Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Имплантация биологического материала аллоплант как способ стимуляции репарации ишемически поврежденного миокарда в эксперименте

На правах рукописи

АНДРИЕВСКИХ Станислав Игоревич

ИМПЛАНТАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА АЛЛ ОПЛАНТ КАК СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАЦИИ ИШЕМИЧЁСКИ ПОВРЕЖДЕННОГО МИОКАРДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.27-хирургия 14.00.15-патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003454585

Челябинск-2008

003454585

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» на кафедре оперативной хирургии и топогра-фичсеой анатомии и в ФГУ «Всероссийском центр глазной и пластической хирургии Росздрава» (г. Уфа.) на базе отдела морфологических исследований

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор ЧелГМА Чукичев Александр Викторович

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Мусина Ляля Ахияровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Галимов Олег Владимирович

доктор медицинских наук,

доцент Кулаев Иван Александрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральская государственная медицинская академия» (г. Екатеринбург)

Защита состоится «<У 2008г. в часов на

заседании диссертационного совета Д.208.117.01 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

Автореферат разослан « V » ¿-{ХХ^З^+л 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Долгушина В.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемическая болезнь сердца остаетс.1 одной из главных причин, определяющих высокий уровень инвалидизации и смертности работоспособного населения во всём мире (Сыркин А Л., 1998, Бокерия Л.А., Гудкова РГ., 2006 и др.).

Основное место среди заболеваний сердечно-сосудистой системы у взрослого населения занимает ишемическая болезнь сердца-46,9% случаев (Бокерия Л А., Гудкова Р.Г 2002) Хроническая сердечная недостаточность (ХСН), субстратом которой, прежде всего, является кардиосклероз, как наиболее частый исход ишемической болезни сердца, так же является весьма актуальной медико-социальной проблемой По данным В А Алмазова и С В. Шляхтова (1995), ХСН страдают около 1 % взрослого населения страны, 10% которого - людей старше 75 лет Ежегодно случаи ХСН выявляются в группе людей от 35 до 65 лет, составляя в среднем 3 случая на 1000 населения, а в группе старше С>5 лет - более 10 Однолетняя выживаемость в группе со среднетяжелым течением ХСН приходится на 7986% населения, в группе с тяжелым течением - 50-70% (Терещенко С Н., 2000).

В последние годы большое внимание уделяется изучению процесса постинфарктного ремоделирования левого желудочка сердца, представляющего собой структурную и функциональную его перестройку, которая происходит после острого инфаркта миокарда Результатом этих морфофункциональных изменений являются выраженная дилата-ция и изменение геометрической формы левого желудочка, что ведет к его систолической и диастолической дисфункции и развитию хронической сердечной недостаточности (Беленков Ю.Н., 1997). Процессы, происходящие в миокарде после острой ишемии, приводят к необратимым морфологическим и функциональным изменениям в сердце (Румянцев П.П , 19В2; Непомнящих Л.М., 1991, Автандилов ГГ., 1984; Гуцол А А , 1990; Бы-шевский А Ш , 1994; Дмитриева Е М., 1983; Клишков А А , 1984; Краковский А А , 1992, СаркисовД С, 1979; СокрутВ.Н , 1991; Сыркин А Л , 1998, Фетисова ТВ., 1975,1976, Фролов В А , 1989 и другие).

Большую эффективность в лечении сердечной недостаточности, связанной преимущественно с коронарной патологией, приобрели малоинвазивные и хирургические методы, такие кактранслюминальная ангиопластика и стентирование коронарных артерий, прямая реваскуляризация миокарда или аортокоронарное шунтирование, динамическая кардиомиопластика, реконструктивные операции на левом желудочке и, конечно, трансплантация сердца (Бураковский В.И., Бокерия Л.А., 1996; Краковский А А., 1992; Шумаков В.И., 2003)

Пересадка сердца без сомнения является достаточно радикальным и эффективным методом лечения декомпенсированной сердечной недостаточности (Бураковский В.И., Бокерия Л А., 1996, Шумаков В И., 2003), однако повсеместное применение данной технологии сегодня ограничено по ряду причин, среди которых немало важное значение имеет иммунологический конфликт донора и реципиента, атак же дефицит доноров (Забирски Дж. Б., 1984, Долгих В.Т, 2000).

В последнее время широко обсуждаются возможности применения клеточной трансплантологии в лечении кардиологических больных. Для заместительной терапии инфарктного миокарда используется различные клеточные линии s клетки-сагеллиты поперечно-полосатой мускулатуры или скелетные миобласты, взрослые и фетальные кардиоми-оциты, ген-модифицированные клетки костного мозга, стволовые клетки костного мозга, факторы роста гепатоцитов и эндотелиоцитов и тд. (Сухих Г.Т., Репин B.C., 1998; Пота-

пов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко И А., 2001; Beltrami А.Р.,2001,2002,2003; Bittira В., 2003; Strauer В Е„ 2002; Harnano К., 2002, Hughes S., 2002; KadnerA., 2002, Li R.-K, 194, 1995,2002,2003; Miyagava S„ 2002, Kajstura J., 1995,1997,2001,2003; Menasche P, 2003: Ruhparvrar A , 2002; Reinecke H , 2002; Roell W., 2002 и другие). Несмотря на видимую эффективность применения донорских или собственных клеток для лечения некоторых форм сердечной недостаточности, метод клеточной кардиомиопластики имеет ряд нерешенных этических и технических моментов

В середине 70-х годов в г Уфа в ходе решения проблемы снижения антигенных свойств аллотрансплантантов профессором Э.Р Мулдашевым и его единомышленниками был создан и клинически широко внедрен спектр биологических материалов под торговой маркой Аллоплант®. Сегодня данный препарат успешно используется не только в хирургии глаза, но и в реконсгруктивно-восстановительной, пластической, челюстно-лицевой хирургии, гепатологии и гастрохирургии (Муслимов С А., 2000)

Основным эффектом действия материалов серии Аллоплант является стимуляция регенерации тканей и дифференцировки клеточных элементов, и как следствие этого, снижение интенсивности образования рубцозой ткани (Мулдашев Э Р., 1994; Нигма-туллин Р.Т., 1995). Его низкие антигенные свойства, способность полностью резорбиро-ваться не вызывают усиления воспалительной реакции в зоне повреждения. Результирующей всех этих свойств является образование функционально полноценного регенерата (Мулдашев Э Р, 1994, Нигматуллин Р.Т., 1995; Муслимов С А., 1984).

Такие биологические свойства, представпяющие не только теоретический, но и практический интерес, привели нас к мысли о возможности использования диспергированной формы материала Аллоплант с целью ремоделирования ишемически поврежденного миокарда

Цель исследования: изучить влияние биологического материала Аллоплант на морфологическую структуру миокарда в различные сроки экспериментальной ишемии л обосновать возможность его применения в лечении острого расстройства кровообращения сердца

Задачи исследования.

1. Воспроизвести адекватную модель экспериментального инфаркта миокарда i морфологически оценить динамику развития рэпаративных процессов в подострую i хроническую фазу ишемического повреждения миокарда.

2 Разработать хирургический способ имплантации биоматериала Аллоплант при экспериментальной ишемии миокарда.

3 Морфологически охарактеризовать и сравнить особенности течения репаратив-ных процессов в инфарцированном миокарде после имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительной реакции.

