Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Интенсивность процессов перекисного окисления липидов печени в условиях экспериментального злокачественного роста



на правах рукописи

ФРОЛОВ ГЕННАДИЯ ФЕДОРОВИЧ

ЮГГЕНСШНОСТЬ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕПИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛКГ31ДОВ ШЧ2ЯИ В УСЛ&ВЯЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНКЯОГО ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ГОСТА

14.00.14 -онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата- биологических наук

Томск- 1995

Работа выполнена е К1Л экспериментальных Тюмоделей Томского научного центра СО РАШ и научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН.

Научные руководители: ■

академик РАШ, профессор К. Е. Васильев.

кандидат медицинских наук Е И. Огреба

Официальные оппоненты; .

доктор медицинских наук, профессор Е Г. Пашшйкий

доктор'биологииеских наук,проЬессор С.А.'Хо

Ведущая организация: Онкологический научный' центр РАМН

Защпа состоится "_" _ 1935 г. в"_" час.

на гаседании специализированного ученого соЕета Д 001.34.01 в научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАШ? ( 634001, г. Томск, пер. Кооперативный, 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НШ онтологии ' ТНЦ СО РАКШ ( пер. Кооперативный,5)

Автореферат разослан "_"_19&5г.

Ученый секретарь специализированного соЕета,

каксилгт медицинских наук Н. Л- Киселеьа.

ОЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность теш. К настсяс^ыу времени накоплен. большой экспериментальный и клиническим материал, свидетельствующий о важной роли процессов перекисного окисления липидов ( ГОЛ) при различных патологических процессах и, в частности, при развитии злокачественных опухолей ( СагЬегу et al,1975; Вайн-штейн и соавт. , 1984; Журавлев и соавт. ,1984; Нодевникова и соавт., -1939). Как известно, перо'ксидация липидов и образующееся при этом реактогенные високотоксичные продукты окззыва-ют многостороннее, отрицательное влияние на структурное и функциональное состояние клеток органов и тканей. При этой наругается проницаемость липидного слоя клеточных мембран, проявлением чего является солюбилизация внутриклеточных фер- ■ |.:гнтсв ( Владимиров и соавт. , 1972; Violetal. ,1986)', дезориентация ферментных систем ( Шйоре и соавт. ,1979; Пзлатина и соаЕт., 1994).разобщение окислительного фосфорилирования и мутации ( Казначеев н соавт. 1976; Коган и соавт. , 1981), торможение синтеза ДНК и потеря пролиферацт! (PHinb et al. ,1587).

Нарушение функции биомембран имеет непосредственное othodj-ние к патогенезу злокачественных новообразований, излагает, что оно вызывает мутации в генном аппарате клетки, которые в последствии приводят к раку ( Jensen., 1986 ). Возникновение и развитие опухолей сопряжено с формированием в организма стрессовых реакций ( Selye. , 1979; Sklare et al., 1981). 'ffl. 3. Ыаерсон (1981) полагает, что'повреждение мембран при стрессовой актнвалии Ю."особенно актуально е свете oSir^fi теории он-ксгенсза, paspafiTTSHHcn Л ЕЫеклерои (1976).

Строгая регламентация pe^uiní; лкшдноп перокгпдацпн в ме-мб-ранних структура* достигается гз г чет ф;-нкдигк1:рсЕ5н:;я cor ла-

гованной система ферментных ( Chsj-.ce е1 а1. , 1978; Мзппэпп. , 1555; Лаякин и соавт. , 1985 ) и неферментных механизмов, контроля га содержанием активных форм кислорода, свободных радикалов и молекулярных продуктов ПОД Нарушение е системе регуляции липопереокислотельных процессов могут .явиться причиной несбалансированной активации ПОЛ. Такая ситуация действительно наблюдется при опухолевой росте ( СагЬегу е1 а1. ,1975; На11аг«-еП,1982; Куравлев и соавт., 1984; 51агГю еЬ а1 1985;Е1ГпЬо1т. , 1936;. Кожевникова и соавт. 1939).

Кроме того, также необходимо подчеркнуть, что опухолевый рост сопровождается развивающимся в организме гипогликемичес-ким давлением опухоли на метаболизм нормальных тканей ( Ш-пот. ,1975). Это явление, в сеою очередь в связи с хроническим дефицитом основного энергетического материала глюкозы приводит к мобилизации тканями других энергетических субстратов, в том числе ненасыщенных жирных кислот ( Дильман,1974). Это обстоятельство и развивасшзяся при раке тканевая гипоксия также лежат е основе стимуляции ЮЛ в организнэ.

Однако имеются сосбсрния ( Б1лянск.,й и соавт. 1392), укагы-. гаюаэтг на то обстоятельство, что опухолевый процесс не сопровождается активацией липопереокислительных процессов.

Противоречивость данных выводов рагных авторов по зтему вопросу, очевидно, не случайна, если, учитывать многоэтапное« развития опухолей, существование тканевой специфичности в используемом процессе, а также выбор экспериментальной модели. Необходимо подчеркнуть, что работы посвященные изучению процессов ПОЛ и антиоксидантных фактров зашиты при опухолевом росте носят единичный характер и ьыполнены главным образом на модели перевиваемых опухолей. В связи с этим представляются актуальными исследования на модели спонтанного и химически индуцированного канцерогенеза, которые наиболее адекватно отражает многоэтапный процесс формирования злокачественны;:

опухолей. При этом важно учесть генетический фактор, во многой определяпций канцерогенез у животных и человека. Большой интерес представляет также сопоставление лкаопереоклслителъ- ' ных процессов у организмов с различной предрасположенностью к бластомогенезу на фене воздействия экстремальных факторов, поскольку вопрос о взаимоотношении стресса и злокачественны! новообразований решен положительно ( Яременко и соавт. 1981; Serhsn et al. ,1982).

