Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Атеросклероз: иммуногенетические и метаболические звенья патогенеза

На правах рукописи

Турмова Екатерина Павловна

АТЕРОСКЛЕРОЗ: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЗВЕНЬЯ ПАТОГЕНЕЗА (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск - 2015

Работа выполнена на кафедре физиологии человека Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

Маркелова Елена Владимировна, доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

Козлов Владимир Александрович, доктор медицинских наук, профессор, академик Российской академии медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», директор

Симбирцев Андрей Семенович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства России, директор

Гвоздснко Татьяна Александровна, доктор медицинских паук, Владивостокский филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания" Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения, директор

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится 28 мая 2015 года в 10.00 часов па заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский Государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул.Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный медицинский университет»» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан «_»_.__2015 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

Ю.С. Шишкова

1Ч)г:сии('.к л'.',

ГОСУДЛ1ч;11П IIIIA',1

Г.ИЬЛИО I I кл

:»о i:>

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Проблема атеросклероза является одной из самых актуальных в современной медицине в связи с его широкой распространенностью и выраженностью неблагоприятных исходов. Согласно статистическим расчетам, пропорция смертности в мире от сердечно-сосудистых заболеваний, среди которых ведущее место занимает атеросклероз, продолжает возрастать и к 2020 году может достигнуть 31,5% (Anakwue, R.C. Cardiovascular Disease Risk Profiling in Africa: Environmental Pollutants are not on the Agenda / R.C. Anakwue, A.C. Anakwue [electronic resource] // Cardio. Toxicol. - 2014. - Access mode: http: // link.springer.com/article/10.1007 link. springer.com/article/10.1007%2Fsl2012-013-9242). По данным Минздрава России - смертность от ССЗ составляет 57%, причем, почти 20% из этого числа умирают в трудоспособном возрасте (Кисляк, О.А. Факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний в развитии болезней, связанных с атеросклерозом / О.А. Кисляк, Н.В. Малышева, Н.Н. Чиркова // Клин, геронтология. - 2008. - Т. 14, № 3. - С. 3-11; Милютина, О.В. Роль хронического воспалительного процесса в прогрессировании атеросклероза у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких в сочетании с артериальной / О.В. Милютина, Е.Н. Чичерина // Пульмонология. -"•009. - №.3. - С. 43-47). Мультифокапьность атеросклеротического поражения проявляется разнообразной клинической симптоматикой, среди которой ишемическая болезнь сердца занимает 60%, системные поражения артерий регистрируются в 20%. Облитерирующий атеросклероз нижних конечностей, как правило, является проявлением распространенного поражения артерий и имеет высокий риск сердечно-сосудистых осложнений (Лутай, М.И. Мультифокальный атеросклероз: польза статинов / М.И. Лутай // Д1абет i сердце. - 2011. - Т. 152, № 6. - С. 40-44). В течение последних десятилетий стало ясно, что атеросклероз (АС) характеризуется комплексом эндокринных, паракринных и юкстакринных перекрестных взаимосвязей между иммунными и васкулярными клетками практически во всех тканях и органах организма, включая мозг, печень, сердце, почки, жировую ткань, надпочечники, поджелудочную железу и половые органы (Carbone, F. Cannabinoid receptor type 2 activation in atherosclerosis and acute cardiovascular diseases / F. Carbone , F. Mach , N. Vuilleumier [et al] // Curr. Med. Chem. - 2014. - Vol. 21, № 35. -P. 4046-4058).

Согласно воспалительной теории AC - основным звеном его патогенеза является иммуноопосредованное повреждение артерий с аутоиммунным компонентом (Libby, P. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis / P. Libby, P. M. Ridker, G. K. Hansson // Nature. - 2011. - Vol. 473, № 7347. - P. 317-325). Важные механизмы патогенеза AC - активация лейкоцитов, их миграция в артериальную стенку, нарушение обмена липопротеинов, пролиферация и модификация макрофагов и гладкомышечных клеток, процессы ремоделирования и тромбообразования регулируются цитокинами на всех этапах повреждения (от инициации до развития

осложнений) как у человека, так и у животных (Кетлинский, С.А. Цитокины / С.А. Кетлинский, А.С. Симбирцев. - СПб.: Фолиант, 2008. - 552 е.; Rohla, М. Metabolic syndrome, inflammation and atherothrombosis / M. Rohla, T. W. Weiss // Hamostaseologie. - 2013. - Vol. 33, № 4. - P. 283-294).

Однако до настоящего времени сохраняется противоречивость мнений в отношении роли цитокиновой регуляции в атерогенезе и взаимосвязях системы цитокинов с показателями липидного метаболизма, оксидативной активности, с маркерами деградации межклеточного матрикса и адипокинами при различной локализации и степени активности атеросклеротического процесса.

Цель исследования Выявить закономерности и особенности иммуногенетических и метаболических звеньев патогенеза при разных клинических вариантах атеросклероза и экспериментально обосновать применение амино-диоксо-тетрагидро-фтапазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus.

Задачи исследования:

1. Оценить значение изменений содержания провоспапительных (IL-ip, TNF-a, IL-6, IFN-y), противовоспалительных (IL-10, TGF-pi, TGF-P2), иммунорегуляторных цитокинов (IL-2, IL-17) и растворимых рецепторов к цитокинам (IL-2R, IL-6R, TNF-a RI и TNF-a RII) в сыворотке крови пациентов с атеросклерозом, в зависимости от его распространенности и выраженности клинических проявлений.

2. Определить роль биохимических маркеров воспаления, отражающих деградацию межклеточного матрикса (ММР-9, TIMP-1, MMP-9/TIMP-1, MMP-9/TIMP-2) и адипокинов (лептина и адипонектина) при различной локализации и клиническом течении атеросклероза.

3. Изучить полиморфизм генов: TNF-a (rsl800629), IL-6 (rsl800795), TGFB1 (rs 1800469), IL-10 (rsl 800896) и PTPN22 (rs2476601) при атеросклерозе, в зависимости от его локализации и клинических проявлений.

4. В эксперименте на животных создать модель атеросклероза, провести мониторинг липидного спектра, показателей оксидантной и антиоксидантной активности, уровня оппозитных цитокинов (IL-ip, TNF-a, IFN-y, IL-10) и ММР-9 в крови и в стенке артерий.

