Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунологический скрининг биологически активных модификаторов противоопухолевого иммунитета

российская акадеш ведкцннсш НАУК онкологический ндачнвя центр

На правах рдкогшса

ЯТША Парима Вячеславовна

ЙШНОЛОГИЧЕСШ СКРИНИНГ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ 110ДКШАТ0Р0В ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИИЦУНИТЕТА

<4.00.14. - онкология

Автореферат Пвссертаци» на сонсканпв ученой степени кандидата биологических наук

[Зосква - 199t г.

Работа выполнена в Онкологическом научно» центре РАМН Научные руководители:

доктор медицинских наук

Кчпин В.И.

доктор медицинских наук Каипова-Полевая Е.Б.

Официальные опоненти:

доктор ведмцинскнх наук, профессор Петагмн В.П. доктор оиологическик наук, профессор Кузнецов В.П.

Ведущая организация - Научно-исследовательские институт онкология им. Il.fi. Герцена

Запита диссертации состоится: " .".. .. 1994 г. на

заседании Специализированного Совета /К.001.17.01/ Онкологического научного центра РАМН / 115478. Еосква. Каширское воссе, 24 /

С диссертацией нояно ознакомится о библиотеке Онкологического научного центра РАйН.

{¡эторефераг разослан "........".............. 1994 г.

УченыА секретарь Специализированного Совета, доктор кедкцинсккх наук, профессор ТУРУСОВ В.С

Актуальность теиы: Последние годы ознаменовались значительным прогрессом в изучении иммунологии опухолей и расвирением исследований а этой области у нас в стране и за рубеаом. Оптимизация методов диагностики и терапии онкологических заболеваний тесно связана с углублением знаний о состоянии иммунной системы. Учитывая измененную имиунологическув реактивность организма онкологических больных, а такае тот факт, что все применяемые методы лечения опухолей оказывапт неблагоприятное воздействие на систему иммунитета, необходимым компонентом лечения у данной категории больных мояет стать иммунотерапия (Кадагидзе .З.Г., 1984,1988). В иммунотерапии злокачественных новообразований ис-польэуптся различные природные и синтетические средства. Все вире стали применятся схемы лечения больных с применением методов иммунотерапии (Т -активина, интерферона и его индукторов,-биологически активных адаптогенов, противоопухолевых полисахаридов, витаминов,физических факторов воздействия) которые иовно обьедииить под одним общим названием - биологически активных кодификаторов иммунитета (ШИКИусатов В.К., 1988,Полевая Е.Б. 1988, Купин В.И.\ 1385). Некоторые из этих препаратов обладаит токсичностьо, ииогда вызывают.побочные реакции. В связи с этин. в .настоящее время,, ведется активный поиск веществ. лкпенных перечисленных недостатков, а такае обладавших вырааенным модулирующим эффектом : на различные звенья иммунных реакций, значимых при развитии противоопухолевого инмунитета. С этих позиций особый интерес вызываат вещества, регулирупцие гонеостаз.так называемые адаптогены.

. В экспериментальных исследованиях показана противоопухолевая и противоиетастатическая активность изучаемых адаптогенов (Дар-дниовИ.В,.1986,Лазарев Н.В.,1965,Яременко К.В..1981). В реализации этих эффектов вашая роль принадлеиит иимуноиодулирупщему действии этих препаратов.Помимо этого,адаптогены низкотоксичны, что ванно учитывать при высокой токсичности применяемых в онкологии средств.. Один и тот.яе имиуномодулирутдий препарат. независимо от имевшегося у больного иммунологического дефекта монет привести к различному эффекту,в связи с генетической неоднородности популяции .человека.С появлением моноклональных антител (ИКйТ) ппоявилась - возиоаность тонкого и точного анализа субпо-пуляционного состава лимфоцитов периферической крови, который обьективно характеризует состояние иммунной системы больного. Использование НКЙТ в иониторинге иммунного статуса неуклонно распиряется,оттесняя на второй план другие методы иммунологического обследования Скоаные тесты и т.д.). Выявление различных нарупений с последующей их коррекцией при понощи иммунокорреги-рупцих препаратов, а также.тщательное изучеиие их действия на систему иммунитета, отработка показаний и противопоказаний к их применению в комплексной терапии онкологических больных, представляет несомненный научный интерес. Становится ясно,что применение методов иммунотерапии в онкологическая практике

должно строго контролироваться с учетом ииешжихся иммдноло-гических нарушений и их динамики под влиянием лечения, а также индивидуальных особенностей больных и свойств используемого им-муноыодулятора.

Таким образом, изучение особенностей иммунного статуса онкологических больных tPHI и Иеланома) характера его изменений в процессе лечения .а также имыуномониторинг биологически активных модификаторов иммунитета (ИМИ).является чрезвычайно актуальным в онкологии.

Цель исследования:

Осуществить иммунологический скрининг бишгагитескн активных модификаторов иммунитета(БОИИ) в системе "in vitro" и "invivú" для разработки адекватных методов иммунокоррекции, способствув-цих повыиению эффективности комплексного противоопухолевого лечения.

Задачи исследования:

1. Определение в системах Tn vitro* и "in vivo" направленности иммуномодулирцпщего действия различных видов биологически активных модификаторов иммунитета с определением индивидуальной чувствительности:

а). Экстракта элеутерококка отечественного, производства горнотаежной станции Хабаровского края.

б). Злеукокк 301-8 -производство Германии.

в). Противоопухолевых полисахаридов растительного происхождения, выделенных из внсяих грибов "Ganoderaa LuciduM".

г). Комплексных противоопухолевых растительных препаратов

( Астрагал, Hi jia. HLXfl. Препарат проф. Song llu Line >.

д). Лазерной адоптивной фотоиммунотерапии.

