Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Иммунологические особенности патогенеза апластической анемии: роль цитокинов

На правах рукописи

РОЗАНОВА ОЛЬГА ЕГОРОВНА

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ: РОЛЬ ЦИТОКИНОВ

14.00.29- гематология и переливание крови 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в ФГУ «Российский ордена Трудового Красного Знамени, ордена Дружбы народов научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Бубнова Людмила Николаевна

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Абдулкадыров Кудрат Мугутдинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Харченко Марина Федоровна доктор медицинских наук, профессор Тотолян Арег Артемович доктор медицинских наук, профессор Богданов Александр Николаевич

Ведущее научное учреждение: ФГУ научно-исследовательский институт Детской гематологии Росздрава (ФГУ НИИДГ Росздрава)

Защита состоится " 27 " марта 2006 г. в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 в Российском НИИ гематологии и трансфузиологии Росздрава по адресу: 193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Известно, что многие шшжииы относятся к разряду гемолоэтических факторов, являются неотъемлемой частью нормального кроветворения и оказывают влияние на все его этапы. В зависимости от характера этого влияния их условно разделяют на позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. К позитивным регуляторам относятся те факторы, которые поддерживают пролиферацию стволовой кроветворной клетки (СКК), лимфоидных, эритроидных, гранулоцитарных, моноцитарных предшественников, стимулируя соответствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, различные колон иестиму лиру ю щи е факторы (КСФ), эритропоэтип (ЭПО), интерлейкины (ИЛ)-1, 3, б, II и т.д. Другие цитокииы, такие, как фактор некроза опухоли (ФНО), интерферон (ИФН), трансформирующий фактор роста (ТФР), напротив, могут снижать клоногениость всех типов предшественников гемоноэтических клеток, в силу чего они способны подавлять эритро-, моно-, грапулопоэз и, по мнению большинства исследователей, относятся к безусловно негативным регуляторам гемопоэза (Орловская И. А. и со авт., 1996; Ы е1 а1., 2000; Оеез НЛ. й а!., 2000). Исследование гемопоэтических факторов является наиболее актуальным при заболеваниях, связанных с нарушением гемопоэза, к которым, несомненно, относится апластическая анемия.

Апластическая анемия (АА) является одной из самых сложных проблем современной гематологии. Это редкое и тяжелое заболевание системы крови с высоким процентом инвалидизации и смертности больных (Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., 1995; КоБепРгМ е1 а1., 2003). Характерным признаком АА является гипоклеточность костного мозга и панцитопення в периферической крови. Это глобальная трехростковая недостаточность гемопоэза, в основе которой, по современным представлениям, лежит прямое или опосредованное повреждение стволовой кроветворной клетки, приводящее к дисбалансу между основными процессами, составляющими

нормальный гемопоэз: пролиферацией, дифференцировкой и клеточным апогггозом. Однако, несмотря на более, чем 100-летшою историю изучения АА, механизмы, приводящие к подобному повреждению, до сих пор окончательно пе установлены.

Среди основных концепций развитая депрессии кроветворения при данном заболевании, наряду с прямым поражением стволовой клетки и дефектностью гсм о поэтического микроокружения, важное место занимает гипотеза о том, что повреждение клеток (как стволовых кроветворных, так и микроокружения) может вызываться и поддерживаться иммунологическими механизмами. Концепция иммунного патогенеза АА привлекает к себе внимание все большего числа исследователей. Это представляется обоснованным в силу ряда обстоятельств. Во-первых, именно иммуносупрессивная терапия, вне зависимости от концептуального подхода, в большинстве случаев приводит к положительным результатам. Во-вторых, имеппо клетки иммунной системы являются основными продуцентами большинства вышеперечисленных гемопозтических факторов, которые, как известно, оказывают влияние на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза, рмупируя, таким образом, гемопоэз, если в качестве клеток-мишеней служат гемопоэтические предшественники.

К сожалению, отечественные исследователи практически не запимаются проблемами цитокинопосредованных процессов при АА. Однако в зарубежной литературе за последнее десятилетие появилось достаточно много сообщений по этому вопросу (Teramura М., Mizoguchi Н., 1996; Young N.S., 2002; Sleijfer S.,, Lugtenburg P.J., 2003; Dubey S. ct al., 2005). Тем не менее, несмотря на бесспорный прогресс в понимании механизмов развития АА, вопрос о единой и общепризнанной теории патогенеза заболевания нельзя считать решенным. До сих пор не выработано единого мнения по поводу уровня гемопоэтинов при АА. Несмотря на признанную роль ц иго кино в в регуляции гемопоэза, комплексная оценка степени нарушения цитокинового статуса больных АА до енх пор отсутствует. И

несмотря на известный постулат, что кроветворение в норме обеспечивается сбалансированным комплексом как позитивных, так и негативных цитокиновых сигналов, до сих пор не определено соотношение основных стимулирующих и иш ибирующих цитокинов у больных АА и их динамика в процессее терапии. Не выяснена связь между нарушениями цитокинов ого, иммунного статусов и тяжестью депрессии кроветворепия больных, а, следовательно, не определены их значимость и место в механизме развития болезни.

В связи с этим, исследование сиптеза и соотношения цитокинов, которые продуцируются клетками иммунной системы и одновременно влияют на гемопоэз, являясь его позитивными и негативными регуляторами, в норме и при АА представляется актуальным и способствующим выяснению роли иммунной системы в формировании депрессии кроветворения. Цель исследования.

Установление роли иммунных механизмов в формировании депрессии кроветворения при апластической анемии, совершенствование диагностики, критериев прогноза течения заболевания и эффективности иммуносупрессивной терапии на основе новых знаний о цитокинопосредованных нарушениях иммунной регуляции гемопоэза. Задачи исследования.

1. Изучить особенности иммунного статуса больных АА в зависимости от тяжести заболевания.

2. Исследовать уровень и продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных АА позитивных гемопоэтических факторов: ЭПО, ИЛ-1р, ИЛ-3 и ИЛ-6.

3. Исследовать продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных АА негативных гемопоэтических факторов:

. ИФН-у и ФНОа.

4.' Исследовать продукцию моионуклеарами периферической крови и костного мои'а больных АА антагониста негативных регуляторов ИЛ-4 и фактора роста Т-лимфоцитов ИЛ-2.

5. Определить соотношение основных оппозитных цитокинов в норме и при АА.

6. Установить взаимосвязь между нарушениями пнтокинового, иммуппого статусов и тяжестью депрессии кроветворения больных АА.

7. Исследовать динамику основных регуляторов гемопоэза в зависимости от эффективности иммуносупрессивной терапии больных АА.

8. Исследовать соотношение основных позитивных и негативных регуляторов гемопоэза и изменение иммунофенотипических характеристик цнтокиннродуцирующих клеток больных АА в ремиссии и рецидиве заболевания.

Научная новизна.

Впервые на основании сравнительного анализа способности мононуклеаров периферической крови и костного мозга к продукции гемопоэтических факторов - цитокинов - дана комплексная оценка нарушений цитоюпгового статуса больных АА и устахюилено соотношение основных позитивных и негативных регуляторов гемопоэза в норме и при АА. Показано, что в норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над синтезом других цитокинов, тогда как при АА приоритеты смещаются и сторону негативного регулятора ФНОа, интенсивность синтеза которого становится доминирующей как в периферической крови, так и в костном мозге;

Впервые охарактеризована динамика соотношения оппозитпых цитокинов 'в процессе заболевания: в стадии полной клинико-гематологической ремиссии и рецидиве, - а также проанализированы соответствующие этим стадиям изменения иммунофенотипических характеристик цитокинпродуцирующих клеток периферической крови и костного мозга больных АА.

Дана оценка иммунного статуса больных АА в соответствии с тяжестью депрессии кроветворения и динамикой заболевания. Выявлены неизвестные ранее взаимосвязи между соотношением иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и костного мозга и степенью нарушения гемопоэза. Установлено, что субпопуляция СЭ4+ Т-хелперов I класса (ТЫ) является преобладающей при тяжелой форме АА, а также в рецидиве заболевания.

На основании комплексного анализа выявленных взаимосвязей между нарушениями цитокинового, иммунного статусов и тяжестью депрессии гемопоэза установлена роль иммунной системы в развитии аплазии кроветворения при АА. Показано, что одним из ведущих механизмов, лежащих в основе угнетения гемопоэза при данном заболевании, является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы: мононуклеарами периферической крови и костного мозга бальных. Установлено, что депрессия кроветворения при АА вызвана не снижением секреции стимулирующих гемопоэтических факторов (ИЛ -1 р, ИЛ-3, ИЛ-б), но, прежде всего, сверхвысокой продукцией ингибирующего цитокина ФНОа (который, при недостаточности своего антагониста ИЛ-4, способствует развитию депрессии гемопоэза), а также повышенной продукцией ИЛ-2, обеспечивающего сохранность и пролиферацию Т-лимфоцитов, активированные формы которых, в свою очередь, являются продуцентами негативных гемопоэтических факторов.

Впервые на основании анализа динамики основных регуляторных цитокинов в процессе лечения больных АА разработаны и предложены ранние прогостические критерии течения заболевания и эффективности иммуносупрессивной терапии.

Практическая значимость.

Предложен комплекс иммунологических методов исследования, позволяющих определить особенности иммунного статуса больных

апластической анемией в зависимости ог тяжести депрессии кроветворения, дополнить диагностику различных ее форм (тяжелой и нетяжелой), а также выделить иммуиообусловленные формы заболевания.

Разработаны алгоритм обследования цитокинового статуса больных апластической анемией и иммунологические критерии, позволяющие оценить

"" -Е '

эффективность проводимой иммуносупрессивной терапии.

Доказана значимость учета динамики основных регулятор пых цитокинов, продуцируемых мононуклеарами больных апластической анемией, при прогнозировании течения заболевания па ранних сроках и при выборе адекватной иммуносупрессивной терапии.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения диссертационной работы были представлены на 12-ом Съезде Международного Общества Гематологов в 1993 году (Вена, Австрия), на Съездах Европейской Международной Ассоциации Гематологов (ЕНА): 1-ом (1994, Брюссель, Бельгия), 2-ом (1996» Париж, Франция), 4-ом (1999, Барселопа, Испапия), 5-ом (2000, Бирмингем, Великобритания), 7-ом (2002, Флоренция, Италия), на ежегодных Съездах Международного Общества Экспериментальной Гематологии (18ЕН): 24-ом (1995, Дюссельдорф, Германия), 25-ом (1996, Нью-Йорк, США), 26-ом (1997, Каппы, Франция), 27-ом (1998, Ванкувер, Канада), на 20-й Международной Конференции Европейской группы Трансплантации костного мозга (Великобритания, 1994), на Международных паучпо-практических Конфереттиях «Актуальные проблемы гематологии» (2000 и 2003 гг., Минск, Беларусь), на Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (2001, Санкт-Перербург, Россия), на Научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии н трансфузиологии» (1996, 1998, 2002, 2004 гг., Санкт-Перербург), на Научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (2003, Москва), на Всероссийских научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2005 гг.).

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты диссертационной работы используются в практике Клиническою отдела химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии и трапсфузиологии, в отделении гематологии Детсгкой Городской больницы №1 г. Санкт-Петербурга, а также в лекциях и семинарских занятиях на обучающих циклах, проводимых Республиканским Центром иммунологического типирования тканей РосНИИГиТ. Но результатам исследований написаны н утверждены:

1. Пособие для врачей «Особенности иммунного статуса больных апластической анемией в зависимости от течения заболевания», 1997г.