Таким образом, ряд вышеизложенных моментов обусловливает актуальность проводимого исследования.

Дедь и задачи исследования. Целью настояний работы явилось изучение состояния ПОЯ и отдельных звеньев антиоксидалтлой систем печени на £сн? развития спонтанных и химически ' индуцированных опухолей, а также при воздействии экстремальных, факторов. •

В райках . этой цели решались следующие задачи:

1. Исследовать возрастные изменения состояния ПОЛ в печени инбредных мышей, оппезитных по спотнанному бластомогенезу.

2. Изучить особенности реакций липидней перокендацни при спонтанном опухолевом росте и химически индуцированном канцерогенезе на разных стадиях развития опухолей.

3. Охарактеризовать состояние отдельных звеньев антиокидант-ной системы в печени животных на указанных выше моделях ' злокачественного роста.

4. Исследовать особенности ПОЛ у высокораковыз: мышей в условиях стресса.

5. Исследовать возможности использования препаратов тимуса тимоптина для кс.^кцип липопереок^:;лптельтя процессов и усилия.противоопухолевой резистентности.

Научная новизна. Ьпервит проЕеден рзд&гедоил: анализ состояния процесегг 1КЛ в печени utasft ыгок.сракгвой лин.з; а корме, ;;рн стрессе, в процессе спгнтаин-го и иядуиирегакизго

канцерогенеза.

Было обнаружено, что интенсивность реакцпй лилидной перок-скдацпп при старении, стрессе и канцерогенезе у них более, вы-' ражена, чем .у генетически низкорагавых животных и обусловлена значительным снижением антиокнсидантных механизмов,обеспечивавших удержание на минимальном стационарном уровне процессов ГОЛ. ' •

Епервые показано, что интенсивность ГОЛ, состояние антипе-рекисных и антирадикальньж факторов защггы зависят от стадии развития' опухоли.

ВперЕые обнаружено, что интенсивность процессов ШЛ, наблюдаемая у животных-опухоленосителей, имеет положительную кор- ' реляционную связь с размерами первичного опухолевого узла

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное. исследование расширяет представление о роли процессов ПОЛ в патогенезе экспериментальных злокачественных новообразований. Резутаты работы позволяют оценить вклад антиоксидантных факторов защиты в развитие синдрома липидной пероксидации при старении, неопластичэском' процессе, а также при воздействии!:

. л

экстремальных факторов. Дальнейшее изучение процессов ГОЛ, • взаимосвязей лилопереокнслиельных реакций с другими кисло-■ родзависимыми процессами при злокачественном росте позволит наметить ■ способы направленной коррекции патобиохимических расстройств. Перспективно в этом плане изучение действия средств с антиоксидантной активностью с целью возможного использования их для лечения онкологических заболеваний. В на- ■ шей работе показана эффективность одного из новых препаратов тимуса т;71лэпт1па, который преждупреждал-.чрезмерную активацию

с

ГОЛ, препятствовал значительному снижению антиоксидантного потенциала при • стрессе и усиливал противоопухолевую резистентность при канцерогенезе. •

Алробания работы. Сгноены? положения работы дололгки и обсуждены на отчетны;: конференциях НИИ онкологии Томского научного центра РАИН (1985,1957); на Есесссной г-онференции "Актуальные вопросы стандартизации лабораторных ответных ( Москва, 1957); на Международной конференция стран Валит, по психосоматика (Кельн,1932); на совместном заседании сотруд--никсв лаборатории пснхс^армакологии ИК фармаколога! ТНЦ РАШ, лаборатории иммунологии, канцерогенеза, онковирусологии 1П0! онкологии ТНЦ РАМН, лаборатории экспериментальных биоиэ-дкцпнских иоделей ИЩ РАМН (1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных

Г - *

С-Сгем и струтурз диссертации: диссертация изложена на 107 стг=->-:!г,.">.:■: магинзяисного текста, включает агедение, обзор лиге- • ратуры, главу материалы и методы, 3 глави собственных исследований, заключение и выгоды. Работа иллюстрирована.3 таблицами и 19 рисунками. Библиографический 'указатель состоит из 233 научных губликаций, из которызС 124 публикации на русской языке, 103 - на иностранных.

4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.ГЛАЕА 1. 0Е30Р ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы рассматриваются следуювде вопросы:

- механизмы индукции ШЛ в биологических системах;

- ШЛ и значение антиоксидаитных факторов в заците от пов-ревдасзрго действия липидяей пероксидацки при злокачественном росте

- Елияние Еозрастз на процессы ШЛ и активность антиоксн-дантных систем;

- состояние ГОЛ и противоопухолевая рег;гтектность организма в условиях стресса.