5. На основе корреляционных взаимоотношений между лабораторными и инструментальными параметрами установить патогенетические механизмы атерогенеза в клинике и эксперименте.

6. Экспериментально обосновать применение: амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата (галавита) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (митилана) для коррекции механизмов иммуноопосредованного воспаления при атеросклерозе.

Методология и методы исследования

1) Клинический раздел.

Были обследованы 260 пациентов с атеросклерозом, из них 140 человек с атеросклеротическим поражением коронарных артерий, ишемической болезнью сердца (АКА (ИБС)) - находились на стационарном лечении в кардиохирургическом отделении ГБУЗ Приморской Краевой клинической больницы № 1 и 120 человек — с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей (ОАНК), без выраженных клинических проявлений ИБС -в отделении сосудистой хирургии Владивостокской клинической больницы № 2. Среди обследованных, мужчин было 220 чел. (84,6%) и женщин - 40 чел. (15,4%). Возраст обследуемых составлял 57,2 ±2,7 лет (от 45 до 89 лет). Группу контроля составляли 50 практически здоровых доноров (30-50 лет), сопоставимых по полу, без клинических проявлений атеросклероза, острых и хронических заболеваний в фазе обострения, не курящих, не употребляющих каких-либо лекарственных препаратов, не злоупотребляющих алкоголем.

2) Экспериментальный раздел.

Эксперимент проводился на 55 белых крысах самцах линии Wistaг, массой 250-350 грамм, в течение шести месяцев, при строгом соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных ^БРА) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Все животные были разделены на 5 групп:

- 1-я группа - 15 животных находились на жировой диете (моделирование гиперлипидемии + гипотиреоз)

- 2-я группа - 25 животных - (комплексная модель: гиперлипидемия, гипотиреоз и артериальная гипертензия);

- 3 группа - 15 животных (здоровые крысы), питались обычным кормом в соответствии со стандартами рациона крысы.

Через 2, 4 и 6 месяцев наблюдения по 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации. В конце опыта, оставшимся 10 животным из 2-ой группы производилась патогенетическая терапия: введение амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата (галавита) - (4 группа - 5 крыс) и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии СгепотуШш grayanus (митилана) - (5 группа - 5 крыс), с целью оценки их иммуно-патогенетической эффективности в комплексной модели атеросклероза. По окончании экспериментальной терапии производилось выведение животных из эксперимента.

Клиническое и экспериментальное исследование одобрено междисциплинарным этическим комитетом ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России (протокол № 2, от 06.02.2013 г.).

Для решения поставленных цели и задач проводилось комплексное (клинико-иммунологическое, биохимическое, функциональное) обследование

пациентов с атеросклерозом. Наблюдение за животными включало: оценку их состояния, поведения, двигательной активности, измерение артериального давления.

Метод ИФА использовался для определения цитокинов, рецепторов к цитокинам, маркеров деградации внеклеточного матрикса, адипокинов - у пациентов с атеросклерозом, и для определения цитокинов, ММР-9 - у животных. Оценку состояния сосудов (аорты и бедренных артерий) крыс проводили методом магниторезонансной томографии, гистохимическим и гистологическим методами. Морфологическая структура печени животных оценивалась с помощью гистологического метода. Для определения показателей общей оксидантной и антиоксидантной активности сыворотки крови и артериальной стенки животных использовался спектрофотометрический метод. Оценку общего холестерина крови обследуемых пациентов и липидного профиля крови животных проводили с использованием колориметрического метода.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достаточное количество наблюдений, использование

сертифицированного оборудования и адекватных методов статистической обработки материала с помощью программы «Stat Plus 2010», регистрационный номер "3-blWdC-7k32t обеспечило достоверность сформулированных положений, выводов и рекомендаций.

Основные положения диссертации представлены на 13 научно-практических конференциях регионального, всероссийского и международного уровней: 14 Интернациональном конгрессе по иммунологии (Япония (Kobe), 2010); VIII региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунопатологии» (Владивосток, 2010); Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению (Москва, 2010); XI региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011); IX Региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии» (Владивосток, 2011); VI Научно-практической конференции «Фундаментальная наука в медицине» (Владивосток, 2011); Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология - междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012); XII Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2013); XII региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики» (Владивосток, 2014) и научно-практическом обществе терапевтов Приморского края (Владивосток, 2014).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, выразилось в проведении научно-информационного поиска, анализе и обобщении данных литературы по профилю диссертационного исследования. Соискатель принимал непосредственное участие в ведении пациентов, страдающих различными клиническими проявлениями атеросклероза на стационарном этапе диагностики и лечения, контролировал выполнение всех исследований, на которых базируются заключение и выводы диссертации. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации.

Положения, выносимые на защиту

1. При атеросклерозе зарегистрированы различия системного содержания цитокинов, адипокинов и показателей деградации межклеточного матрикса, зависящие от распространенности и выраженности клинических проявлений заболевания. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей - иммунный ответ реализуется за счет увеличения функциональной активности Th-1 лимфоцитов, при атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца - клеток врожденного иммунитета и Th-17.

2. Мультифакторность генетической регуляции атерогенеза дополнена выявленной ассоциацией аллельных вариантов иммунорегуляторных генов (Т/Т - TGF-p, (rs 1800469) (-509 С/Т)), G/G и СС - IL-6 (rsl800795) (-174G/C), A/G и А/А - TNF-a (rsl 800629) (-308G/A), G/A и G/G - PTPN22 (rs 2476601)) с механизмами развития заболевания: дисрегуляцией воспаления и нарушением обмена холестерина, что позволяет делать долгосрочный прогноз течения и распространения атеросклеротического процесса, проводить адекватные меры его профилактики и терапии.

3. Взаимосвязи между показателями цитокинов с уровнем общего холестерина крови, адипокинами и маркерами деградации межклеточного матрикса у пациентов с атеросклерозом характеризуют иммуноопосредованность атерогенного повреждения артерий. Высокое содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 и прямая корреляция MMP-9/TIMP-2 с ММР-9 отражает усиление продукции желатиназы В и ее преимущественное связывание с тканевым ингибитором 2 при атерогенном ремоделировании сосудистой стенки.