2. Изучить влияние биологически активных модификаторов иммунитета на соотношение основных нммунорегуляторннх субпопуляций Т-лимфоцитов "in vitro" с применением метода лазерной проточной цитометрии.

3. Оценить клиническую и иммунологическую эффективность использования биологически активных модификаторов иммунитета, а также разработать рекомендации возможности их применения в клинической практике на основании современного иммунологического скрининга.

Научная новизна:

На больяом экспериментальном материале, с помощью метода проточной лазерной цитометрии с набором моноклональных антител, впервые локазана возможность отбора биологически активных модификаторов иммунитета. С учетом индивидуальной чувствительности

к ним обследуемого больного еще до назначения ему какого-либо лечения позволяет оптимизировать применяемые иимунокоррегиру-ицие препараты, учитывая особенности состояния иммунной системы каядого отдельного больного.

На основании этого разработаны и внедрены в практику метода применения различных биологически активных модификаторов иммунитета последующей коррекцией их назначения "in vivo".

Научно-практическая значимость:

1. Показана целесообразность вклпчения природных биологически активных модификаторов иммунитета таких как элеутерококк. Элеу-кокк 301-В. Ganoderna L и физических воздействий, таких как лазерная адоптивная фотоицмунотерапля.в комплекснуп терапии онкологических больных ( ракой ыолочной железы и неланоиы).

2. Показана возмогность моделирования и подбора"in vitro" тестируемых биологически активных модификаторов иммунитета(БАНИ) каздоау отдельному больному на лазерной проточной питометре с набором УКЙТ, с учетом индивидуальной чувствительности больного к препаратам и конкретной дозе еце до назначения лечения больному.

3. Показана целесообразность изучения иммунного статуса у больных раком молочной гелезы и неланомой в процессе противоо-' пухолевой терапии и после нее,что позволяет своевременно выделить группы больных,нуядаюцихся в имиунокоррекции.

Внедрение в практику:

Полученные данные позволяпт моделировать и подбирать "in vitro" различные исследуемые биологически активные модификаторы имнунитета(БМИ) индивидуально каядому больному,на лазерной проточном цитонетре с набором УКАТ , с учетом индивидуальной чувствительности больного к препаратам и конкретной дозы,до назначения больному какого-либо лечения, что позволяет целенаправленно проводить методы иммунотерапии биологически активными модификаторами иммунитета (БАНИ) в комплексной лечении больных раком молочной яелезн и меланомой.

Апробация диссертации состоялась 29 ииня 1933 года на совместной конференции лаборатории биологических модификаторов противоопухолевого иммунитета НИИ ЗДиТО,лаборатории трансплантации костного ыозга, отдела экспериментальной химиотерапии опухолей, лаборатории по создании нетоксических иммуномодуля-торов, группы лазерных методов лечения опухолей, группы первичного 'отбора "in vitro" .группы химии природных соединений, отделения опухолей молочных аелез.

Обьем и структура диссертации:

Диссертация состоит из введения,обзора литературы.описания материалов и методов исследования.изложения собственных данных, обсуждения полученных результатов.выводов и указателя литературы.Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста.Работа содержит 45 таблиц, 9 рисунков.Библиография содержит источников.

Материалы и методы:

В исследовании представлены данные по изучении влияния таких биологически активных модификаторов иммунитета (ВАМИ) как элеутерококк.Злеукокк 301-В,противоопухолевых полисахаридов растительного происхождения,выделенных из высвих грибов Ganoderoa Lucidua .комплексных а/о растительных препаратов.а также лазерной адоптивной фотоиммунотерапии на лимфоциты периферической крови больных раком молочной железы и меланомой и первые результаты применения этих препаратов в качестве имму-номодуляторов. В работе проведен анализ иммуномодулируючего действия с определением индивидуальной чувствительности "in vitro" различных биологических модификаторов иммунитета у 160 человек,из них 80 больным: 19 меланомой кожи и 61 раком молочной железы.а также 80 донорам.

Для изучения системы клеточного и гуморального иммунитета в работе были использованы следующие методы исследования:

1. Определение иммуномодулируючей активности биологических модификаторов иммунитета (элеутерококк, Злеукокк 301-В, Ganoderaa Lucidua и Ganodema Applanatun).

2. Определение количественного состава лимфоцитов при по-иоци сканирующего цитофлиорографа ORTHO -SPECTRUH-3. Выделение ' мононуклеарных клеток периферической крови проводили по стандартной методике,предлагаемой фирмой ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS (CBfl). В работе были использованы моноклональные антитела фирмы ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS : ОКТ-З.ОКТ -4.0КТ-8.0КТ 4 /ОКТ 8. Leu?,а также антитела серии ИКОС лаборатория клинической радиоиммунологии ОНЦ РАИН) Ш-86.ИК0-20.ИК0-1.Основные характеристики используемых нами антител приведены в таблице N 1.

3. Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови человека проводили по стандартной методике на градиенте плотности фиколл-верографин.

4. Методика постановки реакции ТЕа-РОК (Т-активного розет-кообразования).

5. Методика постановки реакции ТЕобч-РОК (Т -обчего розет-кообразования).

6. Варианты определения теофиллин-чувствительных Т -лимфоцитов.

7. Определение цитолитической активности естественных киллеров селезенки.

8. Реакция бласт трансформации (РБТЛ).

9. Методика выделения лимфо-лейкомассы на сепараторе крови "AHINCO CENTRIFUGE" (CIA).

Таблица N 1.

Основные характеристики МКйТ.

