Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Индуцированный микроволнами синтез фрагментов ДНК в нейронах коры головного мозга

ГОССйЙЖАЯ АЩЕМ НАУК НЕШШТ БЮШЗ НЕЕВЕОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ЕЕЙЕШ13К010ГИИ

На правах рукописи УДК 612.825.014 : 615.849.II

ТвэрскоЕа Наталья Бэдшяеез

ИЩУЩРОВАНЕЫЙ ШЮШШШ СИНТЕЗ ФРАШОТОЗ ДНК В НЕЙРОНАХ КОШ ГОЮБЖГО КОЗГА

14.00.1? - норальная физиология

Автореферат

дгссертают на соаоканле ученой степени кандидата мэднргаскиг паук

Москгл - 1394

Ой

Работа' выполнена в физиологической лаборатории экспериментального отдела Российского научного центра реабилитация я физиотерапии Минздрава РФ

Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор

O.A.. Крылов

.Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, доктор философских наук, профессор Р.И. Крумпшда; доктор биологических наук, профессор H.A. Тушмалова

Ведущая организация : Институт нормальной фвшологяя ем.

П.К. Анопгеа РАМН

Зэдита состоится I июня 1994 года в часов на заседании специализированного совета Д 003.10,02 Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН по адресу: II7865, г.Москва, ул. Бутлерова, 5-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Автореферат разослан ■ " 1994 г.

Учений секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

H.H. Лебедева

ОЩАЯ ХАРАКТЕШСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность работы. Сегодня становится очевидным, что ведущая: роль нервной системы в ответе организма на действие факторов среды обусловлена особыми формами функционирования генома нервных клеток./О.А.Крылов, В.С.Тонгур, Р.А.Данилова, IS65; O.A.Крылов, 1966,1979,1982; Н.А.Тушмалова, 1973; О.А.Крылов, Е.П.Кочегарова, 1974; О.А.Крылов, З.А.Соколова, К.И.Федорова, 1978; В.В.Аиапкин и др., 1981,1983/. Результаты целого ряда молекулярно-биолотачес-ких исследований свидетельствуют об исключительно;! транскрипционной активности ядерной ДНК нейронов мозга у млекопитагацих / Hahn, C.DjLaird, 1971» .L.Crouae et al,,1973; W.E.Hahn et al,1982/. Есть основания считать, что усиление генной экспрессии и расширение спектра актйвно функционирующих генов являются не единственно возможными мёханизмами, определяпдоя способность нерЕных элементов избирательно реагировать на различные раздражители.

На протяжении двух последних десятилетий исследователи сталкиваются с фактами интенсификации синтеза ядерной ДНК нервных клеток при различных внешних воздействиях, а такяе обучении / s. Heinis, i9724 1985; S.Heinis, R.W.Lamble, 1972; S.Heinis et al., 1972 /. Особенйо наглядно этот процесс демонстрирует включение 3Н тимидива в ядерную ДНК нейронов головного мозга, которое усиливается не только при травмах мозга, оперативных вмешательствах на органах чувств /О^А.Крылов, Е.П.Кочегарова, 1974; Е.П.Кочегарова, 1980/, но и при выработке условных рефлексов /В.В.Ашап-етн, 1983; В.В.Ашапкнв и др., 1981, 1983/.

Такое включение меченого предшественника ДНК не мозет быть связано с пролиферацией основной массы нейронов головного мозга взрослых млекопитающих, его объясняют либо амплификацией какое-то фрагментов генома, либо репарацией ДНК.

- г =

Нет сомнений в том, что микроволны, наряду с ультрафиолетовым, рентгеновским и гамма- излучениями, способны активно воздействовать на геном клеток. Много лет ведётся дискуссия о возможности мутагенного действия микроволн. Среди людей, подверженных хроническому воздействию микроволнами вероятность различных онкологических заболеваний очень высока /з.Бгт1в1е1ак1, 1993 /. причем опухоли моога встречаются чаще других новообразований /Ь.О.БаЗ.-гогй еь а1., 1993 А что, вероятно, отражает особую чувствительность ядерной ДНК нейронов мозга к внешним воздействиям вооб-це к к действию микроволн, в частности,

Исследования на уровне функционирования генома нервной клетки позволят более полно оценить роль микровода как экологического (Тактора, а также возможности их использования в практической медицине .

Цель и задачи. Целью настоящей работы было определить способность микроволн индуцировать в нейронах коры головного мозга синтез ядерной ДНК и выявить его особенности.

В ходе исследования решались следующие задачи.

1. Изучить влияние микроволн различных интенсивности щ синт-тез ДНК неокортекса.

2. Выявить специфику действия микроволн на синтез ДЩ неркорг текса в сравнении с действием экстремальной физической нагрузку,

3. Определить, какая из клеточных популяций коры головного мозга, нейрональная или нейроглиальная, отвечает на действие исследуемых физических факторов изменением синтеза ядерной ДНК,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые обнаружен факт синтеза ядерной ДНК нейронов кори головного мозга в виде репликации фрагментов гено-:.:а в ответ на действие физических факторов.

