Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммуногенетический анализ полиморфизма генов цитокинов, матричных металлопротеиназ и фактора роста эндотелия сосудов при ряде мультифакториальных заболеваний

На правах рукописи

Шевченко Алла Владимировна

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ И ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ПРИ РЯДЕ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

г г июл 2015

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Новосибирск 2015 г.

005570781

005570781

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» (НИИКЭЛ)

Научный консультант:

Коненков Владимир Иосифович, академик РАН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярных механизмов канцерогенеза Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики»

Меркулова Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории регуляции экспрессии генов Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук»

Бубнова Людмила Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммуногематологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России».

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Государственного научного центра «Институт иммунологии» ФМБА России»

Защита состоится «15» октября 2015 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт Фундаментальной и клинической иммунологии» по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт Фундаментальной и клинической иммунологии» и на сайте организации

Автореферат разослан « ¿.¿^¿'/^ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Белогородцев Сергей Николаевич

кандидат медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Мультифакторнальные заболевания (МФЗ) представляют собой самую многочисленную и разнообразную группу болезней, составляющую более 90% от всех соматопатологий человека, характеризующихся наиболее высокими темпами роста заболеваемости, смертности и инвалидизации трудоспособного населения в современных популяциях [Бочков Н.П., 2011]. Проблема низкой эффективности лечебно-профилактических мероприятий таких заболеваний связана со сложностью и отсутствием полной ясности в понимании особенностей ключевых механизмов развития процессов [Weiss K.M., 2000]. В развитии таких социально-значимых МФЗ, как ишемическая болезнь сердца (ИБС), сахарный диабет 2 типа (СД2), рак молочной железы (РМЖ), ревматоидный артрит (РА), лежит сочетание внешнесредовых и генетических факторов, определяющих особенности иммунного ответа организма на процессы воспаления, характерные для анализируемых заболеваний, реализующиеся через сложные взаимодействия клеток различной специфичности. Регулируя иммунный ответ, клетки продуцируют широкий спектр цитокинов и других медиаторов воспаления, обладающих аутокринной, паракринной и эндокринной активностью, образующих регуляторную сеть, в которой отдельные элементы обладают синергетическим или антагонистическим действием, что влияет на патологический процесс, варианты его течения и исхода [Middleton D., 2003]. Особенности синтеза, сложность сетевых взаимодействий и плейотропных эффектов ключевых медиаторов воспаления - цитокинов - у конкретного индивида может лежать в основе МФЗ [Симбирцев АС, 2004; Lusis AJ, -2004; Sosnoski DM, 2012]. Получены убедительные доказательства участия цитокинов в процессах повреждения коронарной бляшки в результате ее воспаления и разрыва, что является основным механизмом, приводящим на фоне ишемической болезни сердца к развитию острых коронарных событий (ОКС). Выявлена корреляция индивидуальных особенностей уровня секреции цитокинов у больных сахарным диабетом, одним из важнейших факторов риска сердечнососудистых заболеваний (ССЗ). Получены данные о ключевой роли цитокинов в иммунном ответе при воспалении в ревматологических болезнях и в развитии онкопатологий [Srinivas G 2009; Sosnoski D 2012]. Причем в каждом конкретном случае именно баланс про- и противовоспалительных цитокинов определяет характер иммунного ответа на развитие воспалительного процесса в МФЗ [Яременко ОБ , 2005; Dimitrova Р, 2002].

Секреция цитокинов в месте формирования атеросклеротической бляшки, в области деструктивных процессов при ревматических болезнях, в процессах ангиогенеза и метастазирования стимулирует большинство клеток к

з

образованию матричных металлопротеиназ. Эти протеолитические ферменты, во-первых, разрушают окружающий внеклеточный матрикс, создавая тем самым «дороги» для миграции клеток, а во-вторых, обеспечивают конверсию неактивных форм цитокинов, депонированных на матриксе, в активные формы [Shah РК, 2000; Jezierska А, 2009]. Активность матричных металлопротеиназ в иммунном ответе рассматривается как значимый маркер прогрессии МФЗ [Rybakowski J, 2009; Chen Y, 2012].

При прогрессивном росте опухоли происходит образование новых кровеносных сосудов. Ключевая роль в этом процессе принадлежит семейству факторов роста эндотелия сосудов (VEGF). Процессы, связанные с образованием новых кровеносных сосудов, аналогичные происходящим в опухолевых тканях, наблюдаются и при острых коронарных синдромах, и при воспалительных процессах в костных тканях. Причем активность процессов коррелирует с уровнем определяемого в тканях белка [Angelo LS, 2007] и взаиморегулируется и цитокинами, и матричными металлопротеиназами [Ferrara N, 2003; Lynn К, 2010].

Индивидуальные особенности иммунной системы конкретного индивида определяются генетическими особенностями организма и опосредованы генетическим полиморфизмом ответственных за формирование иммунного ответа генов. На регуляцию экспрессии генов оказывает влияние в том числе и полиморфизм регуляторных регионов генов, причем определенные аллельные варианты, а чаще особенности генотипов, включающие несколько полиморфных позиций регуляторной последовательности, ответственны за уровень и функциональную активность кодирующих их белков [Bidwell J, 2001]. Чрезвычайно высокая степень полиморфизма генов цитокинов, матричных металлопротеиназ и факторов роста эндотелия сосудов, в том числе и в регуляторных регионах, обосновывает возможность их использования в качестве генетических предикторов предрасположенности к развитию МФЗ. Однако, несмотря на достигнутые успехи мирового научного сообщества в области изучения генома человека и в разработке новых методов анализа ДНК, по-прежнему только частично можно объяснить отдельные звенья иммунопатогенеза некоторых МФЗ. При этом данные проводимых мета-анализов по результатам исследований ассоциаций иммуногенетических маркеров с предрасположенностью к МФЗ зачастую противоречивы в различных популяциях мира. Поэтому не стоит забывать, что распределение определенных полиморфных вариантов генов среди больных МФЗ имеет свои этногеографические особенности [Пузырев ВП, 2007; Meenagh А. 2002]. Кроме того, нельзя не учитывать сложные сетевые взаимодействия медиаторов воспаления.

Исследование роли иммуногенетических факторов при МФЗ является одним из наиболее перспективных направлений современной иммунологии и приоритетной областью современного здравоохранения. В настоящее время накоплено достаточно данных о вовлеченности различных полиморфных генов, продукты которых принимают непосредственное участие в процессах регуляции иммунного ответа, в формирование предрасположенности к МФЗ [Но1^ааг<1 МУ, 2006]. При этом механизм их развития чрезвычайно сложен, так как в его основе лежит кумулятивный полигенный компонент и полиморфность сети медиаторов воспаления. Анализ ассоциаций МФЗ с сочетанной встречаемостью генотипов различных генов иммунного ответа в настоящее время остается неразработанным направлением исследований. Во многом это связано с тем, что увеличение числа рассматриваемых генов ведет к экспоненциальному росту числа сочетаний их аллельных вариантов, что делает анализ стандартными методами перебора практически невозможным [Ьуоуб Б, 2012].

Предложенный в работе полилокусный анализ генов, продукты которых принимают активное участие в иммунном ответе при развитии воспаления, деструкции и ангиогенеза, в решении этой проблемы представляется современным, перспективным и позволяющим наиболее глубоко и четко выявлять ассоциации иммуногенетических комплексов с МФЗ. Обращает на себя внимание и тот факт, что при неоспоримом наличии общих закономерностей иммунных реакций при различных МФЗ не выявлено общих генетических детерминант предрасположенности к развитию коморбидных заболеваний. Предлагаемый в работе методический подход основан на полилокусном анализе генетических особенностей пациента. Это позволяет подойти к решению принципиально нового класса задач клинической иммуногенетики, связанных, во-первых, с проблемами выявления индивидуальных специфических иммуногенетических комплексов для определенного МФЗ, и, во-вторых, с проблемами выявления общих генетических детерминант, синтропных одновременно для нескольких МФЗ, в патогенезе которых иммунный ответ играет немаловажную роль. Это позволит, во-первых, более точно прогнозировать степень риска развития определенного МФЗ и его осложнений у конкретного индивида и на основе прогноза проводить ранние профилактические мероприятия, т.е. вплотную подойти к решению задач «персонифицированной медицины». Во-вторых, выявить сложные синтропные генетические компоненты, общие для разных МФЗ, что даст новые знания в развитие концепции синтропных генов [Пузырев ВП 2006; 2009]. Таким образом, использование технологии индивидуального анализа генных сетей регуляции воспаления может помочь в создании систем

5

прогнозирования, основанных на персонализированных предикторах предрасположенности/резистентности к развитию социально значимых заболеваний человека, что является актуальной научной и практической задачей. Исходя из этого, сформулированы цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования: проведение комплексного сравнительного анализа полиморфизма генов ключевых цитокинов, матричных металлопротеиназ и фактора роста сосудистого эндотелия при таких мультифакториальных заболеваниях человека, как ишемическая болезнь сердца, ревматоидный артрит, сахарный диабет второго типа и рак молочной железы. Задачи исследования:

1. Оценить особенности полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов TNFa (позиции -863,-308,- 238), ILlß (позиции -511, -31), IL 4 (позиция -590), IL6 (позиция -174) и ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2(-1562), ММРЗ(-1171), ММР9(-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578,+936) у практически здоровых жителей Западной Сибири в сопоставлении с данными по другим этническим группам.

2. Оценить особенности комплексных генотипов генов цитокинов, матричных металлопротеиназ, гена фактора роста эндотелия сосудов в половой и возрастной структуре популяции.

3. Провести анализ ассоциированности полиморфизма генов ключевых цитокинов с уровнем их спонтанной и стимулированной Соп А продукции в культурах МНК.

4. Проанализировать характер ассоциированности генотипов генов цитокинов TNFa (позиции -863,-308,- 238), ILlß (позиции -511, -31), IL 4 (позиция -590), IL6 (позиция -174) и ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2(-1562), ММРЗ(-1171), ММР9(-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578, +936) с риском развития ишемической болезни сердца и ее осложнений и оценить комплексные генотипы, как прогностические критерии риска развития патологии и ее осложнений.

5. Провести анализ ассоциированности комбинаций генотипов промоторных регионов генов цитокинов TNFa (позиции -863,- 308, -238), ILlß (позиция -31), IL2 ('позиция -330), /£4(позиция -590), IL6 (позиция -174), ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2 (-1562), ММРЗ(-1171), ММР9(-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578,+936) с сывороточным уровнем таких лабораторных показателей, как TNFa, IL1B, IL1RA, IL6,

IL8, СРБ, CD40, ММРЗ, ММР9 у пациентов с ангиографически верифицированным коронарным атеросклерозом.

6. Оценить особенности полиморфизма генов цитокинов TNFa (позиции -863, -308, -238), ILlß (позиция -31), /¿-/(позиция -590), IL6 ("позиция -174), ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2 (-1562), ММРЗ (-1171), ММР9 (-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF(-2578,+936) и их комплексных генотипов в развитии сахарного диабета второго типа; их ассоциированность с уровнем сывороточной продукции основных маркеров инсулинорезистентности у пациенток с СД2.

7. Проанализировать особенности распределения генотипов генов цитокинов TNF а (позиции -863, -308, -238), ILlß (позиция -31), IL4 (позиция -590), IL6 (позиция -174), ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2 (-1562), ММРЗ (-1171), ММР9 (-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578,+936) у пациенток с раком молочной железы; оценить их ассоциированность с фактором наследственности, сопутствующими заболеваниями, тяжестью течения, метастазированием; выявить комплексные генотипы, ассоциированные с предрасположенностью и резистентностью к заболеванию.

8. Провести анализ ассоциированности генотипов генов цитокинов TNFa (позиции -863, -308, -238), ILlß (позиция -31), /^(позиция -590), IL6 (позиция -174), ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2 (-1562), ММРЗ (-1171), ММР9 (-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578,+936) у пациенток с ревматоидным артритом, выявить ассоциированные с заболеванием комплексные генотипы и их ассоциированность с уровнем сывороточной продукции РФ и СРБ у пациенток с РА.

9. Выявить общие комплексные генотипы, позитивно либо негативно ассоциированные с несколькими из проанализированных МФЗ.

Научная новизна: впервые выявлены половые различия комплексных генотипов и показано значительное снижение либо полное отсутствие ряда комплексных генотипов в возрастных группах старше 55 лет по сравнению с группой до 55 лет у практически здоровых жителей Западной Сибири.

Впервые выявлены общие и частные закономерности развития некоторых клинических проявлений таких социально-значимых заболеваний, как ИБС, РМЖ, СД2 типа, РА при проведении сравнительного анализа

7

ассоциированности полиморфизма регуляторных регионов генов TNFa (позиции-Ш, -308, -238), ILlß (позиция -511, -31), IL4 (позиция -590), IL6 (позиция -174), ILIO (позиции -1082, -592), матричных металлопротеиназ ММР2 (-1562), ММРЗ (-1171), ММР9 (-1309), регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF (-2578,+936).