2. Методические рекомендации «Комплексная оценка уровня питокинов в периферической крови и костном мозге больных апластической анемией при прогнозировании течения заболевания», 2001 г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Одним-из ведущих механизмов формирования депрессии гемопоэза при апластической анемии является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушепнем синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы. Аплазия кроветворения при данном заболевании связанна, прежде всего, с тем, что мононуклеары периферической крови и костного мозга больных продуцируют сверхвысокое количество ингибирующего гемопоэз цитокипа ФНОа при недостаточном уровне его антагониста ИЛ-4 и повышенное количество ИЛ-2.

2. Уровень эритропоэтина и продукция мононуклеарами периферической крови и костного мозга других позитивных гемопоэтических факторов (мультиКСФ - ИЛ-3, ИЛ-1(5 и ИЛ-б) при апластической анемии являются либо сопоставимыми с нормой, либо повышенными и не имеют патогенетического значения в развитии аплазии кроветворения.

3. В норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над синтезом других цитокинов, тогда как при апластической анемии приоритеты в продукции гемопоэтическнх факторов смещены в сторону негативного цитокина ФНОа, интенсивность синтеза которого мопопуклеарами периферической крови и костного мозга обусловливает тяжесть поражения гемопоэза.

4. Рецидив заболевания характеризуется прогрессией всех нарушений,в соотношении цитокинов и цитокинироду циру югцих клеток, выявленных при АА в периферической крови и костном мозге; полная клинико-гематологическая ремиссия характеризуется тенденцией к нормализации этих показателей, однако даже в состоянии ремиссии продукция ФНОа клетками иммунной системы остается повышепной.

5. Динамика основных регуляторных цитокинов в процессе иммупосупрессивной терапии больных апластической анемией может служить критерием эффективности проводимого лечения и течения заболева!шя.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 223 страницах, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 29 рисунками. Библиография включает 308 источников, из них 43 -отечественных и 265 - зарубежных.

ЛИчныГ! вклад автора '

Автором" лично выполнены* исследования по изучению уровня и продукции цитокинов клетками' больных апластической анемией и доноров и иммунофеиотипической характеристики лимфоидной популяции клеток. Проведен учет, статистичекая обработка, анализ полученных данных , и обобщение результатов исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили 88 больных а пластической анемией, 48 кадровых доноров крови и 22 донора костного мозга.

Характеристика обследованных больных. Группа больных апласгическои анемией (АА) была представлена 49 мужчинами и 39 женщинами в возрасте от 16 до 75 лет, находившимися на лечении в клиническом отделе химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии с 1992 по 2005 годы. Длительность заболевания к моменту обследования колебалась от двух недель до семи лет, в среднем составляя около 1 года. Указания на возможные этиологические факторы химической и физической природы (контакт с бензином, мазутом, лако красящим и материалами, пестицидами, радиационными источниками и т.д.) имелись в анамнезе у 22 больных (25%). У 3 пациентов вероятна связь с перенесенным гепатитом В. Остальные 63 больных расценены как - страдающие идиопатической формой заболевания.

Диагноз апластической анемии устанавливался на основании общепринятого комплекса клин ико-гематологи ч ески х данных. Тяжесхъ течения заболевания определяли по критериям, разработанным Международной группой по изучению АА (классификация СапиМа В.М. е1 а1, 1975, 1982), которые отражают степень депрессии кроветворения и включают в себя следующие показатели гемограммы:

1. Число грапулоцитов менее 0,5x109/л

2. Число тромбоцитов менее 20x109/л

3. Уровень ретикулоцнтов менее 1%

Наличие двух любых показателей из перечисленных выше в сочетании с аплазией костного мозга по данным трепаиобиопсии (клеточность костного мозга не более 30% от нормы) свидетельствует о тяжелой форме АА.

Среди обследованных больных у 64 была диапюстирована тяжелая форма апластической анемии (ТАА) и у 24 - нетяжелая форма заболевания (НАЛ).

Группу сравнения составили практически здоровые жители России. Для сопоставления иммунологических параметров периферической крови была обследовала группа из 48 допоров крови Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (РосНИИГиТ) в возрасте от 22 до 55 лег. Для сопоставления иммунологических параметров костного мозга была обследована группа из 22 здоровых лиц в возрасте от 15 до 55 лет, из которых 10 человек являлись волонтерами, и 12 человек - совместимыми по антигенам системы НЬА донорами костного мозга для аллогепных трансплантаций, проведенных в РосНИИГиТ в период с 1991 по 2003 годы.

Методы исследований. Для решения поставленных в работе задач был использован комплекс иммунологических методов исследования, включающий: 1) оирсдсленисние иммунофенотипической характеристики лимфоидной популяции периферической крови н костного мозга с помощью

ТАБЛИЦА 1

Характеристика дпфференцировочных антигенов

Антиген Характеристика

СОЗ + Зрелые Т-лимфоциты, Т-клеточный рецепторный комплекс

СР4+ Т-лимфоциты (хелперы)

С08+ Т-лимфоциты (цитсгоксические/супрессоры)

С020+ Зрелые В-лимфоциты, лиганд для С045К0 па Т-лимфоцитах

РсуШИ, маркер ЫК-клеток

СЕ25+ Рецептор к ИЛ-2 маркер активации Т- и В-лимфоцитов.

НЬА-Ш Маркер активации Т-лимфоцитов, относящийся к антигенам НЬА класса II

СИ95+ РаБ-А£, рецептор апоптоза

моиоклональных аптител (МоАТ) к различным дифференцировочным антигенам (таблица - I) в- микроварианте лимфоцитотоксического теста

(Исхаков А., 1988); 2) определение содержания иммуноглобулинов класса С, А, М в сыворотке крови стандартным методом радиальной иммунодиффузии в агарозиом геле по Мапсш; 3) определение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови путем их осаждения в полиэтиленгликоле 5% концентрации (НазЬкоуа V., 1978);

ТАБЛИЦА 2.

Характеристика исследуемых цитокииов

итокины Основные клетки-продуценты Основные гемопоэтические эффекты

ИЛ-1Р Т- и В-лнмфоциты, моноциты, макрофаги Стимулирует ППСК, гранулопоэз, ингибирует поздние стадии эритропоэза

ИЛ-2 С04+ Т-лимфоциты: ТЬО и ТЫ Т-клеточный ростовой фактор

ИЛ-3 Т-лимфоциты: ТЫ и ТЪ2 Мульти-КСФ: симулирующее действие на 1ШСК и ранние стадии гемояоэза

ИЛ-4 СЭ4+ Т-лимфоциты: ТЬ2 Антагонист негативных регуляторов гемоноэза: ингибирует продукцию ИФНу и ФНОсх; фактор роста В-клсток

ИЛ-6 Т-лимфоциты, моноциты, макрофаги Поддерживавает пролиферацию ППСК, стимулирует тромбо- и грапулопоэз

ИФНу С04* (ТЫ) и СР8+ Т-лимфоциты, ЕК Ингибирует эритро-, тромбо- и гранулопоэз, активирует процессы апоптоза

ФНОа СЭ4+ (ТЫ), ЕК, макрофаги Снижает клоногепность всех типов предшественников гемопоэтических клеток, активирует процессы апоптоза

эпо Иптерстициальные, перитубулярные или эндотел иал ьцые(? ) капиллярные кл.почек, макрофаги, моноциты, кл. печени Обеспечивает выживаемость, дифференцировку и пролиферацию клеток эритроидного ряда

4) изучение цитокинового статуса с помощью стандартного метода твердофазного иммуноферментного апализа (ИФА): а) определение

и

концентрации эритропоэтина (ЭПО) в сыворотке крови (тест-системы «R&D systems», США), б) исследование цитокмнпродуцирующсй активности клеток иммунной системы путем определения содержания различных гемопоэтических факторов (таблица 2) в супериатантах мононуклеарных клеток периферической крови и костного мозга после их 24-часового культивирования в количестве 2х105/лунку при 37° с 5% С02 в присутствии специфических стимуляторов (индуцированная продукция) и без них (спонтанная продукция) (тест-системы ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург и «Bíosource International», США), Наличие спонтанной продукции какого-либо цитокина in vitro свидетельствует о предсуществующей активации клеток in vivo и отражает интенсивность синтеза цитокина, происходящего в организме без какого-либо дополнительного воздействия. Ответ на индуктор in vitro отражает способность клеток отвечать in vivo на антигенную стимуляцию и свидетельствует о реактогенном потепциале организма.

Статистический анализ полученных результатов исследований проводили с помощью персонального компьютера с использованием пакета прикладных программ для "Microsoft-Excel", версия 7,0 для Windows 2000, применяя методы общей статистики (М — средняя арифметическая величина, тх - средняя ошибка средней, процентное распределение), сравнения двух величин по t-тесту Стыодеггга (Лакин Г., 1990), корреляционного анализа (Гублер Е.В., Генкин A.A., 1973).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Первый этап работы был посвящен исследованию особенностей иммунного статуса больных АА в зависимости от тяжести заболевания, то есть, от степени поражения гемопоэза.

При анализе иммунофенотипической характеристики лимфондной ; популяции установлено, что а периферической крови больных как тяжелой, так и нетяжелой формой АА (рис.1) содержание клеток, экспрессирующих основные дифференпировочные антигены, является либо сопоставимым с

нормой (за исключением СЕ>8+ клеток), либо имеет тенденцию к снижению.

В отличие от этого, в костном мозге больных обеими формами АА (рис. 2) содержание основных субпопуляций лимфоцитов не только имеет тенденцию к повышению, но и повышено; выявлено значительное увеличение общей популяции Т-лимфоцитов (СРЗ+) у больных НАА и уровня СЭЗ+, С04+ и С016+ клеток у больных ТАА.

СОЗ+ С04+ С08+ С020 С016+ С025+

Рис. 1. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных ТАА и

НАА

Рис. 2. Содержание основных субпопуляций лимфоцитов а костном мозге больных ТАА и КАА

Характер изменений в содержании клеток, несущих маркеры активации, выявленных у больных АА как в периферической крови, так и в костном мозге, был, в принципе, одинаков. Степень выраженносги этих

нзмеЕ1ений находилась в соответствии со степенью депрессии кроветворения: так, у больных с тяжелой формой заболевания уровень активированных и С025+) клеток был более высоким, чем в группе с нетяжелой АА, и достоверно превышал показатели контроля (0,005<р<0,05).

Анализ уровня сывороточных иммуноглобулинов и циркулирующих иммунных комплексов у больных АА в соответствии со степенью нарушения гемопоэза пе выявил достоверных различий между группами больных с тяжелой и нетяжелой формами заболевания. Существенными оказались различия только по одному показателю: концентрации сывороточного которая была достоверпо снижена в группе с ТАА по сравнению с нормой.

ТАБЛИЦА 3

Уровни циркулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов в сыворотке крови больных различными формами «пластической анемией

Группа ЦИК (у.е.) 1йО (г/л) 1«А (г/л) 1йМ(г/л)

ТАА (1) п=40 38,43*3,14 9,50*1,00 1,80±0,19 1,85±0,35

НАА (2) п=24 33,04*1,20 11,89*0,56 2,79*0,17 2,56*0,37

Доноры (3) п=20 30,61 £2,83 14,46*1,16 2,61 ±0,3 8 1,31 ±0,20

Р(1-2) >0,05 >0.05 >0,05 >0.05

РП-3) >0.05 <0,05 >0,05 >0,05

Р(2-3) >0.05 >0.05 >0,05 >0.05

Таким образом, анализ особенностей иммунного статуса больных АА в зависимости от тяжести заболевания позволил установить, что статистически значимые различия между группами больпых с тяжелым и умеренным угнетением гемопоэза , были выявлены только по величине иммунорегуляторного индекса (рис 3), который при НАА был снижен до инверсии (С04+/С08+<1) и »^периферической крови, и в костном моз1~е (в отличие от ТАА, при которой он несколько превышал показатели контроля).