Установлено, что обнаруженная форма реагирования генома нерв-

ных клеток имеет общность Ш специфику для различных воздейстшй; в частности, показано* что синтез ядерной ДНК нейронов имеет строго дифференцированный характер в случае действия микроволн л является равновероятным для различных участков генома после экстремальной физической нагрузки.

Выявлены наиболее эффективные дая наблюдае!дых функциональных изменений ДНК нейронов интенсивности воздействия микроволнами /40-80 мВт/см2 при экспозиции 10 минут/.

Показано, что функциональные изменения генома в ответ на действие физических факторов являются исключительным свойством нейронов коры головного ¿лозга, но не присущи клеткам нейроглии.

ПРАКДЭДСШ,.1Ш10СТЬ. Результаты работы обосновывают необходимость более строгого и тщательного подхода к подбору оптимальных интенсйвностей микроволнового воздействия в физиотерапевтической практике< ориентируя клинические исследования на их снижение. Полученные данные поднимают вопрос о целесообразности воздействШ факторамй З'Й микроволнового диапазона на головной мозг без глубокого изучения последствий индуцированных микроволнами генетических изменений в клетках ЦНС на уровне современной молекулярной биологйь

йОЛШШ, ЖОСЮШ НА ЗАЩИТУ

1. Особенностью функционирования нервных клеток коры головного мозга является спонтанная репликация фрагментов их ядерной ДНК, которая коррелирует с интенсивностью и спецификой поступающей афферентацяи.

2. Характер репликации фрагментов ДНК в нервных клетках коры головного мозга определяется качеством раздражителей: в отзет

на действие микроволн реплицируются фрагменты уникальных и мало-повторящихся последовательностей копий нуклеотидов, тогда как

после экстремальных физических нагрузок реплицируются преимущественно фрагменты ДНК с высокой повторяемостью нуклеотидных последовательностей.

3. Синтез фрагментов ядерной ДНК нейронов коры головного моз-' . га в отпет на действие различных раздратштедай мояет, рассматри- ! езгься как способ передачи генетической информации, из .одной нерв-; по it клетки в 'другую, а также в --клетки- улаи, - соэдаиий общую. кар^ тину метаболизма- доминирующего' пула клеток мозга, отраяалцего реакции нервной системы на внешнюю среду. ' -' V-■'"/!';.-Л';':"'':';

АПРОЕАШЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИЯ. Материалы диссертации долоаены .. н?.."Tile first World congress for Electricity end Magnetism in'':■.:•;-'; Biology and Medicine" / Orlando, Florida, USA, 1992 /; 2 nd Inter- . r.ational Scientific Meeting "Microwaves in medicine" / Rome, Italy, 1993 /; 2 nd Congress of tbe Europeon Bioeleotromagnetica . association /.Blend, Slovenia, 1993 f\ итоговой научной сессии' \ РЩ реабилитации и физиотерапии /Москва, 1993/." '; г г.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции ; экспериментального отдела, отделения функциональной диагностики и клинической физиологии и отделения физиотерапии РНЦреабилита-•ции и физиотерапии Минздрава РФ. . .

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа изложена на ..'. IC5 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. ' . "исссрташя иллюстрирована 16 рисунками и 8 таблицами. Библио-rr.rj;;:ieciaiii указатель содержит 28 отечественных и 104 иностранка; работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование проведено на 560 нелинейных белых крысах самцах весом 150-180 г. Животные содержались в стандартных условиях.

Для облучения дециметровыми волнами /ДМВ/ с частотой 460 МГц использовали генераторы электромагнитных сигналов "Ромашка" и "Г4-37 А". Крыс помещали в специальный станок и облучали с помощью контактного цилиндрического излучателя БЯ 2 093 292 диаметром 40 мм, который ориентировали вдоль осевой линии тела и плотно накладывали на голову крысы. Плотность потока мощности /ПШ/ составляла 10, 40, 80, 260, 1000 мВт/см2 /УШ - 0.9, 3.3, 6.2, 21.6 и 81.0 Вт/кг, соответственно/, длительность облучения - 10 жнут.

В экспериментах с экстремальной физической нагрузкой крыс вынуждали плавать с закреплённым на хвосте грузом, вес которого составлял 6 % о? веса тела крысы. Процедура проводилась в ванночке из оргстекла /30x30x50 см/, наполненной водой комнатной температуры. Животные плавали по-двое в течение 5-7 минут, до тех пор, пока не начинали уходить под воду. В этот момент их извлекали из ванночки. Если извлечение производилось несвоевременно, то крысы быстро тонули и погибали.

Для опыта и контроля брали животных из партии одного привоза, содержащихся в одинаковых условиях, контролем служили пнтактные крысы.

После проведения процедур ДОВ-облучения и плавания с груз контрольные и подопытные крысы оставлялись на 3 часа, после чего животных обоих групп декапитировали. В случае исследования вздао-ченля 3Н гимидина в ДНК клеток коры головного мозга крыс забой также осуществлялся через I, 2, 5 и 24 часа после отмены облуче-

' ния. Мозг быстро извлекали и фиксировали в 80 £ этаноле.