ГЛАЗА 2. МАТЕРИАЛЫ И ШСДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Е работе использовали юлкП А'Згч и СБ7Е1/6 обоего пола

массой 14-£0 г. разводки опытно-плем?иного питомника HíiS экспериментальных биомсделзй РА1.Н (г. Мзсква ) и НИЛ экспериментальных бкомоделей Томского научного центра РАМН г Томск ) Всего использовано 1090 мышей. Для получения химически индуцированных опухолей использовали 7,1£-Д1шетилбеэ( а) антрацен ( ДЬЗА,Serva), относяслйся к группе полицикличесютх ароматических углеводородов. Канцероген вводили подкожно в количэст-ве 0,4 1.т в 6,1 ш оливкового масла 2-4- месячным мынам обоего пола. Первые опухоли, гистологически идентифицированные как фибросаркомы, появ!Ш1СЬ спустя 2,5-4 месяца после введения канцерогена у мышей. Контролем служили животные, получавши? только оливковое масло.

Для изучения спонтанных злокачественных новообразований использовали самок мышей линий A/Sn, характеризующиеся высокой частотой развития ( около 75%) спонтанных аденокаршшом 1ялочных жегез в возрасте более 10 месяцев ( Еландова и со-авт. , 1978). Для сравнения использовали самок милей С57Е1/ 6, резистентных к возникновению спонтанных новообразований в возрасте 18 месяцев ( Харьковская и соавт. , 1985 ). Для исследования были взяты животные трех >'|;грастньк групп: 2-Змее., 6-7мес. 11-1Б мес. ( без опухоли и с опухолями различной массы).

В качестве модели экстремального воздействия на изучаемые показателя у животных с раэличной предрасположенностью к злокачественному росту использовали трансмеридианальный перелет (ТЫЛ) мышей линий A/Sn и С57В1/6 из Москва в Томск. Известно, что ТИП можно рассматривать как стрессовое воздействие, вызывайте типичный комплекс адаптационных реакций, опосредованных через нгйро-эндокрйнное звено регуляции гомеостаза ( Ма-тюхин и соавт. , 1088). Исследования проводили на 1,3,7 и 14 сутки после перелета. Для коррекции отрицательного влмияния трансмеридианального перемещения на состояние ПОЛ и отдельные

звенья актпзк^идантной системы попользовали препарат тимуса -тимоптин производства Московского эндокринного завода, Препарат ееодили парзнтерально в дозе 5' мкг на мышь.

Объектом исследования служили супернатант и липидный экстракт печени 8кспбр1шентальных животных. Для оценки состояния ПОЛ определяли содержание первичных-диеновые коньюгаты ( ДК), промэжуточнцх-триеноЕьн коньюгаты (ТК) и конечньк-основаяия Шиффа (ОШ) продуктов лппидной пероксидации в липидных зкс-трактах. В последних определяли также антирадикальную активность (АРА) лкпидов. Антютерекнсную за^ггу оценивали по величине активности фермента глутатионредуктагы (ГР) и концентра-цш: восстановленного глутатпона (£2Н) в супернатаяте.

1. Для изучения активности ГР печень гомогенизировали в го-могеккгатоге Поттера в 50 мМ фзсфатнсго буфера ( РЬ »7,4), содержзцэм 1 мМ ЭДТА (1: 9/вес: объеи)прз1 4С°. Гомогеиа? црнт-РпХугирсвали в ргфрк^раторной центрифуге К-£4 (Германия) ярл £0000 е в течение 1 часа г.ри 4 С.' Определение активности фермента проводили спектрофотометрически на .спектрофотометре БУ ( Бескггап, США) по окислению МАБЯ-Н в реакции восстановления ■окисленного глутатиона (СагЬегу et а1. ,1975) при длине волны поглощения 240 нм. Расчет активности фермента в кнолъ НЛДРНг мин/мг белка проводили по формуле:

( А _ - А г ) * ДХ Ю00 Акт «-ь-±___

Ех Р

( А - А^) - изменение оптической плотности в минуту; Д - разведение гомогената в кювете;

1СГО - коэффициент перевода икмолгй в нмоли;

Е - коэффициент молярной зкстиккизш хроюгеняго субс--(

, рагный 6,22 10 /¡¿'см;

Р - кснцектрация белка в супернатакте в иг/ил.

- в -

2. Для определения содержания БЕН к 1мл 105; гсмсггната псчгнн, приготовлением на фосфатном буфере ( РЬ = 7,6) добавляли 1 ил тргоглоруксуской кислоты с цельв осаждения белков. Гомогенат центрифугировали в рефрижераторной центрифуге К-24 (Германия) при ускорении 1700г з течение 10 минут при 4с! Определение содержания глутатиона проводили спектро-фотометрически на спектрофотометр' СФ -26 (Гоеснл). Ыггод ое-кзван на том, что ЕЗН, реагируя с избытком аллсксанз, образует соединение, имепцее максимум поглощения при длине волны 305 ни (Кау е! а1. , 1950). Содержание глутатионз (А) в печени

(мкыэль/г ) рассчитывали по формуле: ■

и V

А- _X-

V Р М

2

м - содержание глутатиона в пробе, рассчитанного по стандарту, мкг;

Vj- общ!й обгем Оеэбелкового цектрифугата, мл; •*

Vg- объем центрифугата, еэятсНь на определение, мл; Р - навеска ткани, г;

U - относительная молекулярная масса восстановленного / глутатиона - 307,332.