Впервые получены данные ассоциированности полиморфизма ансамбля генов цитокинов, матричных металлопротеиназ, фактора роста эндотелия сосудов, находящихся в сложных сетевых внутренних взаимодействиях при реализации иммунного ответа при развитии СД2, РА, РМЖ, ИБС.

Впервые выявлена ассоциированность комплексных полиморфных маркеров воспаления, деструкции и ангиогенеза с сывороточными уровнями кардиологических маркеров TNFa, IL1B, IL IRA, IL6, IL8, СРБ, ММРЗ, ММР9 на примере пациентов с атеросклерозом, верифицированным ангиографически.

Впервые среди жителей Западной Сибири выявлены ассоциативные связи между сывороточным уровнем факторов инсулинорезистентности и комплексными генотипами, в состав которых входят полиморфные позиции генов TNF- 863,-308,-238; IL1B-31; IL6-174; IL10-592;VEGF2578.

Впервые среди жителей Западной Сибири показана ассоциированность РФ и СРБ с полиморфными комплексами генов цитокинов TNF- 863,-308,-238; IL1B-31; IL4-590; IL6-174; IL10-592, гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF.

Впервые на основе многомерного анализа выявлены индивидуально ассоциированные с заболеванием комплексные генотипы предрасположенности и резистентности к определенным анализируемым МФЗ.

Впервые выявлены комплексные генотипы, синтропные для развития ИБС, СД2, РМЖ, РА.

Теоретическая и практическая значимость исследования: на основе современных молекулярно-генетических технологий получены новые данные об ассоциированности генов, продукты которых принимают непосредственное участие в иммунном ответе, с развитием ишемической болезни сердца, сахарного диабета 2 типа, рака молочной железы, ревматоидного артрита. Выявлены полиморфные маркеры, ассоциированные с клиническими характеристиками анализируемых МФЗ, что способствует лучшему пониманию иммунопатогенеза этих заболеваний. Разработан новый методологический подход к анализу: сопряженный индивидуальный анализ определенных позиций генома человека, при котором несколько полиморфных позиций анализируются как единый генетический признак, что является шагом к персонифицированной медицине. Выявлены индивидуальные для конкретного МФЗ комплексные генотипы, позволяющие более точно выявлять группы

8

повышенного риска их развития. Выявлены комплексные генотипы, позитивно или негативно ассоциированные одновременно с несколькими из анализируемых МФЗ, что свидетельствует об синтропности комплексов в отношении этих МФЗ. Результаты исследования внедрены в научный процесс лабораторий эндокринологии и патологии соединительной ткани НИИ клинической и экспериментальной лимфологии «НИИКЭЛ», в работу терапевтического и консультативного отделений клиники «НИИКЭЛ», научный и лечебный процесс НИИ терапии и профилактической медицины «НИИТПМ» как дополнительный критерий выявления РА, СД2, ИБС и вариантов их течения.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Полиморфизм регуляторных регионов исследованных генов ключевых цитокинов, матричных металлопротеинах, фактора роста эндотелия сосудов ассоциирован с развитием и клиническими проявлениями таких мультифакториальных заболеваний, как ИБС, РА, СД 2 типа и РМЖ.

2. Важная роль комплекса анализируемых генов в процессах поддержания жизнедеятельности человека и состояния его здоровья проявляется в таких основополагающих характеристиках демографической структуры населения Сибири, как продолжительность жизни и ассоциированность с развитием мультифакториальных заболеваний различной природы.

3. Полиморфизм исследованных генов в регуляторных областях носит функциональный характер и проявляет свое влияние на течение МФЗ через детерминированность уровня синтеза белковых продуктов с высокой регуляторной активностью.

4. Анализ комплексных генотипов всех исследуемых генов как единых генетических признаков существенно повышает степень их ассоциированности с наличием исследованных МФЗ, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных дополнительных лабораторных признаков в клинической практике.

5. Определенные комплексные генотипы анализируемых генов ассоциированы одновременно с несколькими из анализируемых МФЗ.

Степень достоверности: достоверность и обоснованность результатов исследования обеспечена репрезентативной выборкой групп пациентов и групп сравнения; соответствием дизайна исследования поставленным целям и задачам; использованием современных методов анализа и статистической обработки информации; научной аргументированностью заключения выводов. Апробация работы: основные положения диссертации представлены на межлабораторных семинарах и ежегодных отчетах НИИ Клинической и

9

Экспериментальной лимфологии (2008-2014 гг., Новосибирск), научных советах Межрегионального центра эндоэкологической реабилитации (ЦЭЭР), (2010-2012 гг., Новосибирск), а также на российских и международных конференциях: «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии»; I Сибирский съезд лимфологов с международным участием (2006 г., Новосибирск); «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» Международная конференция (2008 г., 2011г., 2013 г., Новосибирск); «Профилактика сердечно сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения» Российская научно-практическая конференция (2008 г., Новосибирск); «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований», Международный симпозиум (2009 г., Томск); «Актуальные проблемы профилактики, диагностики и лечения болезней внутренних органов», городская научно-практическая конференция (2009 г., Новосибирск); V Съезд ревматологов России (2009г., Москва); IV Российский конгресс по остеопорозу (2010 г., Санкт-Петербург); «Актуальные проблемы сердечнососудистой патологии», Всероссийская научно-практическая конференция (2010 г., Кемерово); УШ Всероссийская конференция по патологии клетки (2010 г., Москва); Всероссийский диабетологический конгресс (2013 г., Москва); «Фундаментальные науки -медицине: Актуальные проблемы молекулярной медицины», научная конференция (2013 г., Новосибирск); «Инновационные технологии в эндокринологии», Всесоюзный конгресс с участием стран СНГ (2014 г., Москва); VII Всероссийский диабетологический конгресс «Сахарный диабет в 21 веке - время объединения усилий» (2015 г., Москва).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 76 работ, в том числе 41 статья в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией, 29 тезисов в материалах отечественных и зарубежных конференций, 6 статей в сборниках.

Структура и объем работы: диссертационная работа изложена на 388 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, и приложения. Работа содержит 112 таблиц. Библиографический список включает 594 источника, из них 74 работ отечественных авторов.

ю

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Пациенты с ишемической болезнью сердца. В исследование включены 353 образца ДНК мужчин в возрасте от 35 до 84 лет (средний возраст 53,7 года) с диагнозом ишемическая болезнь сердца (ИБС), из них 223 с острым коронарным синдромом (ОКС) в анамнезе, полученных в НИИ Терапии и профилактической медицины, г. Новосибирск. Набор больных осуществлялся на базе 3 кардиологических отделений больниц Новокузнецка в 2003-2004 гг. Пациенты со стенозирующим коронарным атеросклерозом. В исследование включены 83 образца ДНК мужчин в возрасте 42-70 лет (средний возраст 56,1 лет) со стенозирующим коронарным атеросклерозом, верифицированным при проведении селективной коронароангиографии (КАГ), полученные в НИИ Терапии и профилактической медицины, г. Новосибирск. Пациенты с диабетом 2 типа. Пациентки с диабетом 2 типа проходили обследование и лечение в Клинике НИИ Клинической и Экспериментальной Лимфологии, Новосибирск. В исследование включены 316 женщин с СД 2 типа в возрасте от 28 до 70 лет (средний возраст 64,79). У 136 пациенток (43,04%) диагностирована ИБС, у 23 (7,28%) в анамнезе инфаркт миокарда (ИМ). Пациентки с раком молочной железы. В исследование включены образцы ДНК больных инфильтрирующим операбельным раком молочной железы (РМЖ) стадии Т1-4Ы0-ЗМ0 (395 женщин), которые получали оперативное лечение в НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск в 1996-2006 гг. Возраст женщин на момент заболевания составил 20-79 лет (средний 52,59 лет). Пациенты с ревматоидным артритом. Пациенты с ревматоидным артритом (РА) проходили обследование в Клинике НИИ клинической и Экспериментальной Лимфологии, г. Новосибирск. В исследование включены 162 женщины, средний возраст 54,72 лет.

Группа практически здоровых доноров. Группу составили 603 человека, длительное время проживающие на территории Сибирского Федерального округа, европеоидной внешности, идентифицирующие себя и своих родителей как русские, языком общения которых является русский язык. Среди обследованных лиц 193 мужчины и 410 женщины в возрасте от 18 до 69 лет.

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности, при наличии информированного согласия пациентов. На поведение исследований получено разрешение локального этического комитета НИИКЭЛ, локальных этических комитетов организаций, предоставивших образцы ДНК.

Генотипирование. Геномную ДНК выделяли из цельной венозной крови стандартными методами. Концентрацию выделенной ДНК определяли

спектрофотометрическим методом. Генотипирование генов цитокинов TNF-А863С, TNF-A308G, TNF-A238G, ILlß-C5UT, ILlß-C31T, IL2-T330G, IL4-C590T, IL6-C174G, ILIO- A 1082G и IL10-A592C; матричных металлопротеиназ ММР2-С1306Т, ММРЗ-5А1171 6А, ММР 9 - С 1562 Т; гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF - А 2578С и + С 936Т проводили методом ПДРФ анализа, с детекцией в агарозных гелях; в режиме реального времени (Real-Time PCR) с использованием красителя SYBR Green генов TNF-A308G; ILlß-C31T; IL4-С590Т; IL10-A1082G и IL10-A592C и методики Tag man гена VEGF +С936Т у пациентов с СД2.

МНК периферической крови выделяли на градиенте плотности фиколл/верографин. МНК культивировали в течение 72 часов при 37°С в СО2-инкубаторе в среде RPMI-1640 с 10% FCS дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина. Культивирование проводили в присутствии конканавалина A (Con А), и в отсутствие митогенной стимуляции.

Оценку сывороточного уровня продукции маркеров инсулинорезистентности методом проточной флюорометрии в кондиционной среде МНК проводили с применением технологии хМАР (селективное связывание определяемых цитокинов и сорбированных на поверхности микрочастиц антител) по стандартному протоколу Bio-Plex на проточном флюориметре Bio-Plex (BioRad, США) с использованием тест-системы Bio-Rad. В сыворотке крови больных СД 2 определяли содержание 12 биомаркеров инсулинорезистентности - инсулина, С-пептида, висфатина, резистина, лептина, глюкагона, IL6, TNFa, грелина, глюкагоноподобного пептида (GLP-1), ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), глюкозозависимого пептида (GIP).

Определение уровня белковых продуктов методом твердофазного иммуноферментного анализа осуществляли на ИФА анализаторе для планшетов ELx800 (BioTek, Тайвань). У здоровых доноров определялись концентрации цитокинов в спонтанной и стимулированной культуре МНК с использованием стандартизованных наборов: TNFa(nr/Mn), ИЛ lß (пг/мл), ИЛ4 (пг/мл), ИЛ6 (пг/мл), ИЛ10 (пг/мл) производства «Вектор-Бест», Новосибирск. У пациентов с РА проводили количественное определение в сыворотке суммарного ревматоидного фактора (РФ) классов IgG, IgA, IgM, С-реактивного белка (СРБ), с использованием стандартизованных наборов ELISA, Rheumatoid Factor Screen, Orgentec и Bioscience, Bender MedSystems. Данные о концентрации воспалительных цитокинов и вчСРП в сыворотке крови у пациентов с атеросклерозом проведены и предоставлены НИИ Терапии и профилактической медицины, Новосибирск (Лаборатория клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний) с

12

использованием стандартизованных наборов ELIS As: TNFa (пг/мл), ИЛ lß (пг/мл), IL IRA (пг/мл) - Biosource наборы (USA), ИЛ6 (пг/мл), ИЛ8 (пг/мл) -Cytimmune наборы (USA), sCD40L (нг/мл) - Bender MedSystems наборы (USA), вчСРП (мг/л) - Biosource Ha6op(USA).

Методы статистической обработки. При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели как частота встречаемости аллелей, генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR) с расчетом 95% доверительного интервала, чувствительность, специфичность. Распределение генотипов исследованных полиморфных локусов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга [Вейр Б.,1995; Реброва О.Ю., 2002]. Для сравнения частот генотипов между группами использовали критерий X2 с поправкой Йетса на непрерывность или точный двусторонний тест Фишера для значений меньше пяти. При множественных сравнениях применялась поправка Бенджамини-Хохберга [Benjamini Y, 1995]. Математическую обработку связи генетических признаков с количественными лабораторными показателями проводили методом квантильного анализа [Гланц С., 1998]. Анализ уровня таких показателей, как масса тела, индекс массы тела, систолическое и диастолическое артериальное давление, у носителей разных генотипов проводили с помощью теста Манна-Уитни. Использовался пакет прикладных программ SPSS 13.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ, ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ЖИТЕЛЕЙ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

Существенной проблемой оценки роли любого полиморфизма в развитии патологий является его неоднородность в отдельных популяциях. В связи с этим популяционный анализ кандидатных генов — первичный шаг при исследовании значимости полиморфизма. Проведенный анализ полиморфизма SNP промоторных регионов генов цитокинов TNFa -863, (rs 1800630/ TNFa-308 (rs 1800629), TNFa-238 (rs 361525), ILlß -511 (rsl6944), ILlß-31 (rsl 143627), IL 4 -590 ( rs2243250), IL6 -174 (rs 1800795), IL10-1082 (rsl800896) , IL10-592 (rs 1800872), MMP2-1306 (rs 2438650), MMP3-1171 (rs 3025058), MMP9-1562 (rs3918242), VEGF-2578(rs699947), VEGF+936 (rs3025039) и их генотипов среди практически здоровых жителей Западной Сибири европеоидного происхождения в сопоставлении с данными по другим этническим группам, представленными в электронных базах данных NCBI, Allele Frequencies in Worldwide Populations, Opensnp, выявил преимущественно европеоидный

13

характер распределения аллелей и генотипов в анализируемой группе, однако наблюдается и ряд этногеографических особенностей, выраженных в смещении распределения частот генотипов IL4-590, ММРЗ-1171 в сторону их распределения в монголоидных популяциях.

