет. В экономически развитых странах в результате активного внедрения скрининга предрака и рака шейки матки отмечено снижение смертности от РШМ (Lowy D.R. et.al., 2008).

Доказательство роли ВПЧ высокого риска в этиологии РШМ (Zur Hausen Н., 1989,2002) привело к пониманию механизмов канцерогененеза шейки матки и существенно повысило возможности профилактики РШМ. В то же время известно, что инфекция ВПЧ далеко не всегда приводит к развитию рака. Несмотря на широкое распространение ВПЧ в популяции, лишь у части женщин в результате постоянной персистенции вируса возникают предраковые поражения шейки матки - цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN), которые поэтапно, в течение длительного времени могут прогрессировать в рак. В то же время, нередко имеет место и регрессия CIN. Очевидно, наличия вирусной инфекции недостаточно для возникновения рака и необходимы определенные клеточные факторы, способствующие развитию заболевания. В процессе опухолевой трансформации большое значение имеют состояние иммунной системы, генетические особенности взаимодействия вируса и клетки, вызывающие нестабильность генома, и другие факторы.

Крайне важным для разработки оптимальной тактики лечения больных является поиск и выявление возможных маркеров прогрессии CIN и РШМ. В связи с развитием молекулярно-генетических и иммуногистохимических методов анализа в последние годы эти методы используются для поиска и изучения возможных маркеров прогрессии предрака и РШМ. В настоящей работе представлялось актуальным провести анализ ВПЧ и генетических нарушений из всех доступных фокусов CIN и РШМ каждой пациентки. Поскольку в клинической практике наиболее доступны

иммуногистохистохимические исследования, представлялось важным провести сравнительное изучение экспрессии в CIN и РШМ ранних стадий известных маркеров пролиферации, апоптоза и клеточной адгезии.

Цель исследования: изучение клинических, морфологических и молекулярных особенностей цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного рака шейки матки для выявления возможных маркеров прогрессирования предраковой патологии шейки матки.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические особенности цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного РШМ.

2. Определить частоту ВПЧ 16 и 18 типов в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ.

3. Изучить генетические нарушения в ДНК из фокусов цервикальных интраэпителиальных неоплазий и РШМ путем анализа частоты потери гетерозиготности на хромосоме 6.

4. Изучить особенности экспрессии и оценить возможное прогностическое значение иммуногистохимических маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ.

Научная новизна исследования

Выполнено комплексное клиническое и молекулярное изучение CIN и РШМ. Проведена микродиссекция парафиновых срезов цервикальных биопсий и генотипирование ВПЧ 16 и 18 типов в отдельных фокусах CIN и РШМ. Поликлональные поражения шейки матки, обусловленные различными типами ВПЧ, выявлены в CIN II и CIN III в 4 и 16% соответственно, а в РШМ - в 2,6% наблюдений. Наряду с превалированием ВПЧ 16 типа отмечено значительное присутствие ВПЧ 18 типа как в CIN, так и в РШМ.

Показано, что частота вирус-индуцированных генетических нарушений на хромосоме 6 в районе генов HLA в локусах D6S276, TNFa и D6S291 увеличивается при прогрессировании CIN в рак.

Впервые изучены особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров сурвивина (ингибитор апоптоза) и Е-кадхерина (компонент клеточного комплекса адгезии) одновременно с маркером Ki-67 (маркер пролиферативной активности) в CIN и РШМ. Определены критерии оценки экспрессии указанных маркеров и возможность использования этих маркеров в качестве факторов прогноза течения CIN.

Практическая значимость исследования. Иммуногистохимическое определение прогностически неблагоприятных вариантов экспрессии маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина, а также выявление генетических нарушений в локусах D6S276, TNFa и D6S291 на хромосоме 6 позволяет выделить группу

больных CIN с высоким риском прогрессирования, что крайне важно при выборе тактики лечения пациенток с CIN. Оптимизация лечения этой группы больных позволит снизить заболеваемость РШМ.

Апробация диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании отделений акушерско-гинекологического профиля, онкологического профиля, хирургических отделений ФГУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» УД Президента РФ и кафедры хирургии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова 15 июня 2009г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа содержит 39 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 198 источников, из них 39 отечественных и 159 зарубежных.

Содержание диссертации Материалы и методы исследования.

Работа включает ретро- и проспективный анализ историй болезни 255 больных, получавших лечение в отделении гинекологии ФГУ ЦКБ УДП РФ в период с 1998г. по 2005г. включительно, среди них 124 больные с CIN и 131 пациентка с РШМ. Все случаи CIN представлены плоскоклеточными интраэпителиальными неоплазиями. Преобладали пациентки с CIN II-CIN III (91/124, 66,9%). Преинвазивной карциномой страдали 10/33 (30,3%) больных CIN III (рис.1). Возраст больных CIN колебался от 18 до 79 лет, средний возраст больных CIN составил 45,2 года. Плоскоклеточный РШМ выявлен в 87,8% наблюдений РШМ, чаще встречались случаи плоскоклеточного ороговевающего рака (61,1%). Железистое строение опухоли выявлено у 12,2% больных РШМ (рис.2). Преобладали наблюдения РШМ I стадии (101/131, 77%), при этом РШМ IA стадии обнаружен у 82 больных (62,6% больных РШМ). Чаще всего был диагностирован РШМ IA1 стадии (60/131, 45% больных РШМ). Запущенные случаи болезни выявлены у 16 больных: РШМ III стадии в 7,6% наблюдений, РШМ IV стадии в 4,6% случаев (табл. 1). Средний возраст больных РШМ составил 48,6 года. В группу больных РШМ IA1 стадии включены 2 больные с раком культи шейки матки после ранее выполненной надвлагалищной ампутации матки. Частота рака культи шейки матки составила 1,5%.

CIS 30,3%

Тяжелая дисплазия 69,7%

CIN I

33,1%

Рис.1. Состав больных CIN.

□ Плоскоклеточный ороговевающий рак

□ Плоскоклеточный неороговевающий рак

□ Аденокарцинома

□ Железистоплоскоклеточный рак

Рис.2. Состав больных РШМ в зависимости от гистологического строения опухоли

Таблица 1.