3. Экстракции липидов проводили по методу, описанному Folch и соавт. (19S6). Шчень промывали в физиологическом растворе, просушивали на фильтровальной бумаге, измельчали. Навеску помешали в гомогенизатор со стеклянным пестиком и экстрагировали липиды, добавляя .20-кратный объем смеси хлороформ-метанол (2: 1) по частям. Смесь гомогенизировали в течешт Б минут при О -Б С при постоянном встряхивании. Экстракт фильтровали через обезжиренный фильтр.Трижды промывали от нелиппдних примесей 1/7 объема воды. Для быстрого расслаивания фаз пробы центрифу-

тировали в пробирках, с плотно' притертыми пробками при -1500 ой .чей. в течение 20минут. Верхнюю $агу удаляли водоструйным насосом, нижнио использовали для последующ« измерений.

4. Определение ДК. ТК проводили слектрофотометрически на спектрофотометре С4>-26 (Россия) по измерению поглощения уета-нол-гептановоП смеси (7:1) при длине волны 232 нм, соответствующее диеновым коныегатам (Кес1тпзее1 еЬ а1. ,1984) и при дл!ше волны 2?4 нм, соответствующе кетодиенам (БПУег^ет ег а1., 1953) и выражали в единицах оптической плотности на 1 кг липидов.

Е. Содержание ОШ определяли в хлороформеннои липидвои 8кс-трш:те ка флюоресцентной спектрофотометре Н11асЫ-850 (Шо-ния) при длине волны возбуждения 360 нм и длине волны испускания 440 нм (Е1е1сЬег В. 2. е1 а!. ,1.973) и выражали в относи-' тельных единицах на 1 мг липидов.

е; Определение АРА экстрагированных липидов проводили с использованием стабильного свободного радикалХ-днфенши - пик-рилгидр-агил (Д5ПГ) на спектрофотометре СФ-25 (Россия). Сущность метода заключается в том, что ДОЛГ восстанавливается в реакции с антиоксидантом, при этом оптическая плотность его раствора, измеряемая при 517 нм, резко снижается (Ша71п<1, 1863). АРА выражали в мкмоль гидрохинона на 1 г липидов.

Все получение нами результаты подвергались статистической обработка с ■использованием критериев' Стьюдента и Вилкаксо-на-Манна-Уитни.' Е таблицах приведена средняя квадратическая . •ошибка, а на графиках- величины доверительных интервалов. Связь между псказателями оценивали с помогаю .коэффициента взаимной сопряженности.

Результаты исследования 1. Исследование процессов ГОЛ и отдельных факторов аитклэ-ре^рдоП и акт;!радпкапноЯ гаЕггы у иазгй с саркоиой,

индуцированной PEA.

Е опытах на кипах линий A/Sn и С57В1/Б ВЕедекпе 7,12 - дп-а) антрацена подкожно приводила к возникновению сарком, пдентпцзщированкыз: при гистологическом исследовании клк фибросаркомы. Контрольным животным вместо Д1.ША вводили его растворитель. Для и:следоЕакил использовали тшвотных черев 40 -50 дней после введения канцерогена ( " ранний латентный период") , после появления пальпируемы}: опухолей и животных у которых к етсму времени ес= не появились опухоли ("поздний . латентный период").

Исследование показало ( рис.1), что уровень ДК в печэни мып.:-й Еьсскораковой линии» .составляет в контроле 0,19Г + 0,010, у мыгзй С57Б1/6 - 0,1£6 + 0,010 ед. опт. плати, /ыг липидов. У животных группы раннего латентного периода соответствую Ejtfi показатель повышался до 0,257+0,010 (F<0,01) и 0,223 iO,011 ед. опт. плоти, /мг липидов (F<0,05) ссответсЕенио, а минимальные результаты были получены в период, прэдиествую-цпй появлению фкбросарком: 0,412+0,030 И 0,351+0,014 ед. опт.

- (I

плотн./мг липидов Р<0,01 у Mameft^.'Sn и C57E1/G соотЕетсЕен-но. По-видимому данное явление можно сбгяснить увеличением доступности для инициаторов ПОЛ и прсоксиданюр субстрата окисления -полиненасыценных жирных кислйт содержание которых в данный период канцерогенеза повышается ( Гриневич и соавт. , 1085).

При формировании и Солее поздних сроках роста опухолей отмечалось существенное снижение уровня ДК по сравнению с исходным значением, но по отношению к контролю он продолжал оставаться повышенным в печени мышей обеих лотий. Сходные по направленности' результаты были получены при исследовании ТК. Как ендко из рис. 2, в ранние сроки после введения ДМБА содер--жание ОШ оставалось на урсвне с контрольными животными. Е

Рис. I Влияние дМБ^-индуцирэгакного канцерогенеза на содержание ÄK р печени мыхзй А/fn и C07BI/6 По оси абсцисс - группы животных

По оси ординат - концентрация ДК ( ед.оптич. плоти./иг липидоч

1 - контроль

2 - ранний латентный период •

3 - поздний латентный период

4 - ранний опухолечый рост

5 - продуктичный опухолечый рост

* - досто°ерные различия относительно контроля ( Р<0,05) жх - достоверные различия относительно контроля ( Р<0,01)

г. о

Рис.2. Влияние ДЛБп-индуциропанного канцерогенеза на содержание СИ р печени кыпей A/Sn и C57BI/6

По оси абсцисс - группы животных'

По оси ординат - концентрация Uli1 относит, ед./мг липидоя)

1 - контроль

2 - ранний латентный период

3 - поздний латентный период

4 - ранний опухолевый рост

5 - прогрессивный опухолевый рост

к - достоверные различия относительно контроля { Р<0,05) кх - достовернее различия относительно контроля I Р<0,01)

пзгднкй латентный период этот показатель увеличивался до 1.0? +0,100 (Р<-0,01) 11 0,894 +0,050 отн. ед./липидов (Р<0,05) соответственно у >ядг?Л А /Зп и С57Б1/6. При прогрессироваюш опухолевого процесса отмечалась генерализованная активация .ПОЛ с увеличением з 1,3 раза (Р<0,01) у мыпей А/Зп и 1,6 раза (Р< 0,01) у низкорэковых животных. При этаи вьяЕленз высокая положительная корреляционная связь между величиной опухоли и уроЕкем продуктов липидяой персксвдацни г=0,87; (Р<0,001).