4 Оценить баланс пролиферативно-клеточных и фибропластических процессов в ишемически поврежденном миокарде в зависимости от сроков имплантации биологического материала Аллоплант на основе иммуногистохимических исследований экспрессии PCNA-ядерного антигена пролиферирующих клеток и TGF-pi -трансформирующего фактора роста фибробластов

Научная новизна

Впервые для стимуляции репаративных процессов и ремоделирования инфарциро-ванного миокарда экспериментально использована диспергированная форма биологического материала Аллоплант Установлено, что выбранный способ введения аплогенного биома-

териала в миокард является безопасным и надежным. Доказано, что низкий уровень индуктора фиброза-трансформирующего фактора роста ТСР-р1 и слабая пролиферативная ак-тизность фибробластов при применении аллогенного биоматериала обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне миокарда кроликов. Выявлено, что формирование функционального регенерата в миокарде экспериментальных животных после использования аллогенного биоматериала сопровождается васкуляризацией и появлением групп миоцитоподобных клеток. Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных. Обнаружено, что введение аллогенного материала в ишемизированный миокарда животного на поздних сроках вызывает частичную инволюцию грубого рубца с образованием рыхлой соединительной ткани и не приводит к формированию анеризмы левого желудочка в месте имплантации.

Практическая значимость работы. На основе полученных морфологических результатов и разработанной технологии имплантации материала Аплоплант осуществлен подробный качественный и количественный сравнительный анализ патоморфологи-ческих изменений в миокарде до применения материала и после его использования. Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных, что открывают перспективу для клинической апробации технологии имплантации биологического материала Аллоплант в лечении повреждений миокарда Технология имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительного процесса в миокарде может быть использована как один из методов стимуляции репарационных свойств миокарда.

Положения, выносимые на защиту

1. Воспроизведение экспериментальной острой ишемии миокарда, путем перевязки передней нисходящей ветви коронарной артерии, является адекватной моделью для сравнения и систематизации регенераторно-пластических преобразований миокарда при изучении экзогенных стимулирующих факторов.

2. Разработанный интрамиокардиальный способ имплантации биоматериала Аллоплант после острой ишемии является безопасным, не приводит к формированию аневризмы левого желудочка сердца и снижает летальность животных.

3. Введение аллогенного биоматериала в ишемизированную зону миокарда у экспериментальных животных активизирует макрофаги, мезенхимную клеточную реакцию, усиливает влияние макрофагов на структуру образующегося регенерата. Низкий уровень индуктора фиброза ТСР-[51 и слабая пролиферативная активность фибробластов обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне после введения аллогенного биоматериала. Васкуляризация и появление групп миоцитоподобных клеток в миокарде после введения аллогенного биоматериала подтверждают формирование функционального регенерата.

4. Применение аллогенного материала на поздних сроках улучшает трофику постинфарктного рубца с образованием рыхлой соединительной ткани.

Апробация диссертации

Основные результаты работы доложены на региональной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза и регенерации органов грудной и брюшной полости» (г. Екатеринбурге, 2003); на Всероссийской научной конференции, посвященной столетию со дня рождения профессора А Н. Максименкова «Анатомо-физиологические аспекты современных хирургических технологий» (г. Санкт-Питербург, 2006), на первом Российско-Чешском медицинском форуме (г. Челябинске, 2006); на обществе хирургов Челябинской обла-

сти (2007); на межучрежденческом заседании кафедр оперативной хирургии и топографической анатомии, общей, факультетской и госпитальной хирургии, патологической анатомии ГОУ ВПО ЧелГМА и отдела морфологических исследований ФГУ "Всеросийский центр глазной и пластической хирургии" (г. Уфа) (2008).

Внедрение результатов исследования

Теоретические и практические результаты исследования используются в педагогическом процессе на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии и на кафедре хирургических болезней, реаниматологии и интенсивной терапии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 3 диаграммами, 90 морфоло-геическими снимками. В списке литературы 282 источника, в том числе отечественных авторов 105 и иностранных 177.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования

Настоящее исследование проведено на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в отделе морфологии ФГУЛ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии Росздрава», г Уфа

Экспериментальные исследования были проведены нами на 48 беспородных кроликах Все животные были разделены на две группы - контрольную (18 кроликов) и опытную (30 кроликов). Эксперименты на животных выполнялись согласно приказу МЗ СССР «О гуманном обращении с экспериментальными животными» № 755 от 12 августа 1977 г. с соблюдением «Правил проведения работе использованием экспериментальных животных» (приказ Минвуза от 13 ноября 1S84 г №724) С использованием внутримышечной анестезии раствором Кетамина доступом через левую плевральную полость и полость перикарда осуществлялась визуализация передней нисходящей ветви левой коронарной артерии (ПНВ ЛКА) и последующая её перевязка в средней трети с целью создания острой ишемии области миокарда левого желудочка. В дальнейшем на сроке 5 (22 кролика) и 30 (8 кроликов) суток после острой ишемии в опытной группе кроликов в ишемизированную зону выполнялась имплантация диспергированной формы биологического материала Аллоплант растворенном в физиологическом растворе. В контрольной фуппе кроликам, по аналогичной методики, вводился физиологический раствор. Из эксперимента животные выводились путем инсуфляции летальной дозы паров раствора фторотана на 3,7,14,21, 30 и 90 сутки.

После выведения животных из эксперимента сердца извлекались из грудной полости путем отсечения магистральных сосудов (аорта, легочная артерия, легочные вены и полые вены) с оставлением допустимой их длины Полученный препарат тщательно отмывался от сгустков. Вдоль поперечной оси сердца происходила нарезка миокарда желудочков. Участки миокарда с макроскопически видимым повреждением выделялась из окружающего интактного миокарда, с оставлением миокарда периинфаркгной области. По-

лученные препараты фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина, после чего отмывались в физиологическом растворе, обезвоживались в серии спиртов возрастающей концентрации и заливались в парафин по общепринятой методике. Срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 и окрашивали по методам ван-Гизона, Маллори, гематоксилином и эозином. Процентное соотношение мезенхимных клеток и фибробластов считали на парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином (на 1000 клеток). Микроскопические исследования проводились с использованием световых микроскопов JENAVAL иАХЮ IMAGER Z1 (фирмы «CARLZEISS», Германия).

Для электронномикроскопического исследования кусочки тканей фиксировали в 2,5% глютаральдегиде, приготовленном на какодилатном буфере (pH 7,2-7,4) с последующей дофиксацией в 1 % растворе 0s04. Материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпон-812 по общепринятой методике Б. Уикли (1975). Предварительно изготовляли полутонкие срезы толщиной 1 мкм и окрашивали их толуи-диновым синим на 2,5%-ном растворе безводной соды. На данных срезах выбирали участки для электронно-микроскопического исследования. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-III8800 (Швеция) Ультратонкие срезы контрастировали 2% водным раствором уранилацетата, цитратом свинца по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975) и изучали в трансмиссионном микроскопе Jeol-ЮОХВ (Япония) при увеличениях 5,8000-20000

Иммуногистохимические исследования проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5 мкм с минимальной площадью 1 см2. Использовали непрямой стрептави-дин-биотиновый метод с применением моноклональных антител к PCNA - Proliferative Cells Nuclear Antigen - ядерному антигену пролиферирующих клеток и TGF-ß,-трансформирующему фактору роста-p (Santa Cruz Biotechnology). Пролиферативную клеточную активность мезенхимных и юных фибробластов характеризовали по процентному соотношению позитивно окрашенных на PCNA клеток (на 100 просчитанных клеток).

В современных исследованиях большое распространение получил метод оценки пролк.феративной активности клеток с помощью иммуногистохимического анализа уровня экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (proliferative cellular nuclear antigen - PCNA) Данный антиген является не гистонным кислотным ядерным белком массой 36 кД, необходимым для синтеза ДНК и относится к вспомогательным белкам ДНК-полиме-разы дельта Некоторые исследования с использованием PCNA антител показали, что PCNA аккумулируется в ядрах клеток в S фазе митотического цикла и расценивается как маркер пролиферации. Преимуществом данной методики является её простота и быстрота при использовании специального моноклонального метода (PC 10) (Lavezzi A.M., Term L , Matturri L„ 2000).