Анализ распределения комплексных генотипов генов цитокинов, матричных металлопротеиназ, фактора роста эндотелия сосудов, образующих генную сеть, в совокупности с половозрастными характеристиками европеоидного населения сибирского региона выявил комплексы, достоверно различающихся по их частоте встречаемости в группе мужчин и женщин и в возрастных группах. Из 300 статистически значимо преобладающих у женщин, 12 комбинаций не встретились у мужчин ни разу. Аналогично из 789 комбинаций, преобладающих в группе мужчин, 135 не встречаются у женщин. В составе комбинаций, полностью отсутствующих у мужчин, IL4-590СС и IL10-1082 АА, в составе генотипов, отсутствующих у женщин IL4-590ТТ и IL10-1082GG. Провоспалительные цитокины отличаются тем, что в генотипы, отсутствующие у мужчин, включен только генотип ILlß-31CT, в то время как среди генотипов, отсутствующих у женщин, только гомозиготный генотип дикого типа ILlß-31TT. На основании полученных данных можно предположить, что иммунорегуляторный тип мужчин может существенно отличаться от женского типа, что необходимо учитывать при иммуногенетических исследованиях.

Наиболее интегральным и надежным признаком состояния здоровья индивида является продолжительность жизни. Неоднократно были предприняты попытки оценить значимость в процессах долголетия человека различных полиморфизмов фактора роста эндотелия сосудов и генов цитокинов [Capri М.,2006; Del Во R.,2008]. С использованием квантильного подхода из общей группы обследованных выделена группа молодого возраста (менее 35 лет) — 103 человека и старшего возраста (55 лет и более) -116 человек. Ряд комбинированных генетических признаков, включающих генотипы генов цитокинов, матричных металлопротеиназ и фактора роста эндотелия сосудов, которые встречаются в группе молодых лиц с частотой от 10,53% до 44,44%, полностью отсутствуют среди людей старшего возраста. Полностью отсутствующих генотипов в старшей возрастной группе выявлено 736. В группе комбинированных генетических признаков, которые не встречаются в старшей возрастной группе и представлены с высокой частотой в младшей возрастной группе, ILIO -1082AG , ILIO -592СА, IL6-174CG, VEGF-2578 CA, VEGF +936 CC, MMP2-1306 ТС, MMP9-1562CC. Полученные данные свидетельствуют в пользу неслучайности выбывания определенных комплексных генетических признаков в старшей возрастной категории и

14

предполагают возможную ассоциированность выбывших генетических признаков с рядом широко распространенных в популяции заболеваний, обладающих предрасположенностью к их развитию и ограничивающих продолжительность жизни.

Комплексная оценка уровня спонтанной и Con А стимулированной продукции цитокинов в кондиционной среде МНК в популяционной группе. Цитокины являются участниками сложных сетевых взаимодействий, проявляющихся в том числе и на уровне их функционального полиморфизма [Koss К.,2000; Reynard М., 2000]. При использовании квантильного подхода для анализа распределения генотипов анализируемых генов в группах с максимальными значениями концентрации спонтанной и стимулированной продукции TNF а, ILlß, IL4, IL6, ILIO (перцентиль 75% и выше), с их минимальными значениями (перцентиль 25% и ниже) у практически здоровых доноров выявлена корреляция высокой продукции ILlß с ILlß-31 С аллельным вариантом гена (OR=5,19 Р=0,0163). Кроме того, показана ассоциированность продукции цитокинов с полиморфизмом ряда каскадно синтезирующихся белковых продуктов. Так, высокий уровень TNFa позитивно ассоциирован с аллельным вариантом Г и с гомозиготным генотипом TT в позиции С -590 Т цитокина IL 4 (C)R=4,40 Р=0,0193 и OR= 14,67 Р=0,0379 соответственно). С этим же аллельным вариантом гена IL4 ассоциирован высокий уровень IL 6 (OR=4,67 Р=0,0401) и IL 10 (OR=30,33 Р=0,0029), что может быть примером синергетического взаимодействия. С низким уровнем ILlß ассоциирован С аллельный вариант гена IL4 (OR= 6,57 Р=0,0147).

В СопА стимулированной продукции высокий уровень продукции ILIO ассоциирован с IL4 -590 Т аллельным вариантом и IL4 -590 TT генотипом (OR=3,86 Р=0,0036 и OR= 9,80 Р=0,0069 соответственно), что было показано и для спонтанной продукции этого цитокина. В свою очередь, высокий уровень IL4 наблюдается при наличии ILI0-592 А аллельного варианта гена и при гомозиготном носительстве IL10-592 АА (OR=2,59 Р=0,0264 и OR=6,48 Р=0,0392 соответственно). Аналогичные результаты связи полиморфизма IL4 С-590Т с продукцией ILIO у здоровых получены чешскими исследователями. При этом, как и в нашей группе, связи полиморфизма IL4 С-590Т непосредственно с продукцией IL4 ими выявлено не было [Bartova I., 2014].

Учитывая взаимосвязь уровней продукции цитокиновой сети, мы проанализировали ассоциированность полиморфизма анализируемых генов с высоким/низким уровнем нескольких цитокинов одновременно. В спонтанной продукции показана ассоциированность одновременно высоких уровней TNAa и ILlß с ILlß-31C аллельным вариантом (OR=5,61 Р=0,0351) и обоюдно высокий уровень ILlß и ILIO с IL4-590T аллельным вариантом гена (OR=29,00

15

Р=0,0096). При анализе Con А стимулированной продукции показана позитивная ассоциированность аллельного варианта гена ILIO-592 А с высоким уровнем одновременно двух провоспалительных цитокинов TNFa и IL lß (OR=22,89 Р=0,0384). Эта же полиморфная позиция достоверно выше при одновременно высоком уровне стимулированной продукции ILlß и низком уровне IL4 (OR=13,16 Р=0,0302). При одновременно низком уровне IL4 и высоком уровне ILIO достоверно повышена частота IL4 -590 Т аллельного варианта гена (OR=22,87 Р=0,0031). Полученные нами результаты подтверждают данные, выявленные в ряде исследований, где показано, что полиморфизм генов, кодирующих некоторые цитокины или их рецепторы, может быть связан не только с собственной продукцией, но и с уровнем других медиаторов [Wallis S., 2011] и может быть следствием сетевых генетических взаимодействий [Liew F., 2002].

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ, ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ПАЦИЕНТОВ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА Сравнительный анализ полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов у пациентов с ишемической болезнью сердца. Распределение частот генотипов TNFa в позициях -863,-308 и -238, ILlb в позиции -511, -31, IL6 в позиции -174, ILIO в позиции -592 практически идентично в группах мужчин, больных ИБС и здоровых мужчин. Частота минорного генотипа IL4-590ТТ и частота гетерозиготного генотипа IL10-1082AG снижены в группе мужчин с ИБС относительно контрольной группы (OR=0,33 Р=0,0110 и OR=0,52 Р=0,0121 соответственно).

Из общей группы пациентов с ИБС были выделены пациенты, перенесшие разные формы ИМ - с зубцом Q и без зубца Q. В группе пациентов с ИМ с зубцом Q достоверно снижена частота IL4-590TT генотипа и частота ILIO -1082AG гетерозиготного варианта относительно здоровых (OR=0,18 Р=0,0012 и OR=0,53 Р=0,0207 соответственно). Наличие у пациентов с ИБС ILIO -1082GG генотипа противовоспалительного цитокина можно считать фактором риска развития ИМ с зубцом Q (OR=3,97 Р= 0,0345).

В последние десятилетия прослеживается отчетливая тенденция увеличения удельного веса молодых пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС), начиная с 45-летнего возраста [Оганов Р.Г., 2012]. У пациентов с генотипом провоспалительного цитокина TNF-863CC и генотипом противовоспалительного цитокина IL4 -5907Триск острого коронарного случая в более раннем возрасте снижается (OR=0,46 Р=0,0367 и OR=0,22 Р= 0,0156 соответственно), что подтверждается ранее проведенными исследованиями [Paffen Е., 2008]. Учитывая, что в анализируемой нами группе мужчин с ИМ в

16

анамнезе у ряда пациентов наблюдался не один, а от 2 до 5 случаев ИМ в анамнезе в возрасте до 54 лет, была проанализирована ассоциированность генетических особенностей про - и противовоспалительных цитокинов с более высокой предрасположенностью к острому коронарному событию (неоднократному ИМ) (таблица 1). Показано, что генотип 1Ь1 -31СС ассоциирован с повторными ИМ у пациентов, в то время как частота 1Ь6 -174СС другого провоспалительного цитокина в группе пациентов с множественными случаями ИМ достоверно снижена (011=6,69 Р= 0,0064 и 011=0,14 Р=0,0429 соответственно).

Таблица 1.

Анализ полиморфизма генов цитокинов у пациентов до 54 лет включительно с несколькими случаями ИМ относительно пациентов

с 1 случаем ИМ

Полиморфная позиция Генотипы Пациенты с 2-5 случаями ИМ до 54 лет включительно (%) Пациенты с 1 случаем ИМ до 54 лет включительно (%) СЖ 95% С1

1 2

1Ь1 Т-31С N'=20 1М2=83 ТТ 6(30,00) 34(40,96) 0,62 0,19-1,95

ТС 8(40,00) 44(53,01) 0,59 0,20-1,76

СС 6(30,00) 5(6,02) 6,69' 1,52-30,24

1Ь6 С-174С N'=20 N^112 вв 7(35,00) 28(25,00) 1,62 0,52-4,92

ее 12(60,00) 54(48,21) 1,61 0,56-4,72

СС 1(5,00) 30(26,79) 0,14" 0,01-0,99

Примечание. 'X1 =7,36р 0,0064, "X* =3,35р 0,0429 по двустороннему критерию Фишера

Выявлена ассоциированность ряда генотипов генов цитокинов и с классическими факторами риска развития ИМ. Разница в уровнях систолического АД между больными и здоровыми выявляется только для пациентов с 1Ь6 -174СС и 1Ь6 -174СС генотипами (таблица 2), что связывают в том числе и с ассоциированностью полиморфизма с плазменным уровнем 1Ь6, влияющим на усиление синтеза коллагена и уменьшение его деградации в сосудистой стенке с атеросклеротическим повреждением, приводящих к повышению артериального давления ¡^¿¡^погеШ 8., 2003]. Кроме того, частота генотипа 1ЫЬ-31СС достоверно снижена в группе пациентов с нормальным индексом массы тела относительно здоровых, что дает возможность предполагать протективную роль данного генотипа относительно развития ИМ (011=0,34 Р=0,0113). Показано, что у носителей 1И р -31 СС генотипа уровни сывороточного общего холестерина и триглицеридов ниже, а НОЬ-холестерина выше, чем у носителей 1Ы р -31 ТТ генотипа, что может вносить свой вклад в развитие ИМ [^етЬп^ег I., 2009].

Таблица 2.

Анализ отдельных факторов риска между группой ИМ пациентов и группой

Параметры Пациенты с ИМ Здоровые лица Р

Генотип IL-6-174 СС

N=43 N=12

Индекс массы тела 26,29±3,868 23,941±2,885 0,049

АД систолическое 136,416±17,896 126,360±8,090 0,107

АД диастолическое 89,041±9,406 78,940±5,983 0,002

Генотип IL-6-174 CG

N=106 N=47

Индекс массы тела 26,59±4,987 24,857±2,854 0,038

АД систолическое 145,530±25,578 122,660±9,883 0,000

АД диастолическое 93,172±13,851 79,921±3,015 0,000

Генотип IL-6-174 GG

N=51 N=35

Индекс массы тела 26,72 ±3,505 25,242±2,962 0,047

АД систолическое 145,00±27,336 125,57±9,217 0,006

АД диастолическое 94,857± 14,447 79,861±5,397 0,000

Сравнительный анализ полиморфизма промоторных регионов генов матричных металлопротеиназ у пациентов с ишемической болезнью сердца. Не выявлено каких-либо различий при анализе распределения генотипов ММР2, ММРЗ и ММР9 в группах с ИБС относительно контрольной группы. Анализ ассоциированности полиморфизма ММР с развитием ИМ у мужчин в более раннем возрасте (до 54 лет включительно) относительно здоровых мужчин в возрасте до 54 лет включительно показал, что риск развития ИМ достоверно выше у носителей генотипа ММР35А5А (OR=2,43 Р=0,0455). Показано, что носители аллеля 5А более предрасположены к развитию нестабильных бляшек [Beyzade S., 2003]. Частота ММР2-1306ТТ генотипа в группе пациентов с множественными случаями ИМ достоверно повышена (OR=4,29 Р=0,0218).