П;-'—г-;эк.чые данные согласуется с результатами других исследователей, сссбгрщпх об интенсивности ПОЛ в печени крыс с опухолями, Индуцированными ДОБА (Кондакова и соавт., 1939)

Исследование антиперекисных факторов глутатионовой системы зашиты показало, что в ранний период канцерогенеза концентрация ЗЗН в супернатанте печени ньаяй С57В1/6 снижается в 1,4 раза ( с 1;42±0,10 в контроле'до 1,21±0,07 мкмоль/г печени у животных с Д!ЕА. В то же время у высокораковых животных соответствую:;^ показатель достоверно не изменялся. В поздний ла-&т=нтнь-й период количество небелкового тиола составило 1,29+0, 1Г; и 1.13+0,03 мкмолъ/г печени (Р<0,01) у иыпей А/5п и С57В1/0 гогтЕет^твенно, а минимальные результаты были получены в продуктивную фазу роста фибросарком: 1,03 + 0,10 и 1,02 ± 0,03 мкмолъ/г печени соответственно.

Активность ГР.в супернатаяте печени мышей С57В1/В достоверно повивалась в ранние сроки канцерогенеза ( с 11,97+1,48 в контроле до 16,00 ± 1,10 нмоль НАДв-Н^/мяя/мг белка в опытной группе; (Р<0,01). ■ У мышей А/Бп ативность фермента не изменялась. Максимальный уровень показателя был зарегистрирован в период формирования опухолей: 30,44 ±2,88 и 24,49 ± 2,20 нмоль ¡1ЛЛ5-Нг/шш/мг белка у низкоракавьк и высокораковых животных соответственно.

В фззу выраженного роста фибросарком активность ГР резко снижалась у кэдмй обеих линий, однако и при этом она оста-

валась достоверно еык уроеня у лнвотныг Ces ДН5А. Сходная динамика активности ГР показана на модели трансплантационного канцерогенеза ( Ланкин и соавт. ,1976).

Исследование АРА лнлидов печени шзей A/Sn в ранн.:й латентный период не выявило достоверных различий иежду кзкт-ролькой и опытной группами. У низкораковых животных созтветс-твуЕЩ1Й показатель достоверно повышался ( с 9,79+ 0,£2 в контроле до 12,8311,10 мкмоль гидрохинона/г липкдов у шикй с ДЫБА; Р<0,05) В поздний период развили ДМБА-индуцированного канцерогенеза, но до появления фибросаркон, отмечалось прогрессивное снижение соответствующего ■ показателя у шшей обеих -линий, а минимальные значения были получены в поздние сроки роста опухолей: 6,02+0, £9 и 6,13+0,70 мкмоль гидрохинона/г липидов 'соответственно у мышей A/Sn и С57Е1/6. Снижение АРА липидое, вероятно, связано с некомпенсированным расходованием антирадпкальных . факторов защиы при прогрессирующем течении свобокораднкалькых реакций. Одним на возможных факторов защпы может выступать^-токоферол, вклад которого в антирадикальную акгиЕНОсть(АРА) липидов составляет более 60?. (Бурлакова, 1S75). Известно, что этот антиоксидант регенерируется в микросомам печени восстановленным глутатионэм (Sitson et al.,1980) концентрация которого при канцерогенезе, как было отмечено высе, значительно снижается.

Таким образом, 'получена данные,свидетельствующие о выраженном нарушении сбалансированности в действии систем, отве- , чающих, С одной стороны, за генерацию свободных радикалов и липоперекисей и, с друг7?< - их эффективную элиминацию и де-юксикацию при развитии ДОЕА-индуцированных опухолей. Наиболее отчетливо эти изменения проявляются у мысей высокораковой линии т. е, ' устаксЕленз генетическая зависимость уровня исследуемых показателей.

г. с1кнгдшя FAK клочкол железы У ШВЕЯ ЛИНИИ A/Sn. ВОЗРАСТНЫЕ

И31ЕНЕ5ИЯ Л»'ЧЛЕШХ ПОКАЗАТЕЛЕ!! У шшея енхксракоюл И

¡з;ж-рау.обсп лигам.

■Одной из наиболее близких по отношению к человеческой ситуации глоглчестЕ°нного роста является спонтанны? опухоли у животных. В опыте использованы шил линиии A/Sn, самки с раком молочной железы (. подтверждено гистологически). Помимо живот-ню: с опулоллил, э работе использовали также санок мышей вы-сог-ораковзй линии A/Sn и низкораковой С57В1/6 разного возраста; Г. -3 нес.;. 6-7».«с.; 12-15 мес.