Для анализа интенсивности фибропластических процессов использовалась им-vy ногистохимическая оценка экспрессии трансформирующего фактора роста TGF-ß, известного, как индуктор фиброза. Трансформирующий фактор роста (TGF-ß, - transforming growth factor) является по современным данным (Abraham D.J et al., 2000) индуктором фиброза, так как усиливает экспрессию фактора роста соединительной ткани (Connective tissue growth factor), который в свою очередь стимулирует пролиферацию фибробластов и активный синтез ими коллагена (Leask A., Abraham D. J., 2004). Уровень экспрессии трансформирующего фактора роста TGFß, определяли путем измерения относительной площади специфического окрашивания на гистологических срезах с помощью аппаратно-программного комплекса анализа изображений Биоскан-2 (Канако, Белорусь).

Полученные количественные результаты исследования были обработаны при помощи стандартного пакета статистических программ параметрическими методами (Реброва О. Ю., 2002; Боровиков В.П., 2003). Были применены описательные статистические данные (среднее значение, стандартное отклонение, количество случаев), {-критерий оценки различий средних двух независимых выборок. Для оценки динамических изменений каходой группы (контрольной и опытной) был использован дисперсионный анализ, с помощью которого исследовали различия выборочныхдислерсий наЗ, 7,14,21,30,90сутки. Высчитывали показатели, демонстрирующие различие выборочных дисперсий - коэффициент влияния фактора (КВФ), коэффициент Фишера (Р). Для проверки изменений в контрольной и опытной группах на разных сроках исследований был применен двухфакторный дисперсионный анализ, позволяющий выявить взаимодействие факторов - сравнить две группы во времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Внешний вид сердец был практически идентичен у всех животных. Полость перикарда была вовлечена в спаечный процесс весьма умеренно. Отсутствовали внешние признаки формирования аневризмы левого желудочка. Лигатура, с помощью которой производили перевязку артерии локализовалась в намеченном месте - граница между верхней и средней третью ПНВ ЛКА.

Проводя сравнительное изучение внешнего вида сердца у животных опытной и контрольной групп, мы не выявили выраженных макроскопических отличий.

Оценивай состояния окружающих тканей, мы не выявили инфекционных воспалительных реакций в виде гнойных очагов или рубцово измененных тканей, подтверждающих закончившуюся репарацию после микробного воспаления. Легочная ткань не была атепекгазироваиа, равно как и не было плевральных наложений, что подтверждает адекватность проводимой антибактериальной терапии и профилактики пневмоторакса. Края раны были адекватно сопоставлены с образованием послеоперационного гомогенного рубца.

Т^ЩШЩ

Ш&ЫЖЙ:

? •' ' -К«¿/ГУ

иаа

Рис. 1. Область инфаркта через 3 суток после перевязки коронарной артерии. Клеточный вал (Кв), отграничивающий некротизированные мышечные волокна (Нв). Мв - окружающие мышечные волокна. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. х200.

Динамика патоморфологических

преобразований в миокарде кролика после воспроизведения острой ишемии

В контрольной группе животных после воспроизведения острой ишемии миокарда и последующим введении физиологического раствора выявлены определенные морфо-

Рис. 2. Зрелый фибробласт с каналами ГЭР(Т)

и липидными вакуолями (Л)в цитоплазме среди плотно упакованных новообразованных коллагеновых фибрилл (Кф) через 7 суток после перевязки коронарной артерии. Электронная микрофотография. Увел. *19000.

логические преобразования.

Спустя двое суток в очагах поражения в большом количестве обнаруживались сешентоядерные нейт-рофильные гранулоциты. Концентрируясь вокруг очагов некроза кардио-миоцитов и отграничивая некротизи-рованные мышечные волокна, они образовывали относительно широкий клеточный вал (рис.1).

Начиная с четвертых суток кнаружи от лейкоцитарного вала выявлялись макрофаги. В процессе резорбции погибшей ткани они постепенно продвигались в глубокие отделы очага поражения. Среди воспалительных клеток обнаруживались крупные ве-ретеновидные и отростчатые клетки: электронно-микроскопически определялись мезенхимные и малодиффе-ренцированные фибробластоподоб-ные клетки. Фибробластоподобные клетки дифференцировались в фиб-робласты с многочисленными расширенными каналами гранулярного эн-доплазматического ретикулума и несколькими пластинчатыми комплексами Гольджи а цитоплазме, свидетельствующими об активной синтетической деятельности клеток.

В конце первой недели заболевания в отечных интерстициальных пространствах между разрушающимися кардиоциоцитами уже определялись плотно упакованные пучки новообразованных коллагеновых фибрилл. Между ними иногда выявлялись зре-| лые фибробласты с большими липид-

ными вакуолями в цитоплазме (рис. 2).

Через 14 суток в участках, где кардиомиоциты подвергались полной деструкции, наблюдались признаки выраженной лейкоцитарной, гистиоцитарной и фибробластичес-(ой реакции. Расслоившиеся и фрагментированные мышечные волокна обволакивались Нежными соединительно-тканными волокнами, которые разрастались наподобие паутины. заполняя лакуны между разрушенными волокнами (рис. 3).

! Зрелые фибробласты также характеризовались крупными размерами. В фибробла-утах определялись овальные или удлиненные ядра с конденсированным хроматином. В

Рис. 3. 14 сутки после перевязки коронарной артерии кролика. Появление новообразованных коллагеновых волокон (I) вокруг некро-

тизированных мышечных волокон (Н). Окраска по методу ван-Гизона. Увел. х200.

Таблица 1

Относительная площадь окрашивания на срезах миокарда экспрессированного ТвР р, у кроликов контрольной группы (в %)

Срок исследования Сред-нее±станд. откл. (контрольная группа) Критерии различия МК з динамике

КВФ ¥ Р

3-7сутк;и, п=4 17,00±1,15 97% 445,66 0,001

14-21сутки, п=4 31,50±1,05

30 сутки, п=3 26,00±1,63

90 сутки, п=2 16,20+0,92

широкой цитоплазме; наблюдался хорошо развитый ГЭР с резко расширенными каналами, в которых определялось хлопьевидное содержимое. Эндоплазматическая сеть занимала почти весь объем цитоплазмы. Клетки с подобным строением можно отнести к колла-генобластам II типа, которые в свою очередь принадлежат к ряду клеток, интенсивно

продуцирующих коллаген.

В этот же срок эксперимента иммуногистохимически на препаратах выявлялось относи-! тельно большое количество трансформирующего фактора, роста ТОРр,, известного как индуктор фиброза (таблица 1).

Проведенные нами имму-ногистохимические исследования показали, что, начиная с 3 суток эксперимента, на препаратах определяются признаки пролиферации мезенхимных клеток! и юных фибробласгов в виде эк-! спрессии пролиферирующими! ядрами клеток антигена РСМД, окрашивающегося в интенсивный, коричневый цвет (рис. 4).

При подсчете пролифери-; руюицих клеток был проведен од-; нофакторный дисперсионный анализ и была отмечена высокая пролиферативная активность мезенхимных клеток: она составила на 3 - 7 сутки - 34,90+1,73 %, на 14 сутки - 21 сутки; - 11,00±1,25 %, на 30 сутки - 1,00±0,47 % (при р<0,001). На 90 сутки пролиферативная! активность клеток ослабевала (Таблица 2).

* * <>/> Ъ -

к

■к/ ,.

Г*

ЬшШЭ___."-д. ? г . * .....>._„ ;,,,.......

Рис.4. Пролиферация клеток в области инфаркта миокарда кролика через 3 суток после перевязки коронарной артерии. Нм - некротизирующмеся кардиомиоциты. Пролиферирующие кпетки - (-) Непрямой иммунопероксидазный метод выявления РОМА. Увел. х200.

Таблица 2.