Выделение ДНК из неокортекса крыс осуществляли методом Марму-ра с некоторыми модификациями /В.В.Ашапкин и др., 1Ь'81/.

Анализ кинетики реассоциацип ДНК неокортекса крыс si-тючал фрагмеитирование ДНК, денатурацию ДНК, реассоцнацпю ДНК и хрома-тографическое разделение однонитчатой и дсунитчаго;; ДНК на колонках с гидроксиапатитом /ГАП/. Реассоцаации ДНК осуществляли путём ее инкубации при различных концентрациях натрпй-^ос^атного буфера /НФБ/ и определенной температуре до выбранных значений Cq£ , где С0 - концентрация ДНК в молях нуклеотидов на литр,

t - время в секундах. Дяя расчета C0ii использовали следу-лдее со-отноше1ше: GQzf = I, если CQ= 83 мкг/мл, £ = I ч, концентрация НФБ - 0.12 М /r.j.Britten et al,, 1974/.

C0!i = [ДНК1 l инк. К 83

где [ДНК] - концентрация ДНК в мкг/мл, t инк. - время инкубации в часах, К - константа относительной скорости ренатурацга в данном НФБ. Оптимальной температурой для реассоциавди является

t инк. = пл. - 25°, где i- инк. - температура инкубации, пл. - температура плавления ДНК в данном буферном растворе. Для определения последней пользовались расчетами Бриттена. Вычисленные температуры инкубации составляли: 54° для 0.04 НФБ, 62° для 0.14 НФБ и 69° для 0.4 В6Б.

Пробы ДНК реассоциировали до определенных значении CQi- путём подбора подходящей комбинации параметров, учитывая следующее. При инкубации до CQl = 5 10~2 успевают ренатурировать только высокоповторенные последовательности /сателлиты/, составляющие у крыс около. 17 % от всей ядерной ДНК. При дальнейшей инкубации до CQt = 500-600 реассоциируют умеренно повторённые в геноме последовательности, при еще более длительных инкубациях до

i 3 4

со 10 происходит реассоциация уникальных последовательностей, которая не завершается даже при очень длительных инкуба-циях.

Анализ кинетики реассоциации высокоповторятаихся последовательностей ДНК проводили при CQt = 0.1, так как при этом значении CQi успевало реассоциировать 16.I % ДИК интактных аивотных. Для определения включения 3Н тимидина в ДНК неокортекса

крыс препарат 3Н тимидина /удельная радиоактивность 760 ТБк/ 1 ■ / моль, Россия/ инъецировали внутрабрюшинно контрольным и подопытным животным за 3 часа до начала процедур облучения или плавания в 0.3 г.их физиологического раствора по 0.25 мКи на крысу. Радиоактивность меченой ДНК /в имп/с / измеряли на счетчике в-сцинтил-лядай /"Бета", СССР/ в 10 мл смеси, содержащей известное количество ДНК, растворённой- в 0.5-1.0 ni 0.01M натрий-фосфатного буфера с рН 6,8, л даопсалрвкЗ сцинтиллят /ЛД.Остеййш, 1983/. Счет радиоактивности ТЩ производили^ не позднее двух недель со да- инъегедга 3Н тимидина крысам.

Разделение фракций нейронов и нейроглии проводили по .».тетоду Селлинджера /o.z.SelXinger et el., 1971 / с модификациями Флёрова ДЬА.Флёров, 1282/. Чистоту полученных фракций контролировали с помощью световой микроскопии. Нейрональная фракция состояла из пирамидных нейронов и практически не содеркала глиалышх клеток. Глиальная фракция состояла яз.глиалышх клеток, а также содержала некоторое количество неклеточных примесей в виде об-рывкоз капилляров, шелина и т.п.

Для нггдзрешш радиоактивности фракций нейронов и нейроглгш к клеточным осадкам добавляли по 0.5 мл физиологического раствора и определяли концентрации клеток в суспензиях подсчетом^ камере Горяева. Гидролиз нейронашла и глиальннх фракций осуществляли

15-20 минутным кипячением в 5 % НС104, после чего гидролизаты доводили до 10 мл диоксановым сцинтиллятом и измеряли радиоактивность.

Концентрации очищенных, негидролизованных препаратов ДНК в ■ растворе определялись на спектрофотометре "Berkin-Elmer - 550 " по величине поглощения при 260 нм. О чистоте ДНК в растворе судили по отношению Д260/Д280, оценивая таким образом степень освобождения препаратов ДНК от примесей беЛка. , Это отношение всегда доводилось до I.8-I.9.

Достоверность цифровых различий оценивалась по критерии Стью- ■ дэкта i . Но вычисленному значению t и соответствующему зна- , чению степени свободы F определяли вероятность ошибки Р по , таблице Стьюдента-Фишера. Разнит считалась.достоверной, если . уровень значимости не превышал 5 % /р<0.05/. •

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. I. ВКЛЮЧЕНИЕ У3Н ШДЩ В ДНК . .'' НЕОКОРТЕКСА КШС В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ МИКРОВОЛН.