Название МКЙТ Кластер ДИффер. Специфичность Нол.масса антигена Распределение

ИК0-86 ОКТ-4 СД-4 Г-хелперы/ индукторы 64 802 тимоциты 60Z периферические Т-лим,-фоциты

ИКО-31 ОКТ-8 СД-8 , Т-супрессоры/ цитотоксические 33/76 802 тимоциты 35% периферические Г-лиы-фоциты

ИК0-20 СД-38 45 кД Все тимоциты. активир. Т-лим-фоцитн и плазм, клетки естественные

ИК0-1 HLft II класса 29:34 В-клетки,моноциты,активированные Т-лим- фОЦИТЫ.

Реяиы и доз» приема препаратов:

Работа содержит клинические и экспериментальные данные полученные как в системе "in vitro",так и " i n vivo" у больных, получавших различные препараты. Все исследуемые препараты были протестированы на . лимфоцитах, выделенных из периферической крови больных РИ8.и Неланоаой.'Чп vitro" с определением индивидуальной чувствительности к препаратам в концентрациях : 1мг /ыл, 0,1 ыг/мл, 0,01 мг/ыл.

В первой части нашего исследования "in vivo" группа доноров женщин принимала препараты в следующем порядке:

Элеутерококк (отечественного производства) - 20 доноров Элеукокк 301-D Германия - 15 доноров

Плацебо Германия - 15 доноров

Доноры в течение 4 недель .три раза в день принимали препарат по 15-20 нл до еды.

В дальнейшей навей работе "in vivo" была обследована группа доноров из 12 яенцин добровольцев. Диноры получали 10% водный экстракт препарата Ganoderma'Lucidua "per os" до еды по 3 мг

ежедневно в течение месяца. (I также группа вольных ракой молочной железы добровольцев - 8 человек.которые получали 10Z водный экстракт Ganoderoa Lucidua аналогично донорам. В следующей части навей работы к 15 больным раком молочной гелезы был применен метод адоптивной фотоиммунотерапии "in vivo".

Статистическая обработка результатов: .

Доверительность полученных результатов оценивалась по критерию Фимера-Стьюдента.Значимыми считались результаты с вероятность«) не менее 95% (р < 0,05).

Результаты исследований и их обсуждение:

С-появлением моноклональных антител (ИКАТ) появилась возможность тонкого и точного анализа субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови .который обьективно характеризует состояние иммунной системы больного.Осуществить этот анализ позволяет лазерный цитофлворограф. На основе принципа лазерной техники были созданы специальные приборы и разработаны новые методы проточной цитометрии.которые обладают широкими возможностями и позволяют отбирать из потока заданные популяции клеток по их размерам при помощи флпоресцентного окрашивания.Кроме того.метод по известным признакам позволяет отличить нормальные клетки от злокачественных.мертвые от живых,разделить лейкомассу на -составляющие форменные элементы. Возможности этих приборов таковы,что с его помощью можно анализировать и сортировать до 1000 клеток в секунду в непрерывном потоке,получая обьективгые и статистичеки достоверные результаты.Использование набора - НКАТ и специальных красителей позволяет осуществить субпопуляционный и иммуномодуляторный анализ исследуемых проб.

Иммуномодулирующее действие различных препаратов из Элеутерококка в системе "in vitro" и "in vivo" у доноров и больных.

Нам представлялось интересным изучить "in vitro" иммуномодулируичее действие на иммунокомпитентные клетки доноров,различных препаратов,приготовленных на основе экстракта элеутерококка.а также других различных препаратов биологически активных модификаторов иммунитета.Лимфоциты донора или больного инкубировали с исследуемыми препаратами,затем добавляли оп-релеленное IIKAT и исследовали с помощью метода лазерной проточной цитометрии.Данный раздел работы примечателен тем,что впервые с помощью набора МКАТ была предпринята попытка определения индивидуальной чувствительности доноров и больных "in vitro" к

различным изучаемым препаратам.Необходимо подчеркнуть важность определения индивидуальной чувствительности как у доноров.так и у больных при применении оиологически активных модификаторов иммунитета с цельи иымунокоррекции и иммунотерапии i Мусатов В.К.1389),В работе Хван ден Хака1138Эг.)и Полевой Е.Б.(1389г.) имептся данные .доказываииие высокую коррелятивную связь между определением иммуномодулируюцей активности препаратов "In vitro"H"in vivo".что может способствовать индивидуализации терапии.Поэтому в представляемой работе перед назначением препаратов больным определялась индивидуальная чувствительность в тестах'Чп vitro".Согласно полученным нами данным.изучаемые преперашэкстракт Элеутерококка отечеств..Элеукокк проиэводст ва -Германия )у больвинства исследуемых доноров.а также боль-ных(меланомой) в тесте "in уЛго"вызывали стимуляции иммунологических показателей и обладали выраженным иммунным действием.

Четкое проявление индивидуальной чувствительности можно проиллюстрировать примером иммунологических показателей донора К к определяемым препаратам элеутерококкам Табл.2) и сделать вывод о целесообразности назначения донору препарата элеутерококка (Eleutherococcys senticocus) с помочью метода проточной цитометрии с использованием набора ИКАТ у донора К "in vitro".

При приеме донорами препаратов в динамике также прослеживается положительный эффект на иммунологические показатели. Влияние Элеукокка 391-В Германия на отдельные иммунологические показатели были неоднозначны: Элеукокк снижал общее количество зрелых лимфоцитов,тогда как Элеутерококк отечественный повыяал их количество.На хелпернув активность Элеукокк 301-В не оказывал влияния, отечественный препарат ее стимулировал.На супрес-сорнуо активность Элеукокк также не влиял, отечественный элеутерококк снижал ее у доноров.(ТаБл.З).

Таблица N 2.