Динамика количества пролиферируюицих мезенхимных клеток миокарда у кроликов

контрольной группы (в %)

Срок исследования Среднее±станд. С1ТКЛ. контрольная группа Критерии различия МК в динамике

КВФ F Р

3-7сутки, п=4 34,90±1,73 99% 1856,94 0,001

14-21 сутки, п=4 11,00+1,25

30 сутки, п=3 1,00±0,47

90 сутки, п=2 0,20±0,42

Пролиферативная активность юных фибробластов на 3-7 сутки эксперимента была высокой и составила 52,70 1,06 %, в дальнейшем снижалась на 14-21 сутки составив 21,90±0.74, на 30 сутки - 5.00 ±0.57 и к 90 суткам составляла 3,00 ±0,57 % (Таблица 3).

Таблица 3.

Динамика количества пролиферирующих фибробластов миокарда у кроликов контрольной группы (в %)

Срок исследования Среднее±станд. откл. контрольная группа Критерии различия МК в динамике

КВФ Р Р

3-7сутки, п=4 52,70±1,06 99% 3756,21 0,001

14-21 сутки, п=4 21,90±0,74

30 сутки, п=3 5,00+0,57

30 сутки, п=2 3,00±0,57

I В непосредственной близости от рубцовой ткани выявлялись признаки выраженной 1 контракции кардиомиоцитов. Окруженные пучками коллагеновых волокон, кардиомиоциты ] состояли из резко сократившихся деформированных саркомеров с измененными утол-! щенными и деформированными Z-mнmш. В окружающем миокарде отмечалась гипертрофия большинства мышечных волокон. На ульграструктурном уровне в таких участках ¡обнаруживались признаки набухания митохондрий и разрушения ихкрист.

Таким образом, развитие выраженных рубцовых изменений миокарда кроликов при инфаркте сопровождается адаптивно-компенсаторными изменениями или перестройкой окружающих тканей, то есть при инфаркте миокарда процессы ремоделирования !затоагивают как инфарцированный участок, так и здоровый миокард.

I I

Рис. через

5. Гомогенизация частиц биоматериала (БМ) 3 суток после введения при остром инфаркте миокарда у кролика. Окраска по ван- Гиаону. Увел. х25.

Динамика морфологических изменений в миокарде кроликов при введении

ДБ11ЛА после воспроизведения острой ишемии При остром инфаркте миокарда кролика на 3 сутки после введения ДБМА в периинфаркг-ную зону миокарда (т.е. на 8 сутки после наложения лигатуры) в частицах введенного биоматери- : ала определялись признаки гомогенизации и выраженного лизиса коллагеновых волокон (рис. 5).

Выявленные в клеточном инфильтрате крупные макрофаги на ультраструктурном уровне: представляли собой в основном \ зрелые формы, были с выражен- ; ными признаками фагоцитоза, о \ чем свидетельствовали их многочисленные отростки, лизосомы и фагосомы в цитоплазме.

Обнаруживаемые в большом количестве в клеточном инфильтрате мезенхимные клетки были представлены недифференцированными, округ-; лой или удлиненной формы «лет- _ ками со светлой цитоплазмой и крупным ядром (рис, 6).

В меньшем количестве определялись фибробяасты различной степени зрелости - от юных (малодифференцирован-ных) до активных зрелых форм разных размеров с веретено-

видной формой.

Иммуногистохимические исследования с применением монокпональных антител показали, что в ядрах юных фибробластов и мезенхимных клеток экспрессируется ядерный антиген РСЫА, что является признаком их пролиферации (рис.7).

Через 7 суток после введения ДБМА в миокард кроликов наряду с возрастанием клеточной плотности и толщины клеточного вала вокруг частиц биоматериала выявлялись признаки их набухания и гомогенизации, вследствие чего они плотно прилегали друг к другу. Процессы лизиса коллагеновых волокон биоматериала макрофагами продолжались, что вы-;

Рис. 6. Мезенхимные клетки с большим количеством рибосом в узкой цитоплазме (Ц) в инфильтрате вокруг частиц БМА через 3 суток после введения при остром инфаркте миокарда у кролика. Я - ядро. Электронная микрофотография. Увел, х 10000.

казатепем их митотической активности и свидетельствует о новообразовании капилляров (рис. 9).

На 14 сутки клеточная инфильтрация вокруг частиц диспергированного аллогенного биоматериала была примерно той же интенсивности, что и в предыдущий срок эксперимента, а в составе инфильтрата продолжали преобладать фагоцитарные и секреторные макрофаги, мезенхим-ные и фибробластоподобные недифференцированные клетки. В результате интенсивной резорбции фагоцитарными макрофагами количество введенных в миокард частиц ДБМА уменьшалось. По периферии очага имплантации аллогенного биоматериала определялась более зрелая новообразованная соединительная ткань, которая содержала новообразованные тонкостенные сосуды. Отдельные эндотелиоциты иммуногистохимически продолжали экспрессировать антиген пролиферации РСЫА. У окружающих очаги инфаркта кардиомиоцитов структура была различной - от наличия признаков дистрофических изменений различной степени до нормы.

К 21 суткам качественный состав клеток инфильтрата не менялся, уменьшилось

Рис. 8. Изменение тинкториальных свойств частиц бисмагериала (БМ) через 7 суток после введения при остром инфаркте миокарда у кролика. Окраска по методу ван-Гизона. Увел, х 200.

Рис. 7. Экспрессия РСЫА (окраска коричневого цвета) в ядрах фибробластов и мезенхимных клеток через 3 суток после введения биоматериала. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления РСЫА. Докраска гематоксилином. Увел, х 200.

ражалось в изменении их тинкториальных свойств, т.е. они по-разному окрашивались (рис. 8). В составе клеточного инфильтрата наблюдалось преобладание макрофагов разной степени зрелости, мезенхимных и юных фиброб-ластоподобных клеток.

В данный срок эксперимента уже обнаруживались начальные признаки формирования грануляционной ткани в очаге инфаркта. Частицы аллогенного биоматериала резорбировались макрофагами и замещались нежными тонкими коллагеновыми волокнами. В грануляционной ткани обнаруживалось большое количество эндотелиоцитов, зкспресси-рующих РСЫА, что является по-

Рис. 9. Экспрессия РСЫА ядрами эндотелиоцитов (Т) через 7 суток после введения биоматериала. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления РСМА. Докраска гематоксилином.Увел, х 200

количество нерезервированных частиц биоматериала, несколько увеличилась площадь соединительнотканного регенерата. Кроме того, на границе регенерата и мышечных волокон, преимущественно в составе новообразованной соединительной ткани, в направлении к окружающим мышечным волокнам определялась миграция крупных малодиффе-ренцированных клеток с крупными светлыми овальными ядрами. В близлежащих отдельных участках миокарда около новообразованной соединительной ткани стали обнаруживаться РСЫА-по-ложительные, т.е. проявляющие митотическую активность мио-циты (рис. 10). На препаратах эти группы клеток с овальным ядром были близко расположены друг к другу, связаны ме>еду собой, про-лиферативно аетивны и иногда окружены фибробластами.

Причем миоцитоподобные клетки были объединены в группу по типу синцития, что свидетельствует об их функциональном состоянии.

К 30 суткам биоматериал постепенно резорбировался и замещался новообразованной обильно васкуляризованной рыхлой соединительной тканью. Новообразованные сосуды были тонкостенные. Эндотелиоциты б цитоплазме содержали большое количество пиноцитозных пузырьков, что свидетельствовало об интенсификации трансэндотелиалького обмена.