На рис. 3 представлены результаты исследования продуктов ГОЛ -ДК р пзчени нитей A/Sn и С57Е1/6 в процессе старения, а также при ЕогнгкксЕетт и развитии у самок A/sn спонтанного рака молочной жале?«. Уровень Дк у мышей A/Sn и C57B/S достоверно ст;гася в сред'-е-вэграсткоП период на £2,7' (Р<0,05) и 2B,8t (Р, 0,01) гоотт^тстгенно. У 12-ти месячных мышей С57В1/6 этот показатель Сиг. кз одном уровне с 6-месячными животными, но в гг. л" вр--1«я т?г.тог?рво повышался у швей A/Sn (Р<0,05). У епухсшнегупшс животных с небольшими опухолями (" массой до 3 r'i ¿-ревень Д!' существенно не изменялся, но повышался до максимальных значений: 0,305+0,022 у мышей с крупными опухоля-!..~ч'3-10 г) з ср.ичении с 0,255+0,016 еД. ОПТ. плотнЛмг липидов в контроле (F<0,05).

' Сходные по направленности, однако менее выраженнные результаты получены при анализе ТК.

Как видно ::? рис 4, содержание ОШ в печени мышей С57В1/Б в процесс? старения существенно не изменялось. Тогда как у вы-ссксракогих изустных этот показатель значительно увеливался соста-внв: 0,810 +0.0:0; 0,913+ 0,046; 1,074 +0,100 отн. еД. /мг липидов у 2-х, 5-ти и 12-месЪчных животных. У опухоленесудах

ШС57В1/6

Рис. 3. Динамика содержания ДО в печени мышей к/ п и С57В1/6 различного возраста и при развитии у самок ыыпей п/5п спонтанного Pbl.it

По оси абсцисс - группы животных

По оси ординат - уровень ДК ( ед. оптич. плотн./мг липидоч)

1 - молодые животные ( 2 -2,5 месяце«)

2 - средний возраст ( 6-7 месяцев )

3 - старые животные ( 12-13 месяцев )

4 - животные с опухолп/и кассой менее 3 г.

5 - ки»отные' с опухолями массой более Зг. ■

к - достоверные различия относительно контроля ( Р<0,05) ** - достоверные разяпия-относительно контроля ( Р<0,01)

0.0

шэсзтвив иа^п

1 2 3 4 5

Ряс. 4. Динамика содержания ОШ « печени мышей А/5п и

СС7В1/6 различного возраста.и при разлитии у самок кывей

¡\/$п спонтанного РМЖ '

По оси абсцисс'- группы животных

Ло оси ординат - концентрация СИ ( относит. ед;/мг липидоя)

1 - молодые пилотные ( 2 -2,5 Месяце« )

2 - средний возраст ( 6 -7 месяцев )

3 - старые животные I 12- 13 месяцев )

4 - животные с опухолями Яйссой менее 3 г.

5 - животные с опухолями массой более 3 г.

* - достоверные различия относительно контроля ( Р<0,05)

ишей с небольшими опухолями ( до 3 г ) содержанке СИ находилось на уровне этого показателя у животных предраковой группы, но достоверно повыиалось у иышей с опухолями более 3 г ( с 1,074 +0,100 до 1,422 +0,080 отн. ед./иг липидое; г=0,ь8 +0, 032 ).

Представленные данные показывают таким образои, что при старении шшей А/Бп интенсивность пероксидации липидов повивается^ а генерализованная активация ЮЛ наблюдается в период продуктивного опухолевого роста У мывей С57Е1/6 уровень ШЛ с возрастом не повышается. Эти результаты отражает, вероятно, более выраженное увеличение метаболической активности печени высокоракрвых животных в процессе старения. Известно, что интенсивность свободнорадикальных процессов повивается с увеличением мэтаболической активности органов (Иартынекко и соаЕт., 1982; косою и соавт. ,1983).

При исследовании антиперекисных факторов глутатионоЕой системы защиты было установлено, что активность Г? в суперка-танте печени мышей обеих линий с возрастом практически не изменяется (Р>0,05). У опухоленесусдх животных активность фер-изнта снижалась. Особенно характерны эти изменения для шшей с опухолями более З'г (Р<0,02).

Концентрация й5Н у мышей А/5п почти не изменялась в средневозрастной период по сравнению с этим показателем у - молодых животных (Р>0,05), но- значительно снижалась у 12-месячных мышей ( с 1,42+0,10 до 1,12+0,06 мкиоль/г печени;Р<0,05), а минимальные значения были получены в продуктивную фазу роста опухолей ( 0,82 ¿0,07 мкмаь/г печени. Возрастная динамика количества ЕЗН у "йпухолерёзпетентных" мысеЯ С57Б1/6 близка к вьше описанной. Снижение восстановленности глутатиона при старении и росте спонтанных опухолей обусловлено, вероятно, недостаточной активностью ГР, необходшзй для поддержания

Рис. 5. ЛРЛ хипиди« печени мшей А/ л и Со7В1/ф различного

возраста и при рост»- спонтанного РИД у мшей А/$п

По оси врлмтт - 5-Р\ ли пи нов ( мкчоль гицоохийонч / г печени ГЬ осч aScrrcc - группы животных

1 - '."олояые жипотные' ( 2 -2,5 месяцев )

2 - слеаиий позэтет ( 6-7 месяцев )

3 - стчгме животные ( 12 -13 месяцев ) •1 - пчнниЯ опухолевый оост

.5- ппоггессивный опухолевый тост

х - цостовепные тзличия относительно контроля ( Р<0.05) -хх - г,остов9гные пчзличия относительно контооля ( Р<0,01 )

последнего в восстановленном состоянии. У животных-опухолено-сителе.й зтот процесс монет Сыть связан с усиленный рассхзды-ванием небелкового тиола для возмещения недостатка других природных анткокндантов. Иг литературы известно, что в условиях дефицитах- токоферола имеет место адаптационное усилие расходования глутатиона (' Пектск и соагт., 1&89).