Состав больных РШМ в зависимости от стадии и гистологического строения

Стадия Плоско- Адено- Железисто- Все наблюдения

РШМ клеточный карцинома плоскоклеточ- РШМ

РШМ шейки матки ный РШМ

п=115 % п=14 % п=2 % п=131 %

IA1 52 45,2% 7 50% 1 50% 60 45,8%

IA2 22 19,1% - - - - 22 16,8%

IB 15 13,0% 3 21,4% 1 50% 19 14,5%

II 11 9,6% 3 21,4% - - 14 10,7%

III 10 8,7% - - - - 10 7,6%

IV 5 4,3% 1 7,1% - - 6 4,6%

CIN II

Клиническое обследование заключалось в изучении анамнестических и объективных данных, включающих характер менструальной функции, характер репродуктивной функции, сопутствующие заболевания. Проводилась оценка предшествующих методов лечения патологии шейки матки. Кольпоскопическое исследование проведено по стандартной методике с использованием кольпоскопа фирмы К. Storz. Цитологическое исследование и морфологическое исследование проведено коллективом сотрудников патологоанатомического корпуса и отделения клинической цитологии ФГУ «ЦКБП» УД Президента РФ. Гистологическое исследование трактовалось согласно критериям ВОЗ и FIGO. Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров Ki-67 (DAKO, 1:100), сурвивина (DBS, 1:20) и Е-кадхерина (DAKO, 1:100) проведено по методике LSAB в отделении патологической анатомии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН под руководством ведущего научного сотрудника O.A. Ануровой. Исследованы биопсийные препараты 71 больной: 44 препарата CIN и 27 препаратов РШМ. Интенсивность экспрессии Ki-67 (маркер пролиферативной активности) оценивали в зависимости от доли клеток с мечеными ядрами к общему числу клеток эпителия и от распространения клеток с мечеными ядрами по слоям эпителиального пласта. Выделены три варианта экспрессии -выраженная, умеренная, слабая (см. табл.2).

Таблица 2.

Оценка экспрессии маркера Ki-67

Расположение К]'-67-"тюзитивных клеток Степень окрашиванй*^^ Базальная треть эпителия Базальная и средняя треть эпителия Все слои эпителия

Окрашено менее 30% клеток Слабая экспрессия Слабая экспрессия Умеренная экспрессия

Окрашено 30-70% клеток Слабая экспрессия Умеренная экспрессия Выраженная экспрессия

Окрашено более 70% клеток Умеренная экспрессия Выраженная экспрессия Выраженная экспрессия

Белок сурвивин - член семейства ингибиторов апоптоза. Интенсивность экспрессии сурвивина оценивали в зависимости от доли клеток с окрашенными ядрами к общему числу клеток эпителия. Выделены 4 варианта экспрессии сурвивина: выраженная (окрашены ядра более 70% клеток), умеренная (окрашены ядра 30-70% клеток), слабая (окрашены ядра менее 30% клеток), отсутствие экспрессии (не определяются клетки с мечеными ядрами).

Е-кадхерин - поверхностный мембранный глнкопротеид, опосредующий взаимодействие между мембранами клеток эпителия. Интенсивность экспрессии Е-кадхерина оценивали в зависимости от доли клеток с мембранной экспрессией Е-кадхерина к общему числу клеток эпителия. Выделены следующие варианты экспрессии: выраженная (мембранное окрашивание более 70% клеток), умеренная (мембранное окрашивание 50-70% клеток), слабая (мембранное окрашивание 25-50% клеток), очень слабая экспрессия (мембранное окрашивание менее 25% клеток), отсутствие иммунореактивности - клетки с мембранным окрашиванием не определяются.

Молекулярно-генетические исследования выполнены в лаборатории онкогеномики РОНЦ им H.H. Блохина РАМН. В исследование включены 123 пациентки, из них 45 больных CIN и 78 больных РШМ. Препараты ДНК получали с помощью буфера с протеиназой К (Sigma, 500мкг/мл) из клеток РШМ, всех фокусов CIN (включая CIN, сопутствующие РШМ) и нормального эпителия или стромы, собранных при микродиссекции срезов парафиновых блоков цервикальных биопсий. В качестве образца использовали 5мкм серийный срез, окрашенный гематоксилином-эозином, с обозначенными патологом фокусами CIN, рака и нормального эпителия или стромы. Определение типа ВПЧ в препаратах ДНК проводили в ПЦР с праймерами к гену Е6 ВПЧ 16 и 18 типов, продукты ПЦР тестировали в электрофорезе в 2% агарозном геле, в качестве положительного контроля использовали ДНК из клеточных линий Caski (ВПЧ тип 16) и HeLa (ВПЧ тип 18). Определение потери гетерозиготности в ДНК из фокусов CIN и РШМ проводили в ПЦР с праймерами к микросателлитным маркерам D6S344, D6S276, D6S273, D6S291, TNFa и ESR на хромосоме 6, как описано (Мазуренко H.H. и др. 2006).

Статистическая обработка. Достоверность критериев оценивали используя точный критерий Фишера (Statistika 6.0) и коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г). Критерием достоверности считали Р<= 0,05.

Результаты исследования

Клинические исследования.

Преобладание больных РШМ IA стадии (62,6% больных РШМ) - результат длительного применения в системе поликлиник УД Президента РФ комплексного скрининга, включающего цитологическое и кольпоскопическое исследования и типирование ВПЧ высокого онкологического риска. Следует отметить, что 48% наблюдаемых больных РШМ не являлись постоянным контингентом обслуживания поликлиник УД Президента РФ.

Изучение возрастного состава больных показало, что средний возраст больных CIN составил 45,2 года, больных РШМ- 48,6 лет (табл.3). Важно, что средний возраст наблюдаемых больных РШМ на 5 лет меньше, чем средний возраст больных РШМ в РФ в 2006г. (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). Этот факт может быть связан с тенденцией к омоложению РШМ, а также с более ранним выявлением РШМ при проведении комплексного скрининга. Отмечено увеличение возраста больных РШМ с увеличением стадии заболевания г= 0,95, Р<0,05 (табл.3).

Таблица 3.

Средний возраст больных CIN и РШМ

Больные CIN Кол-во Средний возраст Больные РШМ Кол-во Средний возраст

Все больные CIN 124 45,2 Все больные РШМ 131 48,6

CIN I 41 49,8 I стадия 101 46,9

CIN II 50 40,6 II стадия 14 48,6

CIN III 33 46,2 III стадия 10 55,7

Тяжелая дисплазия 23 46,6

Преинвазивный рак 10 45,4 IV стадия 6 66,2

Большинство больных CIN (75%, 93/124) находились в возрасте 20-55 лет (рис. 3), при этом 45,5% больных CIN Ш были моложе 40 лет, а 5% больных CIN III - моложе 30 лет.

ю

9 8

0

ю 7 и '

1 6 X

ё 5 о

5*

Т

2 1

II

к IS i lihid

J5 J*

возрастные группы, в годах. 3 CIN I 0 CIN II H Тяжелая дисплаэия □ Преинвазивный рак

Рис.3. Распределение больных CIN по возрастным группам.

Важно отметить, что среди больных CIN III пациентки с тяжелой дисплазией чаще принадлежали к возрастной группе 41-45лет, а больные преинвазивным раком - к группе 31-3 5лет.

Обнаружены два «пика» частоты встречаемости предраковой патологии шейки матки: в возрастных группах 26-35 лет и 46-50 лет, однако статистическая обработка результатов не выявила достоверных различий в частоте случаев CIN I, CINII, CIN III в возрасте 20-55 лет (Р>0,05).