На 60 сутки частицы аллогенного биоматериала, введенные в миокард кроликов, полностью резорбировались макрофагами и замещались относительно рыхпой васкуля-ризированной соединительной тканью. В толще сформировавшегося регенерата на гистологических препаратах определялись короткие тяжи миоцитоподобных клеток (рис. 11). Они располагались между волокнами и клетками соединительной ткани и местами даже соединялись с близлежащими кардиомиоцитами. На ультраструктурном уровне данные скопления миоцитоподобных клеток напоминали "почки роста", так как клетки соединя-

Рис. 10. Экспрессия РСЫА ядрами кардиомиоцитов (?) через 21 сутки после введения биоматериала при остром инфаркте миокарда у кролика. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления РСЫА. Докраска гематоксилином.Увел.х 400.

Рис. 11. Скопление в регенерате миоцитоподобных клеток (Т) через 60 суток после введения аллоген-ного биоматериала при остром инфаркте миокарда у кролика. Окраска по методу ван-Гизона. Увел, х 200.

г- д г у^ТГТ^;

лись между собой в симпласты и по структуре были очень похожи на миобласты.

При электронно-микроскопическом исследовании окружающей регенерат ткани миокарда кроликов особо выраженных дистрофических изменений не обнаружено. Лишь в отдельных кардиомиоцитах отмечались слабые признаки набухания митохондрий, иногда некоторой изре-занности ядерной кариолеммы. Улучшению структуры миокарда кроликов, вероятно, способствовали и кровеносные сосуды сформировавшегося соединительнотканного регенерата, так как в эн-дотелиоцитах сосудов, соседствующих с мышечными волокнами, обнаруживались признаки усиления трансэндотелиального обмена в виде наличия в цитоплазме множества пиноцитозных пузырьков.

Большей частью кардиоми-оциты вокруг регенерата имели структуру характерную для нормы, хотя у некоторых клеток еще были расширены каналы саркоп-лазматической сети. Но миофиб-риллы уже имели правильную архитектонику, а мевду ними в ряд цепочкой располагались овальные митохондрии с тонкими кри-стами (рис.12).

В конечные сроки эксперимента (90 суток) структура новообразованной соединительной ткани в месте введения в миокард частиц биоматериала отличалась отсутствием грубых пучков коллагеновых волокон, а также относительно большей плотностью сосудистой сети, чем в контрольной группе. Значительную часть образовавшегося регенерата занимали тяжи мышечных волокон (рис. 13). На ультраструктурном уровне определялось, что данные мышечные волокна были несколько сжаты заполняющими межпучковые пространства прослойками коллагеновых волокон. Митохондрии кардиомиоцитов имели также сжатый вид, они были узкими и

/ '"Ж:

ЩЩщщ

Рис. 12. Ультраструктура кардиомиоцита на 60 сутки после введения БМА при остром инфаркте миокарда у кролика. Я - ядро; М - митохондрии; Мф - миофибриллы. Электронная микрофотография. Увел, х 19000.

гаШЙЙЕ

* Ш

К. 1 й®^

Л >\ »<• П1 ! ШЖ

'о:.г

вытянутыми вдоль пучков мио-фибрилл.

На граница между кардиоми-оцитами и регенератом выявлялись капилляры, характерные по строению для сердечно!?; мышцы. В цитоплазме отростков зндотелио-цитов определялось большое количество пиноцитозных пузырьков, свидетельствующих о восстановлении функциональной способности сосудов, т.е. об активном трансэндотелиальном обмене. Кроме того, в цитоплазме зндоте-лиоцитов выявлялись многочисленные рибосомы.

В конечном итоге динамика морфологических изменений в постинфарктной зоне миокарда у животных опытной группы характеризовалась развитием рыхлой обильно васкуляризовак-ной соединительной ткани с большим количеством мышечных клеток.

Рис. 13. Новообразованная соединительная ткань с прослойками мышечных волокон (Т) на 90 сутки после введения аллогенного биоматериала при остром инфаркте миокарда у кролика. Окраска по методу ван- Гизона. Увел.х 400.

сроки

Диаграмма 1. Динамика пропифератиа ной активности мезенхимных клеток у животных опытной группы (О) и контрольной группы (К). Фактор группирования опыт-контроль. КВФ = 91%; |<КК= 0,95; Р =1143; р<0,001 Фактор сутки (изменения со временем). КВФ = 97%; ККК= 0,98; Р =697; р<0,001 КВФ - коэффициент влияния фактора, ККК- коэффициент канонической корреляции,

Из диаграммы 1, демонстрирующей количество мезенхимных клеток, экспресси-рующих РС^, видно, что в контрольной группе в начальные сроки эксперимента мезен-химные клетки в ткани обладали более высокой пролиферативной активностью, чем у животных опытной группы. В дальнейшем лролиферативная активность мезенхимных клеток падала, в то время как в опытной группе количество пролиферирующих мезенхимных клеток долгое время держалось примерно на одном уровне.

Таким образом, результаты гистологических, электронно-микроскопи-ческих, имму-ногистохимических, последующих за ними количественных исследований, их подробный анализ подтвердил наши предположения о том, что введение диспергированного аллоген-ного материала в миокард может повлиять на структуру формирующегося постинфарктного рубца у кроликов в эксперименте. В целом динамика морфологических изменений в постинфарктной зоне миокарда у животных опытной группы характеризовалась развитием обильно васкуляризированной рыхлой соединительной ткани с большим количеством мышечных клеток, в отличие от животных контрольной группы, у которых в зоне инфаркта сформировался грубо организованный соединительнотканный рубец.

Морфологические изменения в миокарде кроликов при введении ДБМА при

хронической ишемии

После введения диспергированного биоматериала Аллоплант в миокард кроликов при экспериментальном хроническом инфаркте (через 30 суток после наложения лигатуры) нами были получена не столь яркая морфологическая картина, как вышеописанная при остром варианте патологии. В связи с тем, что границы рубца и сохранного миокарда не бывает четкой и рубцовый процесс в миокарде чаще носит диффузный характер, инъекции проводились, как правило, в околорубцовую зону и лишь у части кроликов были произведены непосредственно в рубец. Более того, в данные сроки миокард уже претерпевает серьезные функциональные и морфологические изменении, носящие адаптивный характер. Поэтому не на всех сроках эксперимента мы сумели проанализировать влияние аллогенного биоматериала именно на сформированный постинфарктный рубец миокарда кроликов. Наиболее четкая морфологическая картина нами была получена только у животных, выведенных из эксперимента через 30 и 60 суток после введения ДБМА.

Через 30 суток после введения ДБМА в рубцовое соединительнотканное образование миокарда несколько набухшие гомогенизированные частицы биоматериала хорошо просматривались на гистологических препаратах. Им-

Рис.14. Набухание и лизис частиц биоматериала (БМ) через 30 суток после введения в рубцовую ткань миокарда кролика. Окраска по методу ван-Гизона. Увел, х 400.

Рис. 15. Экспрессия PCNA ядрами эндотелиоцмтов (Т) через 30 суток после введения биоматериала. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления PCNA. Докраска гематоксилином.Увел, х 200.

Рис.16. Скопления крупных сеетлых клеток (1'), окрашивающихся гшкрофуксином в желтый цвет, среди волокон новообразованной соединительной ткани через 30 суток после введения аллогенного биоматериала в миокард кролика. Окраска по методу аан-Гизоиа. Увел.х 400.

плантированный биоматериал при окраске препаратов по методу ван-Гизона окрашивался какфук-синофильно в красные тона, так и пикринофильно в желтый цвет что свидетельствовало о лизисе отдельных частиц в данный момент (рис. 14).

Между частицами аллогенного биоматериала формировалась новообразованная соединительная ткань, по структуре гораздо более рыхлая, чем ткань постинфарктного рубца. Она состояла из редко расположенных тонких коллагеновых волокон, между которыми в светлом основном веществе определялись большей частью юные фиброб-ласты с округлыми светлыми ядрами и новообразованные сосуды малого калибра. Иммуно-гистохимически при применении моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирую-щих клеток ядра эндотелиоцитоз новообразованных сосудов окрашивались положительно в коричневый цвет (рис. 15).