Распределение генотипов регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов у пациентов с ишемической болезнью сердца. Проведенный анализ показал снижение частоты VEGF-2578AA генотипа в группах с ИБС и ИМ относительно контрольной группы (OR=0,54 Р=0,0413 и OR=0,54 Р=0,0434 соответственно).

Выявлено достоверное увеличение в группе пациентов VEGFA-2578 АС генотипа и снижение VEGFA-2578 АА генотипа относительно здоровых этой же возрастной категории (C)R=2,01 Р=0,0278, C)R=0,48 Р=0,0472). Эти данные подтверждаются результатами экспериментальных исследований, в которых

18

показано, что защитными протективными свойствами обладают именно низкие уровни VEGF [Tsutsumi Y., 2005; Zachary I., 2000].

Комплексный анализ полиморфизма исследуемых генов у пациентов с ишемической болезнью сердца. Анализ распределения в группах здоровых и мужчин с ИБС комбинированных генетических признаков, представленных в виде комплекса генотипов целого ряда исследованных генов цитокинов TNF-А863С; TNF-A308G; TNF-A238G;; ILlß - Т 511С; ILlß - С 31Т; IL4-C590T; IL6-C174G; ILIO- A 1082G и 1L10-A592C, матричных металлопротеиназ ММР2 - Т 1306С, ММРЗ-5А6А, ММР9 - С 1562Т, фактора роста эндотелия сосудов VEGF -С 2578А, VEGF + С 936Т выявил 240 комбинаций, позитивно ассоциированных с патологией. Негативно ассоциированных с ИБС комбинаций выявляется 2584. Все позитивно ассоциированные комбинации с высоким уровнем достоверности различий между группами и высоким отношением шанса развития патологии имеют в своем составе IL4-590CC, IL10-1082AA и VEGF2578 CA генотипы. Негативно ассоциированные комбинации с высоким отношением шанса развития патологии и высоким уровнем достоверности отличает наличие в составе комбинаций IL4-590TT, IL10-592CC, IL10-1082AG. В комбинациях, в которых отсутствуют IL4-590 и IL10-1082 выявляются ILlß-51 ICC и ILlß-31TT генотипы, в то время как в позитивно ассоциированных генотипах эти полиморфные позиции представлены только гетерозиготами. Ассоциированность уровня продукции кардиологических маркеров с полиморфизмом анализируемых генов у пациентов с атеросклерозом, верифицированным ангиографически. Исследования последних лет показали, что на сывороточные уровни продукции, в том числе и кардиологических маркеров, влияет множество факторов, включая каскад плейотропных эффектов, стимулирующих или ингибирующих продукцию того или иного маркера в воспалительном процессе. Исходя из этого, проведен анализ частоты распределения комбинаций генотипов промоторных регионов генов цитокинов TNF-A863C; TNF-A308G; TNF-A238G; ILlß - С 31Т; IL2 -T330G, IL4-C590T; IL6-C174G; ILIO- A 1082G, IL10-A592C, регуляторных сайтов фактора роста сосудистого эндотелия VEGF-A2578C, VEGF+T936C с сывороточным уровнем таких лабораторных показателей, как TNFa, IL1B, IURA, IL6, IL8, СРБ, CD40 у пациентов с атеросклерозом, верифицированным ангиографически.

Выявлено 23 комплексные генетические комбинации анализируемых полиморфных позиций, позитивно ассоциированные с высокой продукцией TNFa. В большинстве генотипов присутствует генотип IL10-1082 АА. Эксперименты in vitro показали, что экспрессия IL-10 в LPS-стимулированных моноцитах связана с TNFa по типу отрицательной обратной связи. Это свидетельствует о том, что ILIO, по типу отрицательной обратной связи,

19

способствует замедлению продукции провоспалительных цитокинов [Tedgui А, 2001]. Максимальные значения отношения шансов наличия высокой продукции TNFa у этих пациентов достигаются при сочетании в генотипе IL2 ТТ -330/IL10-1082 AA/VEGF+936CC (OR=21,39 Р=0,0058). Два генотипа достоверно ассоциированы с высокими значениями IL1B. Наличие в генотипе TNFa -308 GG/ IL1/3 31 ТТ является достоверным фактором наличия у пациентов высокой продукции IL6 (OR=10,00 Р=0,0448). Данное сочетание присутствует во всех трех комплексных генотипах, достоверно ассоциированных с высокими уровнями этого цитокина. С регуляцией высокого уровня IL8 достоверно ассоциированы 13 сложных генотипа. Примечательно, что ни в одном из генотипов, ассоциированных с высоким уровнем анализируемых белковых продуктов, за исключением именно IL8, не встречается какой-либо из генотипов IL6 -174. Из 13 генотипов, достоверно ассоциированных с высокой продукцией IL8, генотип IL6 -174СС входит в состав 4 генотипов, причем именно IL6-174 СС ассоциирован с высокой продукцией IL8 и в виде моногенотипа (OR=10,50 Р=0,0422). Причем наличие в этих генотипах дуплекса IL6 СС/ TNF-238GG значительно увеличивает вероятность высокой продукции IL8 в этой группе пациентов (OR=23,40 Р=0,0080). Высокий уровень С-реактивного белка также ассоциирован с рядом комплексных генотипов. Максимальный уровень вероятности высокой продукции СРБ обеспечивается у пациентов с генотипами IL2-330TG/VEGF-2578CA/VEGF+936CC и TNF-238GG/IL2-330TT/IL10-1082AG (OR= 10,86 Р=0,0221). Показана ассоциированность высокой продукции CD40 с рядом генотипов. Так, вероятность высокой продукции CD40 у пациента достоверно возрастает при наличии в генотипе IL2-330TG (OR=6,93 Р=0,0187). При наличии в генотипе IL2-330TG/ ILlp-31 ТТ эта вероятность возрастает (OR=12,67 Р= 0,0197), а наличие более сложного генотипа IL2-330TG/ ILlp-31 ТТ / TNF-863CC приводит к еще более чем двукратному увеличению вероятности высокой продукции CD40 (OR=27,88 Р=0,0033). Ряд генотипов ассоциированы с низким уровнем продукции анализируемых кардиомаркеров.

ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ,

МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ, ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ

ВТОРОГО ТИПА

Сравнительный анализ полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов у пациенток с сахарным диабетом второго типа. Распределение частот генотипов TNFa в позиции -238, ILlfi -31,IL4-590,IL6 -174 практически

идентично в группах женщин, страдающих СД 2 типа и здоровых женщин. Частота генотипов дикого типа TNFa-863CC и TNFa-308 GG снижена у пациенток с СД2 (OR=0,67 Р=0,0193 и (Ж=0,62 Р=0,0141 соответственно), а частота гетерозиготного генотипа TNFa-308 GA, напротив, возрастает до 24,37% у больных относительно 16,04% у здоровых и является фактором риска развития заболевания (OR=l,64 Р=0,0084 соответственно). Показано, что у носителей TNF- 308А аллельного варианта - при риске развития ожирения на 23 % выше относительно контрольной группы, значительно выше плазменные уровни инсулина [Sookoian S., 2005]. Частоты генотипов противовоспалительного цитокина ILIO достоверно различаются в группах в двух анализируемых полиморфных позициях, причем у пациентов возрастают частоты гомозиготных генотипов IL-101082AA и IL10-592AA (OR=l,79 Р= 0,0052 и OR=3,91 Р=0,0007 соответственно) и снижены частоты IL10-1082AG (OR=0,59 Р=0,0054). Эти закономерности сохраняются в группе с отягощенным семейным анамнезом по сахарному диабету 2 типа относительно здоровых. В группе больных женщин, ближайшие родственники которых не страдали этим заболеванием, повышена частота типа TNFa-863AA генотипа относительно здоровых (OR=4,92 Р=0,0296).

■ Пациентки с СД2 и ИБС (%) ■ Пациентки с СД2 без ИБС (%) ■ Здоровые

TNFO-863CC TNFa -863АА TNFa -308 GG TNFa-308 GA IL10-1082AA IL10-1082AG IL10-592AA

(СД2 ,без ИБС (СД2 с ИБС (СД2сИБС (СД2 с ИБС

N=178 ;ЗД N=138;6e3 N=136;,6e3 N=134; ЗД

N=362) ИБС N=178; ИБС N=172; N=362)

ЗД N=362) ЗД N=190)

Рисунок 1. Полиморфизм генов цитокинов у пациенток с СД2 и ИБС в анамнезе

У пациенток без признаков ИБС относительно здоровых (рисунок 1) снижена частота TNFa-863 СС и TNFa-308 GG (C)R=0,67 Р=0,0493 и (Ж=0,42 Р=0,00003 соответственно), возрастает частота TNFa-308 GA и TNFa-863 АА генотипов (OR=2,47 Р=0,00002 и OR=3,80 Р=0,0183 соответственно). Между субгруппами пациенток с СД 2 типа с наличием и отсутствием ИБС выявлены инвертированные различия. В субгруппе с ИБС относительно СД2 пациенток без ИБС частота TNFa-308 GG генотипа увеличена (OR=2,93 Р=0,0002), а частота гетерозиготного варианта гена снижена (OR=0,36 Р=0,0005). Частота IL10-592AA достоверно выше в субгруппе с наличием ИБС относительно пациенток без признаков ИБС (OR=2,65 Р=0,0332). Ряд авторов, однако, связывают полиморфизм генов воспаления не с развитием непосредственно заболевания, а с факторами с ним ассоциированными, такими, как, например, ожирение [Chang Y.H., 2004; Sookoian S.C., 2005].

Сравнительный анализ полиморфизма промоторных регионов генов матричных металлопротеиназ у пациенток с сахарным диабетом второго типа. Анализ ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов ММР 2, ММРЗ и ММР 9 выявил, что в группе пациенток с СД2 достоверно реже встречается гомозиготный генотип ММР36А6А, (OR =0,46, Р= 0,0004), в то время как гомозиготный генотип ММРЗ 5А5А является фактором риска развития патологии (OR =2,02, Р= 0,0165) (таблица 3).

Таблица 3.

Анализ частоты генотипов ММР 2, ММРЗ и ММР 9 у пациенток с СД 2 типа

относительно здоровых женщин

Полиморфизм СД 2 типа (%) Здоровые (%) OR 95% CI

ммрзлт N=296 N=128

6А6А 87(29,39) 61(47,66) 0,46" 0,29-0,72

5А6А 132(44,59) 48(37,50) 1,34 0,86-2,10

5А5А 77(26,01) 19(14,84) 2,02" 1,13-3,64

Примечание. "XJ=12.33 Р 0,0004, "X=5,74 Р0,0165, с учетом поправки Йетса

Однако полиморфизм ММР генов рассматривают скорее не как фактор риска развития заболевания, а как фактор риска развития сосудистых осложнений [АЬШеп-а Б., 2006].

При анализе особенностей генотипов субгрупп пациенток с СД 2 типа с наличием/отсутствием ИБС выявлено, что частота генотипа дикого типа ММРЗ-11715А5А повышена только у пациенток с СД и ИБС относительно здоровых женщин ^=2,38 Р=0,0082).

Сравнительный анализ распределения генотипов регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов с развитием и особенностями сахарного диабета второго типа не выявил статистически значимых различий.

Комплексный анализ полиморфизма исследуемых генов у пациенток с сахарным диабетом второго типа. 746 комплексных генотипа позитивно ассоциированы с заболеванием, из них 32 с высоким уровнем достоверности менее 0,001, 129 позитивно ассоциированных с СД 2 типа комбинаций имеют отношения шансов развития патологии выше 10. Негативно ассоциированных с заболеванием комбинаций выявилось 1274, из них 29 комбинаций с уровнем достоверности менее 0,001 и 50 комбинаций со значениями отношения шансов развития заболевания менее 0,05. Среди генов цитокинов, которые вошли в состав позитивно ассоциированных с СД2 комбинированных генетических признаков, высока доля гомозиготных вариантов 1Ы0-1082АА и 1Ь4-590 СС, 1ЫР -31 СС и 1Ь6 -174 СО. Негативно ассоциированные комбинации отличает наличие в составе комбинаций гетерозиготных вариантов указанных выше генов. Кроме того, в позитивно ассоциированных с СД 2 комбинациях полиморфная позиция регуляторного региона УЕйР +936 гена присутствует только в виде гомозиготного генотипа дикого типа, в то время как в негативно ассоциированных комбинациях преимущественно в виде гетерозигот. Можно предполагать, что комплексный генотип отражает в том числе и баланс продукции про-/противовоспалительных цитокинов при развитии СД 2 [Зргагщег I., 2003].