I.I Отработка экспериментов с использованием 3Н ткшдина. '-:

Выполнению данной части исследования предшествовало немалое количество предварительных опытов, целью которых бида отработва ■ оптимального реяима экспериментов. Основной слостостьп.яишлооь отыскание временного соотношения между процедурами обдучеЕЗЯ С» вотных и внутрибрюшинным введением им 3Н тимидана, что ÖUEQ " необходимо для правильной оценки действия микроволн,.Ддз цщол-нения этой задачи учитывалась кинетика' включения-' 3Н .'.тдаидава- ■ ь структуры мозга крыс после внутрибрюшинной инъекции, Ешю во—"' казано /В.В.Ашапкин, 1983/, что удельная радиоактивность, отрук- •. тур мозга достигает максимума приблизительно через 3 часа», а .в I

ос-сей .сложности возрастает в. течение 4-5 часов после инъекции, \ озираясь затем без изменений. Поэтому все последующе экспери-

менты с использованием 3Н тимидина строились таким образом, чтобы облучение животных проводилось по истечении трёх часов от момента инъекции 3Н тимидина, когда кривая изменения удельной радиоактивности ДНК выходит на плато. В этом случае удельная радиоактивность ДНК неокортекса может служить показателем интенсивности её синтеза в ответ на действие микроволн.

1.2. Включение 3Н тимидина в ДНК неокортекса крыс в ответ на действие шкроволн различных интенсивноотей и экстремальную физическую нагрузку. Данная серия экспериментов была выполнена на 144 крысах. Сравнивались показания удельной радиоактивности по трём контрольным и трём опытным пробам ДНК для пяти параметров облучения, а также экстремального плавания с грузом. Каядая проба ДНК выделялась из неокортекса 4-х животных. Забой контрольных и подопытных крыс осуществлялся через 3 часа после .ЩВ-обду-чения или плавания.

Было установлено, что после облучения микроволнами с интенсивностью 40, 80, 260 и 1000 мВт/см2 /УПМ - 3.3, 6.2, 21.6 и 81.0 Вт/кг, соответственно/, а также экстремальной физической нагрузки в кавдом случае происходит достоверное увеличение включения 3Н тимидина в ДНК неокортекса крыс. Наибольший рост удельной радиоактивности ДНК неокортекса, в 1.88 и 1.71 раза,. происходил при облучении микроволнами с ППМ 40 и 80 мВт/см2, тог. да как при воздействии с ППМ 260 и 1000 мВт/см2 рост удельной радиоактивности ДНК составлял, соответственно, 1.15 и 1.26 раза. Воздействие микроволнами с интенсивностью 10 мВт/см2 /ЭТИ - 0.9 Вт/кг/ не вызывало достоверной индукции синтеза ДНК в неокортек-се крыс через 3 часа после облучения /табл.1/.

Включение 3Н тимидина в ДНК неокортекса крыс через 3 часа после процедуры плавания с грузом возрастало в 1.51 раза.

Табл.1. Включение 3Н тимидана в ДНК неокортекса крыс через 3 часа после воздействия микроволнами различных интенсивностей или экстремальной физической нагрузки.

Удельная радиоактивность ДНК, имп/с на 100 мкг

Опыт . Контроль р

М ±т п. М 1Ä п.

Облучение микроволнами ПИЛ /мВт/см2/

10 10.41 ± I.I2 : 3 . 10.10 * 0.52 3 >0.05

40 11.55 ± 0.99 3 6.15 ± 0.26 3 <0.001

80 35.43 ±6.72 3 20.74 ± 0.39 3 <0.05

260 18.32 ± 0.42 3 15.94 ± 0.18 3 <0.001

IQ00 18.24 * 1.44 3 14.43 ± 0.31 3 <0.05

Экстремальная физическая нагрузка /шшвание с грузом/

15.0 ± 0.20 . 3 9.95 ± 0.41 3 <0.001

1.3. Динамика действия микроволн на включение 3Н тимияила в ДНК неокортекса крыс. В этой серии экспериментов было исполь- • зовано 104 крысы. Исследовалось включение 3Н тимидана в ДНК неокортекса крыс в разное время после облучения животных микроволнами с интенсивностью 1000 мВт/см^. Было проведено 5 экспера-

■ ментов, в которых временной промежуток между отменой облучения

■ и началом забоя составлял I, 2, 3, 5 и 24 часа. ■ '

Достоверное увеличение включения 3Н тимидана- в ДНК неокортекса крыс наблюдалось не ранее 3-х часов после облучения микроволнами с интенсивностью 1000 мВт/см2 /УШ - 81.0 Вт/кг/. Результаты, полученные в ходе различных экспериментальных серий, в которых животные подвергались воздействию микроволнами с ин-

тенсивностью 1000 мВт/см? показали то максимальный рост удельной радиоактивности ДНК неокортекса в ответ на облучение микроволнами происходит в промежутке от 3-х до 5 часов после воздействия, затем удельная радиоактивность может снижаться, а в случае ДО-облучення с интенсивностью 1000 мВт/см2 - даже ниже исходного уровня.