Межд.нормы ИКАТ Назв. пр-та. инд.И 45 6.2 28.6 4.1 Д.5 23 4,7 90 9.2

ОКТ 4 UKT 0 0KT4/ÜKT8 Gai(EK) Gf7( В кл)

29.5 24.5 1.2 43,1 76.3 "

Элеутерококк отечественный 0,01 мг/мл 45.0 27.9 1.6 34.6 80.8

Элеукокк Германия СН-В-301 0,01 мг/мл 42.2 25.2 1,6 29,3 65.6

Плацебо Германия СН-В-601 0,01 мг/мл 43.1 24,0 1.7 40.3 84,8

Таблица 3.

Изменение иммунологических показателей у доноров "до" и "после" приема препарата Элеукокк 301-В "in vitro".

Время иссл. Та Тобч| "Гк T"h" T"s" ОКТЗ 0КТ4 0KT8Í0КТ4 J 0КТ8 Leo7 Nk 10:1

"До" 43,1 1.7 50,2f39.2 1.7] 2,4 30.0 1.4 9.2" 0.7 73.5 1.62 58.3 1.8 18,9¡З.З 1.1(0.25 14.4 1.1 31.8 2,9

"После" 31,3 2.1 41,8 33,3 2.0 1.7 18.6 1.7 14,6 1.5 69.6 2.0 59.2 2.6 17.2 3.8 1.4 0.37 12.1 0.79 27.1 3,6

р < 0,05

Нами установлено, что экстракт элеутерококка (отечественного производства, Горно-таежной станции Хабаровского края) лучиим образоы зарекомендовали себя при назначении как донорам, так и онкологическим больным. Он повивал неспецифическуа резистентность.благоприятно действовал на показатели иммунитета, не обладал токсичностьи.аллергенностьи.был оезопасен при длительных приемах. К сожалении этого нельзя о препарате Элеукокк 301-В. производство Германия, и хотя препарат был создан на основе отечественного экстракта элеутерококка.при клинических испытаниях был отмечен ряд побочных эффектовпри его приеме "pernos". Достоверное увеличение иммунологических показателей у доноров показано в работе и отражено на рис.1.

Иммунологические показатели доноров на фоне применения элеутерококка отечественного "in vitro".

Рисунок 1.

707.

607.

т

407. 302 207.

0 I III 111

CD 3 CD 4 CD 8

С^З ~ ДО I-1 ~ ПОСЛЕ

- э -

Нами показано,что доноры более чувствительны к препарату элеутерококка в низких концентрациях, когда как больные (нела-номой и PUS) были чувствительны к средним и высоким концентрациям.Это также согласуется с данными работы Свткиной Н.И.(1993) которая показала, что чем больяе стадия заболевания, тем выше чувствительность к препаратам. Следовательно,с увеличением распространенности процесса необходимость включения в схемы противоопухолевой терапии даннннх препаратов повыиается. В результате наиих исследований "in vitro" было показано, что больные ме-ланомой более чувствительны к препарату элеутерококка в средних и высоких концентрациях. Препарат элеутерококка при действии на лимфоциты человека "in vitro", как и "in vivo" вызывал стимуляции как у доноров, так и у онкологических больных.

Сравнительное изучение иниуномодулирувцего действия экстрактов элеутерококка с помочью метода проточной цитонетрии с использованием набора НКАТ у больного неланоыой И-ва "in vitro".

Таблица 4.

Невд.нормы HKRT Назв. пр-та. инд.Н 45 6.2 28,6 4.1 2,6 3,2 23 4,7 90 9.2

0KT 4 . 0KT 8 0КТ4/0КТ8 Gul(EK) Gf7(B кл)

43,9 26,3 1,6 14.4 66,9

Элеутерококк отечественный 1,0 мг/мл 0,01 мг/мл 58,5 56,8 26,5 29,5 2.2 1.9 44.5 62,0 94,0 86,0

Злеукокк Германия СН-В-301 •1,0 мг/мл 0,01 мг/мл 54,7 66.9 29.5 28.6 . 1,8 2,1 33,9 33,0 89,7 90,3

Плацебо Германия СН-В-601 1,0- мг/мл 0,01 мг/мл 53,6 55,6 25,9 28,1 2.0 1,9 33,0 29,0 87,4 87.4

Приведенная таблица 4 подтверждает нави данные о иммунпмо-дулирующеы действии экстракта элеутерококка отечественного производства на иммунологические показатели больных меланомой. Нами показано, что общебиологическое действие его опосредуется через иммунологические механизмы, а сам' элеутерококк молю от-

нести к группе препаратов, обладавших выраженным иммуномодули-рующим действием.

Анализируя данные, полученные с использованием различных препаратов элеутерококка, при помощи метода лазерной проточной цитометрии с широким набором МКАТ, "in vitro" позволяет выявить различную индивидуальную чувствительность как у доноров, так и у онкологических больных к исследуемым препаратам. Использование лазерного проточного цитометра открывает вирокие возмов-. ности моделирования различных комбинаций препаратов "in vitro" еще до назначения и према больными препаратов, что несомненно увеличивает эффективность иммунотерапии и способствует ее индивидуализации.

Иммуномодулирующее действие различных препаратов Ganoderna Lucidua в системе "in vitro".у доноров и больных.

За последние годы во всем мире выполнена огромная работа по изысканию новых противоопухолевых веществ, извлекаемых из растений, а такие полисахаридов, обладающих выраженной противоопухолевой активностью, выделенных из высших грибов GanoderMa Luciduo. Данными этой работы подтверждаются исследования, которые показывают, что среди препаратов растительного происхождения, обладающих противоопухолевой активностью, многие способны обладать иммуномодулируищей активностью. Изучение разнообразных препаратов, таких как Ganoderaa Lucidua и Ganoderaa Applanatim показало, что у больных РНЕ иНеланомой препарат оказывал положительное действие на иммунологические показатели, изучаемые с помощью метода проточной цитометрии.

Изучение иммуноиодулирующего действия различных образцов Ganoderia Luciduo с помощью метода проточной лазерной цитометрии у доноров "in vitro" и "in vivo".