4. Разработанная экспериментальная модель атеросклероза позволяет проследить динамику иммуноопосредованного атерогенного поражения сосудов с учетом локализации и распространенности патологического процесса, может служить основой для дальнейшего изучения патогенеза заболевания и оценки эффективности средств его профилактики и терапии. Экспериментально обосновано применение амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus в комплексной терапии атеросклероза.

Научная новизна

Выявлены закономерности иммунных механизмов патогенеза атеросклероза на основе комплексного исследования системных цитокиновых и метаболических показателей и оценки их взаимосвязи. При атеросклерозе установлены: смешанный тип иммунного ответа (Thl/Th2) с дисбалансом продукции цитокинов про- и противовоспалительного профиля (увеличение IL-6, TGF-P2, растворимых рецепторов к цитокинам: TNF-a RI, TNF-a RII, IL-2R и снижение уровня IL-2 и IL-10 в сыворотке крови); активация процессов деградации межклеточного матрикса с усилением связывания желатиназы В ее тканевым ингибитором 2 типа; угнетение выработки адипонектина клетками жировой ткани.

Определены особенности течения воспалительного процесса в зависимости от локализации и выраженности клинических проявлений атеросклероза. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей определена поляризация иммунного ответа в сторону Thl (увеличение продукции провоспалительных цитокинов: IFN-y, IL-6, TNF-a, TNF-a RII и их высокая патогенетическая значимость, подтвержденная методом факторного анализа).

При атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца зарегистрировано превалирование функциональной активности клеток врожденного иммунитета, Th-17 и стимуляция продукции лептина адипоцитами (увеличение содержания в сыворотке крови IL-1Р, IL-17 и лептина и высокая значимость их факторной нагрузки).

Установлена связь развития атеросклероза и особенностей его течения с полиморфизмом иммунорегуляторных генов. Выявлена высокая частота встречаемости гомозиготного Т варианта гена TGFpi (-509 СУГ) (rs 1800469), что позволяет считать этот генотип дополнительным маркером заболевания. Впервые установлено, что активность системного воспаления при атеросклерозе -гиперпродукция цитокинов провоспалительного профиля: IL-6, TNF-a, IFN^y, IL-2 ассоциируется с носительством геномных вариантов: G/G и С/С гена IL-6 (-174G/Q, A/G варианта гена TNF-a (-308G/A), G/A варианта гена PTPN22 (rs 2476601), а гиперхолестеринемия > 6,2 ммоль/л - с генотипами: G/G - гена IL-6 (-174G/QT/T- гена TGF-pi (-509 С/Т), A/G и А/А - гена TNF-a (-308G/A)).

Выявлено влияние полиморфизма иммунорегуляторных генов на особенности иммунного ответа у пациентов с различной распространенностью и локализацией атеросклероза. При атеросклерозе с преимущественным поражением артерий нижних конечностей - С/Т вариант TGFpi (-509 С/Т) сопряжен с высоким уровнем TGF-P 1, A/G вариант гена TNF-a (-308G/A) - с увеличением системного содержания TNF-a, G/G вариант гена PTPN22 (rs 2476601)) - с высоким уровнем IL-17 в сыворотке крови. При атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца - G/A вариант гена PTPN22 (G/A) ассоциирован с высоким содержанием IFN-y, G/G вариант гена PTPN22 (G/A) - с высокой концентрацией IL-ip, IL-6, IL-17 в сыворотке крови.

Для изучения иммунных механизмов развития атеросклероза и оценки эффективности средств его профилактики и терапии - разработан способ моделирования атерогенного повреждения артерий, путем длительного сочетанного воздействия на организм крыс гиперлипидемии, угнетения обмена веществ и артериальной гипертензии, на основе которого построена концептуальная модель патогенеза заболевания. В динамике сочетанного воздействия на организм крыс факторов риска атеросклероза определены различия в локальной продукции цитокинов (IL-ip, IFN-y, TNF-a и IL-10) в зависимости от морфологического строения сосудов (аорта, бедренные артерии).

Установлена патогенетическая эффективность применения амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus, заключающаяся: в нормализации показателей липидного обмена, оксидативной активности, модуляции локальной и системной продукции цитокинов, восстановлении функциональных и структурных свойств артериальной стенки и печени при воздействии на организм животных основных факторов риска атеросклероза.

Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическая значимость работы заключается в том, что выявлены новые закономерности и установлены особенности иммуногенетических и метаболических звеньев патогенеза при разных клинических вариантах атеросклероза. Зарегистрированы различия системного содержания цитокинов, адипокинов и показателей деградации межклеточного матрикса в зависимости от распространенности и выраженности атеросклероза, что дополняет представление о его патогенезе. Экспериментально разработана концептуальная модель патогенеза атеросклероза, в которой в динамике определены иммуноопосредованные механизмы повреждения аорты и бедренных артерий при сочетанном воздействии на организм животных факторов риска заболевания (гиперлипидемии, артериальной гипертензии и угнетения обмена веществ).

Практическая значимость работы заключается в следующем:

- для установления предрасположенности к атеросклерозу рекомендовано определять Т/Т вариант гена TGF-pi (-509 С/Т). Выявление носительства генотипов: G/G и С/С - гомозиготных вариантов гена IL-6 (-174G/C), A/G и А/А

- вариантов гена TNF-a (-308G/A), Т/Т - варианта TGF-pi (-509 С/Т), G/A варианта гена PTPN22 (rs 2476601) может быть использовано для прогнозирования характера течения и прогрессирования атеросклероза;

У пациентов с ишемической болезнью сердца в качестве дополнительных маркеров нестабильного течения стенокардии рекомендовано использовать содержание в сыворотке крови IL-6 > 5 пг/мл и лептина > 4 нг/мл;

- для изучения патогенеза атеросклероза и оценки эффективности средств его профилактики и терапии целесообразно использовать экспериментальную модель на основе сочетанного воздействия на организм животных гиперлипидемии, артериальной гипертензии и угнетения обмена веществ

(«Способ моделирования атеросклероза»: пат. 2500041, Российская Федерация; мпк: С09В; С09В23/28);