12

«40

ж

20-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 71-75 старше

75

возрастные группы ,в годах 9 IA1 стадия □ 1А2стадия □ 1Встадия □ Нстадия □ Шстадия Щ 1Устадия

Рис. 4. Распределение больных РШМ по возрастным группам в зависимости от стадии заболевания

Среди больных РШМ 34,3% (45/131) были моложе 40 лет. Три четверти больных РШМ - 76,3% (100/131) - в возрасте 31-60 лет. Так же, как и в наблюдениях CIN, выявлены два «пика» заболеваемости РШМ: в возрастных группах 36-40 лет (16%) и 51-55 лет (14,5%). Однако статистически достоверного различия частоты встречаемости РШМ в указанных возрастных группах не найдено (Р>0,05).

Установлено, что среди больных CIN достоверно чаще встречались женщины с регулярным менструальным циклом (табл.4).

Характер менструальной функции у больных CIN и РШМ.

CIN I-CIN III РШМ

Характер менструальной Абс. число % Абс.число % Р

функции больных больных

Регулярный цикл 78 62,9 68 51,9 0,05

Постменопауза 35 28,2 48 36,6 0,1

Нарушение менструальной 11 8,9 15 11,5 0,3

функции:

Олигоменорея I 0,8 2 1,5 0,5

Аменорея 0 1 0,8

Нерегулярные менструации 5 4 9 6,9 0,2

Дисфункциональные

маточные кровотечения 5 4 3 2,3 0,3

Возраст начала половой жизни колебался от 14 до 27 лет. Средний возраст начала половой жизни в группе больных CIN I-CIN III составил 18,9 лет, в группе больных РШМ - 18,7 лет. Пациентки с диагнозом РШМ достоверно чаще свидетельствовали о начале половой жизни до 18 лет по сравнению с больными CIN I-CIN III (табл. 5).

Таблица 5.

Возраст начала половой жизни у больных CIN и РШМ

Возраст начала половой жизни CIN I-CIN III РШМ Р

Абс.число больных % Абс. число больных %

До 18 лет 31 27,4 46 35,1 0,05

18-20 лет 60 50,8 54 41,2 0,15

21-25 лет 30 26,6 27 20,6 0,3

После 25 лет 3 2,4 4 3 0,5

Анализ репродуктивной функции не выявил зависимости между числом родов и возникновением РШМ. Генеративная функция была реализована не полностью, как у больных CIN, так и у пациенток с РШМ: почти 10% составили нерожавшие женщины, а у половины женщин были только одни роды.

При анализе гинекологических заболеваний у больных CIN и РШМ не выявлено статистически достоверных различий (табл.6). Обращает внимание высокая частота воспалительных заболеваний органов малого таза.

Характер сопутствующей гинекологической патологии.

Характер сопутствующей CIN I-CIN III РШМ Р

гинекологической патологии Лбе.число больных % Абс.число больных %

Воспалительные заболевания 37 29,8 36 27,5 0,4

Дисфункция яичников 11 8,9 12 9,1 0,5

Миома матки 33 26,6 29 22,1 0,2

Эндометриоз органов малого таза 25 20,2 24 18,3 0,4

Патология эндометрия 12 9,7 7 5,3 0,1

Доброкачественные образования 7 5,6 9 6,9 0,4

яичников

Сочетанная генитальная патология 40 32,3 35 26,7 0,2

Гинекологической патологии 41 33,1 49 37,4 о,з

не выявлено

Более чем у половины больных каждой группы установлено наличие предшествующих местных изменений шейки матки предопухолевого характера - фоновых заболеваний шейки матки. Фоновыми заболеваниями шейки матки длительностью более 5 лет достоверно чаще страдали пациентки с РШМ, по сравнению с больными CIN. Выявлено, что больным РШМ достоверно реже было проведено предшествующее лечение по поводу фоновой патологии шейки матки (табл.7).

Таблица 7.

Характеристика предшествующих инвазивных методов лечения у больных

CIN и РШМ

Метод лечения CIN I-CIN III РШМ р

Абс. число % Абс. число %

ДЭК 12 31,6 10 45,5 0,4

Криодеструкция 18 47,4 9 40,9 0,03

Лазеродеструкция 6 15,8 3 13,6 0,2

Ножевая или электроконизация 2 5,3 ~

Всего 38 100 22 100 0,007

При цитологическом исследовании в наблюдениях CIN III чаще были обнаружены клетки с признаками атипии (21/33, Р=0,005), у больных РШМ

преобладали клетки с резко выраженными признаками атипии (53/82 Р=0,001). В наблюдениях CIN I чаще были определены клетки без признаков атипии (33/41 Р=0,0005). В CIN II не обнаружено достоверных различий в частоте выявления клеток с признаками атипии (29/50) и клеток без признаков атипии (21/50) Р=0,08 (рис.5).

□ Клетки без признаков атипии

□ Клетки с признаками атипии

■ Клетки с резко выраженными признаками атипии

РШМ IB-IV стадии

Рис.5. Результаты цитологической диагностики CIN и РШМ.

При минимальных изменениях плоского эпителия чаще были обнаружены малые кольпоскопические признаки, при более выраженных изменениях -большие (рис.6). Для эпителиальной дисплазии были характерны атипическая зона превращения в виде лейкоплакии, основы лейкоплакии (пунктация), полей (мозаики), немых йод-негативных участков. При тяжелой дисплазии и начальных формах рака шейки матки обнаруживались плотный белый эпителий, грубая пунктация, мозаика, толстая лейкоплакия.

100 90 80 70 во 60 40 30 20 10 О

Л

ли

РШМ IA РШМ IB-IV

□ Малые кольпоскопические признаки

□ Большие кольпоскопические признаки

Рис.6. Выраженность кольпоскопических признаков при различных гистологических диагнозах

Нами не обнаружено достоверных различий в характере и специфичности жалоб больных с CIN и РШМ IA стадии, при этом большинство пациенток жалобы не предъявляли.

Хирургическое лечение выполнено 32/124 (25,8%) больных CIN (рис.7). Преимущественно оперированы больные CIN III (20/32 62,5%) и CIN II (8/32 25%). Органосохраняющее лечение выполнено 14/32 больным (44%).

Амбулаторное лечение

Лучевое лечение 0,8%

Ампутация шейки матки 43,80%

Экстирпация матки 53,10%

культи шейки матки

3,10%

Рис.7. Анализ лечения больных CIN.

Средний возраст больных CIN, перенесших органосохраняющее лечение - 38,2 года. Средний возраст больных CIN, перенесших экстирпацию матки - 56 лет. Мы не наблюдали каких-либо осложнений после оперативного лечения.

Для лечения больных РШМ наиболее часто применялись хирургический, комбинированный и лучевой методы лечения (рис.8).

□ Хирургическое

□ Лучевое ■ ПХТ

□ Комбинированное О Сочетанное

□ Симптоматическое

Рис.8. Характеристика лечения, проведенного больным РШМ.