Анализ ассоциированности комплексных генотипов исследуемых генов с сывороточным уровнем основных лабораторных показателей, анализируемых при сахарном диабете второго типа. В настоящее время показано, что цитокины могут включаться в патогенез СД2, участвуя в развитии воспаления жировой ткани и в формировании инсулинорезистентности [Шварц В., 2009]. В сыворотке крови больных определяли содержание 12 биомаркеров инсулинорезистентности - инсулина, С-пептида, висфатина, резистина, лептина, глюкагона, 1Ь6, ТИБа, грелина, глюкагоноподобного пептида (СЬР-1), ингибитора активатора плазминогена (РА1-1), глюкозозависимого пептида (С1Р). Из 12 исследованных показателей лишь у 3 из них высокие уровни исследованных лабораторных показателей ассоциированы с генотипами генов цитокинов (таблица 4). Из четырех комплексных генотипов, ассоциированных с низким уровнем 1Ь6, ведущим мотивом является И6-174 СС: УЕвР- 2578 СА (011=0.05 Р=0.0083). Четыре сложных генотипа ассоциированы с низким уровнем ТОТ а, максимальная сила ассоциированности при этом у генотипа ШР-863 CC.IL!0-592 СС:УЕСР-2578 СА (011=0.13 Р=0.0234). 11 комплексных генотипов ассоциированы с низким уровнем инсулина, при этом в виде моногенотипа с генотипом №1(1-31 7Т (011=0.05 Р=0.0060). Этот же генотип входит в состав всех 11 комплексов.

Таблица 4.

Генотипы, ассоциированные с высокими уровнями биологически активных _пептидов у пациентов с СД2 _

Лабораторный показатель Полиморфная позиция Генотип OR OR_CI95

Лептин IL6-174: VEGF2578 GC-CA 9,44 1.69-52.73

Лептин TNF-238:IL6-174: VEGF2578 GG-GC-CA 7,65 1.37-42.71

РАИ TNF-238.IL6-174 GG-GC 7,80 1.69-36.06

PAI1 TNF-863:TNF-238:IL6-174 CC-GG-GC 7,80 1.69-36.06

PAI1 TNF-238.IL6-174: VEGF2578 GG-GC-CA 5,25 1.09-25.21

Резистин TNF-308 GA 12,00 1.33 - 108.68

Резистин TNF-308: TNF-238 GA-GG 10,50 1.14-96.58

Резистин IL6-174: VEGF2578 GC-CA 7,65 1.37-42.71

Эти данные согласуются с тем, что провоспалительные цитокины ИЛ1, ИЛ2, ИЛ6, ИЛ12, ФНОа, участвующие в формировании воспалительной реакции, угнетающе действуют на продукцию инсулина бета-клетками поджелудочной железы, вызывая торможение секреции инсулина [Бояджян А., 2008]. У шести комплексных генотипов, ассоциированных с низким уровнем сывороточной продукции лептина два ведущих генотипа: IL10-592CA в комплексе с полиморфным генотипам TNF-238GG, -308GG,-863CC и IL6-174 GG в комплексе с VEGF-2578 СА и TNF-238GG, -308GG, -863СС. Предполагается, что полиморфизм TNF - G 308А может быть связан с уровнем лептина, независимо от наличия инсулинорезистентности и гипергликемии [Gupta V., 2012]. Низкие сывороточные уровни резистина и глюкозозависимый пептид (GIP) ассоциированы с единственными комплексами: TNF-308 GG. TNF-238 GG.TL6-174-GG и TNF-238 GG.IL1/3-31 TC:VEGF-2578 СА соответственно (OR=0,10 Р=0,0422 и OR=0,10 Р=0,0422 соответственно).

Полученные данные свидетельствуют о функциональной значимости изученных полиморфных сайтов, в том числе и для иммунопатологических механизмов, и обосновывают их рассмотрение при развитии СД 2 типа.

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ, ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У

ПАЦИЕНТОК С РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И АССОЦИИРОВАННОСТЬ С ХАРАКТЕРОМ ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Сравнительный анализ распределения генотипов генов цитокинов у женщин с раком молочной железы. При анализе распределения частот генотипов промоторного региона гена IL-10 показано, что у пациенток с РМЖ частота генотипа IL10-592AA возрастает в три раза относительно группы здоровых женщин (OR=3,33 Р=0,00331) и является потенциальным фактором риска развития патологического процесса, увеличена частота генотипа IL10-1082АЛ (OR=2,22 Р=0,000139) при статистически значимом снижении в группе

24

больных гетерозиготного генотипа в этой позиции (СЖ=0,37 Р= 0,0000005). Показано, что у женщин с более высоким уровнем экспрессии 1Ы0, обусловленной генетическим полиморфизмом, риск развития рака молочной железы значительно ниже [Вго\уег V., 2005; Ьа^епкИпег и., 2005]. Частота минорного генотипа ТИРа-863 АА увеличена в группах с наследственными онкопатологиями и наследственным РМЖ до 3,92% и 7,15% соответственно, относительно группы без наследственной онкоотягощенности (таблица 5). Частота этого редкого генотипа достоверно увеличена и у пациенток с РМЖ в семейном анамнезе относительно здоровых женщин (011=5,49 Р=0,02), что позволяет рассматривать носительство данного генотипа как определенный наследственный фактор предрасположенности к патологии.

Таблица 5.

Распределение генотипов цитокинов у пациенток с наследственной отягощенностью онкопатологиями и без онкоотягощенности

генотипы РМЖ с отягощ. онкопат. РМЖ с отягощ. РМЖ РМЖ без онко-отягощ. СЖ (1/3) 95% С1 СЖ (2/3) 95% С1

Т№а С-863А 1 2 3

СС 112(73,20) 39(69,64) 139(76,37) 0,85 0,50-1,43 0,71 0,35-1,46

СА 35(22,88) 13(23,21) 43(23,63) 0,96 0,56-1,65 0,98 0,45-2,09

АА 6(3,92) 4(7,15) 0 16,08* 0,00-0,00 31,28*» 0,00-0,00

Примечание. N'=153, N^=56, ^=182; *Х2 5,21 Р=0,0085, **X2 9,25Р=0,0028 точным двусторонним методом

Фишера

Сравнительный анализ возрастных групп развития заболевания до 35 лет и после 35 лет относительно здоровых женщин показал увеличение частоты минорного генотипа 1ЫО-1082АА у пациенток обеих групп (ОЯ= 4,48 Р= 0,02 и 011=2,33 Р= 0,00005 соответственно) при снижении гетерозиготности в группах больных (СЖ=0,08 Р=0,005 и 011=0,36 Р=0,0000004 соответственно) и увеличение частоты генотипа 1Ы0-592АА в старшей возрастной группе относительно здоровых женщин (СЖ=3,38 Р=0,004), что повторяет картину в общей группе.

Сравнительный анализ распределения генотипов генов матричных металлопротеиназ у женщин с раком молочной железы. Одним из главных молекулярных механизмов, лежащих в основе инвазии и метастазирования опухолей, считается разрушение окружающей базальной мембраны и внутриклеточного матрикса ассоциированными с опухолью протеазами [НапаЬап Б., 2011]. Анализ ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов ММР 2, ММРЗ и ММР 9 выявил, что в группе здоровых женщин достоверно чаще встречается гомозиготный генотип дикого типа ММР36А6А (ОЙ. =0,46 Р=0,0005) и минорный гомозиготный генотип ММР 9-1562ТТ

(СЖ=0,22 Р=0,0067), в то время как гетерозиготный генотип ММРЗ 5А6А является фактором риска развития патологии ((Ж =1,61 Р= 0,0344) (таблица 6). Риск лимфагенного метастазирования снижен у пациенток с ММР9-1562СС генотипом. Напротив, гетерозиготный генотип может рассматриваться как фактор риска метастазирования (СЖ=0,60, Р=0,0389 и (Ж=1,66, Р=0,0389 соответственно).

Выявлена ассоциированность гетерозиготного варианта ММРЗ 5А6А со степенью злокачественности опухоли. Частота этого генотипа достоверно снижается по мере повышения степени злокачественности (011=0,23, Р=0,03 и (Ж=0,19, Р=0,04 III степень злокачественности относительно I и II степени злокачественности опухоли соответственно).

Таблица 6.

Анализ частоты генотипов ММР 2, ММРЗ и ММР 9 у пациенток с РМЖ

относительно здоровых женщин

полиморфизм РМЖ (%) Здоровые (%) OR 95%С1

ММРЗ-1171 N=320 N=128

6А6А 95(29,68) 61(47,66) 0,46' 0,30-0,72

5А6А 157(49,07) 48(37,50) 1,61" 1,03-2,50

5А5А 68(21,25) 19(14,84) 1,55 0,86-2,81

UMP9-1562 N=390 N=329

СС 280(71,79) 229(69,60) 1,11 0,79-1,55

CT 106(27,18) 85(25,84) 1,07 0,76-1,52

TT 4(1,03) 15(4,56) 0,22'" 0,06-0,71

Примечание. 2,33 Р 0,00047, "¿=4,47 Р 0,0344, X1=7,34 Р 0,0067 с учетом поправки Йетса

Сравнительный анализ распределения генотипов регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов с развитием и особенностями течения рака молочной железы. Ангиогенез и лимфангиогенез, в котором, по последним данным, также участвует VEGFA, непосредственно промотирует формирование метастазов в лимфатических узлах в пределах дренажного бассейна опухоли [Yabushita Н., 2003]. Сравнение частот VEGF-C 2578А генотипов в группах женщин, больных РМЖ, и практически здоровых женщин выявило статистически значимое повышение частоты генотипа VEGF-2578AA в группе больных РМЖ при достоверном снижении частоты генотипа дикого типа (таблица 7). Частота-2578СА генотипа достоверно снижалась в группах пациенток с наследственной отягощенностью онкопатологиями и РМЖ относительно группы пациенток без наследственной онкоотягощенности (OR=0,50 Р=0,002 и OR=0,50 Р=0,03 соответственно).

При анализе частоты встречаемости генотипов VEGF у пациенток с наследственной онкоотягощенностью и без таковой относительно здоровых женщин выявлено достоверное снижение гетерозиготности в позиции -2578 у пациенток с общей онкоотягощенностью относительно здоровых (OR=0,62

26

Р=0,02) и возрастание гетерозиготности в позиции +936 в этой же группе относительно здоровых (СЖ=1,70 Р=0,02).

Таблица 7.

Распределение частот генотипов УЕвРА в популяции практически здоровых женщин сибирского региона и пациенток с РМЖ

УЕСРА Пациентк и с РМЖ % Здоровые СЖ 95%С1

1 2

С-2578А N,=389 N2=293 СС 80(20,56) 82(27,99) 0.66* 0.45-0.95

АС 202(51,93) 161(54,95) 0.91 0.66-1.24

АА 107(27,51) 50(17,06) 1.81** 1.22-2.69

Примечание. * Л* 5,08 Р=0,0241, * *Х' 9,14 Р=0,00249, *** X15,84 Р=0,0156

Отношения шансов развития патологии достоверно выше у пациенток с гетерозиготным генотипом КЕ(Ж4 -2578 с сохраненным менструальным статусом, чем у пациенток с переменопаузой и постменопаузой одной возрастной группы - после 35 лет (ОЯ=1,63 Р=0,036). Исследователи связывают это с более низким уровнем УЕОР в плазме крови [ЫоЬиЫко К., 2006]. Частота гетерозиготного варианта -2578 СА снижена (011=0,44, Р=0,012) в группе пациенток в пере- и постменопаузе с лимфагенным метастазированием относительно женщин с сохраненным менструальным статусом и отсутствием метастазов, где данный генотип не встретился ни разу.

Неоангиогенез в опухолях тесно связан с наличием эстрогеновых и прогестероновых рецепторов (ЕЯ и РЯ) [Крицкая Н., 2007]. Крайне важным представляется учет наличия в опухолевых тканях пациенток тирозин -киназного рецептора к эпидермальному фактору роста НЕЙ. -2/пеи. Его коварство заключается не только в способности стимуляции опухолью своего роста, но также в вовлечении стромы в экспрессию рецепторов к самому фактору с последующей «косвенной» индукцией опухолевого роста (так называемый «двойной» механизм опухолевой прогрессии) [1Чипез Я., 2002]. Анализ полиморфизма УЕйЕА гена с РМЖ с учетом результатов иммуногистохимического исследования опухолевой ткани (ЕЯ, РЯ, Нег-2/пеи) выявил значительное снижение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа -2578 АС /+936СТ в группе пациенток с наличием эстрогеновых рецепторов в опухолевых тканях (011=0,45 Р=0,03). Кроме того, выявлены генотипы, частоты которых достоверно выше в группе РЯ-позитивных женщин относительно РЯ-негативных: -2578 АА (011=1,89, Р=0,04) и -2578 АА/+936СС (011=2,20, Р=0,02). Данные закономерности сохраняются у пациенток с ЕШ7Р11+ статусом опухоли относительно пациенток с ЕЯ-/РЯ- статусом

опухоли: -2578 АЛ/+936СС (СЖ=2,46, Р= 0,04) и -2578 АС /+936СТ (СЖ=0,38 Р=0,02).