На препаратах, окрашенных по методу ван-Гизона, среди новообразованной соединительной ткани нами были обнаружены единичные небольшие островки - скопления крупных светлых клеток с большими округлыми или овальными светлыми ядрами, содержащими 1-2 темных ядрышка (рис.16). Ввиду сложности выявления таких редких клеточных скоплений для электронно-микроскопического исследования нам не удалось идентифицировать эти клетки на ультраструктурном уровне. Но, судя по желтой окраске цитоплазмы данных клеток пикрофуксином (желтая окраска характерна для мышечной ткани), можно гипотетически предположить, что это миоцитоподобные клетки или миобласты.

Через 60 суток на гистологических препаратах хорошо просматривались частицы

аллогенного биоматериала, введенного в постинфарктную руб-цовую ткань миокарда кролика. Они располагались точно в толще плотного соединительнотканного рубца.

Структура самого рубца отличалась от структуры рубцовой ткани, сформировавшейся в контрольной группе кроликов, где не были введены в миокард частицы ДБМА. Пучки коллагеновых волокон вокруг биоматериала имели правильный однонаправленный ход. Между волокнами выявлялись узкие сосуды мелкого калибра. Такие же мелкие врастающие сосуды обнаруживались по периферии рубца, хотя ткань миокарда вблизи них имела выраженные контрак-тильные изменения.

При исследовании окружающей рубец ткани миокарда выраженных дистрофичес-', ких изменений не обнаружено. Лишь в кардиомиоцитах, непосредственно прилегающих к рубцу, отмечалось набухание цитоплазмы и признаки контракции миофибрилл. Большей частью кардиомиоциты вокруг регенерата имели характерную для нормы структуру -пучки миофибрилл располагались параллельно, а между ними в ряд цепочкой располагались гетерогенные митохондрии с тонкими кристами.

У тех кроликов, которым аллогенный диспергированный биоматериал не смогли ввести непосредственно в область постинфарктного рубца, а биоматериал попал в неизмененные ткани миокарда, морфологических признаков воспалительных клеточных ; реакций вокруг частиц ДБМА не выявлено (рис. 17). Биоматериал постепенно замещался рыхлой соединительной тканью, среди коллагеновых волокон которой выявлялись от-j дельные кардиомиоциты или их небольшие пучки.

Таким образом, полученные нами результаты гистологических, электронно-микроскопических и иммуногистохимических исследований материала, взятого от кроликов с хронической патологией и после применения ДБМА, свидетельствует о том, что введение аллогенного материала непосредственно в постинфарктную рубцовую ткань миокарда может повлиять на частичную инволюцию грубого рубца с образованием рыхлой соединительной ткани.

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что введение ДБМА инициирует создание ряда благоприятных условий, главным из которых, на наш взгляд, является значительно более низкая, по сравнению с контролем, экспрессия трансформирующего фактора рост а (TGF-ß,), который, как известно, стимулирует пролиферацию фиб-робластов и синтез коллагена (Abraham D. J., Shiwen Xu, Black С. M. et al. 2000; LeaskA., Abraham D. J. 2004). Об этом свидетельствует выявленный нами сравнительно низкий уровень пролиферативной активности фибробластов.

Ключевым фактором в механизме подобного течения постинфарктных морфологи-

Рис. 17. Частицы аллогенного биоматериала (БМ), введенные в неизмененный миокард (М) кролика, через 15 суток. Окраска гематоксилином и эозином. Увел, х 200.

ческих изменений, по-видимому, является высокая активность и фенотипическая зрелость макрофагов. Установлено, что продукты распада коллагеновых волокон биоматериала (коллаген, протеогликаны, структурные гликопротеины) во-первых, являются хе-моаттрактантами для моноцитов, мигрирующих из кровеносного русла, что создает определенную их концентрацию (Серов В. В , Шехгер А. Б., 1981; Шехтер А.Б., 1995), во-вторых, способствуют полноценному созреванию моноцитов в тканевые макрофаги (Мусина Л. А., Муспимов С. А., Лебедева А И, 2006) N. G. Frangogiannis и соавт. считают, что оптимизация межклеточных взаимодействий с помощью цитокинов, секретируемых фенотипически зрелыми макрофагами, способст вует также пролиферации зндотелиаль-ных клеток, что улучшает еаскуляризацию новообразованной ткани в зоне повреждения миокарда. Результаты нашего исследования подтверждают этот тезис, так как у животных опытной группы нами было отмечено усиление пролиферативной активности эндо-телиоцитов.

Можно полагать, что введение аллогенного биоматериала и клеточная реакция на продукты его распада, также создают условия дпя проявления мезенхимными клетками относительно высокой пролиферативной активности, о чем свидетельствуют результаты иммуногистохимического исследования. Ранее с помощью проточной цитофотомет-рии было установлено, что в очаге имплантации аллогеннного биоматериала происходит концентрация не только моноцитов-макрофагов, но и мезенхимных клеток, несущих маркеры, указывающие на их костномозговое происхождение (Курчатова H.H., Нигматулли-на Э.А., Юсупова Р.Ш., Надырченко P.M., Хасанов P.A., Сибиряк C.B., 2006). Они могут определяться как полипотентные мезенхимиые стволовые клетки, которые, в дальнейшем могут дифференцироваться как в фиброблэсты, так и в кардиомиоциты (Fukuhara S, Tomita S, NakataniT, Yutani C, Kitamura S., 2005). Направление дифференцировки, по-видимому, зависит от регуляции межклеточных взаимодействий макрофагами и уровня экспрессии трансформирующего фактора роста

Таким образом, на основании проведенного исследования можно заключить, что аллогенный диспергированный биоматериал, введенный в миокард в постинфарктном периоде, стимулирует репаративную регенерацию с адекватным развитием микрососудистого русла и препятствует образованию грубоволокнистой рубцовой ткани, что позволяет в определенной степени восстановить трофику и архитектонику поврежденного участка миокарда Применение ДБМА при острой ишемии приводит почти к двукратному достоверному снижению летальности животных.

ВЫВОДЫ

^Экспериментальная острая ишемия миокарда, воспроизведенная путем перевязки передней нисходящей ветви левой коронарной артерии, является адекватной моделью дпя изучения ремоделирования миокарда при использовании экзогенных стимулирующих факторов.

2. Разработанный способ введения диспергированного аллогенного биоматериала в миокард с целью оценки его эффективности является надежным и безопасным.

3. Интрамиокардиальное введение аллогенного биоматериала сопровождается минимальной воспалительной реакцией, отсутствием инкапсуляции, полным лизисом и резорбцией материала. Диспергированный Аллоплант активизирует макрофаги и ме-

зенхимную клеточную реакцию, усиливает влияние макрофагальных клеток на структуру образующегося регенерата.

4. Низкий уровень ТвЯ-р, и слабая пролиферативная активность фибробластов обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне миокарда, а более высокая пролиферативная активность эндотелиоцитов и наличие групп миоцито-подобных клеток в зоне введения аллогенного биоматериала подтверждают формирование наиболее адекватного регенерата в миокарде

5. Введение аллогенного материала в ишемизированный миокарда животного на поздних сроках улучшает трофику постинфарктного рубца с образованием рыхлой соединительной ткани и не приводит к формированию анеризмы левого желудочка в месте имплантации.

6 Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных, что открывают перспективы для клинической апробации технологии имплантации биологического материала Аллоплант в лечении инфаркта миокарда

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Технология имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительного процесса в миокарде может быть использована как один из методов стимуляции репарационных свойств поврежденного миокарда

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Андриевских, С И. Динамика альтеративных, воспалительных и репаративных процессов в миокарде кролика при экспериментальной ишемии / С.И. Андриевских, A.B. Чукичев, Е Л. Куренков // Материалы региональной научной конференции "Актуальные вопросы морфогенеза и регенерации органов грудной и брюшной полости". - Екатеринбург, 2003 -С 46.