Анализ лечения больных РШМ с указанием стадии заболевания приведен в табл. 8. При микроинвазивном РШМ в 93,9% наблюдений выполнено хирургическое лечение, в 6,1% наблюдений (при железистом строении опухоли) проведено комбинированное лечение.

Таблица 8.

Анализ лечения больных РШМ в зависимости от стадии заболевания.

РШМ РШМ РШМ РШМ РШМ РШМ

X. IA стадии IB стадии II стадии III стадии IV стадия всего

Лечение\ п=82 п=19 п=14 п=10 п=6 п=131

Хирурги- 77 8 - 1 - 86

ческое (94%) (42%) (10%) (65,6%)

Лучевая - 3 6 6 - 15

терапия (15,8%) (42,9%) (60%) (11,5%)

ПХТ - - - 1 (16,7%) 1 (0,7%)

Комбини- 5 6 5 2 - 18

рованное (6%) (31,6%) (35,7%) (20%) (13,7%)

Сочетан- - 2 3 1 1 7

ное. (10,5%) (21,4%) (10%) (16,7%) (5,3%)

Симптома- - - - - 4 4

тическое (66,6%) (3%)

Органосохраняющее лечение (высокая ампутация шейки матки) выполнено 22 больным (28,5%) РШМ 1А стадии, при этом средний возраст больных составил 33 года.

□ Операция Вертгейма

□ Экстирпация матки с верхней 1/3 влагалища, ревизия регионарных лимфатических узлов

□ Высокая ампутация шейки матки

57,1% о Экстирпация культи шейки матки

Рис.9. Характеристика хирургического лечения, проведенного больным РШМ IA стадии

Таким образом, все больные CIN и РШМ получили адекватное лечение, при этом у 65,6% больных РШМ выполнен только хирургический этап. Органосохраняющее лечение, позволяющее сохранить репродуктивную функцию пациентки, выполнено у 16,8% больных РШМ, в частности у 28,5% больных РШМ IA стадии.

2,6% 11,7%

Результаты молекулярно-генетическических исследований. Титрование ВПЧ высокого онкогенного риска.

Проведено типирование ВПЧ 16 и 18 типов во всех доступных фокусах CIN и РШМ каждой пациентки. Установлено присутствие ВПЧ 16 типа в 66,7% (31/45) CIN, ВПЧ 18 типа - в 15,6%(7/45) CIN. Кроме того, у 6,7% (3/45) больных CIN из разных фокусов неоплазии выделены два типа ВПЧ - и ВПЧ 16, и ВПЧ 18, что указывает на наличие поликлонального роста CIN, обусловленного смешанной инфекцией ВПЧ. ВПЧ 16 и 18 типов не обнаружены в 11% (5/45) CIN. В этих случаях наиболее вероятно присутствие других типов ВПЧ.

Таблица 9.

Частота выявления ВПЧ 16 и 18 типа в препаратах CIN

CINI п=10 CIN II п=23 CIN III n=12 CIN I-CIN III n=45

ВПЧ 16+ 6 60% 16 69,6% 8 66,7% 30 66,7%

ВПЧ 18+ 2 20% 4 17,4% 1 8,3% 7 15,6%

ВПЧ 16+18+ 0 0 1 4,3% 2 16,7% 3 6,7%

ВПЧ 16-18- 2 20% 2 8,7% 1 8,3% 5 11,1%

Результаты типирования ВПЧ 16 и 18 типов в препаратах РШМ отражены на рис.11 и в табл.10. В подавляющем большинстве случаев плоскоклеточного РШМ (74,7%) определен ВПЧ 16 типа.

100%

50% 40% 30% 20% 10% 0%

□

□ ВПЧ 16-18-

□ ВПЧ 18+

В ВПЧ 16+ 18+

□ ВПЧ 16+

CIN I

CIN II

CIN III

РШМ IA РШМ IB-IV

Рис 11. Результаты типирования ВПЧ 16 и 18 типов в фокусах CIN и плоскоклеточного РШМ в зависимости от стадии.

Отмечено более значительное присутствие ВПЧ 18 типа в плоскоклеточном РШМ по сравнению с литературными данными (Samoylova E.V et al., 1995). ВПЧ 18 типа чаще был обнаружен у больных РШМ IB-IV

стадии, чем у больных CIN I - CIN III (Р=0,05) и РШМ IA стадии (Р=0,3). Этот факт подтверждает более агрессивное течение и быстрое прогрессирование случаев цервикальной неоплазии с ВПЧ 18 типа (Arends M.J. et al. 1993, Kwasniewska A. et al. 2002). Во всех наблюдениях РШМ железистого строения определен ВПЧ 18 типа.

Таблица 10.

Результаты типирования ВПЧ 16 и ВПЧ 18 в РШМ.

РШМ ВПЧ 16+ ВПЧ 18+ ВПЧ 16+, 18+ ВПЧ16-Д8-

Плоскоклеточный РШМ 1А-1Устадии, п=75 56 (74,7%) 14 (18,7%) 2 (2,7%) 3 (4%)

IA стадии, п=50 39 (78%) 8 (16%) 2 (4%) 1 (2%)

IB-IV стадии, п=25 17 (68%) 6 (24%) 0 2 (8%)

Железистый РШМ IA-IV стадии, п=3 0 3 (100%) 0 0

РШМ IA-IV стадии п=78 56 (71,8%) 17 (21,8%) 2 (2,6%) 3 (3,8%)

Следует отметить, что смешанная инфекция ВПЧ 16 и 18 типов не обнаружена в CIN I, а в CIN II- CIN III частота смешанной инфекции нарастает с увеличением степени тяжести неоплазии (в CIN II - 4,3% , в CIN III - 16,7%). При этом у больных РШМ поликлональный рост цервикальных неоплазий, обусловленный различными типами ВПЧ, выявлен лишь у 2/50 (4%) больных РШМ IA стадии, что составило 2,6% наблюдений РШМ

Определение потери гетерозиготности в ДНК CIN и РШМ.

Цель фрагмента исследования состояла в том, чтобы определить могут ли генетические нарушения быть ранними маркерами опухолевой трансформации. Для решения этого вопроса проведено сравнение частоты потери гетерозиготности в ДНК больных CIN и РШМ. На основании предыдущих исследований (Киселев Ф.Л. и др. 2002) выбраны шесть локусов с высокой частотой аллельных делеций на хромосоме 6. Пять микросателлитов расположены на коротком плече (6р) хромосомы 6 и включают район генов HLA (D6S276, TNFa, D6S273, D6S291), в том числе микросателлит TNFa вблизи гена фактора некроза опухоли, а также прителомерный микросателлит D6S344. Кроме того, выбран локус гена рецептора эстрогена (ESR) на длинном плече хромосомы 6 (6q), который по данным литературы отличается высокой частотой потери гетерозиготности при РШМ (Chuaqui R. et al., 2001).