- для повышения качества терапии атеросклероза проведен этап исследования применения амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии СгепотуШия ауапиБ. Экспериментально доказана эффективность амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и 1,6-а-О-глюкана, заключающаяся в нормализации свободнорадикальных процессов, липидного обмена, коррекции иммунной дисфункции, восстановлении функциональных и структурных свойств артериальной стенки и печени, что подтверждает целесообразность проведения дальнейших этапов исследования по применению этих средств у пациентов с атеросклерозом в комплексном лечении заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику Материалы диссертации внедрены в работу терапевтического центра и консультативной поликлиники Медицинского центра Дальневосточного федерального университета; кардиологического отделения краевой клинической больницы № 1 г. Хабаровска им. профессора С.И. Сергеева Министерства здравоохранения Хабаровского края; в лекционный курс кафедр: физиологии человека; клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии; госпитальной терапии и фтизиопульмонологии; терапии, функциональной и ультразвуковой диагностики ФПК и ППС; патологической анатомии, судебной медицины и права ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России и кафедры клинической лабораторной диагностики Краевого государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Института повышения квалификации специалистов здравоохранения» Хабаровского края.

Публикации

Соискатель имеет 65 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 28 научных работ общим объёмом 5,6 печатных листов, в том числе 13 статей - в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, а также 13 работ опубликованы в виде статей и тезисов в материалах региональных, всероссийских и международных конференций и симпозиумов (из них 1 работа

- в зарубежных и 1 - в электронных научных изданиях). Соискателю выдан 1 патент на изобретение, опубликовано 1 информационное письмо.

Объем и структура диссертации Работа изложена на 295 страницах текста, проиллюстрирована 33 таблицами, 63 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования и раздела, содержащего результаты собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций практическому здравоохранению и списка использованной литературы, содержащего 461 источник (их них - 160 источников отечественных и 301 - зарубежных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Наблюдение за пациентами с атеросклерозом проводилось в кардиохирургическом отделении ГБУЗ Приморской Краевой клинической больницы № 1 (главный врач Кузьмин A.B.) и в отделении сосудистой хирургии Владивостокской клинической больницы № 2 г. Владивостока (главный врач Глушко В.В.) за период с 2009 - 2013 годы. Основные иммунологические исследования выполнены на базе научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России под руководством заведующей кафедрой физиологии человека, доктора медицинских наук, профессора Е.В. Маркеловой, а также в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова» Дальневосточного отделения РАН (заведующий отделом -доктор химических наук, профессор П.А. Лукьянов).

При выполнении настоящей работы был проведен клинико-иммунологический мониторинг состояния 260 пациентов с АС. Все обследуемые пациенты были разделены на 2 основные группы:

1) Пациенты с атеросклеротическим поражением коронарных артерий с выраженным клиническим проявлением ишемической болезни сердца (АКА (ИБС)) -140 человек.

2) Пациенты с преимущественным поражением сосудов нижних конечностей (облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей (ОАНК), без выраженных клинических проявлений ИБС- 120 человек.

Забор крови у пациентов с АКА (ИБС) осуществлялся за сутки перед проведением операции аортокоронарного шунтирования или стентирования коронарных артерий в отделении кардиохирургии, у пациентов с ОАНК - при поступлении в отделение сосудистой хирургии.

Контрольную группу составляли 50 практически здоровых доноров (3050 лет), сопоставимых по полу, без клинических проявлений артериальной недостаточности, острых и хронических заболеваний в фазе обострения, не курящих, не употребляющих каких-либо лекарственных препаратов, не злоупотребляющих алкоголем.

При распределении пациентов с АС по возрасту, согласно классификации ВОЗ, зарегистрировано, что в возрастной группе 45-59 лет (средний возраст) было 109 человек (41,9 %), из них 95 мужчин (36,5%) и 14 женщин (5,4%), от 60 до 74 лет (пожилые) - 107 чел. (41,2 %), из них мужчин - 85 (32,7%) и 22 женщины (8,5 %), возрастную группу старческого возраста (75-89 лет) составляли 44 чел. (16,9%), среди них - 40 мужчин (15,4 %) и 4 женщины (1,5%). В группах пациентов с АКА (ИБС) и с ОАНК возраст и пол пациентов был практически равнозначным. Обследованные пациенты с АКА (ИБС) были разделены на подгруппы, соответственно наличию аритмии, инфаркта миокарда (ИМ) в анамнезе, временному интервалу после ИМ на момент обследования, течению стенокардии, функциональному классу СС, степени хронической сердечной недостаточности (ХСН). Разделение пациентов с ОАНК осуществлялось согласно стадии ишемии нижних конечностей (НК) по

классификации Fontaine-Покровского, уровню артериальной окклюзии, наличию в течение заболевания синдрома Лериша.

Из всей кагорты обследованнных, в зависимости от содержания общего холестерина (ХС) крови были сформированы 3 подгруппы: с уровнем общего ХС менее 5,0 ммоль/л; от 5,1 до 6,1 ммоль/л и более 6,2 ммоль/л. По результатам биохимического анализа крови было установлено, что у 134 (51,5 %) пациентов с АС уровень общего ХС крови был менее 5,0 ммоль/л, у 54 пациентов (20,8 %) - его концентрация была от 5,1 ммоль/л до 6,1 ммоль/л), содержание более 6,2 ммоль/л определялось - у 72 человек (27,7%). В группе с АКА (ИБС) 57,8% пациентов были с уровнем общего ХС - менее 5,0 ммоль /л, у 25% концентрация общего ХС была от 5,1-6,1 ммоль/л, у 17, 2% -> 6,2 ммоль/л); у пациентов с ОАНК - (у 44%- менее 5,0 ммоль /л, у 16%-от 5,16,1 ммоль /л, у 40% - > 6,2 ммоль/л).

Определение цитокинов: IL-lß, IL-6, IFN-y, IL-2, TNF-a, IL-17, IL-10, TGF-ßl, TGF-P2; рецепторов к цитокинам: (IL-2R, IL-6R, TNF-aRI, TNF-aRII); металлопротеиназы-9 (MMP-9); ее тканевого ингибитора 1 типа - TIMPI; комплексов MMP-9/TIMP1, MMP-9/TIMP2; адипокинов (адипонектина и лептина) проводили методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, согласно прилагаемых инструкций с использованием специфических реактивов фирмы "R&D Diagnostics Inc." (USA).