1.4. Связь зафекта микроволн с фоновым синтезом ДНК в неокор-тексе* Исследование влияния микроволн и экстремальной физической нагрузки ка включение' 3Н тимидина в ДНК неокортекса крыс выполнялось с использованием большого количества биологического материала /около 300 крыс/. Было проведено в общей сложности 30 опытов, в которых оценивался синтез ДНК неокортекса через 3 часа после дав-облучения или плавания. В 21 из 30 опытов значение уровня включения 3Н тимидина в ДНК неокортекса контрольных крыс /фоновый синтез ДНК/ приходилось на интервал от 6 до 40 имп/с на 100 мкг ДНК, в 9 опытах удельная радиоактивность ДНК в контроле соответствовала интервалу от 50 до 70 имп/с на 100 мкг ДНК. При сопоставлении результатов всех опытных серий стала очевидной зависимость величины эффекта микроволн от состояния синтеза ДНК в день эксперимента. При воздействии микроволнами с высокой интенсивностью /1000 мВт/см2/ исходный уровень синтеза ДНК в неокортексе являлся определяющим: при его максимальном значении эффект микроволн был неоднозначным.

2 .ДЕЙСТВИЕ МИКРОВОЛН НА РЕАССОНИАЩЮ ДНК НЕОКОРТЕКСА КИС.

2.1. Реассоциация последовательностей ДНК неокортекса различной кинетической сложности после воздействия микроволнами.

,Целью данной части исследования являлось определение характера индуцированного микроволнами синтеза ДНК. Для этого проводился анализ кинетики реассоциации ДНК неокортекса крыс, облученных

микроволнами с интенсивностью 1000 мВт/см2. В экспериментах было использовано 130 крыс. Реассоциащя ДНК неокортекса контрольных и облученных микроволнами■животных исследовалась при 16 значениях-^?^ от -I до 3.69, охватывая таким образом 16 различных по кинетической сложности фракций ДНК.

Тенденция к увеличению количества ренатурированной ДНК в ответ на действие микроволн наблюдалась по всему геному. Достоверное увеличение процента ренатурироЕанной 'ДНК по сравнению с контролем наблюдалось, однако, только для умеренно повторяицихся и уникальных полследовательностей при значениях : 2.39,

2.69, 3.0 и 3.13. При значении - 2.39 эффект был макси-

мальным.

Сравнение поэтапного /с увеличением СQt / прироста количества ренатурированной ДНК неокортекса крыс отдельно в контроле и в опыте позволило выявить интервалы значений ^С/ : -0.12 - 1.53, 1.77 - 2.75, 2.94 - 3.10 и 3.57 - 3.69, в которых прирост количества ренатурированной ДНК в опыте был больше, чем в контроле. Выбирая из найденных интервалов те, в которых изменения реассо-циации ДНК были достоверными, можно выделить область значений ¿f С0^ - от 2.0 до 3.0, определяющую кинетическую сложность последовательностей, количество которых растет в ответ на действие микроволн. Это последовательности, повторённые в гаплоидном геноме 10-20 раз и меньше, включая уникальные /рис.1./.

2.2 Реассоциащя ДНК неокортекса крыс после воздействия шк-говолнамд различных интенсивностей и экстремальной физической нагрузки. В этом исследовании было использовано 72 крысы. Сравг нивались изменения кинетики реассоциации ДНК неокортекса крыс в ответ на облучение микроволнами с интенсивностью 80, 260 и 1000 мВт/см2 /УШ - 6.2, 21.6 и 81.0 Вт/кг/ и экстремальную физическую

нагрузку. Реассоциашя ДНК проводилась при трёх выбранных значениях : -1.0, 2.0 и 3.0. Таким образом оценивались количественные изменения ДНК на этапах реассоииашш високоповторйгдася, умеренно повторяющихся и уникальных последовательностей.

Воздействие микроволнами с интенсивностью 80 и 2С0 .•/¿зт/с:/' вызывало достоверное увеличение количества ренатурровагаюй в интервале умеренно повторяющихся и уникальных последов:гтелыгос-тей. ЭЗфект был наибольшим в случае облучения с интенсивность?) 80 мВт/см2 при сравнении с таковым при интенсивности 260 и 1000 мВт/см2, что хорошо согласуется с результатами включения меченого тимидина в ДНК неокортекса крыс после ВДВ-облучения.

В случае экстремального плавания достоверное увеличение количества ДНК наблюдалось по всему геному, при этом эффект был . симальным в интервале высоких повторов и минимальным для уникальной ДНК, что выражалось "спрямлением" кривой реассоциации /рис.2/.

Сопоставление количественных изменений ДНК неокортекса крыс после воздействия ■микроволнами и экстремальной физической нагрузки показало, что рост включения 3Н тимидина в ответ на действие микроволн с интенсивностью 80 , 260' и 1000 мВт/см^ коррелирует с соответствующим каждой интенсивности приростом количества ДНК в интервале уникальных последовательностей, что подтверждает избирательность синтеза ДНК в неокортексе при индукции микроволнами. Наибольший рост суммарного количества ДНК в ходе реассош-ации происходит в ответ на экстремальное плавание, тогда как максимальный уровень включения меченого тимидина наблюдается в случае облучения микроволнами при ППМ 80 мВт/см2 /рис.З/.