2 Андриевских, С И. Кардиомиопластика биологическим материалом Аллоплант/ С.И. Андриевских // Сборник рефератов научно-исследовательских работ аспирантов. - Челябинск, 2003 -С 41.

3 Андриевских, С.И. Применение диспергированного биоматериала Аллоплант для коррекции ишемического повреждения миокарда в эксперименте / С.И. Андриевских // Материалы Всероссийской научной конференции посвященной столетию со дня рождения профессора А.Н Максименкова "Анатомо-физиологические аспекты современных хирургических технологий", - г. Санкт-Питербург, 2006. - С. 67.

4. Андриевских, С И. Стимуляция репаративных процессов в поврежденном миокарде с помощью биологического материала Аллоплант в эксперименте / С.И. Андриевских, С А. Муслимов, А В. Чукичев// Материалы 1-го Российско-Чешского форума. - Челябинск 2006 - С. 28

5. Андриевских, С И. Перспективы регенеративной терапии сердечной патологии в экспериментеI С.И. Андриевских, С.А. Муслимов, А В. Чукичев// Материалы 2-го Россий-ссо-Чешского форума. - Прага 2008. - С. 24.

6. Андриевских, С.И. Применение аллогенного диспергированного биоматериала для стимуляции регенерации миокарда после ишемического повреждения в эксперименте /С.И. Андриевских, С.А. Муслимое, A.B. Чукичев, Л.А. Мусина // Уральский медицинский журнал. - Екатеринбург, 2008. - №2 (42). - С. 91 -94.

7. Мулдашев, Э.Р. Применение аллогенного биоматериала для коррекции постинфарктного рубца и регенерации кардиомиоцитов в эксперименте / Э.Р. Мулдашев, С И Андриевских, С.А. Муслимов, A.B. Чукичев, Л.А. Мусина// Материалы IV Всероссийского съезда трансплантологовпамяти академика В.И. Шумакова. - Москва - 2008. - С. 265 -266.

СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В АВТОРЕФЕРАТЕ

ПНВ Л КА - передняя нисходящая ветвь левой коронарной артерии ДБМА - диспергированный биоматериал Аллоплант®

На правах рукописи

АНДРИЕВСКИХ Станислав Игоревич

ИМПЛАНТАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА АЛЛ ОПЛАНТ КАК СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАЦИИ ИШЕМИЧЕСКИ ПОВРЕЖДЕННОГО МИОКАРДА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.27-хирургия 14.00.15 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2008

Отпечатано в полиграфическом отделе ООО "Институт медико-социальных исследований". Подписанов в печать 19.11.2008 г. Формат 60x84 Vte Бумага офсетная. Гарнитура Arial Суг. Усл. п.л. 1,0. Печать на ризографе. Тираж 100.

Актуальность проблемы. Ишемическая болезнь сердца остается одной из главных причин, определяющих высокий уровень инвалидизации и смертности работоспособного населения во всём мире (Сыркин A.JL, 1998; Бокерия JI.A., Гудкова Р.Г., 2006 и др.).

В 2006 году сердечно-сосудистые заболевания по-прежнему являлись основной причиной смертности в России, вызывая более 50% летальных исходов (Гудкова Р.Г., 2006 год). Свыше миллиона американцев перенесли инфаркт миокарда или острый коронарный синдром, 40% из них погибли. Среди оставшихся в живых 22% мужчин и 46% женщин относятся к IV классу сердечной недостаточности по NYHA. Пятилетний период смертности в этой группе составил 50% (2001 Heart, and stroke statistical update. American Heart Association.).

Основное место среди заболеваний сердечно-сосудистой системы у взрослого населения занимает ишемическая болезнь сердца - 46,9% случаев (Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. 2002).

Хроническая сердечная недостаточность (ХСН), субстратом которой, прежде всего, является кардиосклероз, как наиболее частый исход ишемиче-ской болезни сердца, так же является весьма актуальной медико-социальной проблемой. По данным В.А. Алмазова и С.В. Шляхтова (1995), ХСН страдают около 1% взрослого населения страны, и 10% людей старше 75 лет. Ежегодно случаи ХСН выявляются в группе людей от 35 до 65 лет, составляя в среднем 3 случая на 1000 населения, а в группе старше 65 лет - более 10. Однолетняя выживаемость в группе со среднетяжелым течением ХСН приходится на 79-86% населения, в группе с тяжелым течением - 50-70% (Терещенко С.Н., 2000).

В последние годы большое внимание уделяется процессу постинфарктного ремоделирования левого желудочка сердца, представляющего собой структурную и функциональную перестройку левого желудочка, которая . происходит после острого инфаркта миокарда. Результатом этих морфо-функциональных изменений являются выраженная дилатация и изменение геометрической формы левого желудочка, что ведет к его систолической и диастолической дисфункции и развитию хронической сердечной недостаточности (Беленков Ю.Н., 1997). Процессы, происходящие в миокарде после острой ишемии, приводят к необратимым морфологическим и функциональным изменениям в сердце (Румянцев П.П., 1982; Непомнящих J1.M., 1991; Автандилов Г.Г., 1984; Гуцол А.А., 1990; Бышевский А.Ш., 1994; Дмитриева Е.М., 1983; Клишков А.А., 1984; Краковский А.А., 1992; Саркисов Д.С., 1979; Сокрут В.Н., 1991; Сыркин А.Л., 1998; Фетисова Т.В., 1975,1976; Фролов В.А., 1989 и другие).

Большую эффективность в лечении сердечной недостаточности, связанной преимущественно с коронарной патологией, приобрели малоинвазив-ные и хирургические методы, такие как транслюминальная ангиопластика и стентирование коронарных артерий, прямая реваскуляризация миокарда или аортокоронарное шунтирование, динамическая кардиомиопластика, реконструктивные операции на левом желудочке и, конечно, трансплантация сердца (Бураковский В.И., Бокерия JI.A., 1996; Краковский А.А., 1992; Шумаков В .И., 2003).

Пересадка сердца без сомнения является достаточно радикальным и эффективным методом лечения декомпенсированной сердечной недостаточности (Бураковский В.И., Бокерия JI.A., 1996; Шумаков В.И., 2003), однако повсеместное применение данной технологии сегодня ограничено по ряду причин, среди которых немало важное значение имеет иммунологический конфликт донора и реципиента, а так же крайне небольшое количество доноров (Забирски Дж. Б., 1984; Долгих В.Т., 2000).

В последнее время широко обсуждаются возможности применения клеточной кардиомиопластики в лечении кардиологических больных. Для заместительной терапии инфарктного миокарда используется различные клеточные линии — клетки-сателлиты поперечно-полосатой мускулатуры или скелетные миобласты, взрослые и фетальные кардиомиоциты, ген-модифицированные клетки костного мозга, стволовые клетки костного мозга, факторы роста гепатоцитов и т.д. (Сухих Г.Т., Репин B.C., 1998; Потапов

И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко И.А., 2001; Beltrami А.Р.,2001, 2002, 2003; Bittira В., 2003; Strauer В.Е., 2002; Hamano К., 2002; Hughes S., 2002; Kadner A., 2002; Li R.-K., 194, 1995, 2002, 2003; Miyagava S., 2002; Kajstura J., 1995, 1997, 2001, 2003; Menasche P., 2003; Ruhparwar A., 2002; Reinecke H., 2002; Roell W., 2002 и другие).