Поскольку величина иммунорегуляторного индекса является интегральным показателем, по которому устанавливают иммунную недостаточность или иммунодефицит, выявляется парадоксальная, на первый

взгляд, ситуация: если судить по величине индекса, то состояние иммунитета у больных с тяжелой депрессией кроветворения является лучшим, чем у пациентов с умеренным нарушением гемопоэза. Однако, указанный индекс характеризует соотношение основных иммунорегуляторных субпопуляций (СЭ4+ клеток-хелперов и СЭ8+ Iвдтотоксических клеток), и его повышение означает, что у больных с ТАА субпопуляция С04+ лимфоцитов является преобладающей и в периферической крови, и в косгаом мозге.

□ норма

п/к к/м

Рис. 3. Величина иммунорегуляторного индекса (СЭ4+/С08>) у больных ТАЛ и НАД

При тяжелой форме АА также является характерным повышение уровня активированных клеток: ЦК+ и С025+. В свою очередь, активированные формы С04+ лимфоцитов являются профессиональными продуцентами цитокинов, в том числе тех, которые оказывают регуляторное воздействие на все этапы кроветворения. Важно отметить, что и СОЗ+, и С04+, и СО 16+ лимфоциты, повышенное содержание которых выявлено в костном мозге обеих групп больных, также являются активными источниками синтеза различных регуляторов гемопоэза. Таким образом, следующий этап работы был посвящен исследованию тех цитокинов, которые продуцируются клетками иммунной системы при АА.

Известно, что недостаточное количество гемоноэтинов на ранних этапах кроветворения приводит к повышению апоптотической гибели клеток - предшественников гемопоэза, и многие исследователи связывают

депрессию кроветворения при АА с недостатком именно положительных гемопоэтических факторов. В связи с этим, прежде всего, были изучены уровень и продукция так называемых «позитивных» регуляторов гемопоэза; факторов, поддерживающих пролиферацию СКК, а также стимулирующих эритро-, тромбо- и грапулопоэз - то есть, те звенья гемопоэза, которые являются наиболее уязвимыми у больных АА.

ТАБЛИЦА4

Содержание эритропоэтина (тШ/ш!) в сыворотке крови больных

апластической анемией _

Доноры (п=48) Больпые АА (п=37)

>200 <200 (п=13)

10,0 (33-16,6) 618,3 (200 - 700) 63,2 (5-175)

□ ЭПО > 200 ИЭПО < 200

Рис. 4. Распределение уровня эритропоэтина у больных АА.

Исследование уровня ЭПО в сыворотке крови больных АА (таблица 4), показало, что, при очень широких колебаниях ( от 5 до 700 тШ/т1), ни у одного пациента содержание данного фактора не было ниже нормативных показателей. Принято считать, что лечение эритропоэтином является нецелесообразным для тех больных, у которых его содержание в сыворотке крови превышает 200 тШ/т! (УаМеггаЬапо Р., 1997).

Проведенный анализ показал, что у 13 больных АА (35%) уровень ЭПО находился в пределах от 5 до 175 тШ/т1, а у 24 больных (65%) - в

пределах от 200 до 700 mlU/ml и превышал указанный выше рубеж (200 mlU/ml), То есть, больные АА, в целом, характеризуются высоким уровнем Э110, что подтверждает тезис об эритропоэти«независимости АА.

Данные о способности клеток иммунной системы бальных АА к продукции других регуляторов гемопоэза представлены в таблицах 5 и б.

Спонтанная продукция ИЛ-1р у больных АА, по сравнению с нормой, была повышена в костном мозге почти в 2 раза, а в периферической крови - в 7 раз. Уровень спонтанной продукции другого позитивного фактора - ИЛ-б -у больных АА был также повышен, в среднем, в 1,9 раз и в 2,8 раз в костном мозге и в периферической крови, соответственно. При этом индуцированная продукция цитокииов была снижена» в результате чего соотношение спонтанной и стимулированной продукции обоих цитокинов, свидетельствующее о реактогенном потенциале клеток, было нарушено как н периферической крови, так и в костном мозге.

Спонтанный синтез мультиКСФ ИЛ-3 клетками периферической крови больных практически не отличался от нормы, а в костном мозге имел тенденцию к некоторому снижению; индуцированная же продукция цитокина (как в периферической крови, так и в костном мозге) имела тенденцию к повышению, и, хотя эти изменения пе являлись статиститчески значимыми, они свидетельствовали о сохранности реактогенного потенциала клеток.

Следует подчеркнуть, что наличие спонтанной продукций какого-либо цитокина in vitro свидетельствует о предсуществующей активации клеток in vivo и отражает шгтенсивность синтеза цитокина, происходящего в организме без какого-либо дополнительного воздействия. В этой связи анализ уровня ЭПО,. а также спонтанной продукции ИЛ-ip, ИЛ-3 и ИЛ-б, которые у больных являются либо сопоставимыми с нормой, либо, чаще, повышенными, свидетельствует о том, что аплазия кроветворепия при АА не может быть обусловлена недостаточным синтезом изученных положительных гемопоэтических факторов.

Б качестве негативных регуляторов гемопоэза были изучены ФНОа и ИФНу. Спонтанный синтез ИФНу клетками костного мозга больных АА практически не отличался от нормы, а клетками периферической крови -несколько превышал таковой, однако эти изменения не являлись достоверными.

ТАБЛИЦА 5

Способность моиопуклеаров периферической крови к продукции осповных регуляторов гемопоэза в норме и при я п л а сти ческой

анемии

Цитокины Больные АА Доноры

Споит, (пг/мл) Индуц. (пг/мл) ИС Спонт, (пг/мл) Индуц. (пг/мл) ИС

ИЛ-1р 247,1* 45,2* 486,2* 82,8 3,1* 0,6*** 33,8* 11,8 767,5* 86,7 23,6*1,75

ИЛ-6 319,8* 34,9* 863,9* 77,5*** 6,4* 1,7*** 111,8* 46,6 2000,0* 229,4 Зб,0±5,8

ил-з 0,95*0,11 86,08±9,33 82,40* 6,99 0,97*0,24 55,18* 6,63 46,32* 7,68

ИФНу 50,2± 13,5 519,4± 134,5** 16,4± 6,0* 42,3*9,7 1250,0* 154,6 54,6*10,1

ФНОа 536,5± 58,3***, 903,9±87,6 3,2* 0,7*** 44,2*16,9 1099,6* 155,4 50,3*11,6

ИЛ-4 9,1±1,1* 19,3*2,6** 2,1*0,2 21,5*6,0 61,2*15,4 2,8*0,6

ИЛ-2 40,5* 3,2** . 41,9*3,6 1,5± 0,3*** 5,0*1,1 50,2*10,8 — . ... — 9,8*2,3

Примечаиие: * - р<0,05; - р<0,01; *** - р<0,001, различия достоверны по сравнению с группой доноров

Что же касается другого негативного гем о поэти ческого фактора -ФНОа, то установлено резкое повышение его продукции клетками и костного мозга (табл.б), и периферической крови (табл.5) в 7 и 12 раз, соответственно. Следует отмстить, что при исследовании негативных регуляторов гемопоэза

(ФНОа и ИФН7), так же как и при изучении положительных факторов ИЛ-р и ИЛ-б (но не ИЛ-3), выявлено существенное нарушение соотношения спонтанной и сгимулированной продукции цитокинов.

ТАБЛИЦА 6

Способность мононуклеаров костного мозга к продукции основных регуляторов гемолоэза в норме и при япластической анемии

Цитокины Больные АА Доноры

Спонт. (пг/мл) Индуц. (пг/мл) ИС Спонт. (пг/мл) Индуц. (пг/мл) ИС

шыр 55,5*14,1 119,0* 23,0*** 2,5* 0,4*** 28,8*1,33 762,5* 50,7 23,6*1,8

ИЛ-6 373,9* 50,9 715,9* 79,1*** 2,8* 0,5*** 189,4*11,7 2262,5 * 74,2 14,5*0,9

ИЛ-3 0,90*0,18 80,00* 13,62 69,66* 9,26 1,25± 0,22 78,75* 6,63 67,00±6,1 4

ИФНг 15,2*1,84 296,7± 53,0** 24,4* 5,4* 15,9*1,39 822,5* 66,1 72,1*7,5

ФНОа 305,2* 51,6* 525,2* 91,1** 1,8* 0,2*** 42,3*3,4 1206,3* 84,8 49,4*5,1

ИЛ-4 9,5*0,5 12,7*1,1 1,5*0,1 10,0*0,7 17,5*1,2 1,8*0,1

ИЛ-2 46,6* 5,9 48,2* 6,0 1,4*0,2 20,4* 0,9 30,8* 3,7 1,4.*0,1

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001, различия достоверны но сравнению с группой доноров

Таким образом, мононуклеары периферической крови и костного мозга при АА характеризуются сверхвысокой выработкой негативного гемопоэтнческого фактора ФНОа.

Спонтанная продукция ИЛ-4 была сопоставима с нормой в костном мозге и существенно снижена в периферической крови. ИЛ-4 является прямым антагонистом ФНОа, и между этими двумя цитокинами выявлена

обратная коррелятивная связь. Поэтому, в целом, учитывая характерную для АА гиперпродукцию ФНОа, можно заключить, что клетки иммунной системы при данном заболевании синтезируют недостаточное количество антагониста негативных факторов — ИЛ-4.

В отличие от этого, .спонтанная продукция ИЛ-2 была повышена и в костном мозге, и в периферической крови. ИЛ-2 поддерживает жизпеспособпость и пролиферацию Т-лимфоцитов, а в совокупности с повышенной экспрессией своего рецептора, выявлешюго на лимфоцитах при АА, обеспечивает защиту этой популяции от апоптогеиного влияния ФНОа.

Сравнивая уровни спонтанпой продукции цитокинов в группе доноров и в группе больных, можно прийти к выводу, что в норме интенсивность выработки позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над синтезом других цитокинов как в периферической крови, так и в костном мозге (рис. 5).

илир ИЛ-6 ИЛ-3 ИФНу ФНОа ИЛ-4 ИЛ-2

Рис. 5. Спонтанная продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови и

костного мозга в норме

Больные же АА характеризуются серьезными " нарушениями цитокииового статуса: с одной стороны, у них выявлено резкое повышение продукции такого негативного регулятора гемопоэза, как ФНОа, с другой стороны, уровень и продукция положительных гемопоэтических факторов у

ТАБЛИЦА 7

Спонтанна» продукции основных оппозитиых цитокннов мононуклеарамн периферической крови больных апластической анемией по отношению к норме

Б-ные Гемоноэтические факторы

Позитивные Негативный Антагонист ФНОа

ил-т ИЛ-б <1 ШОа V Ш-4

Спонт пг/шг Мда/МЫ Спонт пг/мл Мдд/М N Споят пг/мя МАА/Мм Спо(гг пг/мл МДА/ММ

Г-ин 200 5,9 500 4,5 1000 22,6 8 0,37

О-ик 200 5,9 220 2 480 10,9 12 0,55

И-ва 80 2,4 330 3 460 10,4 14 0,65

Б-ва 100 3 . 72 0,6 850 19Д 12 0,55

Г-па 190 5,6 150 1,3 1300 29,4 5 0,23

Н-нч 350 10,4 680 6 900 20,4 12 0,55

Из-ва 100 3 150 из 2500 56,6 4 0,18

Б-ко 280 8,3 840 7.5 2100 47,5 8 0,37

Ш-ев 150 4,4 240 2Д 640 14,5 15 0,70

Т-ва 150 4,4 600 5,4 550 12,4 8 0,37

... ... ... ... ... ... ... ... ...