Риск развития рецидивов за период 5 лет у обследуемых женщин оказался достоверно выше у носительниц генотипа УЕОР+936СС относительно пациенток без возникновения рецидива за период наблюдения (011=1,42 Р=0,02). Гетерозиготный вариант +936СТ УЕОРА гена в группе с наличием рецидивов не встречался ни в одном случае в отличие от пациенток без рецидивирования заболевания, где этот генотип выявлялся в 27,7% случаев. Комплексный анализ полиморфизма исследуемых генов у пациенток с раком молочной железы. Уникальных генетических комбинаций, позитивно ассоциированных с РМЖ, выявлено 650, причем в большинстве комбинаций присутствует генотип 1Ы0-1082АА. Генотипы 1Ы0-1082АС и 1Ы0-1082СС ни разу не встречаются в индивидуальных позитивно ассоциированных генетических комбинациях, характерных для пациенток с РМЖ. 8 из этих комбинаций с очень высоким уровнем достоверности (Р=0,0000) по двустороннему критерию Фишера. Примечательно, что такой уровень достоверности достигается при одновременном носительстве 1Ы0-1082АА и ММР9-1562СС генотипа. В 37 комбинациях генотипов отношения шансов развития заболевания выше 10, при максимальном значении ОЯ =23,19 для генотипа ШР-863 СС/114-590 СС/1Ы0-592 АА/ММР9-1562СС, что позволяет выявлять группы с очень высоким риском развития заболевания. В 26 характерных для РМЖ комбинаций с высоким риском развития патологии присутствует генотип ММР9-1562 СС, в 18 генетических комбинациях присутствует генотип 1Ы0-1082АА, десять комбинаций содержат 1Ы0-592АА генотип. Кб -174 в позитивно ассоциированных с РМЖ комбинациях с высоким отношением шансов развития патологии и высоким уровнем достоверности представлен либо гетерозиготным генотипом, либо 1Ь6 —174Сй генотипом. K£'GF -2578 представлен в комбинациях УЕСР-2578 АА генотипом.

Отмечается явный дисбаланс числа комбинаций генотипов, позитивно ассоциированных с предрасположенностью к развитию РМЖ, к числу негативно ассоциированных с развитием данной болезни, которых выявлено 3425. У 24 из данных комбинаций уровень достоверности по двустороннему критерию Фишера достигает Р=0,0000. Во всех высоко достоверных комбинациях присутствует 1ЫО-1082 АС генотип, не встречающийся в позитивно ассоциированных комбинациях для РМЖ. Кроме того, 1Ы0-1082 АО генотип содержится в большинстве всех негативно ассоциированных с РМЖ генотипов. 538 резистентных к заболеванию генотипов достигают значения менее 0,1. Из них 78 генотипов со значениями 011 менее 0,05. В 57 из 78 генотипов также присутствует 1Ы0-1082 АС генотип. В восьми комбинациях

28

генотип ММР9-1562 TT, в семи VEGF2578CC при отсутствии IL10-1082 AG. Кроме того, в комплексном генотипе при отсутствии IL10-1082 AG генотипа появляются редкие генотипы TNF-238AG и TNF-308AG, отсутствующие в положительно ассоциированных генотипах для РМЖ.

Именно комплексный анализ отражает более полную картину сетевых взаимодействий при развитии патологии, что, несомненно, более ценно при скрининговых исследованиях.

ОСОБЕННОСТИ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ, МАТРИЧНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ, ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ У ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ И ИХ АССОЦИИРОВАННОСТЬ С ХАРАКТЕРОМ

ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ Сравнительный анализ распределения генотипов генов цитокинов у женщин с ревматоидным артритом. Распределение частот генотипов TNFa в позициях -863 и -238,1-lb -31, IL4-590, IL6 - практически идентично в группах женщин, больных РА и здоровых женщин. Частота генотипа дикого типа TNFa-308 GG снижена у пациенток с РА, а частота гетерозиготного генотипа в этой полиморфной позиции, напротив, возрастает до 27,16% у больных относительно 16,04% у здоровых и является фактором риска развития заболевания (OR=0,52 Р=0,0043 и OR=l,95 Р=0,0041 соответственно). Частоты генотипов противовоспалительного цитокина ILIO достоверно различаются в группах в двух анализируемых полиморфных позициях, причем у пациентов возрастают частоты гомозиготных генотипов IL10-1082AA и IL10-592AA (OR=l,94 Р=0,0059 и OR=4,02 Р=0,0022 соответственно) и снижены частоты IL10-1082AG и IL10-592CC (OR=0,38 Р=0,00003 и OR=0,66 Р=0,0366 соответственно). Рассматривается как собственный вклад полиморфизма гена TNFa, так и его возможное неравновесное сцепление с генами HLA региона, а один из возможных механизмов ассоциированности полиморфизма ILIO предполагает, что низкое содержание ILIO может способствовать развитию РА за счет смещения баланса в сторону воспалительных цитокинов [Rego-Perez I., 2008; Rodriguez-Carreon А., 2005].

Ревматоидный фактор определялся в крови у 122 женщин (75,78%), и 39 женщин (24,22%) считались серонегативными. Показано, что достоверные различия распределения частот генотипов гена TNFa-308 сохраняются только для группы серонегативных пациенток относительно здоровых, причем значения отношения шансов при выделении серонегативной группы возрастают по сравнению с общей группой больных: TNFa-308 GG (QR=0,33 Р=0,0026), TNFa-308 GA (OR=3.27 P=0,0012). В группе серопозитивных пациенток

29

выявляются достоверные различия относительно здоровых женщин только по двум полиморфным позициям гена ILIO. У пациенток возрастают частоты генотипов ILIO -1082АА и IL10-592AA (OR=l,85 Р=0,0184 и OR=4,61 Р=0,0010 соответственно) и снижены частоты IL10-1082AG и IL10-592CC (OR=0,34 Р=0,00003 и OR=0,62 Р=0,0325 соответственно). Выявляется тенденция снижения частоты IL4-590 СС (OR=0,43 Р=0,0525) и увеличение частоты IL6-174GG (OR=2,96 Р=0,0502), показанные для ряда популяций [Soroka N.E., 2010].

Частота генотипа дикого типа TNFa-308 GG снижена у пациенток с РА без наличия ревматоидных узелков, а частота гетерозиготного генотипа в этой полиморфной позиции, напротив, возрастает в этой группе пациенток относительно здоровых (OR=0,48 Р=0,0174 и OR=2,12 Р=0,0343 соответственно). У пациентов этой группы возрастают частоты гомозиготных генотипов IL10-1082AA и IL10-592AA (OR=2,06 Р= 0,0097 и OR=4,37 Р=0,0039 соответственно) и снижены частоты IL10-1082AG и IL10-592CC (OR=0,42 Р=0,00018 и OR=0,58 Р=0,0237 соответственно). В группе пациенток с наличием ревматоидных узелков сохраняется снижение частоты гетерозиготного генотипа ILI0-1082AG относительно здоровых (OR=0,37 Р=0,0174) и выявляется повышение частоты IL10-1082GG генотипа относительно здоровых (OR=2,42 Р=0,0343).

Сравнительный анализ распределения генотипов генов матричных металлопротеиназ у женщин с ревматоидным артритом. Анализ ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов ММР 2, ММРЗ и ММР 9 выявил, что в группе здоровых женщин достоверно чаще встречается гомозиготный генотип ММР36А6А (OR=0,59 Р=0,0376). Показано, что 6А аллельный вариант связан двукратным понижением транскрипционной деятельности ММРЗ [Kim J., 2002], что и может объяснять меньшую степень деструкции суставов при развитии заболевания.

Сравнительный анализ распределения генотипов регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов с развитием и особенностями ревматоидного артрита. Различий в распределении частот VEGFC-2578A и VEGFC+936T генотипов в оппозитных группах установлено не было. Показано повышение частоты VEGF -2578 СС генотипа только у пациенток с РА с наличием ревматоидных узелков. Предполагают, что ревматоидные узелки представляют собой не что иное как омертвение тканей вокруг воспаленных мелких кровеносных сосудов, с накоплением в них иммунных комплексов и ревматоидного фактора, что может поддерживаться высокой транскрипционной активностью VEGF, предшествующей образованию узелковых образований [Chen Y., 2011].

30

Комплексный анализ полиморфизма исследуемых генов у пациенток с ревматоидным артритом. 947 уникальных генетических комбинаций позитивно ассоциированы с РА, причем 30 сложных генотипов с уровнем достоверности до 0,001. Выявлено 169 комплексных генотипа со значением отношения шансов развития заболевания выше 10, из них 92 комплексных генотипа обладают значениями величины отношения шансов 17,98-25,12. Максимальные значения отношения шансов развития РА в комплексных генотипах И1/1-31 ТС:Ш0-592 АА:УЕСР-2578 СА (СЖ=25,01 Р=0,0017), 7М7-863 СС:И1Р-31 ТС:1Ы 0-592 АА:УЕСР-2578 СА (<Ж=25,01 Р=0,0017), И1Р-31 ТС:И4-590 СС:УЕСР-2578 СА.ММР2-1306 ТТ (СЖ=25,12 Р=0,0008). 1455 комбинаций негативно ассоциированы с заболеванием. Для позитивно ассоциированных комплексных генотипов характерно наличие 1Ы0-1082АА, К10-592АА, УЕвР -2578СА или УЕвР -2578АА генотипов. Негативно ассоциированные комбинации генотипов, напротив, характеризуются наличием в составе 1Ы0-1082АС и 1Ы0-592СС генотипов, УЕвР-2578СА либо УЕОР-2578СС генотипа.

Ассоциированность уровня продукции ревматоидного фактора и С-реактивного белка с полиморфизмом анализируемых генов у пациентов с ревматоидным артритом. Выявлено 10 комплексных генетических комбинации анализируемых полиморфных позиций, позитивно ассоциированных с высокой продукцией СРБ. В состав 8 из этих генотипов входит 1ЫР-31ТС как в виде моногенотипа, так и в составе 2- и 3- локусных комплексов, причем максимальное значение отношения шансов наличия высокой продукции СРБ при наличии в комплексе 1ЫР-31 ТС: 116-174 ОС (011=5,57 Р=0,0386). Еще два генотипа содержат в составе 1Ь6-174 СС: УЕОР2578 СА в двухлокусном генотипе и трехлокусном генотипе ШР-238 СО:И6-174 СС:УЕОР-2578 СА (011=5,00 Р=0,0278, 011=5,64 Р= 0,0379). 19 генотипов позитивно ассоциированы с высокой продукцией РФ у пациентов с РА. В составе 13 сложных генотипов присутствует 1Ь4-590СТ. Этот же генотип ассоциирован с высокой продукцией РФ и в виде моногенотипа. В составе трех генотипов выявлен 1Ь6-174 ОС. Показано, что 1Ь-6 способствует продукции аутоантител, таких как РФ [Тапака Т., 2013]. В двух генотипах комплекс 1Ь1р-31 ТТ:1Ы0-592 СА. Максимальное значение отношения шансов наличия высокого уровня РФ у носителей генотипов 1ЫР-31 ТТ:1Ы 0-592 СА; ТЫР-308:И4-590: УЕСР2578 СС-СТ-СА; тр-238:1ЫР-31:1Ы0-592 СС-ТТ-СА; ТЖ-308:ТЫР- СС-вв-СТ-СА 238:114-590: УЕвР2578 (ОЯ=6,67 Р=0,0230 для всех приведенных генотипов).

С низкой продукцией СРБ ассоциировано 16 генотипов, включая низкоэкспрессирующий моногенотип УЕСР-2578АА (011=0,22 Р=0,0349). Эти

31

данные коррелируют с представленными ранее данными о том, что VEGF-2578 АА ассоциирован с более низким индексом активности PA DAS28 [Chen Y., 2011]. В сложном генотипе TNF-238 GG:VEGF-2578AA (C)R=0,22 Р=0,0349) значения отношения шансов не изменяются. Можно предположить, что включенный в комплекс TNF-238 GG не имеет функциональной значимости в отношении уровня продукции СРБ в данном комплексном генотипе. В семи комплексах присутствует IL1/Í-31TT. Наибольший шанс наличия низкой продукции СРБ у носителей генотипов ILip-31TT:IL4-590CT:IL10-592CC и TNF-238GG:ILip-31 TT.TL4-590 CT.IL10-592CC (C>R=0,10 Р=0,0272 для двух комплексов). Можно сделать аналогичное предположение: включенный в комплекс TNF-238 GG не имеет функциональной значимости в отношении уровня продукции СРБ в данном комплексном генотипе. В 6 комплексах присутствует IL4-590 CT.IL6-174GC (<Ж=0,17 Р=0,0097). Причем TNF-863CC, включенный в комплекс IL4-590 CT.IL6-174GC, существенно изменяет значения OR (OR=0,09 Р=0,0139), а включение в комплекс TNF-238GG в этих генотипах не приводит к изменению значений отношения шансов.