Определение полиморфных локусов генов: TNF-a (rs 1800629), IL-6 (rs 1800795), TGFB1 (rs 1800469), IL-10 (rs 1800896) и PTPN22 (rs2476601) выполняли методом ПЦР. ДНК выделяли из венозной крови, в реальном времени - амплификатор -CFX96, фирмы «Bio-Rad», США. Генотипирование проводили в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, группа фармакогеномики.

Экспериментальное исследование: 55 белых крыс самцов линии Wistar, массой 250-350 грамм, были разделены на 5 групп:

- 1-я группа состояла из 15 животных, которым проводилось моделирование гиперлипидемии (ГЛ) + гипотиреоз;

- 2-я группа из 25 животных - подверглись воздействию факторов риска, таких как: ГЛ, гипотиреоз и артериальная гипертензия (комплексная модель);

- 3 группа - 15 животных (здоровые крысы), питались обычным кормом в соответствии со стандартами рациона крысы.

В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных 86/609. Эксперимент проводился в течение шести месяцев, при соблюдении требований Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению, уходу за подопытными животными и выводу их из эксперимента с последующей утилизацией. Через 2, 4 и 6 месяцев наблюдения по 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом, путем декапитации.

В конце опыта 10 животным из 2-ой группы производилось патогенетическая терапия - 5 крысам (4 группа) - осуществлялось введение

амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата в количестве - 1 мг на 1 кг веса, по схеме: 1 инъекция в день, в течение 10 дней, затем 1 инъекция в 3-е суток. Общий курс лечения крыс составлял - 15 инъекций и 5 крыс (5 группа) получали 1,4; 1,6-а-О-глюкан - per os, в количестве - 10 мг/кг, через день, в течение 1 месяца. По окончании экспериментальной терапии производилось выведение животных из эксперимента. Материалом для исследования служили: сыворотка крови, фрагменты аорты, бедренных артерий и печени крыс.

Моделирование ГЛ и гипотиреоза проводили по методике К.А. Мещерской и Н.П. Королевой в модификации. Диета заключалась в добавлении в корм животным порошка холестерина в количестве 1%, 10% маргарина, мерказолила - 10 мг/кг массы тела, и витамина D - 2,5 ME на 1 кг массы тела крысы (Мещерская, К.А. О методике отбора средств, влияющих на обмен холестерина / К.А. Мещерская, Г.П. Бородина, Н.П. Королева // Элеутерококк и другие адаптогены из дальневосточных растений / Под ред. К. А. Мещерской. - Владивосток, 1966. - С. 289-294). Кормление животных осуществляли на протяжении 6 месяцев (180 суток).

Моделирование АГ проводилось по методике F. Helle (2006), в модификации: наложение лигатуры на почечную ножку левой почки нерассасывающимся шовным материалом и прошивание верхнего полюса правой почки, оставляя 2/3 органа (Helle, F. Angiotensin Il-induced calcium signaling in the afferent arteriole from rats with two-kidney, one clip hypertension / F. Helle, О. В. Vagnes, В. M. Wersen // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 2006. - Vol. 291, №1. - P. 140-147). Артериальная гипертензия развивалась в течение 6 недель (реноваскуляторный и ренопривный механизмы развития АГ). Модель комплексного воздействия факторов риска: ГЛ, замедления метаболизма (гипотиреоз) и АГ заключалась в следующем: за 15 дней перед началом кормления аналогичным атерогенным рационом производится операция моделирования АГ по выше представленной методике.

Определение артериального давления производили на хвостовой артерии крыс с помощью анализатора MLU/ 4С 501 (Med Lab КНР). MPT диагностика артериального русла животных выполнена на томографе для экспериментальных исследований «Pharma Scan US 70/16» (Bruker, Германия).

Гистологическое исследование пораженных артерий (аорты и бедренных артерий) и ткани печени осуществлялось путем фиксации фрагментов в 10% нейтральном формалине с дальнейшей заливкой в парафин. Использовали следующие методы окраски препаратов: гематоксилин и эозин, судан-4 (метод Окамото). Описание микропрепаратов проводилось на микроскопе Olympus ВХ 41. Снимки осуществляли с использованием электронной камеры 01утривДР 12, при постоянном увеличении на 100 и на 400. Содержание NADPH-диафоразы определяли гистохимическим методом по стандартной прописи Hope, Vincent (1989).

Определение уровня цитокинов: Rat (IL-lß, IFN-y, TNF-a, IL-10) и металлопротеиназы-9 Rat (MMP-9) - проводили в сыворотке крови животных и

ткани пораженных и непораженных артерий. Для анализа использовали специфические реактивы фирмы "R&D Diagnostics Inc." (USA).

Определение липидного спектра (содержание общего холестерина (ОХ); ТГ; холестерина ЛПНП, ЛПВП) в сыворотке крови животных проводили с помощью стандартного колориметрического метода с использованием реагентов «Ольвекс диагностикум» (Россия). Оценку общей оксидантной (ООА) и общей антиоксидантной (АОА) активности сыворотки крови и фрагментов сосудов (аорты и бедренной артерии) крыс проводили спектрофотометрическим методом, разработанным в лаборатории химии неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН с использованием индикатора - пигмента морского ежа Scaphechinus mirabilis - гистохрома (Способ оценки общего оксидантного статуса организма: пат. 2407450, Российская Федерация; мпк: А61В10/00; G01N33/52 /Лукьянов П.А., Потапов В.Н.., Лупач Н.М. [и др,]; заявитель и патентообладатель Владив. гос. мед.ун-т, Тихоок. инст. биоорг. химии ДВО РАН; заяв. 04.08.2009; опубл. Бюл. сибирской медицины. - 2007. -№4, C.3I-36).

Для суждения о дисбалансе антиоксидантной и оксидантной систем определялся оксидантный индекс (ОИ). Формула расчета: ОН = ООА/АОА.