Таблица 5.1

Донор У Конц. 30.7 13,4 2.0 20,9 10,8

контроль иг/мл Z г г г г

21.11.90

Препарат CD4 CD8 CD4/CD8 NK (IКО—20) В-се11 (IK0-1)

GanodeгDa 1.0 21.6 18.3 1.1 10,4 6,1

Н 3. КНР 0,01 27.6 17,9 1,5 9.3 7.5

Сапоёегва 1.0 20.0 16.9 1.1 9.8 8.0

N 4, КНР 0,01 25,5 17.4 1.4 10,1 8.0

Сапобегиа 1.0' 26,7 18,9 1.4 12.7 9.1

N 7, КНР 0.01 27.4 14.0 1.9 11.1 8.9

Ganoderвa 1.0 31,2 16.1 1.9 . 10.? 9.5

N 6.КНДР 0,01 31.7 17,6 1.8 • 9.4 10,0

• и -

Таблица 5.2

Донор Y контроль 28.lt.90 Конц. иг/мл 36,4 г 19,2 г 1,3 г 13.2 г 17.2 7.

Препарат CD4 С08 CB4/CÜ8 NK (1 КО—20) В—се 11 С1К0-1)

Ganoderna N 3. КНР 1.0 0.01 30,2 32,7 21,4 21.4 1.4 1.5 17.1 17.2 16. г 15.3

Ganoderna N 4. КНР 1.0 0,01 28,3 31,3 21,9 19.0 1.3 1.6 19.5 17,8 18.9 18.5

Ganoderna Н 7. КНР 1,0 0,01 24,6 29,4 20,3 20.3 1.2 1.4 16.0 17.9 17.8 15,0

Ganoderna N. б,КНДР 1.0 0,01 29,7 32.9 17,2 22.8 1.7 1.4 17.0 16.3 17,0 18.2

Донор 3 принимала отвар в течение недели.

Препарат ' CD 4 CU 8 CD4/CU8 ПК В

До 46.7 25,0. 1,8 13,2 10.1

После 42,3 26.0 1.6 14.7 10.5

Изучение иымуноиодулирунщего действия различных образцов препарата Ganoderna Lucidua (в них входили различные лекарственные Формы торопок.гранулы,таблетки различных стран производителей КНР,КНДР.Россия) у доноров " in vitro " и " in vivo" выявило иаыунорегуляторную способность данных препаратов в отно-иении клетлчного и гуморального иммунитета определяемого с по-мощыз набора НКАТ ГСД4.СД8.СД4/СД8.ИН0-20.ИКО-1). Таблица 5. Исследование образцов препаратов у доноров "in vitro" показало нормализации количества Т"хелперов" по сравнениис исходной нормой, Т"супрессоры" оставались без изменения. В первом исследовании отмечалось значительное подавление в 2 раза НК-клеточной активности.при повторном тесте подавление ослабевало, сводясь к незначительному.Относительно гуморального иммунитета при повторном исследовании отмечена тенденция к повыие-нив у препарата бапойегва 4 в двух концентрациях. Исследования выполненные "in vivo" у донора 3,которая принимала по 30 мл отвара Ganoderna Lucidun ежедневно в течение недели.не показал существенной разницы в изучаемых показателях по сравнении с контрольными значениями. Пнализируя полученные данные можно сделать вывод,что препарат Ganoderna Lucidun не влияет существенным образом на состояние неизмененной иммунной системы у

доноров. Относительно изучения препаратов Ganoderaa Lucldua у онкологических больных "in vitro" на примере PHI и Меланомы. коми было отмечено,что Т-"хелперы" в больвинстве случаев стимулировались, Т-"супрессоры" спивались или оставались без изменения, NK-клеточная активность возрастала во всех тестах.В- клетки-показатели гуморального иммунитета, стимулировались под воздействием изучаемых препаратов. Таким образом,показано, что положительное иммуномодулирупцее действие препаратов Ganoderaa Lucldua на иммунологические показатели доноров и онкологических больных PMS и Иелаиомой "in vitro". Надо отметить, что сучест-венного преимуцества препарата Ganoderaa Lucidua различных стран-производителей и лекарственных форм, изучаемых нами, друг перед другом мы не отметили. По - видимому, как и классические иммуномодуляторы (тимозин, Т-активин, леваиизол и др.) препарат Ganodersa Lucidua способен усиливать слабую, ослаблять сильную и оставлять без изменения нормальнуа реакции иммунной системы, т.е. обладать выраженным иммуномодулируацим действием.

Таблица N 6.

Такт Тобщ. Тк Ту ст. Тчувст. ико-эо ЛТ-4 ИКО-31 ИКО-i ИК0-12, HKQ-20 па

Время "h." "S" ош 0КГ4 0КТ8 0КГ4/ 91 Leu7 NK

0КГ8 ю:1

До 33,5 45,0 40.5 3.7 •3.5 57.4 36.6 26.0 15,8 9.9 34,6 37 .i

процедуры +7.3 +7.8 +8,3 +1,7 +5.7 +7.1 +4.4 +4.3 +3.4 +3.2 +3,7 +ю.:

После 42,0 48.4 46,1 46,9 -0,6 59,6 38,4 18.1 19,4 16,9 27.6 31.!

процедуры +9,3 +11.5 +7,6 +11.7 +6,0 +16.3 +18.3 +8.6 +12.1 +12,3 +6.5 +16.;

Изучение иммуномодулирую^его действия препарата Ganoderaa Lucidua в системе "in vivo" у доноров и больных PHI.