МАА 247,1 7,3±1,4 319,8 2.9±0,3 536,5 12Д±13 9,1 0,49± 0,04

Норма (Мы) 33,8 111,8 44,2 21,5

Примечание: Маа - средние показатели в группе больных АА;

Ми - средние показатели в группе доноров (норма);

Мдд/Мм -- показатель, характеризующий во сколько раз

спонтанная продукция цитокина в группе больных АА превышает

норму

ТАБЛИЦА 8

Спонтанная продукция основных оппознтных цитокинов мононуклеарами костного мозга больных апласгической анемией но

отношению к норме

Б-ные Гем опоэтиче ские факторы

Позитивные Негативный Антагонист ФНОа

ИЛ-1(5 ИЛ-6 ФНОа И [Л-4

Споит пг/мл МАА/ММ Споит пг/мл МАА/Мм Споят пг/мл МАЛ/МЫ Споит пг/мл Маа/МЫ

Г-ии 110 3,8 450 2,4 650. 15,4 5 0,5

О-ик 40 1,4 350 1,9 350 12 1,2

И-ва 30 и 380 2 300 7Д 10 1

Б-ва 45 1,6 900 4,8 440 10,4 5 0,5

Г-на 55 1.9 850 4,5 240 5,7 И 1.1

Н-ич 180 6,3 390 2 350 8,3 10 1 .

Из-ва 48 1.7 400 2,1 280 6,6 10 1

Б-ко 30 1,1 440 2,3 270 6,4 8 0,8

Ш-св 15 0,5 260 1.4 100 2,4 10 1

Т-ва 35 1,2 900 4,8 420 9,9 10 1

... ... ... ... *»* ... ...

МАА 55,5 1,9*0,5 373,9 2,0*0,3 305,2 7,2*1,2 9,5 0,95* 0,1

Норма <Мц) 28,8 189,4 42,3 10 ■

Примечание: Маа- средние показатели в группе больных АА;

Ми- средние показатели в группе доноров (норма); Мад/Мм - показатель, характеризующий во сколько раз спонтанная продукция цитокина в группе больных АА превышает норму

данной категории больных либо не отличаюгея от нормальных величин, либо - чаще - тоже существенно повышены.

Для того, чтобы выяснить, какие же из цитокинов являются доминирующими при АА, было проанализировано соотношение основных оппозитных цитокинов у каждого конкретного больного и в 1руппе в целом.

Прежде всего, мы выделили группу тех больных АА, у которых продукция негативного регулятора ФНОа мононуклеарами периферической крови в 10 и более раз превышала показатели нормы, и сопоставили ее с уровнями положительных факторов на тот же момент обследования, а также соотнесли их с показателями нормы (таблица 7). Из представленных данных видно, что столь высокому уровню ФНОа у больных данной группы далеко ие всегда соответствовали высокие значения оппозитных по гемопоэтическому. эффекту цитокинов - ИЛ-1Р и ИЛ-6 - и никогда не соответствовали высокие значения прямого антагониста - ИЛ-4. То есть, несмотря на то, что показатели, характеризующие положительн ые гемопоэтическио факторы (ИЛ-1Р и ИЛ-б) у конкретных больных могли быть самыми разнообразными - и приблизительно соответствующими норме (Б-ва, Из-ва), и повышепными (Г-нн), и высокими (Н-ич) - все больные характеризовались резким повышением продукции негативного регулятора гемопоэза ФНОа при спиженнии уровпя его антагониста - ИЛ-4.

Следует отметить, что пе у всех больных АА продукция ФНОа более, чем в 10 раз превышала показатели нормы, по при широком разбросе данных (от 24 пг/мл до 2500 пг/мл), эта закономерность сохранялась для всей группы в целом как в периферической крови, так и в костном мозге (таблица 8). И если проследить величину среднего уровня спонтанной продукции цитокинов в группе больных (Мдд) по отношению к среднему уровню спонтанной продукции этих цитокинов в группе доноров (Мм), то есть МАа/Мм, то становится очевидным, что приоритеты в продукции цитокинов при АА смещаются в сторону негативного регулятора ФНОа, интенсивность синтеза

которого становится доминирующей как в периферической крови, так и в костном мозге (рис. 6).

Примечание: Млл/Мщ - показатель, характеризующий во сколько раз

спонтанная продукция цитокина при ЛА (Мал) превышает норму (Мм)

Рис. б. Интенсивность синтеза основных оппозитных цитокинов мононуклеарами периферической крови и костного мозга при АА

Следует отметить, »по» сопоставляя уровпи цитокинов у отдельных больных, мы не выявили статистически значимой корреляции между синтезом позитивных и негативных регуляторов, то есть между ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНОа. Однако между ИЛ-4 и ФНОа была установлена достоверная (РОДИ) обратная коррелятивная связь, выявленная и в периферической крови (г - -0,67), и в костном мозге (г = -0,59). Вероятно, это связано с тем, что ИЛ-1Р, ИЛ-6 и ФНОа являются противоположными цитокинами по гемопоэтическому эффекту и проявляют свои оппозитные эффекты опосредованно, а ИЛ-4 известен как прямой антагонист негативных регуляторов гемопоэза по механизму действия н непосредственно снижает выработку как ФНОа, так и ИФНу.

В экспериментальных исследованиях было показано, что ФНОа, наряду с ИФНу, способен ннгибировать чувствительность клеток-предшественников к гемопоэтикам, блокируя на них соответствующие рецепторы, а ранее было

установлено, что присутствие стимулирующих факторов (Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИЛ-3 и ИЛ-6), которые добавляли в культуру клеток костного мозга больных АА и доноров, не улучшало гемопоэтических функций клеток больных, в отличие от здоровых. В связи с этим можно предположить, что высокий уровень ФНОа, продуцируемый клетками иммунной системы при АА, делает недоступными те или иные гемопоэтические факторы для клеток-предшественников и тем самым способствует угнетению кроветворения при данном заболевании. Показано также, что ФНОа является самым апоптогенным цитокином. Ингибируя чувствительность клеток-предшественников к позитивным гемопоэтическим факторам и активируя процессы апоптоза, ФНОа, таким образом, способен вызывать гипоклеточность костного мозга и папцитопению в периферической крови.

Выявленные закономерности позволяют предположить, что депрессия кроветворения при АА обусловлена нарушением иммунной регуляции гемопоэза, а именно: дисбалансом синтеза и соотношения цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы, - и вызвана не снижением уровня положительных гемопоэтических факторов, но, прежде всего, ; сверхвысокой продукцией негативного регулятора гемопоэза ФНОа (который, при недостаточном уровне своего антагониста ИЛ-4, способствует развитию депрессии кроветворения), а также повышенной продукцией ИЛ-2, поддерживающего сохранность и пролиферацию Т-лимфоцитов, активированные формы которых, в свою очередь, являются продуцентами негативных гемопоэтических факторов. То есть, механизмом,: лежащим в основе угнетения гемопоэза при АА, может быть цитокинопосредовапная , иммуносупрессия.

Для того, чтобы подтвердить данное предположение, мы;изучили: во-первых, взаимосвязь между продукцией гемопоэтических факторов (прежде всего, негативного регулятора ФНОа) и тяжестью депрессии кроветворения больных АА, во-вторых, взаимосвязь между уровнем ФНОа и экспрессией маркера апоптоза С095 и, в третьих, динамику основных регуляторов

гемоноэза в зависимости от эффективности иммуносупрессивной терапии больных АА, в ремиссии и рецидиве заболевания.

Установлено, что даже при тяжелой депрессии кроветворения клетки иммунной системы больных синтезируют сопоставимое с нормой и повышепное количество положительных гемопоэтических факторов, а интенсивность синтеза негативного регулятора ФНОа при обеих формах АА превалирует над синтезом других цитокипов как в периферической крови, так и в костном мозге (рис. 7).

Примечание: Мдл/Ми - показатель, характеризующий во сколько раз

спонтанная продукция цитокина при АА (Мдл) превышает норму (Мм)

Рис. 7. Интенсивность синтеза цитокинов _ мононуклерами периферической крови (А) и костного мозга (Б) в зависимости от тяжести заболевания.

Группы с нормальным гемопоэзом, умеренным и тяжелым угнетением гемопоэза достоверно различаются между собой только по одному параметру: ФНОа (таблица 9). Спотанпая продукция данного ингибиторного цитокина у больных с умеренным угнетением кроветворения достоверно превышает таковую в группе с нормальным гемопоэзом, а у больных с тяжелым угнетением, гемопоэза она настолько велика, что делает статистически значимыми различия не только между группами больных и доноров, но и между группами больных с тяжелой и нетяжелой формой АА.

Это позволяет заключить, что тяжесть депрессии кроветворения при АА обусловлена, прежде всего, интенсивностью синтеза негативного регулятора

гемопоэза ФНОа, сверхвысокая продукция которого имеет патогенетическое значение.

ТАБЛИЦА 9

Уровень спонтанной продукции ФНОа моиоиуклеарамн периферической крови и костного мозга больных апдиетической анемией в зависимости

от тяжести заболевания

Фактор некроза опухоли альфа (пг/мл)

Группа Костный мозг Периферическая кровь

Б-ные ТАА 416,5*67,4 . 719,8*39,9

(1) (п=4!) (п-4П

Б-ные НАА 119,1*6,1 288,3*82,0

(2) И9) (п-19)

Доноры 42,3 ¿3,4 44,2*16,9

(3) (п-12) (п=32)

Рм <0,005 <0,0001

Рм <0,05 <0,05

Ри <0,005 <0,005

Уровень спонтанной продукции ФНОа и количество клеток, экспрессирующих маркер апоптоза, представлены в таблицах 10 и 11.

Учитывая, что Fas экспрессируется па многих клетках, но апоптозу подвергаются только активированные, мы сопоставили уровень спонтанной продукции ФНОа не только с количеством клеток, экспрессирующих маркер апоптоза (или преапоптотических), но и с количеством активированных (DR+ н CD25+) клеток и соотпеслн это с различной тяжестью депрессии кроветвреиия больных АА.

Установлено, что как в периферической крови (таблица 10), так и в костном мозге (таблица И) сверхвысокой продукции апоптогенного шггокина ФНОа при ТАА соответствовало не только более выраженное и достоверное повышение количества CD95+- клеток, но И статистически значимое повышение числа клеток, несущих маркеры активации (CD25* и DR+). Проведение корреляционного анализа ерди указанных параметров подтвердило достоверную прямую взаимосвязь между величиной продукции

ФНОа и количеством СП95+ клеток (гЮ,564, р=0,0005 для периферической крови и г=0,511, р<0,005 для костного мозга), а также между уровнем ФНОа и количеством активированных ОЮ клеток (г=0,368, р<0,05 и г-=0,471, р<0,005 для периферической крови и костного мозга, соответственно).