Определено, что частота аллельных делеций по маркерам D6S276, TNFa, D6S273, D6S291 и ESR в ДНК фокусов РШМ IA стадии превышает частоту аллельных делеций в ДНК фокусов CIN I - CIN III, однако статистически достоверные различия выявлены лишь в частоте потери гетерозиготности по маркерам D6S276, TNFa и D6S291 (рис.12). Следует отметить, что на хромосоме 6 между маркерами D6S276 и TNFa располагаются гены основного комплекса гистосовместимости HLA I класса, определяющие иммунный ответ. Известно, что нарушения генов HLA I класса наблюдаются у большинства больных РШМ и, по-видимому, приводят к ускользанию ВПЧ-инфицированных клеток от иммунного ответа (Кооршап I.A. et al., 2000).

60%

DGS344 D6S276 TNFa D6S273 D6S291 ESR

□ CIN l-CIN Iii в РШМ Iстадии

Рис. 12. Результаты анализа частоты потери гетерозиготности в препаратах ДНК больных CINI - CIN III и РШМ I стадии.

Частота LOH по маркеру D6S344 в ДНК CIN превышала частоту LOH в РШМ I стадии, однако выявленные различия статистически не достоверны. Низкая частота LOH в локусе ESR в ДНК CIN (12% CIN I-CIN III) и РШМ (28,6%) позволяет предположить, что аллельные делеции в этом локусе не характерны для канцерогенеза шейки матки

Таким образом, установлено, что частота аллельных делеции по маркерам D6S276, TNFa и D6S291 существенно увеличивается в процессе канцерогенеза шейки матки, поэтому аллельные делеции по данным маркерам могут рассматриваться как фактор неблагоприятного прогноза при CIN.

Иммуногистохимические исследования препаратов CIN и РШМ.

Изучение экспрессии Ki-67.

Ki-67 - белок, присутствующий в ядрах клеток на всех стадиях жизненного цикла за исключением G0 и начальной стадии Gl. После выхода клетки из митоза Ki-67 не выявляется, поэтому является оптимальным маркером пролиферации. В нормальном цервикальном эпителии экспрессия Ki-67 определялась в виде окраски ядер клеток базального слоя, либо ядер койлоцитов в случае продуктивной вирусной инфекции. В CIN выявлено повышение пролиферативной активности цервикального эпителия, начиная с ранних этапов канцерогенеза: выраженная экспрессия Ki-67 зафиксирована в 14,2% CIN I (рис.13). При этом отмечено линейное увеличение пролиферативной активности цервикального эпителия на этапах трансформации CIN I-CIN III, r=0,99.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

14,2% 35,8% 46,71 80% 76,9% 85,7%

)

50% 33%

20% 13,3°/ 15,4% 14,3%

6,7%

CIN I

CIN I

CIN III

PLUM IA

РШМ IB-IV

□ Слабая экспрессия □ Умеренная экспрессия

□ Выраженная экспрессия

Рис.13. Результаты исследования экспрессии Ki-67 в препаратах CIN и РШМ

Показано, что в CIN III пролиферативная активность цервикального эпителия высока и сопоставима с пролиферативной активностью цервикального эпителия в РШМ IA и 1В-1Устадий (выраженная экспрессия Ki-67 выявлена в 80% CIN III, 76,9% РШМ 1Астадии и 85,7% наблюдений РШМ IB-IV стадии, Р=0,46-0,6). По сравнению с наблюдениями CIN, в препаратах РШМ отсутствовали случаи умеренной экспрессии Ki-67.

Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о невозможности использования выраженной экспрессии Ki-67 для дифференциальной диагностики CIN III и плоскоклеточного РШМ. В то же

время, выраженная экспрессия Ki-67 может быть отнесена к факторам неблагоприятного прогноза CIN.

Мы не обнаружили достоверных различий в частоте выраженной, умеренной и слабой экспрессии Ki-67 в зависимости от присутствия ВПЧ 16, либо ВПЧ 18 типа (Р=0,2-0,7), что согласуется с литературными данными (Nam E.J. et al., 2008). При этом, в случаях со смешанной инфекцией ВПЧ 16 и ВПЧ 18 в 80% наблюдений обнаружена выраженная экспрессия Ki-67.

Исследование экспрессии сурвивина.

Сурвивин - мультифункциональный белок, который подавляет апоптоз и регулирует клеточный цикл. Его суперэкспрессия коррелирует с неблагоприятным прогнозом при многих злокачественных новообразованиях. Экспрессия сурвивина не определяется в нормальном эпителии шейки матки. Однако уже на стадии CIN I наблюдается значительное число случаев с умеренной (окрашены ядра 30-70% клеток) или слабой (окрашены ядра менее 30% клеток) экспрессией сурвивина (рис.14).

100% 90% 80% 70% 60% 60% 40% 30% 20% 10% 0%

42%

26%

33%

27%

20%

26,7%

27%

28,6%

28,6%

36,7%

7,1%

23%

30,8%

38,6%

7,7%

16,4%

23%

38,6%

23%

CIN I

CIN II

CIN III

РШМ1А

PÜJM IB-IV

□ нет окрашивания □ слабая экспрессия

□ умеренная экспрессия □ выраженная экспрессия

Рис. 14. Результаты исследования экспрессии сурвивина в CIN и РШМ

Частота случаев с экспрессией сурвивина линейно возрастает при нарастании тяжести CIN: CIN 1-67%, CIN И-73,4%, CIN Ш-92,9%, r=l. В РШМ IA стадии экспрессия сурвивина определяется практически с той же частотой, что в группе CIN III (92,1% и 92,9% соответственно), однако чаще, чем в группе РШМ IB-IV стадии (76,9%). Важно отметить, что выраженная экспрессия сурвивина (окрашены ядра более 70% клеток) отсутствует в CIN I, но выявлена в CIN II-CIN III, РШМ IA и РШМ IB-IV в 15,4-28% наблюдений. Мы не

обнаружили статистически достоверных различий ни в частоте случаев экспрессии сурвивина, ни в частоте случаев с выраженной, умеренной, слабой и негативной экспрессией сурвивина во всех исследуемых группах.

Выраженная экспрессии сурвивина свидетельствует об ингибировании апоптоза в более, чем 70% клеток цервикального эпителия, что может способствовать прогрессированию неоплазии и является неблагоприятным прогностическим признаком. Отсутствие экспрессии сурвивина в 33% CIN I, в 26,7% CIN II и 7,1% CIN III, 7,7% РШМ IA, 23% РШМ 1B-IV может говорить как о возможности сохранения апоптоза в данных наблюдениях (что способствует спонтанной регрессии CIN), так и о возможности ингибирования апоптоза посредством иных регуляторов.

Нами не выявлено достоверных отличий в частоте случаев с различными вариантами экспрессии сурвивина в неоплазиях с ВПЧ 16 типа и 18 типа.

Исследование экспрессии Е-кадхерина.