Для статистической обработки полученных данных использовали программу «Stat Plus 2010», регистрационный номер "3-blWdC-7k32t". Результаты представляли в виде медианы, верхнего и нижнего квартилей. Сравнение средних значений в выборках осуществляли с помощью непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни. Для изучения взаимосвязей между признаками использовали метод ранговой корреляции по Спирмену, факторный анализ (определение факторной нагрузки, метод главных компонент), критерий %2, ROC - анализ. Для определения риска заболевания или риска развития определенных клинических проявлений АС - вычисляли отношение шансов (ОШ) с доверительным интервалом=95%, достоверность различий (р) в распределении частот генотипов между группами оценивали с помощью критерия х2-

Результаты исследования и их обсуждение

У пациентов с АС установлен дисбаланс цитокиновой регуляции: определялось увеличение уровня в сыворотке крови IL-6 (в 3,2 раза), меньше нарастало содержание TGF-p2 и растворимых рецепторов к цитокинам: TNF-aRI, TNF-aR II, IL-2R, отмечалось снижение концентрации уровня IL-2 и IL-10 (в 2,7-3 раза) по сравнению с контролем (р<0,05) (рисунок 1). Изменение содержания других исследуемых цитокинов характеризовалось тенденцией к повышению без статистически значимых отличий. Увеличение содержания растворимых рецепторов к TNF-alI типа представляет собой механизм компенсации, заключающийся в связывании провоспалительного цитокина с последующим угнетением его биологической активности (Назаров, П.Г. Реактанты острой фазы / П.Г. Назаров. - СПб: Наука, 2001. - 423 е.). Высокий уровень IL-6 при АС отражает провоспапительную активность иммунокомпетентных клеток, что согласуется с данными литературы

(Association between IL-6 and the extent of Coronary Atherosclerosis in The Veterans Affairs Diabetes Trial (VADT) / A. Saremi, R.J. Anderson, P. Luo [et al.] // Atherosclerosis. - 2009, № 2. -Vol. 203, № 2. - P. 610-614).____________________

TN

"IGF 32 "GF|31 IFN-y IL-6R 1L-6 'ami TNf-a Ri TNF-a ILlfl IL-17 L-ZR

Рисунок 1 - Схематическое изображение дисбаланса содержания цитокинов в сыворотке крови у пациентов с атеросклерозом относительно границы контроля (увеличением или уменьшение относительно границы контроля). Примечание: *- достоверность различий с контролем (р<0,05).

Низкое содержание IL-2 свидетельствует о функциональной недостаточности механизмов адаптивного иммунитета, нарушении Т-клеточной регуляции у пациентов с AC (Local deliveiy of IL-2 reduces atherosclerosis via expansion of regulatory T cells / T. Dietrich , T. Hucko, C. Schneemann. [et al] // Atherosclerosis. - 2012. - Vol. - 220, № 2. - P 329-336).

Зарегистрировано достоверное увеличение значений растворимого рецептора к IL-2R и прямая корреляция (г=0,30, р=0,005) между цитокином и его растворимым рецептором, что представляет собой компенсаторную реакцию на недостаточность продукции IL-2 (Лапин, С.В. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний / С.В. Лапин, А.А. Тотолян. - Спб.: Человек, 2010. - 272 е.). Снижение продукции IL-10 у пациентов при АС согласуется с данными литературы (Баранов, А. Аторвастатин в лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей / А. Баранов, А. Обухов, Н. Шаркова, А. Бузин // Врач. - 2007. -№ 9. - С. 66-69; Кузнецов, М.Р. Прогнозирование отдаленных результатов оперативного лечения больных с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / М.Р. Кузнецов, Б.В. Болдин, В.М. Кошкин [и др.] // Ангиология и сосуд, хирургия. - 2008. - Т. 14, № 1. - С. 106-112) и может быть связано с угнетением функциональной активности CD4+, CD25+, Foxp3 -Т-регуляторных клеток в условиях гипоксии и дефицита IL-2. О вероятном угнетении противовоспалительных механизмов реактивности и адекватного функционирования Т-регуляторных клеток свидетельствует выявленное снижение отношения IL-10/IFN-y в общей группе пациентов с АС (Медиана 1,02 (0,7-3,0), против 4,6 (3,4-26,7) у здоровых доноров, р<0,05).

Выявлена средняя прямая корреляция (г=0,40, р=0,002) между изоформами TGF-ßi и TGF-ß2, что подтверждает их прямое, синергичное взаимодействие между собой и согласуется с данными других исследователей (Holifield, J.S. TGF-betal, -beta2 and -beta3 cooperate to facilitate tubulogenesis in the explanted quail heart / J.S. Holifield, A.M .Arien, R.B. Runyan R.J. Tomanek // J. Vase. Res. -2004. - Vol. 41, № 6. - P. 491-498).

Нарастание TGF-ß2 у пациентов с АС можно расценить, с одной стороны, как защитный механизм, препятствующий атерогенному повреждению стенки сосудов, снижению воспаления и способствующий стабилизации атеромы, однако оно может отражать сдвиг процессов ремоделирования в сторону развития фиброза сосудов, что согласуется с данными литературы (Сергеенко, И.В. Влияние реваскуляризации миокарда на динамику сосудистого эндотелиального и трансформирующего факторов роста у больных ишемической болезнью сердца / И.В. Сергеенко, А.Е. Семенова, В.П. Масенко, Л.И. Хабибуллина // Кардиоваскул. терапия и профилактика. - 2007. - Т.6, № 5. — С. 12-17). По нашему мнению эффект TGF-ß в организме характеризуется плеотропностью, определяется количеством вырабатываемого цитокина и меняется на различных этапах патологического процесса.

При анализе системного содержания ММР-9 и ее ингибиторов при АС выявлено увеличение значений MMP-9/TIMP-2 в 11,5 раз, тогда как значения ММР-9 и комплекса MMP-9/TIMP1 практически не отличались от показателей контроля (р>0,05) (рисунок 2).

MMP-9/TIMP-2

ММР

9/TIA

1Р-1

TIMP-1 ММР-9

Лег тин

Адипонектин

Рисунок 2 - Схематическое изображение белков, регулирующих состояние межклеточного матрикса и адипокинов в сыворотке крови у пациентов с атеросклерозом (увеличение или уменьшение относительно границы контроля).

Примечание *- достоверность различий с контролем (р<0,05).