ТАБЛИЦА 10

Спонтанная продукция ФНОа и содержание активированных (1Ж+ н С025+)и преапоптотических (С0954) клеток в периферической крови больных различными формами апластичсской анемии

Группа С025+(%) (%) СЭ95+ (%) ФНОа (пг/мл)

ТАА (1) 28,5±1,3 (п=б4) 32,2±1,4 (п=64) 30,1 ±0,9 (п=41) 719,8±39,9 (п=41)

НАА (2) 26,3±1,6 (п-24) 2 8,9 ±2,3 (п=24) 24,1 ±0,4 (п=19) 288,3±82,0 (п=19)

Доноры (3) 24,1±1,1 (п=48) 24,9±0,9 (п=48) 13,2±0,8 (п=32) 44,2±1б,9 (п=32)

Р.* <0,05 <0,01 <0,0001 <0,0001

Р 2-3 >0,05 >0,05 <0,001 <0,05

Р1-2 >0,05 >0,05 >0,05 <0,005

ТАБЛИЦА 11

Спонтанная продукция ФНОа и содержание активированных (Т)К* и (Л>25+> и преапоптотических (С1)95+) клеток в костном мозге больных различными формами апластнческой анемии

Группа С025+<%) ПК+ (%) С095+ (%) ФНОа (пг/мл)

ТАА 27,8±2,1 34,0±2,1 28,7±1,3 416,5±67,4

(1) (п=64) (п=64) (п=41) (п-41)

НАА 25,2±1,7 28,4±3,5 24,4±1,5 119,1±6,1

(2) (п=24) (п-24) (п=19) (п-19)

Доноры 17,7±1,4 20,1 ±1,1 14,4 ±0,6 42,3 ±3,4

(3) (п-22) (п=22) Гп=Ш (п-12)

Р* <0,05 <0,05 <0,001 <0,005

Рн >0,05 >0,05 <0,005 <0,05

Рм >0,05 >0,05 >0,05 <0,005

На основании полученных данных мы не можем указать, какое число клеток точно подвергнется апоптозу. Выбор пути - выживание или апоптотическая гибель клетки зависит от наличия как проапоптотических, так

и антиапоптотическнх рецепторов, а также от баланса внутриклеточных посредников соответствующих сишалов. Однако выявленная нами у больных АА положительная коррелятивная связь между интенсивностью синтеза клетками иммунной системы апонтогеиного цитокина ФНОа и количеством клеток, несущих маркеры активации (DR.) и апоптоза (Fas/CD95), а также доказанное в экспериментах наличие экспрессии маркера активации (DR) и специфических рецепторов для индукции апоптоза (Fas/CD95) на CD34+ клетках, свидетельствуют о том, что в качестве одного из механизмов иммуносупресси гемопоэза при АА может иметь место цятокинопосредованная активация процессов клеточного апоптоза.

Характерную для АА сохранность популяции Т-лимфоцитов, но нашему мпеиию, можно объяснить повышенной экспрессией на них рецептора к ИЛ-2 - CD25 и высоким уровнем ИЛ-2, выявленным у больных АА. Известно, что ИЛ-2 в высоких концентрациях, именно таких, при которых он обеспечивает жизнеспособность активированных Т-лимфоцитов, способен запускать механизмы 'защиты клеток от апоптоза. При этом субпопуляция «профессиональных продуцентов цитокинов» - CD4+ Т-лимфоцитов - является наиболее устойчивой к апоптотической гибели из-за конститутивной экспрессии у них большего количества Fas-ассоциированной фосфатазы - 1/FAP, которая участвует - в дефосфорилировании' цитоплазматической части Fas, защищая клетку от Fas-опосредованного апоптоза. Таким образом, популяция Т-клеток при АА, будучи запщщегшой от апоптогенного влияния ФНОа, сама является активным продуцентом данного негативного гемопоэтического факгора.

Динамика основных риуляторов гемопоэза в зависимости от эффективности иммуносупрессивиой терапии больных АА циклоспорином А представлена на рис. 8 и 9.

Известно, что циклоспорин А (ЦсА) ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов, имея своей мишенью преимущественно CD4+ клетки, а также снижает выработку ИЛ-2 и, как было недавно установлено, ФНОа тоже. Это

обстоятельство делает терапию больных АА данным препаратом весьма удобной моделью для подтверждения гипотезы о цитокинопосредованной иммуносупрессии кроветворпия при АА.

Анализ представленного а работе материала был проведен на основании обследования 45 больных АА в процессе иммуносупрессивной терапии циклоснорином-А (сапдиммуном, производства фирмы Сандоз-Новартис) в средних дозах 4-10 мг/кг массы тела в сутки перорально при длительности приема от 4 до 12 и более месяцев. Положительный эффект был получен у 33 (73,4%) из 45 больных АА, причем клиника-гематологическое улучшение было отмечено у 6 пациентов (13,3%), частичная ремиссия у 15 (33,5%) и полная клинико-гематологическая ремиссия - у 12 (26,6%) больных. Заметного эффекта от терапии сандиммупом достичь не удалось у 12 (26,6%) пациентов. Кроме того, у 8 больных с достигнутой ремиссией в последующем был отмечен рецидив заболевания.

Обязательный алгоритм исследований включал определение способности мононуклеаров периферической крови и костного мозга больных к продукции гемопоэтических факторов, по крайней мере, трижды: в момент постановки (или подтверждения) диагноза до лечения, в течение первых двух месяцев иммупосупрессивной терапии и по достижении частичной или полной ремиссии в случае успешного лечения. Отдельно был проведен анализ соотношения основных оппозитных цитокинов и измнений иммунофенотипических характеристик мононуклеаров при рецидиве заболевания и при полной кл инико -гемато л о ги ч еской ремиссии.

Анализ динамики основных регуляторов гемопоэза в процессе иммуносупрессивной терапии больных АА, позволяет сделать вывод, что успешному лечению (рис. 8), с последующим выходом в частичную или полную клинико-гематологическую ремиссию, сопутствует снижение сверхвысокой интенсивности синтеза негативного ре]улятора гемопоэза

1200 г^ 1000' 800 600-адог 200 О

------споит,

-индуцнр

норм

т

ФНО-альфз, п/*

Пршя Пр4ц>СС4 рМ1«М

ИГК2, п>к

кжжш

ИЛ1-б«та, пЫ

Прми |)т(«СИН

1-100

1200 угг:

1000

800 л-

600 Т

400 т

200 17

0-1

□ споит. Н иидуцир.

я

ФНО-альфа, к/м

ИЛ-2, кГм

Рис. Дипамикз продукции цитокииов моноиуклеарами периферической крови (п/к) и костного мозга (к/м) больных АЛ при успешной иммуносуирессивпон терапии

О с понт. ' икдуцир.

ФНО-альфа.л^к

_ , , 1*р*пш (|иц|си роимом» ИЛ-1-бета, юм прими

Рис. 9. Динамика продукции цитокинов мопонуклеарами периферической крови (п/к) и костного мозга (к/м) больных АА в процессе неэффективной иммунэсупрессивной терапии

ФНОа, снижение нсходно повышенной продукции фактора роста Т-яимфоцитов ИЛ-2, восстаноапение (в костном мозге практически полное) соотношения уровней спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-1р, то есть нормализация не только интенсивности си иге за, но и реактогенного потенциала клеток в отношении данного цитокина, и активация - продукции позитивного фактора ИЛ-б. При неэффективной им му носу прессив ной терапии (рис. 9) наблюдается дальнейшее повышение интенсивности синтеза ФНОа и Ш1-2, дальнейший подъем уровня спонтанной продукции ИЛ-1р и ИЛ-6 с ослаблением их реактог*еппого потенциала.

Анализ соотношения основных оппозитных цитокинов в динамике заболевания (ремиссии и рецидиве), а также соответствующие этом двум стадиям изменения иммунофепотипической характеристики цитокинпродуцирующих клеток позволили выявить определенные закономерности.

Как было установлено, при АА приоритеты в продукции цитокинов, в отличие от нормы, перемещаются с ИЛ-6 в сторону ФНОа (рис. 11), а уровень продукции ФНОа достоверно коррелирует с уровнем маркера активации мононуклеаров ОК.

Рецидив заболевания характеризуется прогрессией всех нарушений в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток, выявленных при АА. Так, повышению (как по сравнению с исходным уровнем в периферической крови, так и по сравнению с нормой в костном мозге) количества СШ+, С04+, СТ> 16+ лимфоцитов и, прежде всего, уровня их активации (экспрессии , маркера ОЯ), а также повышению величины иммунорегуляторного индекса (С04+/СГ)8+), выявленным в рецидиве заболевания в периферической крови и костном мозге больных АА (рис. 10), соответствует достоверное увеличение продукции ИЛ-1р и ИЛ-2 и, прежде всего, сверхвысокая, доминирующая над всеми цитокинами, интенсивность синтеза негативного регулятора гемопоэза ФНОа при снижении продукции его антагониста ИЛ-4 (рисунок 11).

с03+ с04+- сс»+ с016+ 0№-яГк,до терапии

80,0

соз* с 04* с09* сш6+ к/м, до терапии

СШ+ СМ+ С 08+ СИ6+ ОН к/и, роцидип

с оз

к/м, р»м«ссия

РисЛ 0. Иммунофенотнпическая характеристика

цитокиппродуцирующих клеток периферической крови (п/к) и костного мозга (К/'м) в динамике заболевания

Выявленная динамика цитокинов в совокупности с повышением иммунорегуляторногпо индекса (С04+/С03+) свидетельствует о том, что в рецидиве заболевания активируется, прежде всего, субпопуляция Т-хелперов I класса (ТЫ).

Стадия полной клинико-гемаггологическо й ремиссии характеризуется

—

ИЛИ ИЛ-6 ФИО игм Полная ремиссии

т-г

12

10 «

в 4

2 О

у

J

ИЛИ ИЛ-в ФИО ИЛ-4 Дотерзпим

ИЛ-2

ИГМ ИЛ-в ФИО игм Рецидип

ИЛ-2

Примечание: Мда/Мм - показатель, характеризующий во сколько раз

спонтанная продукция цитокина при АА (Мдл) превышает норму (Мы)

Рис. 11. Соотношение основных оппозитных цигокиноп, продуцируемых моионуклеарами периферической крови (п/к) и костного мозга (к/м) больных АА, в динамике заболевания

тенденцией к нормализации в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток. Так, достоверному, по сравнению с рецидивом, снижению уровня практически всех субпопуляций (за исключением СО8+ клеток) и, прежде всего, уровня их активации, а также уменьшению (вплоть до инверсии) величины иммунорегуляторного индекса (СЭ4+/С08+<1), выявленным в стадии полной ремиссии в периферической крови и костном мозге больных АА (рисунок 10), соответствует смещение приоритетов в продукции цитокинов мононуклеарами больных с негативного регулятора ФНОа в сторону ИЛ-б (рисунок 11). Интенсивность синтеза данного позитивного фактора становится преобладающей над синтезом других цитокинов, как это было выявлено в норме. Однако даже в стадии

полной клин ико-гематологи ческой ремиссии уровень продукция ФНОа моноиуклеарами и периферической крови, и костного мозга больных остается повышенным, как и экспрессия коррелирующего с ним маркера активации 1Ж

Анализ динамики основных регуляторов гемопоэза в процессе иммуносупрессивной терапии больных, а также их соотношение в состоянии полной клинико-гематояогическон ремиссии и при рецидиве заболевания, подтверждает гипотезу о нарушении иммунной регуляции гемопоэза при АА, механизмом которого служит цитокинопосредованная иммуносупрессия.

То обстоятельство, что тенденции в динамике цитокинов, выявленные в первые месяцы эффективной иммуносупрессивной терапии, сохраняются и наиболее ярко проявляются в состоянии полной ремиссии, а тепдопции, выявленные в первые месяцы неэффективной терапии, как правило, наиболее ярко проявляются при рецидиве заболевания, позволяет использовать динамику уровня цитокинов в течение первых месяцев лечения в качестве критерия эффективности проводимой иммуносупрессивной терапин н ранних прогностических заключений о ходе заболевания.

Таким образом, на основании комплексного анализа выявленных взаимосвязей между нарушениями цитокинового, иммунного статусов и тяжестью депрессии гемопоэза установлена роль иммунной системы в развитии аплазии кроветворения при АА. Повязано, что одним из ведущих механизмов, лежащих в основе угнетения гемопоэза при данном заболевании, является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной сисгемы - моноиуклеарами периферической крови и костного мозга больных. Установлено, что депрессия кроветворения при АА вызвана не снижением секреции стимулирующих гемопоэтических. факторов (ИЛ-1р, ИЛ-3, ИЛ-б), но, во-первых, сверхвысокой продукцией ингибиторного цитокина ФНОа, который, при недостаточности своего антагониста ИЛ-4, способствует развитию

депрессии гемопоэза, снижая чувствительность клеток-предшественников к гемопоэтическим факторам и активируя процессы апоптоза, - и, во-вторых, повышенной продукцией ИЛ-2, обеспечивающего сохранность и пролиферацию Т-лимфоцитов, активированные формы которых, в свою очередь, являются продуцентами негативных гем о п озтич ее ких факторов.