Нами 6ало проведено исследование АРА яипидов печени б процессе старения кашей низкораоковой и выкокораковой линий и при появлении и развитии опухолей молочной железы у мышей A/Sn (рис.S). Исходный уровень показателя у 2-месячных животных составил 11,52+1,12 и 12,15+1,32 мкмоль гкдрохикона/г липидоь у мыней A/Sn и С57В1/6 соответственно. У старесчге животных (12-15 месяцев) АРА липидов снижалась до 8,32+0,50 у иьсяй линии C5SB1/6 (Р<0,05) и до 6,61iO,Sl у линии A/Sn (Р<0,01). У животных опухсленосителей с массой опухоли Солее 3 г соответствующий показатель снижался до минимальных значений (. 5,20±0,47 1йсмоль идрохинона/г липидов,(Р<0,01).

Снижение АРА липидов в процессе старения и роста спонтанных новообразований, очевидно, обусловлено истощением антирадикальных факторов защиты, природа которых однозначно не установлена; определенную роль здесь может играть^-токоферол (Ка-нуго, 1932; Jonanetean. ,1981).

Таким образом можно заключить, что возрастные изменения интенсивности генерации свободных радикалов и липоперекисей и надежности системы защиты в печени высокораковых мышей A/Sn скомпенсированы не полностью. Особенно демонстративно зто явление у животных с рас?*цщш опухолями молочных желез. Механизмы прооксидактного действия в печени шаей С57Е1. 6 м=нее эффективны.

- 21 -

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСТРЕМАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА СОСТОЯНИЕ ШЛ 5'

«ИЛЕЙ, СШОЗИГШХ Ш СПОНТАННОМУ ЕЛАСТОЮГЕНЕЗУ

В работе исйпльзованы мыши линии А/Бп и С57Б1/6," полученные из опытно-племенного питомника КИЛ ЭВМ РАНН; доставка из г. Москвы в г. Томск осуществлялась самолетом; исследования проводились на 1 -е,3-и,7-е и 14-е сутки после перевозки." В, 1-3 -и сутки адаптации происходит с умственное увеличение концентрации ксртикостероидов. ( 11-СКС) в крови у мышей обеих линий, причем' амплитуда реакции боль се, а период восстановления длительнее у мышей вьеокораковой линии. Уровень. Ш у высокорасквых животных достоверно повышался только на 1-3-и сутки после перелета и составлял в среднем 14451 и 69Х от уровня контроля. Достоверный '.прирост ОТ наблюдался на 1-е,3-й,7-е сутки постстрессорного периода. Интенсивность ШЛ у мышей С57В1/6 в названные сроки адаптации носила менее выраженный характер. Показано также, что на 1-е сутки после перелета у мышей обеих линий достоверно повышалась активность глу,алгнор:'Дуктагы, но резко снижалась до нормы к 3-им суткам стресс-реакции. Концентрация восстановленного глутатиона снижалась на 1-е сутки, продолжала оставаться на атом уровне черев 7 суток адаптации у мышей С57В1/6 и до конца наблюдений у Еысокораковых животных.

При исследовании корректирухщгго влияния препарата гимоптина на стрессиндуцированпые изменения в интенсификации ШЛ в печени мыаей выс'окораковой линии выявлено, что тимоптин оказывает выраженное нормализующее влияние на уровень продуктов ПОЯ Так уже на 3-й сутки после перелета не обнаруживалось накопления ДК и ТК, а после 7-х суток увеличения концентрации ОН В основе .такого эффекта препарата, вероятно, лежат его . антиоксидантные свойства. Вместе с тем использование ияноптина приводило к повышение активности глутатноредуктазы и нормали-

-22 - •

ввции уровня восстановленного гдутатвона к 3 суткам адаптации. Полученные результаты согласуются с данными литературы о проявлении аятиоксидактной активности препаратов тимуса, полученных на других моделях стресса (Сапов с соавт.. ,1587; Лука-шова с соавт. ,1890; Шиутов, 1990).

Отмеченные свойства тимоптйна позволяли надеяться на высокую эффективность его применения на ранних этапах канцерогенеза, _ которые, как было показано выше, сопровождаются значительной интенсификацией ПОЛ и снижением антиперекисных и антирадикальных факторов защиты. Действительно, ежемесячные профилактические шгьекции тимоптина ( в дозе б мкг парентб-рально), начиная через 1 месяц после введения ДЦЕА приводили к существенному снижению' выхода индуцированных опухолей у мы- -шей A/Sn. При ■ атом процент животных с опухолью в контроле составил через 4 месяца 225, на 5 -Й 34Z и на 6-ой -61%, тогда как у животных, получавших корректор, соответственно: 10,15,40Х. Кроме того тимоптин значительно тормозил скорость опухолевого роста и увеличивал продолжительность жизни опухо-леносИтелей.