3. АКТИВНОСТЬ СИНТЕЗА ЯДЕРНОЙ ДНК НЕЙРОНОВ И НЕЙРОГЖИ В ОТВЕТ НА ДЕЙСТВИЕ МИКРОВОЛН, в экспериментах было использовано 64 крысы. Изучалось включение 3Н тимидина во фрак-

цни не;;ропог и нейроглии через 3 часа после МВ-сйлучения с ин-тснспмюстью 80 мВт/см2, а также после экстремального плавания.

Было установлено значительное /в 3.84 раза/ увеличение включения 3Н тпмздика в нейроны неокортекса крыс после воздействия микроволнами с интенсивностью 80 мВт/см2 /табл.2/. Радиоактивность нейроглиалыюй фракции не менялась в ответ на ДМВ-облуче-1ше и окла в 12.5 раз ниже фонового уровня нейронов. После экстремальной физической нагрузки радиоактивность фракций нейронов возрастала в 2.16 раза /табл.2/, радиоактивность нейроглии не изменялась и была значительно ниге уровня нейронов.

Табл.2. Изменения радиоактивности клеточнше фракций неокортекса крыс через 3 часа после воздействия микроволнами с ГШ 80 мВт/см2 или экстремальной физической нагрузки.

Фракция клеток Радиоактивность фракций. имп/с на 100 х Ю6 клеток'

Опыт Контроль р

Ц ±т М ±т

Облучение микроволнами

Нейроны 682.59 ± 78.49 177.69 ± 58.76 < 0.02

Некроглия 13.80 ± 5.13 14.17 ± 3.38 >0.05

Экстремальная физическая нагрузка /плавание с трузок/,

345.63 ± 20.70 159.82 ± 25.94 <0.02

19.72 ± 4.98 20.98 ± 0.60 >0.05

Нейроны Не.':роглия

'Рис.1. Прирост количества ренатурированной ДНК неокортекса контрольных и облученных ДО крыс в ходе реассоциации. По горизонтальгой оси: £ С^ /в моль с/л/. По вертикальной оси¡прирост количества ренатурированной ДНК для каждого значения С01 в исследованном ряду /в процентах как разница количеств ренатурированной ДНК при данном значении СЬ и нрл ¡п:едц:;ущо:; значении рада. Обозначения: / —»— / - прирост ДНК в контроле, / / - прирост ДНК в олкте, / •/ -р<0,05, - превышение прироста ДНК в опыте ¡од йриросто:.: Д!2С и конгрсле.

-I О I 2 3

Рис.2. Изменения кинетики реассоциаши да неокортекса крыс в ответ на облучение микроволнами е интенсивностью 80 мВт/саг Д./ л экстремальную физическую нагрузку /2./. По горизонтальной оси: ^С I /в моль с/л/. По вертикальной оси: количество рена-турированяой ДНК /в процентах/. Обозначения: / — / - реассоци-ацня ДНК контрольных животных, /-*-/- реассоциадия ДНК облу- , чённых ДМВ животных, /• / - р<0.001т0.05.

: * ДМВ-облучение /плавание с грузом/

йо.З. Д./ Йгкэиеная рзассоцааппи высокоповторявдихся /ВЦ/, уверенно повторящихся /УП/ п уцакяяшпс /УН/ последовательностей ДНК неокортекса крцо чорзз 3 часа поело облучения гадрогол-еи плл ог.отрс:/зльцс11 фззпчсскоЗ цагрузга.По вертикала: количество рзнатурлроьанной ДНК а контроле / -о- /аз охшто /-а-/. /2./ Рост включения 3Н з.ДНК неокортекса крыс / О /

а рост суммарного количества ДНК в ходе реассоциации / ЕЗЗ / поело еоздсйстезя ?гпфо?олна!.ш или экстремальной фззаческой нагрузка. Су?.?зрноа количество ДНК витасдядось пах суи.а значений реассоциации ДНК при ^С^ : -1,0, 2.0 и 3.0. По вертикали: натуральный логарифм величины эффекта роста /в отн.единицах/. Обозначения: /1 /, /$'/,/*/- достоверность, соответственно, 3, 2 и I слогаешх в сумме, /• / - р<0.001г0.05.

ОГОдДЕШЁ' РЕЗУЛЬТАТОВ.

Настоящим исследованием показана возможность синтеза ядерной ДНК нейронов ЦНС de novo у высших животных в ответ на внешние воздействия, в частности, микроволны.

Очевидно, исследованный синтез.ядерной ДНК физиологичен для нейронов неокортекса и присущ исключительно, этим клеткам. Сходные изменения метаболизма ДКК неокортекса были обнаружены у крыс при обучении /В.В.Ашапкин и др., 1981, 1983/. Тот ^акт, что уровень фонового синтеза ДНК неокортекса может время от времени меняться, вероятно, отражает свойственную нейронам ЦНС реакцию на внеынпе воздействия, которые,пусть в очень небольшой степени, присутствуют в среде постоянно.