ВЫВОДЫ

К Одним из ведущих механизмов формирования депрессии кроветворения при апластической анемии, является цитокинопосредоваиная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы — мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных апластической анемией.

2. Продукция мультиксшониестимулирующего фактора ИЛ-3, ИЛ-1р и ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови и костного мозга, а также уровень ЭПО при апластической анемии являются либо сопоставимыми с нормой, либо повышенными. Это свидетельствует об отсутствии связи депрессии кроветворения при данном заболевании с недостаточным синтезом позитивных гемопозтических факторов.

3. В норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над продукцией других цитокинов, тогда как при апластической анемии приоритеты в синтезе гемопозтических факторов смещены в сторону негативного цитокипа ФНОа, спонтанная продукция которого превышает норму более, чем в 10 раз.

4. Положительная связь между интенсивностью синтеза ФНОа и тяжестью нарушения гемопоэза у больных тяжелой и нетяжелой формами АА свидетельствует о патогенетической роли данного ингибиторного цитокина в формировании депрессии кроветворения при данном заболевании.

5. Субпопуляция СС>4+ Т-хелперов 1 типа (ТЫ) является преобладающей при тяжелой форме АА и существенно увеличивается в рецидиве заболевания.

6. Выявлена положительная коррелятивная связь между продукцией мононуклеарами больных АА апоптогенного цитокина ФНОа и экспрессией маркеров активации (ОК) и апоптоза (Раз/СВ95).

7. Повышенная продукция моноиуклеарами периферической крови и костного мозга ИЛ-2 - фактора роста Т-лимфоцитов и аптиапоптотического цитокина — в сочетании с увеличенной экспрессией на них рецептора для ИЛ-2 - С025 обеспечивает пролиферацию лимфоидных клеток и их защиту от апоптогенного влияния ФНОа.

8. Рецидив заболевания характеризуется прогрессией всех нарушений в соотношении цитокипов и цитокинпродуцируюших клеток, выявленных при АА в периферической крови и костном мозге. Повышению уровня лимфоидных субпопуляций (СОЗ+, С04+, С016+), экспрессии маркера активации ОК. и величины иммунорегуляторного индекса соответствует увеличение продукции ИЛ-1Р и ИЛ-2 и сверхвысокая интенсивность синтеза ФНОа при снижении продукции его антагониста - ИЛ-4.

9. Полная клинико-гематологическая ремиссия характеризуется тенденцией к нормализации в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток периферической крови и костцого мозга. Снижению экспрессии маркера активации ПК, а также уменьшению (вплоть до инверсии) величины иммунорегуляторного индекса соответствует смещение приоритетов в продукции гемопоэтических факторов с негативного регулятора ФНОа в сторону ИЛ-6, однако даже в состоянии ремиссии продукция ФНОа клетками иммунной системы остается повышенной.

10. Определена прогностическая значимость динамики основных регуляториых цитокинов в процессе иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией: снижение спонтанной продукции ФНОа, а также фактора роста Т-лимфоцитов - ИЛ-2 с одновременным восстановлением и активацией положительного фактора ИЛ-6 в течение первого месяца лечения является благоприятным прогностическим фактором, свидетельствующим об адекватной иммуносупрессивной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении периичнога обследования больных апластической анемией в дополнение к традиционным (морфологическим, гистологическим и др.) лабораторным исследованиям рекомендуется определять некогорые показатели цитокннового и иммунного статуса больных:

- исследование цитокинов включает в себя определение спонтанной (обязательное) и индуцированной (желательное) продукции клеткми иммунной системы (моионуклеарами периферической крови и/или костного могза), прежде всего, ингибирующего цитокина ФНОа и, далее по степени важности, ИЛ-2, ИЛ-б и ИЛ-1 р;

- 1гсследование иммунного статуса носит факультативпый характер, может проводиться при отсутствии возможности определения продукции цитокинов и должпо быть направлено на определение иммунофенотинйческой характеристики основных цитокинпродуцирующих клеток: выявление СОЗ+, С04+, С08+, СО 16+ мононуклеаров периферической крови и, особенно, костного мозга, но, - прежде всего, соотношения иммунорегуляторпых субпопуляций (иммунорегуляторного индекса СВ4-»/СЭ8+) и наличия маркера активации ЭК..

2. Повышение величины иммунорегуляторного индекса (С04-»/С08+ ~1,5 и более) при увеличении количества активированных мононуклеаров (ОН+ клеток) в сочетании со сверхвысокой спонтанной продукцией ФНОа в 1015 раз) и повышенной ИЛ-2 (в 3-8 раз) характеризует тяжелую форму заболевания.

3. Особое внимание следует обращать на динамику. цитокинов в процессе терапии: снижение спонтанной продукции, прежде всего, негативного регулятора гемопоэза ФНОа, а также фактора роста Т-лимфоцитов — ИЛ-2 с одновременным восстановлением И активацией положительного фактора ЙЛ-6 в течение первого месяца лечения можно рассматривать как благоприятный прогностический фактор, свидетельствующий об адекватной иммуносупрессивной терапии; повышение спонтанной продукции

негативного регулятора ФНОа, и фактора роста Т-лимфоцитов - ИЛ-2 с ослаблением реактогенного потенциала клеток в отношении позитивного фактора ИЛ-6 в течение первого месяца лечения, свидетельствуют о неэффективной иммуносупрессивной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Rozanova О. Lymphocyte subpopulations and serum TNFa level in patients with aplastic anaemia in antilymphocyte globulin treatment/ O.Rozanova, L.Bubnova, T.Glazanova, T. Pop о va, A.Ganapiev// 12 Meeting of the International Society of Haematology. - Austria. - 1993. - P. 65.

2. Bubnova L. Serum TNFa and IL-lp levels in haematological patients and during ВМТ/ L.Bubnova, O.Rozanova, T.Glazanova, I.Pavlova, N. Kalinina, S.Moiseev// 19 Annual Meeting of the EBMT. - Germany. » 1993. - P.25.

3. Rozanova O. Peripheral lymphoid subsets and serum cytokine level in patients with aplastic anaemia during ALG-therapy/ O.Rozanova, L.Bubnova, T.Glazanova, I.Pavlova, E.Shilova, A.Ganapiev// 1st Meeting of the European Haematology Association. - Belgium. - 1994. - P.83.

4. Ganapiev A. New method of immunomodulation therapy by ultraviolet irradiation . for treatment with, aplastic anemia/ A.Ganapiev, S.Moiseev, O.Rozanova// Iй Meeting of the European Haematology Association. - Belgium. -

1994.-P. 124.

5. Ganapiev A. The method of immunosuppression by ultraviolet irradiation in patients with aplastic anaemia/ A.Ganapiev, S.Moiseev, O.Rozanova, I.Pavlova, T.glazanova, FLAbdulkadirov // 20 Annual Meeting of the EBMT. - UK. - 1994. -P.211.

6. Bubnova L. Autologous BMT: serum TNF level and lymphoid subsets/ L.Bubnova, O.Rozanova, T.Glazanova, I.Pavlova, K..Abdulkadirov// XXII Meeting of ISOBM. - Groningen. - 1994. - P.206.

7. Ганапиев А. Динамика показателей иммунитета у больных алласгаческой анемией в процессе АЛГ-терапии/ А.Ганапиев, Л.Бубиова, О.Розанова, Т.Глазанова, ИПавлова, Е.Шилова// Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Тез. докл. - Баку, 1994. - С. 15-16.

8. Ганапиев А.А. Результаты лечения больных апластической анемией различными дозами антилкм фо цитарного глобулина/ А .А .Ганапиев, К.М.Абдулкадыров, Е.Р.Шилова, Т.И.Попова, О.Е.Розанова, Ю.Л.Кацадзе// Терапевтический архив. - 1995. - №8. -С.51-54.

9. Абдулкадыров К.М. Морфологические и патогенетические аспекты апластической анемии/ К.М.Абдулкадыров, С.С.Бессмельцев, В.А.Балашова, О.А.Рукавицын, Е.Р.Шилова, О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова// Морфология! -

1995. - Т. 108, № 3. - С. 58-62.

10. Гапапнев А. Новый метод иммуиомоделирующей терапии апластической анемии с помощью ультрафиолетового облучения крови/ А.Гапапиев, С. Моисеев, О.Розанова, Т. Глаза нова, И.Павлова, С.Тиранова, К.Абдулкадыров// Матер. 3" Всероссийск. коифереиц. гематол. и трансфузиол., СПб, 1995: Тез. Докл. - СПб, 1995. - С. 384-386.

11. Bubnova L. Effect of ALG and UV irradiation treatment on scrum cytokine level in aplastic anaemia/ L.Bubnova, O.Rozanova, T.Giazanova, I.Pavlova, A.Ganapiev, K.Abdulkadirov// Experimental Hematology. - 1995. - V. 23, № 8. -P. 912. ......

12. Bubnova L. TNFa in vitro influence on the cells of patients with aplastic anaemia/ L. Bubnova, O.Rozanova, T.Glazanova, I.Pavlova, K.Abdulkadirov// Experimental Hematology. - 1996.-V. 24, № 9. - P. 1103.

13. Bubnova L. Immunologic monitoring in patients with autologous bone marrow transplantation/ L.Bubnova, T.Glazanova, O.Rozanova, I.Pavlova, S.Moiseev, K.Abdulkadirov// Human immunology. - 1996 - Vol. 47, N 1-2. - P. 134.

14. Розанова O.E. Влияние ФНОа na клетки больных апластической анемией в опытах in vitro/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова, Т.В.Глазанова, И.Е.Иавлона, С.И.Моисеев// Актуальные вопросы гематологии и трак сфуз и ол оги и ; Матер. III Всероссийского съезда гематол. и трансф. - СПб., 1996. - С. 14. -

15. Бубнова Л.Н. Иммуномониторинг и иммунореконсгитупия реципиентов аллогенного костного мозга/ Л.КБубнова, Т.В.Глазанова, О.Е.Розанова, И.Е.Павлова, С.И.Моисеев, К .M. А бдул кадыр ou// Вопросы онкологии. - 1996. - Т. 42, № 4. - С.36-39.

16. Ganapiev A. The immunomodulation mechanisms of blood ultraviolet irradiation in patients with aplastic anemia/ A.Ganapiev; S.Moiseev, O.Rozanova, L.Ribakova, T.Glazanova, L.Bubnova// Bone Marrow Transplantation. - 1997. — V. 19, suppl. 1.-РЛ06.

17. Rozanova O. Serum IL-ip and TNFa level and its cell production in aplastic anaemia/ O.Rozanova, T.Glazanova, L.Bubnova, I.Pavlova, KLAbdulkadirov// 26th Annual Meeting of the International Society of Experimental Hematology. Cannes - 1997.- abstr. № 134.

18. Rozanova O. Impaired TNF, IL-1 and IL-2 production by mononuclear cells in patients with aplastic anaemia/ O.Rozanjva, T.Glazanova, I.Pavlova, L.Bubnova, K.Abdulkadirov// 27th Annual Meeting of the international Society of Experimental Hematology. - Vancouver. - 1998. - abstr.N 407.

19. Абдулкадыров K.M. Динамика клинико-лабораториых показателен у больных апластической анемией в процессе лечения циклоспорином А (сандимуном)/ К.М.Абдулкадыров, Т.И.Иопова, Е.Р.Шилова, Л.Н.Бубнова, О. Е.Розанова, М.Н.Зенина, Ю.Л.Кацадзе// 36ipHHK наукових* прахгь сшвроб¡тник1в КМАПО îm. П.Л.Щупика. - Киев. - 1999. - вып.8, книга 1. - С. 5-9.