Таким образом, анал)!эируя полученные результаты и данные литературы о нормализующем влиянии тимоптина на процессы ПОЛ при^ стрессе, а также принимая во внимание результаты наши" исследований о значительной интенсификации лшадной■ перокси-дации и снижении антиоксидантного потенциала на фоне экспериментальных опухолей вполне правомерно предположить, что одним из механизмов противоопухолевого действия тимоптина является коррекция ГШ и антиэксидантнсй активности.

шведа

1. У высокоракзЕи:. иышай. A'Sn при старении обнаруживается нарастание стационарной концентрации начальных, промежуточных

л конечных прсд^тасв перекисного окисления липидов и снижение антиокскдзнтных резервов печени. У мышей низкораковой линии С57Е1/Р дачние показателя с Еозрастом не изменяются.

2. При росте {фонтанных опухолей молочных желез у мазей'А-. Зп активизируются процессы липидной пероксидации и снижается активность антиоксидалтных факторов защиты.

3. В латентный период химического канцерогенеза в печени ЕЫссгаракоЕнх иыпей A/Sn интенсифицируется перекисяое окисление липидов, проявляющееся в повышении уровня Продуктов ли-пидной пероксидацпи. У низкораковых мыпей С57Е1/6 указанные изменения носят менее выраженный характер.

4. При развитии фибросарком происходит снижение уровня знтнп«р5!-:!снг.й и антирадикальной защиты печени с одновременным нарастанием интенсивности липспереокислительных процес-

5. Ллпидная персксидация, наблюдаемая у животных с хими-чеега nnrjn^rcnaHMirci и спонтанными опухолями имеет положи-те^мул • -лг.циснную связь с размерами первичного опухолевого н-'ttc

с. .Ч'-'тгч.-чгЕно^ть перекисного окисления липидов на стрессовое sosjeftcTE«? у '«ьшей оппозптных по предрасположенности к злокачественному росту, неодинакова. Интенсивность его вывэ у BtECKOpaKDBOft линии.

7. Препарат тимуса тимоптин предупреждает чрезмерную активацию перекисного окисления липидов в печени высокоракогой линии А/5п при стрессе и тормозит развитие химически индуцированных опухолей.

Список работ,опублпкоЕзнных по теме дисссертации: 1. Dependence reactions of »nranity factors to extremal influence from genetic, predisposition and typology of nervous / V. V. Vasjlyev, V. l.Ofreba, T.I. Kolyda, S.A. Slankevih et al

- 24 -

// Тезисы докладов Европейской иммунологической конференции. Загреб, Югославия. - 1987. -Н10-49. -Р;65

2. Гормональные механизмы иммуноре'гуляции и состояние системы иммунитета у животных с различной предрасположенностью к спонтанному бластомогенеау в норме и в условиях экстремального воздействия /соавт. В. И. Огреба, С. А-Кусмарцев, Н. Е Чердын-цева, С. А. Станкевич // Тез. докладов 4-го В:есосзного симпозиума" Регуляция ч^иунного гомеостаэа, Суздаль 1986.

3. Особенности стресс-реакции на субэкстремальные воздействия у линий мышей, оппоаитных по спонтанному бластмогенеау / соавт. Е И. Огреба // Актуальные вопросы стандартизации лабораторных животных для медико-биологических исследований. Ы.,1988. С. 163-165. ' . -

4. Сравнительная характеристика функционального состояния Т-и Е-клеточного авеньев иммунитета у линий животных, оппоаитных по спонтанному бластомогенезу / соавт. Е И. Огреба,' С. А. Станкевич,С. А. Кусмарцев.Е А. Терновой // Бы. зксперим. биол. и мед.'. -И., 1989,- 44С. ВМЕНИ 20.01. 69, Н 481 Е5Э

Б. Взаимосвязь Т-звена иммунитета и глюкокорхикоидной функцни надпочечников у линий мьшей, оппозитных по спонтанному бластомогенезу на этапах адаптации животных к климато-ге-ографическим условиям Сибири / соавт. И. И. Огреба, С. А. Станкевич, , Е А. Терновой, И. Н. Дауркина, Г. И Смагин. // Актуальные Проблемы онкологии. -<Еып. 7. -Томск, 1989. -С: 21-30.

6. Перекикое окисление липидов печени мышей с различной онкологической характеристикой на этапах 7,12-ДЦЕА-1шдуцнро-вансго опухолевого роста / соавт. в!И. Огреба // Лаборатоные «шоткие для медкко-биологических исследований-11 ,3960. -С. 126.

?. Иьыунск^гтектори природного происхождения'и перспективы их пр;шекгн;:я в гериатрии .' соавт. Е. П. Сгреба . Гериатричее-

кт средствз; экспериментальный поиск и клиническое применение.-Киев, 1990. -С. 181-182.

8. Интенсивность перекисного окисления липидов и состояние антиоксидзнтньв: систем печени (.ьгией . в условиях нормы и на этапах 7, 12-ДНЕА-индуцированного канцерогенеза /соавт. Е И. Огреба // Взаимосвязь нервной л иммунной систем. -Л. -Ростов-на-Дону, 1990. -0.182-183. '

9. The - effect of tranmsridicnal flight on antitumor resistance / П. V. Cherdyncev3 N. V. Vasiliev V. I. Ogreba // Тезисы докладов 1ей конференции стран Балтии.- Киль (Германия), 19Q2'