Таким образом, индуцированные микроволнами или экстремальной физической нагрузкой количественные изменения ядерной ДНК нейронов неокортекса могут представлять универсальный механизм реагирования последних на различные внешние факторы, хотя и обладают определенной спецификой для какдого типа воздействия. Индуцированный микроволнами синтез ядерной ДНК затрагивает уникальные и малоповторённые фрагменты генома, в то время как экстремальное плавание вызывает увеличение количества последовательностей да всему спектру кинетической сложности с максимальной ориентацией на простые последовательности. Последнее обстоятельство, вероятно, лежит в основе несоответствия удельной радиоактивности ДНК • неокортекса после экстремального плавания суммарному росту её количества в ходе реассоциации. Легко допустить, что радиоактивная метка "вымывается" из фракции коротких высокоповторяадихся последовательностей, например, при действии эвдонуклеаз,

Совремешше представления об амплификации генов наводят на мысль о том, что именно она лежит в основе наблюдаемого явления.

В пользу амплификации ядерной ДНК как основы количественных изменений генома нейронов неокортекса в ответ на действие микроволн и экстремальную физическую нагрузку говорят следуицие факты, Амплификация ДНК может быть сцеплена с различными хромсесмшялл аберрацияг.я ^.а.згагк е4 а1, 1989 /. которые часто инду^^ру-отся высокоинтенсивнк.м микроволнами. Стимуляторам амплификации могут быть любые агенты, способные вмешиваться в синтез ;ц5К или повреждать ДНК, например, канцерогены, гипоксия, стресс, ингибиторы синтеза ДНК, ультрафиолетовое излучение, ионизирушее излучение И Т.д. /а.Я^ахк, а.м.'.7аы, 1984} Й.Т.ЗсЫл&е, 1988 /. По мнению некоторых авторов эти воздействия ведут к индукции генной экспрессии, продукты которой в основном направлены на стимуляцию амплификации /с.Ьискв-НиЫо, Р.НвггИсЬ, 1987 /•

"Горячими точками" амплификации ядерной ДНК нейронов неокор-, текса в ответ на экстремальную физическую нагрузку могли служить многочисленные в геноме инвертированные повторы, ренатури-рующие в нулевой момент времени, то есть чрезвычайно быстро -при значениях С0^ менее 10"^ или 10"^. Известно, что амллифи-цированная ДНК часто содерпшт большие обращенные повторы /а.Е.Ьоо-пеу, о.Ь.Нал11п, 1987; Ы.Рогй вt а1., 1985; С.Ыа в* а1.( 1988 /. Поскольку амплифицированный район обычно бывает достаточно большим /от 450 Ю3 до 10000 Ю3 оснований/, в него, естественно, могут входить другие уникальные и умеренно повторяющиеся последовательности. Всё шесте создаёт картину количественных изменений ДНК нейронов на ?грёх этапах реассоциации.

Индуцируемая экстремальной физической нагрузкой амплификация скорее всего является стохастической. Генетические изменения в нейронах' неокортекса после действия микроволн, напротив, отличаются избирательностью. Они больше похожи на дифференциальную

амплификацию. Случаи такой дифференциальной амплификации определённых последовательностей, кодирупцих белок, у эукариот известны /в.Ьв»г1п, 1987 /• В данном случае количественные изменения ядерной ДНК вполне соответствуют модели двунаправленной репликации, если предположит^., что точка множественной инициации репликации находится вблизи тех сложных последовательностей, количество которых достоверно увеличивалось в ходе реассоциации. Степень амплификации в этих локусах была наибольшей. Наблюдаемую тенден-, цию количественного роста более простых последовательностей можно объяснить их вхождением в первоначальный репликон.

Данные последних лет позволяют взглянуть на амплификацию ДНК как на сложный лабильный процесс, открывающий возможность функционирования генов в экстрахромосомном состоянии, причисляя её к классу генетических изменений, лежащих в основе динамичности генома. Поэтому модель амплификации применима при рассмотрении временных, быстро исчезающих изменений синтеза ядерной ДНК, какие наблюдались нами после ДМВ-облучения или плавания.

Для понимания биологического смысла амплификации ядерной ДНК нейронов в ответ на внешние воздействия подобные микроволновым нужна точная идентификация продуктов амшшфицированных генов. Это задача будущих исследований. Пока можно только предполагать, какой характер информации вновь синтезируемой экстрахромосомной ДНК.

На первый взгляд значение индуцируемой микроволнами и экстремальной физической нагрузкой амплификации заключается в увеличении числа матриц структурных генов, кодирупцих какие-то ^функциональные, возможно, стрессоркые белки. Роль амплификации ядерной ДНК нейронов в таком случае ограничивается адаптацией. Дифференциальная амплификация, индуцируемая микроволнами, возможно,зат-

рагивает гены мозгоспецифических белков, подобных семейству близкородственных белков 5100.