С низким уровнем РФ в сыворотке ассоциировано 20 генотипов, из них IL4-590 СС в виде моногенотипа с низким уровнем экспрессии. При этом IL4-590 СС присутствует во всех 19 комплексных генотипах в различных сочетаниях. Частота именно этого генотипа выше у серонегативных пациентов с РА в анализируемой нами группе. Максимальное значение отношения шансов наличия низкой продукции РФ у носителей генотипа ILip-31 TT.-IL4-590 CC:IL10-592 CC:VEGF-2578CA (OR=0,11 P=0,0272).

Представленные данные показывают, что определение таких показателей может быть использовано для оценки риска возникновения РА.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОБЩИХ И ЧАСТНЫХ КОМПЛЕКСНЫХ ГЕНОТИПОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С АНАЛИЗИРУЕМЫМИ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Клинически различные заболевания могут контролироваться синтропными генами [Пузырев В., 2009]. При синтропном влиянии сигнальные сети под влиянием генов восприимчивости индивидуально либо совместно могут провоцировать развитие не одной, а нескольких болезней. Болезни могут быть связаны между собой как положительно, так и обратно пропорционально [Proal А., 2009]. Существует целый ряд вариантов связи генных сетей с предрасположенностью к таким тяжелым социально значимым болезням, как СД2, РА, РМЖ, ИБС, как показано в предыдущих главах. Разные по патогенезу заболевания ассоциированы и с наличием в геноме пациентов одних и тех же наборов полиморфных вариантов генных сетей. В таблице 8 представлено

32

количество сложных генотипов позитивно и негативно ассоциированных одновременно с двумя из анализируемых заболеваний.

Распространенность ССЗ среди пациентов с СД 2 типа более чем в 4 раза превышает таковую у лиц без данного заболевания, т.е патологические процессы, характерные для СД 2 типа, являются предпосылками риска развития ИБС [Куликова А., 2007]. Несмотря на различия в частотах встречаемости комплексных генотипов в группе здоровых мужчин и женщин, выявлены 22 комплексных генотипа, позитивно ассоциированных с двумя патологиями. Наиболее высокий уровень отношения развития СД 2 (OR=6,34) и одновременным отношением шансов развития ИБС (OR=5,89) у носителей генотипа TNF-308GG:TNF-238GG-:IL10-1082AA: VEGF-2578 СА: VEGF+936 СС: ММР9-1562СС.

Таблица 8.

Количество сложных генотипов позитивно и негативно ассоциированных

одновременно с двумя заболеваниями

Позитивные комбинации РА (%) N=947 СД2 (%) N=746 РМЖ (%) N=650 ИБС (%) N=126

РА ❖ 210(28,15) 214(32,92) 27 (21,43)

СД2 210(22,18) ❖ 139(21,38) 22 (17,46)

РМЖ 214(22,60) 139(18,63) ❖ 13(10,31)

ИБС 27(2,85) 22 (2,94) 13 (2,00) ❖

Негативные комбинации РА(%) N=1455 СД2(%) N=1274 РМЖ(%) N=3425 ИБС(%) N=1246

РА(№1455) ❖ 462(36,26) 871(25,43) 61 (4,89)

СД2 462(31,75) ❖ 534 (15,59) 23 (1,85)

РМЖ 871 (59,86) 534(41,91) ❖ 84 (6,74)

ИБС 61(4,19) 23(1,81) 84 (2,45) ❖

Примечание. -V- количество индивидуально ассоциированных с заболеванием сложных генотипов, в скобках представлена доля общих генотипов в % для данного заболевания

В структуре причин преждевременной смертности при РА наибольший удельный вес также приходится на ИБС и ее осложнения [АиЬгу М., 2007]. Показана причинно-следственная связь эндотелиальной дисфункции и развития коронарного атеросклероза у пациентов с РА [Мазуров В., 2009], что может предполагать единые молекулярно-генетические особенности предрасположенности к развитию двух заболеваний. Выявлено 27 сложных генотипов, ассоциированных одновременно и с РА, и с ИБС. Наибольшее значение отношения шансов развития РА (ОЯ=7,61) для генотипов 7Ъ[р-З0800:1ы0-1082АА:УЕСР-2578СА:УЕСР+936 СС:ММР9-1562 СС и ТЫР-308 Св:тР-238 СО:1ЫО-Ю82 АА:УЕОР-2578 СА:УЕвР+936 СС:ММР9-1562СС и одновременном значении отношения шансов развития ИБС ((Ж=5,89 и

OR=5,34 соответственно). Структура генотипов, одновременно позитивных для ИБС, РА и СД2, - только низкоэкспрессирующие гомозиготные генотипы противовоспалительных цитокинов, генотип, ассоциированный с высоким уровнем экспрессии регуляторного региона в позиции +936 гена VEGF и ассоциированный с низким уровнем продукции генотип ММР9 -1562СС. Провоспалительный цитокин ILlß-31 и VEGF-2578 представлены в гетерозиготном виде. Обращает на себя внимание, что среди генотипов, позитивно ассоциированных с СД2/ИБС и PA/ИБС более половины, а именно 21 генотип позитивно ассоциирован одновременно с 3 заболеваниями - РА, СД 2 типа и ИБС.

В группах пациентов, представленных только женщинами, 101 комплексный генотип позитивно ассоциирован одновременно с тремя заболеваниями. Значения отношения шансов развития заболеваний при этом высоки: TNF-863 CC-.IL4-590 CC.TL10-592 АА - PA (OR=15,55), СД2 (OR= 12,21) и РМЖ (OR=14,37); TNF-863 CC:TNF-308 GG:IL4-590 CC.IL10-592AA - PA (OR=10,96), СД2 (OR=12,21) и РМЖ (OR=11,40). Представленные в составе комплексов гомозиготные генотипы про- и противовоспалительных цитокинов ассоциированы с низким уровнем белковой продукции. Гомозиготное носительство деструктивного маркера ММР9 в данных комплексных генотипах также ассоциировано с низкой продукцией белка. Полиморфная позиция гена VEGF -2578 в области промотора представлена преимущественно гетерозиготами, а при гомозиготном носительстве вариантом с низким уровнем экспрессии. Напротив, VEGF +936 полиморфная позиция в 3' нетранслируемом регионе гена представлена гомозиготным вариантом, ассоциированным с повышенной продукцией. Обращает на себя внимание, что относительное ранжирование значений показателя относительного риска развития одного из трех анализируемых заболеваний от большего к меньшему, приводит к аналогичному ранжированию этого расчетного коэффициента и для других заболеваний.

Аналогично позитивным комбинациям одинаковые генотипы, негативно ассоциированные с заболеванием, представлены в основном в группах женщин (таблица 8). Резистентность к развитию и СД2, и РА, и РМЖ ассоциируется с одинаковыми комбинациями 326 сложных генотипов одновременно. Для комбинаций характерно наличие генотипа VEGF -2578СС, ассоциированного с высоким уровнем экспрессии гена, провоспалительного цитокина IL6-174 GG, ассоциированного с высоким уровнем экспрессии гена, противовоспалительного цитокина ILIO -1082 в гетерозиготном виде и ILIO -592СС, ассоциированного с высоким уровнем экспрессии.

Особого внимания заслуживает то, что в группах женщин с тремя разными патологиями нет ни одного сложного генотипа, который был бы позитивно ассоциирован с каким-либо одним заболеванием и одновременно являлся бы протективным в отношении другого. Аналогично с протективными генотипами в женской группе. Только 5 генотипов, негативно ассоциированные с болезнью в женских группах, носят противоположно ориентированный характер в группе мужчин с ИБС.

ВЫВОДЫ

1. Анализ генов цитокинов TNFa -863 (rs 1800630), TNFa-308 (rs 1800629), TNFa-238 (rs 361525), ILlß -511 (rsl6944), ILlß-31 (rsl 143627), IL 4 -590 (rs2243250), IL6 -174 (rsl800795¿ 1L10-1082 (rsl800896) , IL10-592 (rs 1800872); матричных металлопротеиназ MMP2-1306 (rs243865), MMP3-1171 (rs3025058), MMP9-1569 (rs3918242); гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-2578 (rs699947) и VEGF +936 (rs3025039) выявил преимущественно европеоидный характер распределения аллелей и их генотипов у практически здоровых жителей Западной Сибири. Однако наблюдается и ряд этногеографических особенностей, выраженных в смещении распределения частот генотипов IL4-590 (rs2243250), ММРЗ-1171 (rs3025058) в сторону их распределения в монголоидных популяциях, что необходимо учитывать при анализе генетической ассоциированности данных генотипов с исследуемыми заболеваниями.

2. Существуют достоверные различия комплексных генотипов генов цитокинов, матричных металлопротеиназ и фактора роста эндотелия сосудов между группами здоровых разного пола и возраста: отсутствует ряд комплексных генотипов в группах мужчин/женщин, и отсутствуют определенные комплексные генотипы в группах лиц пожилого возраста, присутствующие с высокой частотой в группах молодых жителей Западной Сибири.

3. Проведенный анализ уровня спонтанной и стимулированной Con А продукции цитокинов у практически здоровых доноров выявил ассоциированность высокой продукции IL1B с ILlß-31 С аллельным вариантом гена; ассоциированность полиморфизма промоторного региона гена IL 4-590 с уровнем продукции цитокинов IL1, IL6, TNFa, ILIO; промоторного полиморфизма ILIO -592 с уровнем продукции IL4, что подтверждает наличие сетевых взаимодействий.

4. Проанализированный характер распределения генотипов регуляторных регионов генов цитокинов TNFa -863 , -308, ILlß -31, IL4 -590, IL6 -174,

35

ILIO -1082 и ILIO -592; матричных металлопротеиназ, ММРЗ-1171, ММР9 -1562; гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-2578 выявил индивидуальный характер их ассоциированности с риском развития СД2, РА, РМЖ, ИМ и их клиническими проявлениями.

5. Анализируемые гены медиаторов воспалительного ответа образуют индивидуальные ассоциированные с ИБС, СД2, РА и РМЖ генные сети, различающиеся при определенном заболевании структурой провоспалительных цитокинов. При этом для всех позитивно ассоциированных с ИБС, РМЖ, РА, СД2 комплексных генотипов характерно наличие противовоспалительных цитокинов IL4-590CC, IL10-592АА, IL10-1082AA, VEGF+936CC , ММР9-1562СС, а в протективных комплексных генотипах — генотипов IL4-590CT, IL10-592CC, IL10-1082AG,, ММР9-1562СТ.

6. Комплексные генотипы, в отличие от единичных полиморфизмов, обладают значительно более высокими значениями отношений шансов развития заболевания, что позволяет использовать данные результаты дополнительно при скрининговых обследованиях с целью выделения групп повышенного риска к развитию ИБС, СД 2, РМЖ, РА.

7. Ряд моногенотипов анализируемых генов индивидуально ассоциированы с сывороточным уровнем продукции кардиомаркеров. С высоким уровнем продукции FNO-альфа ассоциирован VEGF-2578 СС генотип, CD40 - IL2-330 TG генотип, IL8 - IL6-174СС генотип; с низким уровнем продукции TNFa - IL10-1082GG генотип, IL8 - IL6-174GC и VEGF-2578 CA генотипы. Комплексные генотипы регуляторных регионов анализируемых генов избирательно ассоциированы с высокими/низкими сывороточными уровнями кардиологических маркеров, с гораздо большим значением отношений шансов и уровнем достоверности различий, что показано на примере пациентов с атеросклерозом, верифицированном ангиографически.

8. При СД2 выраженные отличия высокого/низкого сывороточного уровня 7 лабораторных показателей: инсулин, лептин, резистин, фактор некроза опухолей-альфа (TNFa), интерлейкин-6, ингибитор 1 типа активатора плазминогена (PAI-1), глюкозозависимый пептид (GIP) ассоциированы с комплексными генотипами, в составе которых полиморфные позиции генов TNF- 863,-308,-238; IL1B-31; 1L6-174; IL10-592;VEGF-2578.

9. У пациенток с РА моногенотип VEGF-2578AA ассоциирован с низким уровнем СРБ. Ряд комплексных генотипов при РА ассоциированы с уровнем продукции РФ и СРБ. С высоким уровнем продукции РФ ассоциированы комплексы, в состав которых входит IL6-174 GG генотип,

36

частота которого выше в группе серопозитивных пациентов с РА. С низкими уровнями РФ ассоциирован как в виде моногенотипа, так и в составе комплексных генотипов IL 4-590 СС, частота которого выше у серонегативных пациентов с РА в анализируемой группе. Это свидетельствует о том, что СРБ и РФ как лабораторные признаки, интегрально отражающие характер течения РА у отдельных индивидов, ассоциированы с генетическими особенностями пациентов, а выявленные генетические комплексы могут рассматриваться в качестве дополнительных показателей риска и характера развития РА.

10. Наряду с индивидуальными для определенного заболевания комплексными генотипами, выявлены общие комплексные генотипы предрасположенности/резистентности одновременно к нескольким анализируемым МФЗ, что свидетельствует об их синтропности по отношению к анализируемым заболеваниям.

11. Все комплексные генотипы, позитивно ассоциированные с какой-либо одной анализируемой патологией, могут быть только позитивно ассоциированы с другой патологией в женских группах. Аналогичная закономерность прослеживается и при анализе протективных генотипов в этих группах обследованных лиц. Это свидетельствует о том, что такие варианты генетических сетей отображают единый вектор иммунного ответа.