Е-кадхерин - поверхностный мембранный гликопротеид, опосредующий взаимодействие между мембранами клеток эпителия. Кадхерины вовлечены также в процесс клеточной дифференцировки и регуляции миграции в ответ на повреждение. Изменения гена Е-кадхерина (мутации, делеции, метилирование) проявляются потерей экспрессии Е-кадхерина и приводят к нарушению межклеточных контактов, накоплению в-катенина в ядре. В результате стимулируется размножение клеток, увеличивается их способность к инвазии. В нашем исследовании наряду со снижением частоты выраженной экспрессии Е-кадхерина по мере нарастания тяжести цервикальной неоплазии (рис.15), г= -0,93, 0.05<Р<0,1, обнаружено поэтапное появление вариантов более слабой экспрессии Е-кадхерина.

Так, в CIN I обнаружены лишь случаи выраженной и умеренной экспрессии. Очень слабая экспрессия Е-кадхерина (мембранное окрашивание менее 25% клеток) выявлена в 9% CIN II, 46,7% CIN III, 30% случаев РШМ IA стадии и в 50% наблюдений РШМ IB-IV стадии. Отсутствие экспрессии Е-кадхерина выявлено в 13,3% CIN III, 15,4% РШМ IA стадии и в 30% РШМ IB-IV стадии (различия статистически не достоверны, Р=0,3-0,6).

Не выявлено статистически достоверных различий в частоте случаев с выраженной и умеренной экспрессией Е-кадхерина (мембранное окрашивание более 50% клеток), а также случаев с очень слабой и негативной экспрессией Е-кадхерина (мембранное окрашивание менее 25% клеток) в группах CIN III/ РШМ 1А/ РШМ IB-IV, а также в группах CIN I/CIN II. В то же время, в группах CIN II/CIN III выявлено статистически достоверное различие в частоте случаев с выраженной и умеренной экспрессией кадхерина (Р=0,05), а также в частоте

случаев с очень слабой и негативной экспрессией Е-кадхерина (Р=0,01). По-видимому, это свидетельствует о наиболее существенных изменениях клеточного комплекса адгезии на этапе прогрессии CIN II-CIN III.

100% ........................ —.....................................................—......|__0. ...............................................

7,7% 10%

90% - ----- 20% -

10%

80% —— 30,8°/, -

70% 64-б°" ^

60% 77% 1^7% -

16,4°/, 60%

50% _

40% 18,2% 46,7°/,

30% __30,8°/,........ .

20% 18.2° о

23°/ ----30%

10% 9Л% 13,3°/

0% -I---т------------Т--------Т-----(

CIN I CIN II CIN III PLUM IA РШМ IB-IV

□ нет окрашивания □ очень слабая экспрессия

□ слабая экспрессия □ умеренная экспрессия

□ выраженная экспрессия

Рис.15. Результаты исследования экспрессии Е-кадхерина в CIN и РШМ.

Таким образом, в процессе цервикального канцерогенеза происходит поэтапная потеря активной мембранной экспрессии Е-кадхерина. Наиболее выраженные нарушения экспрессии Е-кадхерина выявлены на этапе трансформации CIN II/CIN III. Очень слабая экспрессия Е-кадхерина и, особенно, отсутствие экспрессии Е-кадхерина могут быть отнесены к факторам неблагоприятного прогноза CIN.

Анализ экспрессии Е-кадхерина в зависимости от присутствия ВПЧ 16 и 18 типа не выявил достоверных различий в частоте различных типов экспрессии Е-кадхерина в неоплазиях с ВПЧ 16+, ВПЧ 18+ и в группе, содержащей и ВПЧ 16, и ВПЧ 18 (Р=0,2-0,8).

Проведено сопоставление результатов анализа экспрессии исследуемых маркеров в каждом случае CIN и РШМ. Для этого выделены прогностически благоприятные варианты экспрессии маркеров (слабая экспрессия Ki-67, слабая и негативная экспрессия сурвивина, выраженная и умеренная экспрессия Е-кадхерина) и прогностически неблагоприятные варианты (выраженная экспрессия Ki-67, выраженная экспрессия сурвивина, очень слабая и негативная экспрессия Е-кадхерина). Частота встречаемости прогностически

77% 64,5°/ 20% 7,7% 10%

10%

1 13,3°/ 30,8°/ > 60%

6,7%

16,4°/

18,2°/ 30,8°/

1 46,7°/ >

30% I

23%

18,2° 0 \

13,3°/ 16,4%

9,1%

благоприятных и неблагоприятных вариантов экспрессии маркеров отражена на рис. 16.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

исследуемых

m uj »

II I

CIN I

ш

Q.

><

О

CIN II

CIN III

1Г

РШМ1А

ir

РШМ IB-IV

О прогностически неблагоприятный вариант экспрессии □ промежуточный вариант экспрессии О прогностически благоприятный вариант экспрессии

Рис.16. Сопоставление частоты встречаемости прогностически благоприятных и неблагоприятных вариантов маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина в CIN и РШМ.

При детальном анализе наблюдений CIN и РШМ мы не выявили корреляционной зависимости между прогностически благоприятными и прогностически неблагоприятными вариантами экспрессии маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина (г=0,02-0,48, Р>0,05). Отсутствие корреляции, по-видимому, связано с тем, что данные маркеры отражают различные аспекты канцерогенеза шейки матки. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности комплексного использования исследованных маркеров для прогнозирования течения CIN.

выводы

1. Доминирование больных РШМ I стадии (77%) - результат длительного комплексного скрининга, применяемого в системе поликлиник УД Президента РФ. РШМ IA стадии диагностирован у 62,6%, РШМ IA1 стадии - у 45% больных РШМ. Преобладание больных РШМ ранних стадий позволило применить только хирургическое лечение у 65,6% больных РШМ. Средний возраст больных РШМ (48,6 г.) на 5 лет меньше, чем в РФ, что может быть связано как с ранней диагностикой РШМ, так и с тенденцией к омоложению РШМ.

2. Отмечено превалирование ВПЧ 16 типа как в CIN, так и в РШМ: частота ВПЧ 16 типа варьировала от 60% в CIN I до 78% в препаратах РШМ IA стадии. Выявлено значительное присутствие ВПЧ 18 типа (в 13,3% CIN I-CIN III, 21,8 % РШМ, 18,7% плоскоклеточного РШМ). Частота случаев поликлонального роста цервикальных неоплазий, обусловленных разными типами ВПЧ (16 и 18 типов) максимальна в CIN III (16,8%) и уменьшается по мере профессии CIN III-инвазивный рак.

3. Установлено, что частота аллельных делеций по маркерам D6S276, TNFa, D6S291 нарастает в процессе канцерогенеза шейки матки. Определение этих генетических нарушений у больных CIN может свидетельствовать о высоком риске прогрессирования неоплазии.