После серии исследований "in vitro" с различными лекарственными формами Ganoderaa Lucidua на иымунокомпитентных клетках доноров и больных, и получения удовлетворяющих результатов,нам представилось интересным изучить препарат Ganoderaa Lucidua в системе "in vivo" у доноров и больных РН8. В результате наших исследований мы обнарузили усиление эффекта иммунорегуляции при воздействии препарата "Ganoderna Lucidua на иммунную систему организма. Доноры - добровольцы принимали водный экстракт Ganodcrma Lucidura "per os" ежедневно в течение месяца. 3 доно-jiiiH с исходно сличенными иммунологическими показателями после применения препарата öanodnrna Lucidua показатели повышаются до нормы, а показатели ß пределах нормы - остаются'без изменений. 11а навему мнению, препарат Ganoderaa Lucidum зарекомендо-

вал себя активным модификатором иммунитета.обладающим выраженным иммуномодулирувщим эффектом в системе "In vivo" у доноров. При аналогичных условиях исследования препарата Ganodernia Lu-cidua в,системе "in vivo" у больных РН8. мы такяе получили, эффект иымунорегуляции всех тестируемых иммунологических показателей. что подтвердило наяе ранее высказанное предполояение о выраженном эффекте иымунорегуляции иммунологических показателей. (Та5л.б)

Приведенная таблица наглядно иллюстрирует выше приведенное высказывание. На конкретном' принере больной С-ой (PÜS) ионно проследить изменение иммунологических показателей в динамике. Рисунок 2.

После месячного приема препарата Ganoderaa Lucidun мы наб-лпдали увеличение общего количества лимфоцитов с 35 И исходно до 55 У.. т.е. на 20 У.. ТЕ -активные лимфоциты такяе увеличивались на 20 У. с 28 У. до 48 У. после курса Ganoderna Lucidun.Хел-перная активность возросла с 32 У. до 53 У., а супрессоры из положительных величин перешли в отрицательные, с ? У. до 3

Отмечается, что в динамике эти показатели в течение года удерживаются на достаточно высокой уровне, по сравнении с исходными показателями, йы пришли к выводу, что исследуемый нами препарат показал себя как новый биологический модификатор иммунитета, обладавший иымунонодулирувщиы эффектов у' больных с опухолью молочной железы. Больные, получавшие этот препарат отмечали улучшение аппетита, самочувствия, йы полагаем, что нами был исследован один из перспективных иимупомодуляторов. известных на сегодняшний день среди противоопухолевых полисахаридов, выделенных из высших грибов. Ро наиену мнению, препарат Ganoderaa Lucidun целесообразно использовать в комплексной терапии онкологических больных PHS и других нозологий.

Изучение иммунологических показателей у больных раком мо-очной железы, получавших Ganoderua Lucidun с учетом показаний индивидуальной чувствительности и подбора дозы препарата "in vitro" показало, что отмечается улучшение клинического самочувствия больных. Они лучие переносят курсы химиотерапии и облучения. У них нет выраженного падения лейкоцитов и иммунологических показателей. Этот препарат монно применять для снятия иынунодепрессии при послеоперационной терапии или для предотвращения побочных эффектов противоопухолевой терапии. Он может оказаться полезным при включении его в клинике общей терапии, включая хирургическое лечение, химиотерапию, лучевое лечение. Поэтому среди множества терапевтических приемов, известных в

ДИНАМИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ Б-НОЙ С-ОЙ, ПОЛУЧАВШЕЙ ОАИООЕКМА Ь

ТЕ - акт.

40 20 0

Рис.2.

60 60 40 20 0

ТЕ - общ.

Т - "шторы"

Т - "супрессоры"

Т-1-1-I I-1-1-I*

t4 - '

настоящее время, противоопухолевые полисахариды, выделенные из грибов таких как Zentihou. Oanodersa Lucidun и ftplanatun можно рассматривать не просто как один из множества . компонентов, входящих в комплекс лечеоных мероприятий, а как наиболее сильные физиологически активные цитоыины.

Исследование комплексных восточных биологически

активных веществ в системе "in vitro" у доноров и больных.

Поиск новых эффективных иыауноыодуляторов природного про-исхошдения представляет особый интерес для онкологии. Мы полагаем. что среди препаратов растительного происхождения обладавших противоопухолевой активностьп. многие способны обладать и имыуномодулирувщей активностьп. Китайские ученые продемонстрировали способность многих из китайских традиционных растений индуцировать образование интерферона и стимулировать естественную киллернуп активность как у экспериментальных животных, так и у человека. Использование лазерного проточного цитоыетра открывает широкие возможности моделирования "in vitro" различных комбинаций, особенно комплексных препаратов восточной медицина. Нам представилось интересным изучить влияние этих противоопухолевых комплексных препаратов "in vitro" на лимфоциты иммунной системы больных РИЗ и меланоиой. а также доноров. У китайских коллег в арсенале лекарственных трав есть интересные разнообразные комплексные противоопулевые препараты. Препарат профессора Song Ни Ling представляет собой препарат, состоящий из гранул и порошка. Это многокомпонентный препарат, одним из его составлявших является Ganoderaa Lucidua. Иы исследовали препараты в разных комбинациях "in vitro" на лимфоцитах больных и доноров методом лазерной проточной цитометрии с набором ИКОТ. При действии на лимфоциты донора препарат профессора Song Hti Ling снижал количество 'Г-хелперов по сравнению с контрольными на 10 7. в низкой концентрации 0,01 иг/мл. в высокой на 7 7.. Супрессорнуп активность он стимулировал в высокой концентрации на 3 7.. а в низкой практически не изменял показателей. НК-активность незначительно подавлялась, а В-клеточный иммунитет также подавлялся в большой концентрации незначительно, а в низкой концентрации на 4 7.. (Ta.U.7)

■ Таблица влияния п/ö препарата профессора Song Hu Ling на лимфоциты донора "in vitro".

Таблица N 7.