20. Rozanova О. TNFa, IL-1 р and IL-2 production by peripheral and bone marrow mononuclear cells in patients with aplastic anaemia/ O.Rozanova, T.Glazanova, L.Bubnova, I. Pavlova, K.Abdulkadirov, T.Popova// 4th Congress of the European Haematology Association. - Spain. - 1999. - abstr. № PO-0848.

21. Ganapiev Л, Sufficient decrease in CD16+, CD38+ and CD25+ lymphocytes ailer ex vivo ultraviolet irradiation of peripheral blood: a rationale for immunosuppressive UV theraoy in aplastic anemia// A.Ganapiev, O.Rozanova, L.Ribakova, T.Glazanova, I.Pavlova, B.Afanasiev, A.Chuhlovin// Bone Marrow Transplantation. - 1999. -V. 12, suppl. 2. - P.86.

22. Розанова О ,E. Динамика уровня цитокинов в периферической крови и костном мозге больных апластической анемией в процессе терапии/ О.В.Розанова, Л.Н.Бубпова, Т.В.Глазанова, И.Е;11авлова, Е.Р.Шияова, Т.И.Попова, К.М.Абдулкадыров// Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Матер, науч.-практич. копф. - Мипск. - 2000. - С. 35-38.

23. Rozanova О. The dynamics of cytokine level during the therapy of aplastic anaemia with cyclosporin A (CsA)/ O.Rozanova, T.Glazanjva, I.Pavlova, L.Bubnova, T.Shilova, iCAbdulkadirov// The Hematology Journal - 2000. - V. 1, suppl. 1. - P. 45.

24. Абдулкадыров K.M. Комплексная оценка уровня цитокинов в периферической крови и костном мозге больных апластической анемией при прогнозировании течения заболевания/ К.М.Абдулкадыров, Л.НБубнова, -О.Е.Розанова, Т.В.Глазанова, И.Е.Павлова, Т.И.Попова, Е.Р.Шилова// Методические рекомендации, утвержденные МЗ РФ. - 2001. - 17 с.

25. Розанова О.Е. Продукция цитокинов клетками периферической крови и костного мозга бальных апластической анемией/ О.Е.Розанова, Л.НБубнова, Т.В.Глазанова, И.Е.Павлова, К.М.Абдулкадыров// Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы».-2001,-Т. 5, № 1.-С. 58-59.

26. Бахтин С.И. Влияние Т-лимфоцитов на восстановление гемопоэза после трансплантации аутологичных стволовых клеток/ С.И.Бахтин., Т.В.Глазанова, О.Е.Розанова, И.Е.Павлова, С.И.Моисеев// Медицинская иммунология. — 2001. - Т. 3. - J& 2. - С.304.

27. Розанова О.Е. Содержание эритропоэтина в сыворотке больных апластической анемией/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова, Т.В.Глазанова, И.Е.Павлова, Е.Р.Шилова, Т.И.Попова// Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер, науч.-практич. конф. - СПб. - 2002. - С. 257.

28. Грицаев С.В. Спонтанная продукция цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови как маркер эффективности терапии циклоспорином А больных миелодиспластическим синдромом/ С.В.Грицаев, О.Е.Розанова, С. С. Бессмельцев, Л.Н.Бубнова, К.М.Абдулкадыров// Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер, науч.-практич. конф. - СПб. - 2002. - С. 109-110.

29. Розанова О.Е. Продукция некоторых гемотюэтических факторов у больных апластической анемией/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова, Т.В.Глазанова, И.Е.Павлова// Медицинская иммунология: - 2002. - Т. 4, № 2. - С. 16—161.

30. Rozanova О. Synthesis of some hemopoietic factors in patients with aplastic anaemia/ O.Rozanova, L.Bubnova, T.GJazanova, I.Pavlova// The Hematology Journal. - 2002. - V. 1, suppl. 1. - astr. № 1444.

31. Розанова O.E. Синтез некоторых цитокинов - позитивных и негативных регуляторов гемопоэза - у больных апластической анемией/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова// Медицинская иммунология. - 2003. - Т. 5, № 3-4. - С. 441-442.

32. Розанова O.E. Синтез некоторых гемопоэтических факторов у больных апластической анемией / О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер. V Съезда гематологов и трансфузиологов респ. Беларусь. - Минск. - 2003. - Т.]. - С. 111-114.

33. Розанова O.E. Продукция ИЛ-2 и ИЛ-4 мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных апластической анемией/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова, Е.Р.Шилова, К.М.Абдулкадыров// Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Матер, науч.-практич. конф. - 2004. - СПб. -С. 78.

34. Розанова O.E. Соотношение и синтез некоторых цитокинов - регуляторов гемопоэза у больных апластической анемией/ O.E. Розанова// Медицинская иммунология. - 2004. - Т. 6, № 3-5. - С.354-355.

35. Розанова O.E. Продукция IL-3 мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных апластической анемией/ O.E.Розанова// Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, Кг 2-3. - С. 319.

36. Грицаев C.B. Клиническое значение отдельных субпопуляций лимфоцитов и цитокинпродуцирукнцей активности клеток крови больных первичпым миелодиспластическим синдромом/ С.В.Грицаев, O.E.Розанова, Абдулкадыров K.M., Бубнова Л.Н., Тиранова С.А.// Вопросы онкологии. — 2005.5. - С. 563-566.

37. Розанова O.E. Способность монопуклеаров периферической крови и костпого мозга больных апластической анемией к продукции мультиколониестимулирующего фактора - интерлейкина 3/ О.Е.Розанова// Медицинская иммунология. — 2005, -Т. 7, №4. - С. 421-424.

38. Розанова O.E. Цитокипопосредованные аспекты иммупопатогепеза апластической анемии/ О.Е.Розанова, Л.Н.Бубнова// Цитокииы и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 4. - С. 34-38.

Актуальность темы.

Известно, что многие цитокины относятся к разряду гемопоэтических факторов, являются неотъемлемой частью нормального кроветворения и оказывают влияние на все его этапы. В зависимости от характера этого влияния их условно разделяют на позитивные и негативные регуляторы гемопоэза. К позитивным регуляторам относятся те факторы, которые поддерживают пролиферацию стволовой кроветворной клетки (СКК), лимфоидных, эритроидных, гранулоцитарных, моноцитарных предшественников, стимулируя соответствующие ростки кроветворения. Это, прежде всего, различные колониестимулирующие факторы (КСФ), эритропоэтин (ЭПО), интерлейкины (ИЛ)-1, 3, 6, 11 и т.д. Другие цитокины, такие, как фактор некроза опухоли (ФНО), интерферон (ИФН), трансформирующий фактор роста (ТФР), напротив, могут снижать клоногенность всех типов предшественников гемопоэтических клеток, в силу чего они способны подавлять эритро-, моно-, гранулопоэз и, по мнению большинства исследователей, относятся к безусловно негативным регуляторам гемопоэза (Орловская И. А. и соавт., 1996; Li W.M. et al., 2000; Deeg H.J. et al., 2000). Исследование гемопоэтических факторов является наиболее актуальным при заболеваниях, связанных с нарушением гемопоэза, к которым, несомненно, относится апластическая анемия.

Апластическая анемия (АА) является одной из самых сложных проблем современной гематологии. Это редкое и тяжелое заболевание системы крови с высоким процентом инвалидизации и смертности больных (Абдулкадыров К.М., Бессмельцев С.С., 1995; Rosenfeld S. et al., 2003). Характерным признаком АА является гипоклеточность костного мозга и панцитопения в периферической крови. Это глобальная трехростковая недостаточность гемопоэза, в основе которой, по современным представлениям, лежит прямое или опосредованное повреждение стволовой кроветворной клетки, приводящее к дисбалансу между основными процессами, составляющими нормальный гемопоэз: пролиферацией, дифференцировкой и клеточным апоптозом. Однако, несмотря на более, чем 100-летнюю историю изучения АА, механизмы, приводящие к подобному повреждению, до сих пор окончательно не установлены.

Среди основных концепций развития депрессии кроветворения при данном заболевании, наряду с прямым поражением стволовой клетки и дефектностью гемопоэтического микроокружения, важное место занимает гипотеза о том, что повреждение клеток (как стволовых кроветворных, так и микроокружения) может вызываться и поддерживаться иммунологическими механизмами. Концепция иммунного патогенеза АА привлекает к себе внимание все большего числа исследователей. Это представляется обоснованным в силу ряда обстоятельств. Во-первых, именно иммуносупрессивная терапия, вне зависимости от концептуального подхода, в большинстве случаев приводит к положительным результатам. Во-вторых, именно клетки иммунной системы являются основными продуцентами большинства вышеперечисленных гемопоэтических факторов, которые, как известно, оказывают влияние на процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза, регулируя, таким образом, гемопоэз, если в качестве клеток-мишеней служат гемопоэтические предшественники.

К сожалению, отечественные исследователи практически не занимаются проблемами цитокинопосредованных процессов при АА. Однако в зарубежной литературе за последнее десятилетие появилось достаточно много сообщений по этому вопросу (Teramura М., Mizoguchi Н., 1996; Young N.S., 2002; Sleijfer S., Lugtenburg P.J., 2003; Dubey S. et al., 2005). Тем не менее, несмотря на бесспорный прогресс в понимании механизмов развития АА, вопрос о единой и общепризнанной теории патогенеза заболевания нельзя считать решенным. До сих пор не выработано единого мнения по поводу уровня гемопоэтинов при АА. Несмотря на признанную роль цитокинов в регуляции гемопоэза, комплексная оценка степени нарушения цитокинового статуса больных АА до сих пор отсутствует. И несмотря на известный постулат, что кроветворение в норме обеспечивается сбалансированным комплексом как позитивных, так и негативных цитокиновых сигналов, до сих пор не определено соотношение основных стимулирующих и ингибирующих цитокинов у больных АА и их динамика в процессее терапии. Не выяснена связь между нарушениями цитокинового, иммунного статусов и тяжестью депрессии кроветворения больных, а, следовательно, не определены их значимость и место в механизме развития болезни.

В связи с этим, исследование синтеза и соотношения цитокинов, которые продуцируются клетками иммунной системы и одновременно влияют на гемопоэз, являясь его позитивными и негативными регуляторами, в норме и при АА представляется актуальным и способствующим выяснению роли иммунной системы в формировании депрессии кроветворения.

Цель исследования.

Установление роли иммунных механизмов в формировании депрессии кроветворения при апластической анемии, совершенствование диагностики, критериев прогноза течения заболевания и эффективности иммуносупрессивной терапии на основе новых знаний о цитокинопосредованных нарушениях иммунной регуляции гемопоэза.

Задачи исследования.

1. Изучить особенности иммунного статуса больных АА в зависимости от тяжести заболевания.

2. Исследовать уровень и продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных АА позитивных гемопоэтических факторов: ЭПО, ИЛ-1/3, ИЛ-3 и ИЛ-6.

3. Исследовать продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных АА негативных гемопоэтических факторов: ИФНуиФНОа.

4. Исследовать продукцию мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных АА антагониста негативных регуляторов ИЛ-4 и фактора роста Т-лимфоцитов ИЛ-2.

5. Определить соотношение основных оппозитных цитокинов в норме и при АА.

6. Установить взаимосвязь между нарушениями цитокинового, иммунного статусов и тяжестью депрессии кроветворения больных АА.

7. Исследовать динамику основных регуляторов гемопоэза в зависимости от эффективности иммуносупрессивной терапии больных АА.

8. Исследовать соотношение основных позитивных и негативных регуляторов гемопоэза и изменение иммунофенотипических характеристик цитокинпродуцирующих клеток больных АА в ремиссии и рецидиве заболевания.