Полученные результаты свидетельствуют об активации процессов связывания ММР-9 ее тканевым ингибитором 2 типа. Отсутствие увеличения ММР-9 можно связать с ингибированием экспрессии ММР-9 в результате действия статинов, принимаемых пациентами (Koh, К.К. Non-lipid effects of statin on hypercholesterolemic patients established to have coronary artery disease who remained hypercholesterolemic while eating a step- II diet / K.K. Koh, J.W. Son, J.Y. Ahn [et al.] // Coron. Artery. Dis. - 2001. - Vol. 12, № 4. - P. 305-311).

Установлена слабая прямая корреляция между ММР-9 и TIMP-1 (г=0,23, р=0,01); средняя прямая - между ММР-9 и MMP-9/TIMP-1 (г=0,48,р=0,0001) и высокая - между ММР-9 и MMP-9/TIMP-2 (г=0,92, р=0,003), что отражает активацию связывания желатиназы ее ингибиторами 1 и 2 типа при АС. У здоровых доноров выявлена также прямая сильная корреляция между ММР-9 и MMP-9/TIMP-2 (г=0,34, р=0,05), что свидетельствует о более высокой связывающей активности TIMP-2, по сравнению с TIMP-1, даже при отсутствии воспалительных изменений и клинических проявлений АС.

У пациентов с АС выявлен низкий уровень адипонектина в сыворотке крови (р<0,05), что способствует нарушению реализации его антиатерогенных эффектов: подавления связывания моноцитов с клетками эндотелия, ингибирования экспрессии молекул адгезии (VCAM-1, ICAM-1, Е-селектина) и МСР-1, препятствия отложения липидов в сосудистой стенке за счет нарушения поглощения макрофагами измененных липопротеинов (Al-Attas, O.S. Association of body mass index, sagittal abdominal diameter and waist-hip ratio with cardiometabolic risk factors and adipocytokines in Arab children and adolescents / O.S Al-Attas, N.M. Al-Daghri, M.S. Alokail, K.M. Alkharfy [et al.] // BMC Pediatr.

- 2012. - Vol. 7, № 12. - P. 119). Выявлена обратная корреляция между лептином и ММР-9 (г=-0,75, р=0,0001), прямые корреляции между лептином и TIMP-1 (т=0,23, р=0,04), лептином и MMP-9/TIMP-1 (i=0,35,p=0,006), что согласуется с данными: J. Вао (2010) и М. Wendremaire с соавт. (2013), показавших стимулирующий эффект лептина на синтез коллагена, посредством ингибиции продукции ММР-2 и ММР-9 (Вао, J. P. Leptin plays a catabolic role on articular cartilage / J.P. Boa, W.P. Chen, J. Fang [et al.] // Mol. Biol. Rep. - 2010. -Vol.37, № 7. - P. 3265-3272; Wendremaire, M. Effects of leptin on lipopolysaccharide-induced remodeling in an in vitro model of human myometrial inflammation. / M. Wendremaire, P. Mourtialon, F. Goirand [et al] // Biol. Reprod. -2013. - Vol. 88, № 2. - P. 45); с результатами M.G. Bilbao (2011) с соавт., установивших, что лептин стимулирует не продукцию, а только активность ММР-9, повышая экспрессию тканевых ингибиторов металлопротеиназ (TIMP); и с данными S. Kralisch (2007), выявивших прямую корреляцию между лептином и TIMP-1 (Bilbao, M.G. Differential effects of leptin on ovarian metalloproteinases and their tissue inhibitors between in vivo and in vitro studies / M. G. Bilbao, M.P. Di Yorio, A. G. Faletti // J. Endocrinol. - 2011. - Vol. 209, № 1.

- P. 65-74; Kralisch, S. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 predicts adiposity in humans / S. Kralisch, M. Bluher, A. Tonjes [et al.] // Eur. J. Endocrinol. - 2007. -Vol. 156, № 2. - P. 257-261). Однако вышеперечисленные корреляции противоречат результатам M.R. Schroeter с соавт. (2012) и L. Wang с соавт. (2013) отметивших, что лептин, напротив, повышает экспрессию ММР-9 (Schroeter, M.R. Schroeter Leptin promotes the mobilization of vascular progenitor cells and neovascularization by NOX2-mediated activation of MMP9 / M. R. Schroeter, S. Stein, N. M. Heida [et al.] // Cardiovasc Res. - 2012. -Vol. 93, № 1. - P. 170-180; Wang, L. The effect of leptin and its mechanisms on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells // L. Wang, H. Cao,

X. Pang [et al.] H Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. - 2013. - Vol. 29, № 12. -P. 1272-1276).

Установлена обратная корреляция между адипонектином и TIMP-1 (г=-0,22, р=0,05), что подтверждает данные S. Kralisch (2007) (Kralisch, S. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 predicts adiposity in humans / S. Kralisch, M. Bluher, A. Tonjes [et al.] // Eur. J. Endocrinol. - 2007. -Vol.156, № 2. - P. 257261). Выявлена прямая корреляция средней силы IL-ip с ММР-9 - (г=0,57, р = 0,01), что согласуется с мнением G. Opdenakker с соавт. (2001) и М. Rohla, T.W. Weiss (2013) об участии ММР-9 в активации IL-ip (Opdenakker, G. Review Gelatinase В functions as regulator and effector in leukocyte biology / G. Opdenakker, P.E. Van den Steen, B. Dubois, I. Nelissen // J.J. Leukoc. Biol. -2001. - Vol. 69, № 6. - P. 851-859; Rohla, M. Metabolic syndrome, inflammation and athero thrombosis / M. Rohla, T. W. Weiss // Hamostaseologie. - 2013. -Vol. 33, № 4. - P. 283-294), (рисунок 3).