Доза ИКАТ препарата CD4-T"h" CB3-T"S" ИКО-20-НК ИК0-1-В кл.

Контроль 36,4 19.2 19,2 17,2

1,0мг./мл. 29,0 22,7 17,5 16,3

0,01 мг./мл. L 27.9 20,1 18,5 13,1

В изуч.' мых нами препаратах компоненты были разнообразны. Препарат "Huiaja" представляет собой экстракт женьшеня и животного класса Земноводные (Huiaja, Ginsenl gejie extractun, КНР). "IIXLfi" - комплексный противоопухолевый препарат, представляющий собой 7 7. циклофосфалида и 30 7. экстракта женьшеня, остальное - наполнитель. Препарат "Астрогал" содержит экстракт из традиционного китайского растения Astrogales Hembranoceus - nilk Uetchbuke (КНР). Все эти препараты, ввиду своей необычности представляли для нас определенный интерес. Проведенные эксперименты показали, что исследованные противоопухолевые комплексные препараты обладают имыуномодулирувщей активностью. Это согласуется с литературными данными, представленными китайскими учеными, что препараты растительного происхождения (яеньюень, элеутерококк, китайский лимонник, л^нтипан, Ganoderna Lucidum) способны индуцировать образование Г-интерферона и стимулировать естественную киллернув активность. В результате проведенных серий исследований "in itro" у больных отмечено неоднозначное действие препаратов на- иммунную систему организма. .На поврежденную и сохранную иммунную систему они действовали различно. Примером может служить таблица 8, которая демонстрирует изменение иммунологических показателей больной РЫМ-до лечения после обработки лимфоцитов "in vitro" противоопухолевыми препаратами.

Таблица N 8.

Назв. ИКАТ препарата С04/С086 хелперы CD8-CD31 супрессоры ИК0 - 20 NK-клетки ИК0 - 1 • В - клетки

Контроль 23.92 20.12 25,12 12,32

Астрогал 1.0 (КНР) 0.01 11.6 15.4 18,2 10,2

¿6.7 25.3 27,1 11.4

Препарат 1.0 проф.Song Ни Ling 0.01 25.1 25.4 20,9 8.1

26.8 22,0 26,4 9.2

HXLA 1.0 (КНР) 0.01 28.6 27.9 24,2 8.7

27.4 28,2 15,4 8,5

Все три тестируемых препарата в малых концентрациях оказали стимулирующее воздействие на хелперную активность по сравнению с контролем, в больиих концентрациях такае отмечена стимуляция, кроме препарата Астрогал. он оказал подавляющее действие на хелпернуп активность в больиой концентрации. Суп-рессорная активность стимулировалась всеми препаратами в обеих концентрациях, кроме препарата Астрогал в больиой концентрации, где очевидно подавление почти на 5 2. Киллерная активность препаратом Астрогал и препаратом профессора Song Ни Ling в больаих концентрациях подавлялась, в малых концентрациях незначительно стимулировалась. Препарат HXLA оказал подавление на киллериую активность в обоих концентрациях, причем в малой концентрации почти на 10 Гуморальный иммунитет подавлялся препаратов профессора Song Ни Ling и HXLA в обеих концентрациях. Препарат Астрогал незначительно подавлял показатели В-кле-точного иммунитета. Этими исследованиями ни затронули проблему изучения и понимания механизма противоопухолевых препаратов нового поколения из растений, в комбинации с эффективными ци-тостатиками. В сочетании с мягким неповреядающим действием при добавках из растительных препаратов как в случае HXLA - яень-вень. в препарате профессора Song Ии Line - Ganoderaa Lucidum. смягчающих весткий цитостатический эффект (лейкопению, рвоту), делающих химиотерапию и радиолучевое лечение более щадящим для онкологических больных.

йдоптивная фотоиммцнотерапия.

Обсушдая полученные данные нельзя не сказать о методе адоптивной фотоиммунотерапии, . при котором мы изучали влияние лазерного излучения неповрешдающей интенсивности на иммуноком-питентные клетки периферической крови онкологических больных В результате исследований, в нашем центре был разработан и апп-робирован новый метод иммунотерапии активированным гелий-неоновым лазерным излучением лимфоцитами больных РИ8 1-й и 2-ой степени. Полученные результаты подтверадаит литературные данные о коррегирующем действии Не-Ме облучения на клетки крови, в особенности на лимфоциты, которые изменяли свою поверхностную ультрастру^уру в сторону активации. Неооходимо отметить, что действие лазерного излучения потенцировало иммунологические показатели как у здоровых, так и у больных людей, причем у онкологических больны" это действие .было выравено более значительно. Влияние Не-Не оолучения приводит не только к количественному, но и к качественным изменениям. Исследование иммунологических показателей проводилось в динамике. Через 2 часа после процедуры отмечено достоверное повышение Т-активных лимфоцитов, повышение Т"Ь" и снинение Т"з". Общее количество лмфоцитов такве увеличивалось. Через 4 года наблюдения иммунологические показатели спиваются во всех реакциях, возвращаясь о исходное состояние, что с достоверной очевидностью указывает на необходимость повторных сеансов с периодичностью в 4 года, что подвергается и клиническими наблюдениями.(То5л.Ч)

Таблица N 9.

Динамика изменений иммунологических показателей у больных ршяж молочной железы,

получавши адоптивнуш иммунотерапии.

Время исследования Иммунологические показатели (в %).