Несмотря на видимую эффективность применения донорских или собственных клеток для лечения некоторых форм сердечной недостаточности, метод клеточной кардиомиопластики имеет ряд нерешенных этических и технических моментов. До сих пор нет юридической основы для использования данной технологии в клинической практике. Окончательно не решены вопросы технологии заготовки и хранения клеточного материала, обеспечения его достаточности и жизнеспособности после трансплантации, нет четкой ясности с проблемой дифференцировки клеток и многие другие (Потапов И.В., Крашенинников М.Е., 2001; Orlic D., 2002; Menasche Р., 2003; Li R. -К., 1997; Reinecke Н., 2002). Поэтому изучение возможности применения доступных и разрешенных биологических материалов для стимуляции репара-тивных процессов в органах и тканях, в том числе и в поврежденном миокарде, остается весьма актуальным.

В середине 70-х годов в г. Уфа в ходе решения проблемы снижения антигенных свойств аллотрансплантантов профессором Э.Р. Мулдашевым и его единомышленниками был создан и клинически широко внедрен спектр биологических материалов под торговой маркой Аллоплант®. Сегодня данный препарат успешно используется не только в хирургии глаза, но и в реконст-руктивно-восстановительной, пластической, челюстно-лицевой хирургии, ге-патологии и гастрохирургии (Муслимов С.А., 2000).

Основным эффектом действия материалов серии Аллоплант является стимуляция регенерации тканей и дифференцировки клеточных элементов, и как следствие этого, снижение интенсивности образования рубцовой ткани (Мулдашев Э.Р., 1994; Нигматуллин Р.Т., 1995). Его низкие антигенные свойства, способность полностью резорбироваться не вызывают усиления воспалительной реакции в зоне повреждения. Результирующей всех этих свойств является образование функционально полноценного регенерата (Мулдашев Э.Р., 1994; Нигматуллин Р.Т., 1995; Муслимов С.А., 1984).

Такие биологические свойства, представляющие не только теоретический, но и практический интерес, привели нас к мысли о возможности использования диспергированной формы материала Аллоплант с целью ремо-делирования ишемически поврежденного миокарда. Исследования в этом направлении ранее не проводились, в связи с этим нами была поставлена цель.

Цель исследования: Изучить влияние материала Аллоплант на морфологическую структуру миокарда в различные сроки экспериментальной ишемии и обосновать возможность его применения в лечении острого расстройства кровообращения сердца.

В соответствии с указанной целью необходимо были решить следующие задачи:

1. Воспроизвести адекватную модель экспериментального инфаркта миокарда и морфологически оценить динамику развития репаративных процессов в подострую и хроническую фазу ишемического повреждения миокарда.

2. Разработать хирургический способ имплантации биоматериала Аллоплант при экспериментальной ишемии миокарда.

3. Морфологически охарактеризовать и сравнить особенности течения репаративных процессов в инфарцированном миокарде после имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительной реакции.

4. Оценить баланс пролиферативно-клеточных и фибропластических процессов в ишемически поврежденном миокарде в зависимости от сроков имплантации биологического материала Аллоплант на основе иммуногисто-химически исследований экспрессии PCNA-ядерного антигена пролифери-рующих клеток и TGF-(31 - трансформирующего фактора роста.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые для стимуляции репаративных процессов и ремоделирования инфарцированного миокарда экспериментально использована диспергированная форма биологического материала Аллоплант. Установлено, что выбранный способ введения аллогенного биомаериала в миокард является безопасным и надежным. Доказано, что низкий уровень индуктора фиброза — трансформирующего фактора роста TGF-bl и слабая пролиферативная активность фибробластов при применении аллогенного биоматериала обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне миокарда кроликов. Выявлено, что формирование функционального регенерата в миокарде экспериментальных животных после использования аллогенного биоматериала сопровождается васкуляризацией и появлением групп миоцитопо-добных клеток. Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных. Обнаружено, что введение аллогенного материала в ишемизированный миокарда животного на поздних сроках вызывает частичную инволюцию грубого рубца с образованием рыхлой соединительной ткани и не приводит к формированию аневризмы левого желудочка в месте имплантации.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. .Воспроизведение экспериментальной острой ишемии миокарда, путем перевязки передней нисходящей ветви коронарной артерии, является адекватной моделью для сравнения и систематизации регенераторно-пластических преобразований миокарда при изучении экзогенных стимулирующих факторов.

2. Разработанный интрамиокардиальный способ имплантации биоматериала Аллоплант после острой ишемии является безопасным, не приводит к формированию аневризмы левого желудочка сердца и снижает летальность животных.

3. Введение аллогенного биоматериала в ишемизированную зону миокарда у экспериментальных животных активизирует макрофаги, мезен-химную клеточную реакцию, усиливает влияние макрофагов на структуру образующегося регенерата. Низкий уровень индуктора фиброза TGF-bl и слабая пролиферативная активность фибробластов обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне после введения аллогенного биоматериала. Васкуляризация и появление групп миоцитоподобных клеток в миокарде после введения аллогенного биоматериала подтверждают формирование функционального регенерата.

4. Применение аллогенного материала на поздних сроках улучшает трофику постинфарктного рубца с образованием рыхлой соединительной ткани.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

На основе полученных морфологических результатов и разработанной технологии имплантации материала Аллоплант осуществлен подробный качественный и количественный сравнительный анализ патоморфологических изменений в миокарде до применения материала и после его использования. Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных, что открывают перспективу для клинической апробации технологии имплантации биологического материала Аллоплант в лечении повреждений миокарда. Технология имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительного процесса в миокарде может быть использована как один из методов стимуляции репарационных свойств миокарда.

Теоретические и практические результаты исследования используются в педагогическом процессе на кафедре оперативной хирургии и топографической анатомии и на кафедре хирургических болезней реаниматологии и интенсивной терапии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные результаты работы доложены на региональной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза и регенерации органов грудной и брюшной полости» (г. Екатеринбурге, 2003); на Всероссийской научной конференции, посвященной столетию со дня рождения профессора А.Н. Максименкова «Анатомо-физиологические аспекты современных хирургических технологий» (г. Санкт-Питербург, 2006); на первом Российско-Чешском медицинском форуме (г. Челябинске, 2006); на обществе хирургов Челябинской области (2007); на межучережденческом заседании кафедр оперативной хирургии и топографической анатомии, общей, факультетской и госпитальной хирургии, патологической анатомии ГОУ ВПО ЧелГМА и отдела морфологических исследований ФГУ "Всероссийский центр глазной и пластической хирургии" (г. Уфа) (2008).

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальная острая ишемия миокарда, воспроизведенная путем перевязки передней нисходящей ветви левой коронарной артерии, является адекватной моделью для изучения ремоделирования миокарда при использовании экзогенных стимулирующих факторов.

2. Разработанный способ введения диспергированного аллогенного биоматериала в миокард с целью оценки его эффективности является надежным и безопасным.

3. Интрамиокардиальное введение аллогенного биоматериала сопровождается минимальной воспалительной реакцией, отсутствием инкапсуляции, полным лизисом и резорбцией материала. Диспергированный Аллоплант активизирует макрофаги и мезенхимную клеточную реакцию, усиливает влияние макрофагальных клеток на структуру образующегося регенерата.

4. Низкий уровень TGF-pl и слабая пролиферативная активность фибробла-стов обусловливают минимальное развитие фиброза в ишемизированной зоне миокарда, а более высокая пролиферативная активность эндотелио-цитов и наличие групп миоцитоподобных клеток в зоне введения аллогенного биоматериала подтверждают формирование наиболее адекватного регенерата в миокарде.

5. Введение аллогенного материала в ишемизированный миокарда животного на поздних сроках улучшает трофику постинфарктного рубца с образованием рыхлой соединительной ткани и не приводит к формированию аневризмы левого желудочка в месте имплантации.

6. Применение аллогенного биоматериала при экспериментальной острой ишемии снижает летальность животных, что открывают перспективы для клинической апробации технологии имплантации биологического материала Аллоплант в лечении инфаркта миокарда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная технология имплантации биологического материала Аллоплант в различные фазы воспалительного процесса в миокарде может быть использована как один из методов стимуляции репарационных свойств поврежденного миокарда.