4. Выраженная экспрессия Ki-67 в цервикальном эпителии является фактором неблагоприятного прогноза при CIN. Выявлена линейная зависимость - рост частоты случаев с выраженной экспрессией Ki-67 с увеличением степени CIN (г=0,99). При этом достоверных различий в частоте выраженной экспрессии Ki-67 в CIN III, РШМ IA стадии и РШМ 1В-1Устадии не обнаружено (Р>0,05).

5. Установлено, что выраженная экспрессия сурвивина является ранним маркером неблагоприятного прогноза CIN. Частота случаев с экспрессией сурвивина линейно возрастает при нарастании тяжести CIN, г=1. Выраженная экспрессия сурвивина (окрашивание ядер более чем 70% клеток) не обнаружена в CIN I, выявлена в 15-28% CIN II, CIN III, РШМ IA и РШМ 1В-1Устадии, Р>0,05.

6. Выявлено, что отсутствие, либо очень слабая мембранная экспрессия Е-кадхерина при CIN - неблагоприятный прогностический признак. Частота выраженной мембранной экспрессии Е-кадхерина уменьшается по мере прогрессирования CIN - инвазивный рак (Р<0,05). Очень слабая либо негативная экспрессия Е-кадхерина не зафиксирована в CIN I, наблюдалась в 9,1% случаев CIN И, 60% CIN III, 38,5% РШМ IA и в 80% случаев РШМ IB-

1Устадии. Негативная экспрессия Е-кадхерина не выявлена в CIN I и CIN II, обнаружена в 9-15% случаев CIN III, РШМ IA и РШМ 1В-1Устадии (Р>0.05).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ю.А. Блиев, Д.Ю. Песков. Н.В. Снигур. Е.Б. Савинова, H.H. Мазуренко. Анализ потери гетерозиготности на хромосоме 6 в дисплазиях и раке шейки матки // Материалы Ш съезда онкологов и радиологов СНГ,- Минск, 2004,-Часть I.- С.298.

2. Б.А. Биджиева, Ю.А. Блиев, Д.Ю. Песков, Н.В. Снигур. Е.Б. Савинова, H.H. Мазуренко. Инфекция HPV и генетическая гетерогенность дисплазий и рака шейки матки // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-2004.-Т.8.-Ш.-С.56.

3. Мазуренко H.H., Блиев А.Ю., Биджиева Б.А., Песков Д.Ю., Снигур Н.В., Савинова Е.Б., Киселев Ф.Л. Потеря гетерозиготности на хромосоме 6 как маркер ранних генетических нарушений при дисплазиях и микроинвазивном раке шейки матки // Молекулярная биология.-2006.-Т.40.-№3.-С.436-447.

4. Б.А. Биджиева, A.C. Осташкин, Н.В. Снигур. Е.Б. Савинова, H.H. Мазуренко. Полиморфизм в районе генов HLA III класса у больных с дисплазиями и раком шейки матки // Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ.- Баку, 2006.-часть 2.-С.38.

5. Б.А. Биджиева, Н.В. Снигур. Д.Ю. Песков, Е.Б. Савинова, H.H. Мазуренко. Исследование генетического полиморфизма цитокинов у больных раком шейки матки // Кремлевская медицина.-2007.-Т.14.-№3.-С.63-65.

6. В. Bidzhieva, N. Snigur. N. Mazurenko. Genetic polymorphism of TNFa and IL-10 in Russian CIN and cervical cancer patients // Abstracts of ECCO 14, Barselona, 2007. Eur. J. Cancer.-2007.-Suppl..Vol.5.-№4.-P.316.

7. Биджиева Б.А., Осташкин A.C., Цыганова И.В., Снигур Н.В.. Савинова Е.Б., Мазуренко H.H. Полиморфизм в локусе фактора некроза опухолей у больных с дисплазиями и раком шейки матки // Молекулярная медицина.-2008.-Т.5.-№1.-С.45-50.

8. Мороз Е.А., Ротин Д.Л., Снигур Н.В.. Песков Д.Ю., Савинова Е.Б., Мазуренко H.H., Петровичев H.H. Анализ экспрессии Ki-67 и сурвивина для оценки прогрессии дисплазий и микрокарцином шейки матки // Тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. Вопросы онкологии.-2008.-Т.54.-№2.-С.19.

9. В. Bidzhieva, N. Snigur. N. Mazurenko. Genetic polymorphism in the promoters of IL-6 and IL-10 in CIN and cervical cancer patients // Proceedings EACR-20.- Lyon, 2008,- P.176.

10. NV. Snigur. E.A. Moroz, D.L. Rotin, N.N. Mazurenko, E.B. Savinova. Ki-67 and survivin immunostaining for evaluation of cervical precancer lesions // Proceedings EACR-20.-Lyon, 2008,-Abstract 613,- P.247.

11. Snigur N.V., Anurova O.A., Savinova E.B. Ki-67, survivin and E-kadherin expression in early stage cervical carcinoma // ECCO 15-38 ESMO Congress.-Berlin, 2009. Eur. J. of Cancer.-2009.- Suppl.Vol.7.-№2.-P.449.

12. Снигур H.B. Анурова O.A. Особенности экспрессии Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина в интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки // Материалы XIII Российского онкологического конгресса, 17-19 ноября 2009г.-Москва, 2009,-С.369-370.

Подписано в печать 02.11.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

___Заказ № В90 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак шейки матки (РШМ) - важная проблема для гинекологов и онкологов всего мира. В структуре смертности женщин от злокачественных опухолей гениталий РШМ занимает второе место [9,31]. Ежегодно в мире выявляется около 500 тысяч новых случаев заболевания, более 270 тысяч женщин умирают от рака шейки матки [184]. Три четверти всех случаев РШМ регистрируется в развивающихся странах [27,31]. В экономически развитых странах в связи с успехами в изучении этиологии и молекулярных механизмов канцерогенеза РШМ, с внедрением профилактических осмотров, отмечено снижение смертности от РШМ [27,37, 157].

В России в последние десятилетия наблюдается рост заболеваемости раком шейки матки, отмечается высокий показатель запущенности и увеличение числа больных молодого возраста [27]. В 2006 году в России РШМ занял первое месте в структуре заболеваемости онкологической патологией женщин в возрастной группе 15-39 лет и второе место в возрастной группе 40-54 года, уступив лишь раку молочной железы [8]. В структуре смертности женщин от онкологических заболеваний в 2006г. в России РШМ находился на втором месте в возрастных группах 25-49 лет [9].

Доказательство роли ВПЧ высокого риска в этиологии РШМ привело к пониманию механизмов канцерогененеза шейки матки и существенно повысило возможности профилактики РШМ [196-198]. Однако инфекция ВПЧ далеко не* всегда приводит к развитию рака. Несмотря на широкое распространение ВПЧ в популяции, лишь у части женщин в результате постоянной персистенции вируса возникают предраковые поражения шейки матки — цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN), которые поэтапно, в течение длительного времени могут прогрессировать в рак. В то же время, нередко имеет место и регрессия CIN. Очевидно, наличия вирусной инфекции недостаточно для возникновения рака и необходимы определенные клеточные факторы, способствующие развитию заболевания. В процессе опухолевой трансформации большое значение имеют состояние иммунной системы, генетические особенности взаимодействия вируса и клетки, вызывающие нестабильность генома, и другие факторы.