Е-РОК Еа-РОК ! ЕЛС-Р0К 'Грез.-РОК (Т-хелперы) Т-чувств.-РОК (Т-супрессорц) ЕК

1 : 25 1 :50

До процедуры 45.5 4,0 31.8 2.5 16,3 3,1' 34,5 2.2 ' +8.6 0.5 г 53,5 2,4 67.0 3,3

Через 2 часа после процедуры 53.0 3.9 45.3 2,6 16,0 2,0 49,5 5,3 -2,0 0.1 53,0 2.2 61,0 5,4

Через 48 часов после процедуры 54,0 2.6 40,0 3,6 1?,2 1.4 47,0 4.3 -0,2 0,02 87,0 3,2 70,0 2.6

Через 7 дней после пр-цедуры 56.0 3,0 42,4 5.2 15.8 1,2 38,6 2,1 -ОД 0,06 86.0 8,1 91,0 8,2

Через (5 месяцев 55,0 2.9 51,4 4,8 18.4 2.6 49.4 4.2 -0,5 0,05 - -

Через 1 год 53.0 2.6 38,2 3,0 19,6 1.2 46.6 3,9 -1.8 0,09 -

Через 2 года 50.5 3.8 52,5 2,3 - 67,0 5,8 +1,5 0,2 - ■ . -

Через 4 года 46.2 3.1 32,5 2.3 - 32,0 1.9 +11,3 2,1 - -

Через 5 лет 39,0 3,5 32,0 2.7 - ■ 36,0 5,7 2,4 4.3 - -

Через 6 лет 49.0 5.9 34.0 5.7 - 27.7 5.4 6.0' 2,3 - -

Через 7 лет 42.0 5.0 38,2 4.9 - 40,5 4.2 2,8 2,2 - -

В заключение иоано констатировать, что клиническое испытание нового метода лазерной адоптивной фотоиммунотерапии при раке молочной железы доказало его перспективность в плане пн-разенности его иммуномодулирующего . воздействия на организм. Доказано отсутствие токсических воздействий предложенного ' метода на организм и хороиую переносимость процедуры. Данный метод, по нашему мненип. может быть использован для ранней профилактики иетастазирования у онкологических больных. Получен-' ные результаты открывают перспективы для использования иммуностимулирующего действия лазерного излучения на иммунную систему организма, что може-г найти применение в онкологической практике для разработки новых, более эффективных методов иммунотерапии онкологических больных.

Выводы:

1. Показана возможность сравнительного изучения иммуномодулирующего дёйствия различных биоолгически активных модификаторов имаунитета (БГШИ) с помощью метода лазерной проточной цитоаетрии с пироким набором НКАТ "In vitro".

2. Остановлено, что отечественный препарат элеутерококка в сравнении с препаратом Злеукокк и Плацебо (Германия) оказал наиболее активное иммуномодулирующее действие на иммунокомпи-тентные Т-клетки человека как "in vitro" так и "in vivo".

3. Показано, что препарат ßanoderaa Luciduo является но-81Ш биологически активным модификатором иммунитета, обладающим выраженным иммуномодулирувщим эффектом в системе "in vitro" как у доноров, так и в группах больных меланокой и PMS.

. ■ 4. Установлено, что препараты растительного происхождения, такие как элеутерококк и полисахариды, выделенные из высвих грибов Ganoderna Luciduo не обладают побочным действием при длительных приемах как у доноров, так и у больных мелано-мой и PMS.

5. Использование метода адоптивной лазерной фотоиммунотерапии позволяет повысить иммунологические показатели до нормального уровня и стабилизировать их на длительный период вре-иени.

6. Показано, что использование лазерного проточного анализатора с батареей МКАТ, открывает вирокие возможности моделирования "in vitro" различных комбинаций ' препаратов, в том числе комплексных препаратов восточной медицины. Используя набор МКАТ можно быстро определить чувствительность и подобрать дозы к исследуемым препаратам и веществам.

7. Использование иммуномодификаторов в условиях онкологической клиники долено быть строго контролируемый с учетом уже имеющихгя иммунологических нарувений. изменений иммунологических показателей под влиянием лечения, а такяе определения индивидуальной чувствительности больных к применяемым биологически активным веществам и воздействиям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. биологические и физические модификаторы иммунитета в.' онколигии. (Совместно с В.И.Купиным.й.В.Ивановыи.Н.Б.Веретен-никовой).ВИНИТИ-экспресс информация N 9,1987,с.1-17

2. Биологически активные модиикаторы иммунитета в комплексном лечении злокачественных новообразований. (Совместно с В.И.Купиным.А.В.Ивановым.М.Б.ВеретенниковойЛ.ВИНИТЙ - экспресс информация N 8, 1987, с. 1-20.,

3. Пот-чцируоцее действие лазерного излучения на иммунологические показатели человека. (Совместно с В.И.Кцпиныи, ft.В. Ивановым. Е.О.Полевой). В книге "Новые подход'н'к иммунотерапии рака".Тезисы.Кемерово, 198S, с. 36-3?.

4. Современные возможности иммуномониторинга и иммунокор-рскции в процессе лечения злокачественных новообразований, (Совместно с В.И.Купиным, Н.И.Свткиной). В сборнике "Модификация лекарственной терапии опухолей". 1990. Калининград.с.3-17..

5. Сравнительное изучение биологической активности природных адаптогенов и их аналогов из биомассы .выращенной "in vitro" (Совместно с О.й.Бочаровой, Н.Ю.'Гоыилиной,Н.Б.Бодровой, Е.П.Грубо8ой,В,И.Купиныы).Третья Украинская конференция по медицинской ботанике. Сборник докладов. Киев. 1992,

6. Препараты растительного происховдения - перспективные индукторы цитоиинов в организме в норме и патологии.(Совместно с В.И. Купинын.Н.В. Иалаховой.Е.П.Грубовой.й.Юварцбергом.Л.Б. Знгеле.Д.В.Венекус.И.Г.Яуналкене). 1994. Вестник ОНЦ. В печати.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ЗОНЦ АМН

ПОДП.-К ПЕЧАТИ л-

ЗАКАЗ 5Ь ТИРАЖ №0 SX3.