Статьи по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК.

1. Коненков В.И., Голованова О.В., Дортман В.В., Шевченко A.B., Карпова A.B. Полиморфизм гена TNFA и неравновесное сцепление TNFA и HLA-генов II класса (DRB1, DQA1 и DQB1) в популяции сибирских европеоидов. // Иммунология,- 2008.- N1.- с.6-10.

2. Голованова О.В., Коненков В.И., Шевченко A.B., Коломейчук М.Ю., Завьялова М.В., Вторушина C.B. Полиморфизм гена TNFA(C-863A, G-308А, G-238A) у больных раком молочной железы. // Иммунология,- 2009.-N2,- с.92-94.

3. Голованова О.В., Коненков В.И., Шевченко A.B., Смольникова М.В. Частоты аллелей генов DRBI, DQAI, DQBI, и TNFA у пришлого населения Западной Сибири. // Генетика.- 2009,- Т.45(8).- с. 1118-1124.

4. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коломейчук М.Ю., Коненков В.И., Гарбуков Е.Ю., Стахеева М.Н. Полиморфизм промоторного региона генов IL-4, IL-6, IL-10 у пациенток с раком молочной железы. // Медицинская иммунология,- 2009,- Т.11(1).- с.21-28.

5. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И., Воевода М.И., Максимова В.Н., Толкачева О.М. Анализ взаимосвязи полиморфизма гена IL6(-174 G/C) и классических факторов риска у пациентов с острым

инфарктом миокарда в анамнезе. // Медицинская иммунология.- 2009.-Т.11(6).- с.557-566.

6. Коненков В.И., Голованова О.В., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Зонова Е.В., Королев М.А., Леонова Ю.Б., Халайджи H.A., Лапсина С.А. Распределение аллельных вариантов промоторных участков генов цитокинов и гена фактора роста сосудистого эндотелия среди здоровых людей и пациентов с ревматоидным артритом в популяции европеоидного населения России. // Вестник РАМН,- 2010,- N9,- с.9-14.

7. Коненков В.И., Зонова Е.В., Королев М.А., Леонова Ю.Б., Шевченко A.B., Голованова О.В., Прокофьев В.Ф. Фармакогенетические критерии эффективности базисной противовоспалительной терапии ревматоидного артрита. // Терапевтический архив.- 2010.- N12,- С.56-61.

8. Коненков В.И., Зонова Е.В., Леонова Ю.Б., Королев М.А., Прокофьев В.Ф., Голованова О.В., Шевченко A.B. Возможности использования генотипирования цитокинов с регулирующей воспаление активностью в качестве биологических маркеров прогноза эффективности терапии ревматоидного артрита. // Научно-практическая ревматология,- 2010.- N5.-с. 19-26.

9. Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Голованова О.В., Зонова Е.В., Королев М.А., Леонова Ю.Б. Комплексный анализ полиморфизма в промоторных участках генов цитокинов IL-IB Т31-С, IL-6 G-174C, TNFA G-238A, TNFA G-308A, TNFA С-863А, IL-4 С-590Т и IL-10 С592-А в патогенезе эффекта от лечения ревматоидного артрита. // Медицинская иммунология.- 2010.- Т. 12(4-5).- с.361-374.

10. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И. Особенности полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов IL1, IL4, IL5, IL6, ILIO и TNFa у европеоидного населения Западной Сибири. // Иммунология,- 2010,- Т.31(4).- с. 176-181.

11. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И., Воевода М.И., Максимов В.Н. Полиморфизм промоторного региона гена IL-Ib у пациентов с инфарктом миокарда в анамнезе. // Медицинская иммунология,- 2010,- Т. 12(3).- с.219-226.

12. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И., Толкачева О.М., Ромащенко А.Г., Максимов В.Н., Воевода М.И. Анализ полиморфизма трех позиций промоторного региона гена TNF-a у пациентов с ишемической болезнью сердца, нестабильной стенокардией и инфарктом миокарда. // Кардиология,- 2010,- Т.50 (2).- с.9-14.

13. Шевченко A.B., Голованова О.В., Коненков В.И., Толкачева О.М., Максимов В.Н., Воевода М.И., Ромащенко А.Г. Анализ полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ-2 и -9 у пациентов с ишемической болезнью сердца. // Терапевтический архив.- 2010.- Т.82(1).- с.31-34.

14. Коненков В.И., Шевченко A.B., Королев М.А., Лапсина С.А., Зонова Е.В., Прокофьев В.Ф., Орлов Н.Б., Голованова О.В., Королева Е.А Комплексный анализ клинической значимости выявления аллельных вариантов генов

цитокинов illb, il6, illO, tnfa и фактора роста vegf в качестве генетических факторов риска развития остеопороза при сахарном диабете 2 типа.//Остеопороз и остеопатии. 2010. № 3. С. 5-12.

15.Благодатских А.Е., Голованова О.В., Шевченко A.B., Коненков В.И., Завьялова М.В., Вторушин C.B., Воевода М.И. Функциональный полиморфизм гена ИЛ-10 при раке молочной железы. // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина.- 2011.- Т.9(4).- с. 161-166.

16.Коненков В.И., Повещенко О.В., Ким И.И., Покушалов Е.А., Романов А.Б., Гульева H.A., Бернвальд В.В., Шевченко A.B., Голованова О.В., Янкайте Е.В., Повещенко А.Ф., Караськов A.M. Влияние G-CSF на проангиогенные свойства мобилизованных клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия,- 2011.- Т.6(3).- с.71-75.

П.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Голованова О.В. Полиморфизм генов цитокинов как один из факторов демографической структуры европеоидного населения Сибири. // Иммунология.- 2011,- N2.-с.60-65.

18.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Воевода М.И. Полиморфизм генов белков - регуляторов воспаления, при атеросклерозе, осложненным развитием острого инфаркта миокарда. // Атеросклероз.-2011,- Т.7(1).- с.5-18.

19.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Голованова О.В. Сравнительная генетика промоторов генов цитокинов европеоидного населения России // Медицинская иммунология.- 2011,- Т.13(4-5).- с.539-540.

20.Шевченко A.B., Коненков В.И., Голованова О.В., Благодатских А.Е., Гарбуков Е.Ю., Стахеева М.Н., Полиморфизм гена VEGFA (С-2578А, С+936Т) у пациенток с раком молочной железы. // Медицинская иммунология,- 2012,- Т.14(1-2).- с.87-94.

21.Коненков В.И., Королев М.А., Шевченко A.B., Лапсина С.А., Королева Е.А., Зонова Е.В., Прокофьев В.Ф. Полиморфизм генов цитокинов при сахарном диабете 2 типа у женщин России европеоидного происхождения. // Терапевтический архив,- 2012,- N10.- с.14-22.

22.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Климонтов В.В., Королев М.А., Фазуллина О.Н., Лапсина С.А., Королева Е.Г. Ассоциация вариантов гена фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и генов цитокинов (IL-1В, IL4, IL8, ILIO, TNFA) с сахарным диабетом 2 типа у женщин. // Сахарный диабет.- 2012.- N3.- с.4-10.

23.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Климонтов В.В., Королев М.А., Фазуллина О.Н., Лапсина С.А., Королева Е.А. Генетические факторы индукции нарушений регуляции ангиогенеза при сахарном диабете 2 типа//Медицинская иммунология,- 2012,- Т.14(6).- с.489-500.

24.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Максимов В.Н. Комплекс генотипов цитокинов как генетический фактор риска развития инфаркта

миокарда у мужчин европеоидного населения России. // Кардиология. -2012,- N7,- с.22-29.

25.Шевченко A.B., Коненков В.И. Функциональный полиморфизм генов семейства VEGF. // Цитокины и воспаление.- 2012,- Т.11(4).- с.14-20.

26. Шевченко A.B., Коненков В.И., Гарбуков Е.Ю., Стахеева М.Н. Полиморфизм регуляторных регионов гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF А у пациентов с раком молочной железы с наследственной отягощенностью. // Вопросы онкологии.- 2012,- Т.58(6).- с.773-776.

27.Коненков В.И., Климонтов В.В., Прокофьев В.Ф., Фазуллина О.Н., Шевченко A.B. Комбинации генотипов цитокинов и матриксных металлопротеиназ, ассоциированные с ретинопатией, у женщин с сахарным диабетом 2-го типа. // Офтальмохирургия,- 2013.- N4.- с.72-77.

28.Коненков В.И., Королев М.А., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Убшаева Ю.Б., Соколова О.С., Летягина Е.А., Дюбанова Г.А. Генетические факторы нарушений регуляции ангиогенеза у женщин с ревматоидным артритом. // Терапевтический архив,- 2013.- N5.- с.16-23.

29.Коненков В.И., Королев М.А., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Убшаева Ю.Б. Полиморфизм гена фактора роста сосудистого эндотелия ФРСЭ-2578 А/С в комбинации с полиморфизмами генов цитокинов среди пациентов с ревматоидным артритом. // Научно-практическая ревматология,- 2013.-N3.- с.240-245.

30.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B. Прогностическая значимость полиморфизма генов-регуляторов лимфангиогенеза в оценке состояния здоровья человека. // Бюллетень СО РАМН.- 2013.- Т.33(6).-с.51-59.

31.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Чернявский A.M., Караськов A.M. Возрастная и половая динамика структуры цитокиновых генных сетей населения России. // Вестник РАМН.- 2013.- N9.- с.15-21.

32.Коненков В.И., Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Королев М.А., Климонтов В.В., Чердынцева Н.В., Покушалов Е.А., Караськов A.M. Цитокиновые генные сети в персонализированном прогнозе состояния здоровья человека и формирования групп высокого риска развития заболеваний для проведения профилактических мероприятий. // Профилактическая медицина,- 2013,- Т.16(4).- с.19-26.

33.Шевченко A.B., Коненков В.И., Бабышкина H.H., Савенкова О.В., Слонимская Е.М. Анализ ассоциаций полиморфизма гена VEGF-A в позициях 2578/АС и +936С/Т с разным рецепторным статусом у больных раком молочной железы. // Сибирский онкологический журнал,- 2013.- N1.-С.32-38.

34. Шевченко A.B., Коненков В.И., Караськов A.M. Полиморфизмы С-257ВА и С+936Т гена VEGF среди мужчин европеоидного происхождения с коронарными осложнениями атеросклероза. // Иммунология.- 2013.-Т.34(3).-с. 144-148.

35.Повещенко О.В., Ким И.И., Шевченко A.B., Покушалов Г.А., Романов А.Б., Бондаренко H.A., Лыков А.П., Повещенко А.Ф., Караськов A.M., Коненков В.И. Оценка уровня цитокинов, продуцируемых мононуклеарами периферической крови пациентов с хронической сердечной недостаточностью после мобилизации стволовых клеток костного мозга Г-КСФ. // Бюллетень СО РАМН,- 2014,- Т.34(4).- с.42-47.

36.Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Коненков В.И. Генная регуляция уровня матричных металлопротеиназ у пациентов с коронарным атеросклерозом. // Кардиологический вестник,-2014.- T.IX, N2.- с.86-92.

37.Шевченко A.B., Прокофьев В.Ф., Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Воевода М.И., Коненков В.И. Ассоциация полиморфизма генов воспалительных цитокинов с уровнями биохимических маркеров в сыворотке крови при коронарном атеросклерозе. // Медицинская иммунология,- 2014,- Т. 16, N4,-с.333-344.

38.Шевченко A.B., Коненков В.И., Гарбуков Е.Ю., Стахеева М.Н. Ассоциированность полиморфизма в промоторных участках генов металлопротеиназ (mmp2, mmp3, mmp9) с вариантами клинического течения рака молочной железы у женщин России// Вопросы онкологии.-2014,- т.60(5).- с. 630-635.

39.Шевченко A.B., Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Покушалов Е.А. Анализ комбинаций генотипов в полиморфных точках промоторных участков генов трех матричных металлопротеиназ (ммр) и гена фактора роста эндотелия сосудов (vegf) у пациентов, перенесших острый инфаркт миокарда// Терапевтический архив. -2014.- Т. 86(4).- С. 19-24.

40.Коненков В.И., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Покушалов Е.А., Караськов A.M. Ассоциированность комбинированных генотипов полиморфных участков генов цитокинов, фактора роста сосудистого эндотелия и металлопротеиназ с развитием инфаркта миокарда у мужчин//Российский кардиологический журнал. -2014.-Т.114(10).- С. 34-39.

41.Коненков В.И., Повещенко О.В., Прокофьев В.Ф., Шевченко A.B., Ким И.Н., Бондаренко H.A., Караськов A.M., Покушалов Е.А., Романов А.Б.Анализ информативности клинических, функциональных, лабораторных и генетических показателей оценки состояния пациентов, перенесших инфаркт миокарда, в прогнозе эффективности интрамиокардиальной аутологичной клеточной терапии хронической сердечной недостаточности// Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2015; 14(1): 23-29

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630073, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 2.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 2153. Подписано в печать 01.07.2015 г.