Учитывая более вероятное экстрахромосомное состояние вновь синтезированной ДНК нейронов.неокортекса, логичнее признавать за . ней регуляторные функции. Похоже, что экстрахромосомные гены,

если такие индуЮТрувтся.в ответ на действие микроволн, действи-.; тельно имеот отношение к регуляции процессов тканеспецифической / экспрессии генов пролиферации и дифференцаровки в нейронах-неокортекса. Не Ьлучайно,' среди людей, подвершенных хроническому воздействаю микроволнами вероятность онкологических заболеваний оченьвелика, а опухоли мозга встречаются чаще других новообразований /s.smtgieleki, 1993* b.G.Salford et al.» 1993 /• С дру-,гой сторонн, давно известнообщеепротавоопухолевое действие : .: слабоинтенсившамикроволн, породившее одно из направлений в те: / рашш онкологических бОЛ^НШС /jfQtShC)Ttp P.P.Turner, 1980 /. „';.". соетододо генов нейронов аеокор-

текса. вновь синтезирупщ^ся в мвет на вуешше воздействия, в .. . .частности, ойсучение ьщкроволнаш, определяет широкие' возможности ЦНС в плане регуляцаи метаболизма всего организма. Показано, что кольцевые ДНК ногут проникать из одной клетки в другие и там . активно функционировать /.G,Bf Stark 9% ol», 1989; J.d.Gaii, j.d. Hochalz, 1974 /• Длительно^ воздействие высокоинтенсивными микроволнами ведет к срыву процесса регуляции посредством экстрахромосомных генов, что имеет крайнее проявление в опухолевом росте.

ВЫВОДЫ

I. Воздейстше микроволнами /460 МГц/ с экспозицией 10 минут вызывает индукцию синтеза ядерной ДНК неокортекса крыс, что выражается увеличением количества ДНК и ростом включения в её

структуру меченого тимидина.

2. Индуцированный микроволнам синтез ядерной ДНК неокортек-са достигает шксимума через 3-5 ч и приходит к исходному уровню через 18-24 ч после воздействия.

3. Наиболее эффективным является воздействие с ПЛМ 40-80 мВт/а.!2. Воздействие микроволнами с интенсивностью 10 мВт/см2

не вызывает индукции синтеза ДНК в неокортексе. При высокоинтенсивном действии /1000 Шт/см2/ микроволн характер и величина эффекта в значительной степбнй определяется состоянием синтеза ДНК на момент облученйя. Если уровень фонового синтеза ДНК в неокортексе достаточно высок, действие микроволн монет быть парад оксалышм.

4. Экстремальная физическая нагрузка индуцирует количественные изменения ядерной ДНК неокортекса крыс, которые регистрируются через 3 ч после процедуры плавания с грузом.

5. Индударувмый микроволнами синтез ядерной ДНК неокортекса является избирательным. Он затрагивает уникальные и малоповто-ренные /10-20 копий на гаплоидный геном/ последовательности и коррелирует с включением меченого тишдина в ДНК. Синтез ДНК в неокортексе после экстремального плавания, напротив, затрагивает различные по кинетической сложности участки генома и ориентирован на быстро ренатурируццие последовательности. Количественные изменения ядерной ДНК после экстремальной физической нагрузит наиболее выразительны в ходе реассоциации ДНК и слабее выявляются 6 помощью тимидинового теста.

6. Индуцируемый микроволнами и экстремальной физической, нагрузкой синтез фрагментов генома происходит, по крайней мере в первые часы после воздействия, исключительно в нейронах неокортекса, но не в клетках нейроглии, для которых уровень включения

3Н тимидина в ядерную ДНК в 8-12 раз ниже контрольного уровня нейронов.

7. Синтез фрагментов генома нейронов кори головного мозга в ответ на действие микроволн может являться дифференциальной амплификацией генов, тогда как количественные изменения ядерной ДНК нейронов неокортекса после экстремальной Физической нагрузки, скорее всего, связаны с равновероятной для различных участков генома шлшшгРикацией ядерной ДНК с возможным участием инвертированных повторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕШАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крылов О.А., Руцай С.В., Михайлик Д.В., Тверскова Н.В. Действие дециметровых волн на ядерную ДНК клеток коры головного мозга // Вопросы курортологии, физиотерапии и JK>K. - 1991. -

J§ 4. - с. 20-23.

2. Тверскова Н.В. Включение ^ тамндана в ядерную ДНК клеток коры головного мозга под действием микроволн // Вопросы курортологии, физиотерапии и J®K; - I992i - * 4. - с. 39-41.

3.Krylov O.A.,Butsai S.Y.¿Tverskova HiV.,Mifcflaiiik L.V. Altered nuclear ША synthesis in neocortical cells exposed со

microwaves // Toe first VPorld congress for Electricity and Magnetism in Biology and Medicine.-Orlando,iiorida.USA,1992.-p.146.

4.Krylov O.A.,Tverskova N.V.,Milchaililc L.V. fragment nuclear ША replication of neocortical cells after microwave exposure.// ТЬе 2 nd International Scientific Meeting -Microwaves in meoicine.-Bone.Italy,I992--P»98-101.

5.Kryiov O.A. ,rverslcova Xi.V. .Miicnailik L.V. About the mecna-nisa of prolonged action of microwave traces in brain cells.// The 2 nd Congress of tne European Bioelectronagnetics association. -Blend,Slovenia,1993.-P.39•