Крайне важным для разработки оптимальной тактики лечения больных является поиск и выявление возможных маркеров прогрессии CIN и РШМ. В связи с развитием молекулярно-генетических и иммуногистохимических методов анализа в последние годы эти методы используются для поиска и изучения возможных маркеров прогрессии предрака и РШМ. В настоящей работе представлялось актуальным провести анализ ВПЧ и генетических нарушений из всех доступных фокусов CIN и РШМ каждой пациентки. Поскольку в клинической практике наиболее доступны иммуногистохистохимические исследования, представлялось важным провести сравнительное изучение экспрессии в CIN и РШМ ранних стадий известных маркеров пролиферации, апоптоза и клеточной адгезии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Изучение клинических, морфологических и молекулярных особенностей цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного рака шейки матки для выявления возможных маркеров прогрессирования предраковой патологии шейки матки.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1. Изучить клинические особенности цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного шейки матки.

2. Определить частоту ВПЧ 16 и 18 типов в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки.

3. Изучить генетические нарушения в ДНК из фокусов цервикальных интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки путем анализа частоты потери гетерозиготности на хромосоме 6.

4. Изучить особенности экспрессии и оценить возможное прогностическое значение иммуногистохимических маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Выполнено комплексное клиническое и молекулярное изучение CIN и РШМ. Проведена микродиссекция парафиновых срезов цервикальных биопсий и генотипирование ВПЧ 16 и 18 типов в отдельных фокусах CIN и РШМ.

Поликлональные поражения шейки матки, обусловленные различными типами

ВПЧ, выявлены в CIN II и CIN III в 4 и 16% соответственно, а в РШМ - в 2,6% наблюдений. Наряду с превалированием ВПЧ 16 типа отмечено значительное присутствие ВПЧ 18 типа как в CIN, так и в РП1М.

Показано, что частота вирус-индуцированных генетических нарушений на хромосоме 6 в районе генов HLA в локусах D6S276, TNFa и D6S291 увеличивается при прогрессировании CIN в рак.

Впервые изучены особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров сурвивина (ингибитор апоптоза) ' и Е-кадхерина (компонент клеточного комплекса адгезии) одновременно с маркером Ki-67 (маркер пролиферативной активности) в CIN и РШМ. Определены критерии оценки экспрессии указанных маркеров и возможность использования этих маркеров в качестве факторов прогноза течения CIN.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Иммуногистохимическое определение прогностически неблагоприятных вариантов экспрессии маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина, а также выявление генетических нарушений в локусах D6S276, TNFa и D6S291 на хромосоме 6 позволяет выделить группу больных CIN с высоким риском прогрессировала, что крайне важно при выборе тактики лечения пациенток с CIN. Оптимизация лечения этой группы больных позволит снизить заболеваемость РШМ.

выводы

1. Доминирование больных РШМ I стадии (77%) — результат длительного комплексного скрининга, применяемого в системе поликлиник УД Президента РФ. РШМ IA стадии диагностирован у 62,6%, РПГМ IA1 стадии - у 45% больных РШМ. Преобладание больных РШМ ранних стадий позволило применить только хирургическое лечение у 65,6% больных РШМ. Средний возраст больных РШМ (48,6 г.) на 5 лет меньше, чем в РФ, что может быть связано как с ранней диагностикой РШМ, так и с тенденцией к омоложению РШМ.

2. Отмечено превалирование ВПЧ 16 типа как в CIN, так и в РШМ: частота ВПЧ 16 типа варьировала от 60% в СШ 1 до 78% в препаратах РШМ 1А стадии. Выявлено значительное присутствие ВПЧ 18 типа (в 13,3% CIN I-CIN III, 21,8 % РШМ, 18,7% плоскоклеточного РШМ). Частота случаев поликлонального роста цервикальных неоплазий, обусловленных разными типами ВПЧ (16 и 18 типов) максимальна в CIN III (16,8%) и уменьшается по мере прогрессии CIN Ш-инвазивный рак.

3. Установлено, что частота аллельных делеций по маркерам D6S276, TNFa, D6S291 нарастает в процессе канцерогенеза шейки матки. Определение этих генетических нарушений у больных CIN может свидетельствовать о высоком риске прогрессирования неоплазии.

4. Выраженная экспрессия Ki-67 в цервикальном эпителии является фактором неблагоприятного прогноза при CIN. Выявлена линейная зависимость - рост частоты случаев с выраженной экспрессией Ki-67 с увеличением степени CIN (г=0,99). При этом достоверных различий в частоте выраженной экспрессии Ki-67 в CIN Ш, РШМ IA стадии и РШМ Ш-1Устадии не обнаружено • (Р>0,05).

5. Установлено, что выраженная экспрессия сурвивина является ранним маркером неблагоприятного прогноза CIN. Частота случаев с экспрессией сурвивина линейно возрастает при нарастании тяжести CIN, г=1. Выраженная экспрессия сурвивина (окрашивание ядер более чем 70% клеток) не обнаружена в CIN 1, выявлена в 15-28% CIN II, CIN III, РШМ IA и РШМ 1В-1Устадии, Р>0,05.

6. Выявлено, что отсутствие, либо очень слабая мембранная экспрессия Е-кадхерина при CIN - неблагоприятный прогностический признак. Частота выраженной мембранной экспрессии Е-кадхерина уменьшается по мере прогрессирования CIN - инвазивный рак (Р<0,05). Очень слабая либо негативная экспрессия Е-кадхерина не зафиксирована в CIN I, наблюдалась в 9,1% случаев CIN П, 60% CIN III, 38,5% РШМ IA и в 80% случаев РШМ IB-1Устадии. Негативная экспрессия Е-кадхерина не выявлена в CIN I и CIN II, обнаружена в 9-15% случаев CIN III, РШМ IA и РШМ ГО-1Устадии (Р>0.05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Рекомендовано проведение комплексной диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий с проведением иммуногистохимических и молекулярно-генетических исследований. Выявление генетических нарушений в локусах D6S276, TNFa и D6S291 на хромосоме 6 и иммуногистохимическое определение прогностически неблагоприятных вариантов экспрессии Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина (выраженная экспрессия Ki-67, выраженная экспрессия сурвивина, очень слабая и негативная экспрессия Е-кадхерина) позволяет выделить среди больных CIN группу пациенток с высоким риском прогрессии заболевания. Оптимизация лечения этой группы больных (с учетом возраста, наличия сопутствующих гинекологических заболеваний, заинтересованности в сохранении репродуктивной функции) позволит снизить заболеваемость РШМ.