Научная новизна.

Впервые на основании сравнительного анализа способности мононуклеаров периферической крови и костного мозга к продукции гемопоэтических факторов - цитокинов - дана комплексная оценка нарушений цитокинового статуса больных АА и установлено соотношение основных позитивных и негативных регуляторов гемопоэза в норме и при АА. Показано, что в норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над синтезом других цитокинов, тогда как при АА приоритеты смещаются в сторону негативного регулятора ФНОсе, интенсивность синтеза которого становится доминирующей как в периферической крови, так и в костном мозге.

Впервые охарактеризована динамика соотношения оппозитных цитокинов в процессе заболевания: в стадии полной клинико-гематологической ремиссии и рецидиве, - а также проанализированы соответствующие этим стадиям изменения иммунофенотипических характеристик цитокинпродуцирующих клеток периферической крови и костного мозга больных АА.

Дана оценка иммунного статуса больных АА в соответствии с тяжестью депрессии кроветворения и динамикой заболевания. Выявлены неизвестные ранее взаимосвязи между соотношением иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов периферической крови и костного мозга и степенью нарушения гемопоэза. Установлено, что субпопуляция CD4+ Т-хелперов I класса (Thl) является преобладающей при тяжелой форме АА, а также в рецидиве заболевания.

На основании комплексного анализа выявленных взаимосвязей между нарушениями цитокинового, иммунного статусов и тяжестью депрессии гемопоэза установлена роль иммунной системы в развитии аплазии кроветворения при АА. Показано, что одним из ведущих механизмов, лежащих в основе угнетения гемопоэза при данном заболевании, является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы: мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных. Установлено, что депрессия кроветворения при АА вызвана не снижением секреции стимулирующих гемопоэтических факторов (ИЛ-1(3, ИЛ-3, ИЛ-6), но, прежде всего, сверхвысокой продукцией ингибирующего цитокина ФНОа (который, при недостаточности своего антагониста ИЛ-4, способствует развитию депрессии гемопоэза), а также повышенной продукцией ИЛ-2, обеспечивающего сохранность и пролиферацию Т-лимфоцитов, активированные формы которых, в свою очередь, являются продуцентами негативных гемопоэтических факторов.

Впервые на основании анализа динамики основных регуляторных цитокинов в процессе лечения больных АА разработаны и предложены ранние прогостические критерии течения заболевания и эффективности иммуносупрессивной терапии.

Практическая значимость.

Предложен комплекс иммунологических методов исследования, позволяющих определить особенности иммунного статуса больных апластической анемией в зависимости от тяжести депрессии кроветворения, дополнить диагностику различных ее форм (тяжелой и нетяжелой), а также выделить иммунообусловленные формы заболевания.

Разработаны алгоритм обследования цитокинового статуса больных апластической анемией и иммунологические критерии, позволяющие оценить эффективность проводимой иммуносупрессивной терапии.

Доказана значимость учета динамики основных регуляторных цитокинов, продуцируемых мононуклеарами больных апластической анемией, при прогнозировании течения заболевания на ранних сроках и при выборе адекватной иммуносупрессивной терапии.

Апробация материалов диссертации.

Основные положения диссертационной работы были представлены на 12-ом Съезде Международного Общества Гематологов в 1993 году (Вена, Австрия), на Съездах Европейской Международной Ассоциации Гематологов (ЕНА): 1-ом (1994, Брюссель, Бельгия), 2-ом (1996, Париж, Франция), 4-ом (1999, Барселона, Испания), 5-ом (2000, Бирмингем, Великобритания), 7-ом (2002, Флоренция, Италия), на ежегодных Съездах Международного Общества Экспериментальной Гематологии (ISEH): 24-ом (1995, Дюссельдорф, Германия), 25-ом (1996, Нью-Йорк, США), 26-ом (1997, Канны, Франция), 27-ом (1998, Ванкувер, Канада), на 20-й Международной Конференции Европейской группы Трансплантации костного мозга

Великобритания, 1994), на Международных научно-практических Конференциях «Актуальные проблемы гематологии» (2000 и 2003 гг., Минск, Беларусь), на Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (2001, Санкт-Перербург, Россия), на Научно-практических конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (1996, 1998, 2002, 2004 гг., Санкт-Перербург), на Научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (2003, Москва), на Всероссийских научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2003, 2004, 2005 гг.).

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты диссертационной работы используются в практике Клинического отдела химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга Российского НИИ гематологии и трансфузиологии, в отделении гематологии Детсткой Городской больницы №1 г. Санкт-Петербурга, а также в лекциях и семинарских занятиях на обучающих циклах, проводимых Республиканским Центром иммунологического типирования тканей РосНИИГиТ. По результатам исследований написаны и утверждены:

1. Пособие для врачей «Особенности иммунного статуса больных апластической анемией в зависимости от течения заболевания», 1997г.

2. Методические рекомендации «Комплексная оценка уровня цитокинов в периферической крови и костном мозге больных апластической анемией при прогнозировании течения заболевания», 2001 г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Одним из ведущих механизмов формирования депрессии гемопоэза при апластической анемии является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы. Аплазия кроветворения при данном заболевании связанна, прежде всего, с тем, что мононуклеары периферической крови и костного мозга больных продуцируют сверхвысокое количество ингибирующего гемопоэз цитокина ФНОа при недостаточном уровне его антагониста ИЛ-4 и повышенное количество ИЛ-2.

2. Уровень эритропоэтина и продукция мононуклеарами периферической крови и костного мозга других позитивных гемопоэтических факторов (мультиКСФ - ИЛ-3, ИЛ-1/3 и ИЛ-6) при апластической анемии являются либо сопоставимыми с нормой, либо повышенными и не имеют патогенетического значения в развитии аплазии кроветворения.

3. В норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над синтезом других цитокинов, тогда как при апластической анемии приоритеты в продукции гемопоэтических факторов смещены в сторону негативного цитокина ФНОо, интенсивность синтеза которого мононуклеарами периферической крови и костного мозга обусловливает тяжесть поражения гемопоэза.

4. Рецидив заболевания характеризуется прогрессией всех нарушений в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток, выявленных при АА в периферической крови и костном мозге; полная клинико-гематологическая ремиссия характеризуется тенденцией к нормализации этих показателей, однако даже в состоянии ремиссии продукция ФНОа клетками иммунной системы остается повышенной.

5. Динамика основных регуляторных цитокинов в процессе иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией может служить критерием эффективности проводимого лечения и течения заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Одним из ведущих механизмов формирования депрессии кроветворения при апластической анемии, является цитокинопосредованная иммуносупрессия, обусловленная нарушением синтеза и соотношения основных регуляторных цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы - мононуклеарами периферической крови и костного мозга больных апластической анемией.

2. Продукция мультиколониестимулирующего фактора ИЛ-3, ИЛ-1/3 и ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови и костного мозга, а также уровень ЭПО при апластической анемии являются либо сопоставимыми с нормой, либо повышенными. Это свидетельствует об отсутствии связи депрессии кроветворения при данном заболевании с недостаточным синтезом позитивных гемопоэтических факторов .

3. В норме интенсивность синтеза позитивного фактора ИЛ-6 превалирует над продукцией других цитокинов, тогда как при апластической анемии приоритеты в синтезе гемопоэтических факторов смещены в сторону негативного цитокина ФНОа; спонтанная продукция которого превышает норму более, чем в 10 раз.

4. Положительная связь между интенсивностью синтеза ФНОа; и тяжестью нарушения гемопоэза у больных тяжелой и нетяжелой формами АА свидетельствует о патогенетической роли данного ингибиторного цитокина в формировании депрессии кроветворения при данном заболевании.

5. Субпопуляция CD4+ Т-хелперов 1 типа (Thl) является преобладающей при тяжелой форме АА и существенно увеличивается в рецидиве заболевания.

6. Выявлена положительная коррелятивная связь между продукцией мононуклеарами больных АА апоптогенного цитокина ФНОсе и экспрессией маркеров активации (DR) и апоптоза (Fas/CD95).

7. Повышенная продукция мононуклеарами периферической крови и костного мозга ИЛ-2 - фактора роста Т-лимфоцитов и антиапоптотического цитокина - в сочетании с увеличенной экспрессией на них рецептора для

ИЛ-2 - CD25 обеспечивает пролиферацию лимфоидных клеток и их защиту от апоптогенного влияния ФНОо;.

8. Рецидив заболевания характеризуется прогрессией всех нарушений в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток, выявленных при АА в периферической крови и костном мозге. Повышению уровня лимфоидных субпопуляций (CD3+, CD4+, CD16+), экспрессии маркера активации DR и величины иммунорегуляторного индекса соответствует увеличение продукции ИЛ-1/3 и ИЛ-2 и сверхвысокая интенсивность синтеза ФНОО! при снижении продукции его антагониста - ИЛ-4.

9. Полная клинико-гематологическая ремиссия характеризуется тенденцией к нормализации в соотношении цитокинов и цитокинпродуцирующих клеток периферической крови и костного мозга. Снижению экспрессии маркера активации DR, а также уменьшению (вплоть до инверсии) величины иммунорегуляторного индекса соответствует смещение приоритетов в продукции гемопоэтических факторов с негативного регулятора ФНОо; в сторону ИЛ-6, однако даже в состоянии ремиссии продукция ФНОо; клетками иммунной системы остается повышенной.

10. Определена прогностическая значимость динамики основных регуляторных цитокинов в процессе иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией: снижение спонтанной продукции ФНОо, а также фактора роста Т-лимфоцитов - ИЛ-2 с одновременным восстановлением и активацией положительного фактора ИЛ-6 в течение первого месяца лечения является благоприятным прогностическим фактором, свидетельствующим об адекватной иммуносупрессивной терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении первичного обследования больных апластической анемией в дополнение к традиционным (морфологическим, гистологическим и др.) лабораторным исследованиям рекомендуется определять некоторые показатели цитокинового и иммунного статуса больных:

- исследование цитокинов включает в себя определение спонтанной (обязательное) и индуцированной (желательное) продукции клеткми иммунной системы (мононуклеарами периферической крови и/или костного могза), прежде всего, ингибиторного цитокина ФНОсе и, далее по степени важности, ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-1/3;

- исследование иммунного статуса носит факультативный характер, может проводиться при отсутствии возможности определения продукции цитокинов и должно быть направлено на определение иммунофенотипической характеристики основных цитокинпродуцирующих клеток: выявление CD3+, CD4+, CD8+, CD 16+ мононуклеаров периферической крови и, особенно, костного мозга, но, прежде всего, соотношения иммунорегуляторных субпопуляций (иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+) и наличия маркера активации DR.

2. Повышение величины иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+ 4,5 и более) при увеличении количества активированных мононуклеаров (DR+ клеток) в сочетании со сверхвысокой спонтанной продукцией ФНОсе («в 1015 раз) и повышенной ИЛ-2 (в 3-8 раз) характеризует тяжелую форму заболевания.

3. Особое внимание следует обращать на динамику цитокинов в процессе терапии: снижение спонтанной продукции, прежде всего, негативного регулятора гемопоэза ФНОо, а также фактора роста Т-лимфоцитов - ИЛ-2 с одновременным восстановлением и активацией положительного фактора ИЛ-6 в течение первого месяца лечения можно рассматривать как благоприятный прогностический фактор, свидетельствующий об адекватной иммуносупрессивной терапии; повышение спонтанной продукции негативного регулятора ФНОо, и фактора роста Т-лимфоцитов - ИЛ-2 с ослаблением реактогенного потенциала клеток в отношении позитивного фактора ИЛ-6 в течение первого месяца лечения, свидетельствуют о неэффективной иммуносупрессивной терапии.

193