Рисунок 3 - Корреляционные взаимосвязи между цитокинами, ферментами, регулирующими состояние межклеточного матрикса и адипокинами в общей группе

пациентов с атеросклерозом. Примечание--► прямая корреляционная

зависимость,-------» - обратная корреляционная зависимость

Зарегистрирована слабая корреляция между ТОТ-а и Т1МР-1 (г=0,21, р=0,05), что указывает на компенсаторное повышение продукции ингибитора ММР-9 1 типа в ответ на стимуляцию экспрессии цитокина. Установлены прямые корреляции 1Ь-2 и 1Ь-2Я с Т1МР-1 (г=0,26, р=0,04 и г=0,47, р=0,003, соответственно) и 1Ь-2 и 1Ь-2Я с комплексом ММР-9/Т1МР-1 (г=0,26, р=0,05 и г=0,35, р=0,01, соответственно), что свидетельствует об активации связывания ММР-9 ее тканевым ингибитором 1 типа в ответ на опосредованное 1Ь-2 и 1Ь-2R хроническое воспаление в стенке сосуда с участием лимфоцитов. Интерлейкины 17 и 10 также прямо коррелировали с ММР-9/Т1МР-1 (г=0,30,

р=0,01 и г=0,42, р=0,04) при АС, что указывает на цитокинопосредованную стимуляцию связывания ММР-9 с ее ингибитором 1 типа.

Исследовано влияние цитокинов и на продукцию гормонов жировой ткани. Установлена средняя прямая связь между лептином и IL-Iß (r=0,35, р=0,01), что косвенно подтверждает синергичность их провоспалительного действия при АС и согласуется с данными S. Margetic (2002) и S. Gaillard (2007) о стимулирующем эффекте лептина на синтез и секрецию цитокина (Margetic, S. Leptin: a review of its peripheral actions and interactions / S. Margetic, C. Gazzola, G.G. Pegg [et al.] // Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. - 2002. -Vol. 26, № 11. — P. 1407-1433; Gaillard, S. Adipose tissue as an endocrine organ / S. Gaillard, R. Gaillard // Obesity and Metabolism. - 2007. - Vol. 3. - P. 191-205). Выявленные - средняя обратная связь адипонектина с TGF-ßj (г -0,41, р=0,01) и средняя обратная связь его с TGF-ß2 (г= -0,30, р=0,05), указывают на то, что снижение уровня адипонектина при АС способствует повышению продукции противовоспалительного TGF-ß (компенсаторный механизм), но и реализации его профиброгенных эффектов, что согласуется с данными S. J. Hong с соавт. (2007) (Hong, S.J. Comparison of effects of telmisartan and valsarían on late lumen loss and inflammatory markers after sirolimuseluting stent implantation in hypertensive patient / S.J. Hong, W. J. Shim, J.I. Choi, H.J. Joo // Am. J. Cardiol. -2007. - Vol. 100,№ 11.-P. 1625-1629).

Оптимальные показатели холестерина менее 5,0 ммоль/л, наблюдаемые почти у половины обследуемых пациентов с клинически выраженными проявлениями ишемии на фоне АС, позволяют судить, что гиперхолестеринемия является не обязательным проявлением развития и прогрессирования заболевания, что подтверждает мнение других исследователей (Лутай, М.И. Атеросклероз, современный взгляд на патогенез / М. И. Лутай // Укражський кардюл. журн. - 2004. - № 1. - С. 22-34, Лиходед, В.Г. Рецепторная теория атеросклероза / В.Г. Лиходед, В.М. Бондаренко, А.Л. Гинцбург // Вестн. РАМН. - 2010. - № 5. - С. 11-25). Исходя из этого, можно заключить, что в развитии АС важен не уровень повреждающего агента, а нарушение его взаимодействия со структурными компонентами сосудистой стенки: эндотелиальными, гладкомышечными клетками и лейкоцитами. Зарегистрировано, что при концентрации общего ХС>5,0 ммоль /л определялся высокий уровень TNF-a (р<0,05), что можно расценить как проатерогенный эффект - стимуляцию провоспалительной активности клеток иммунного системы в ответ на гиперлипидемию, одного из основных ФР АС. Но в то же время данная связь может свидетельствовать о компенсаторном механизме реактивности, поскольку известно, что TNF-a подавляет поглощение модифицированных ЛПНП макрофагами и экспрессию мРНК скэвенджеров -рецепторов класса А, необходимых для захвата ЛПНП, и на клетках (Юбицкая, Н.С. Роль фактора некроза опухоли в развитии метаболического синдрома / Н.С. Юбицкая, М.В. Антонюк, Л.В. Веремчук, К.К. Ходосова // Тер. архив. -2009. - № 11. - С. 59-63; Ройтберг, Г.Е. Метаболический синдром и распределение жировой ткани: точки соприкосновения и противоречивость взаимоотношений / Г.Е. Ройтберг, Ж.В. Дорош, О.В. Курушкина //

Профилактическая медицина. - 2010. - № 1. - С. 22-25). При высоком уровне ХС показатели TNF-aRI и TNF-aRII, напротив, были статистически значимо ниже, чем при его низком содержании (р<0,05), установлена отрицательная корреляция между растворимыми рецепторами TNF-aRI и общим ХС крови (сильная между TNF-aRI и ХС (г= - 0,78, р<0,05) и средняя - между TNF-aRII и ХС (г=-0,36, р<0,05), что объясняется антагонизмом этих рецепторов со своим лигандом и, следовательно, - разнонаправленным эффектом в отношении обмена холестерина (рисунок 3). По мнению М.И. Душкина с соавт. (2007), положительная корреляция между провоспалительными цитокинами, такими как TNF-a, IL-lß, IL-6 и IFN-a и липидным обменом заключается в том, что они способствуют индукции синтеза жирных кислот и развитию триглицеридемии (Душкин, М.И. Интеграция сигнальных путей регуляции липидного обмена и воспалительного ответа / М.И. Душкин, E.H. Кудинова, Я.Ш. Шварц // Цитокины и воспаление. - 2007. - №2. — С. 18-25). Было установлено, что высокий уровень общего ХС, напротив, сопровождался статистически значимым снижением уровня IL-6 (р<0,05) и некоторым уменьшением IL-lß, что косвенно согласуется с результатами экспериментального исследования Я.Ш. Шварц (2011) об инактивации сфингомиелина в мононуклеарных фагоцитах, снижении продукции ими провоспапительных медиаторов и цитокинов, уменьшении зимозан-индуцированного гранулемообразования и нарушении процесса миелопоэза в костном мозге под влиянием гиперхолестеринемии (Шварц, Я.Ш. Реактивность макрофагальной системы при фибропластических процессах воспалительного генеза: оценка, механизмы регуляции и патогенетическое значение: дис. ... докт. мед. наук / Я.Ш. Шварц. - Новосибирск, 2011. - 336 е.). Определено, что содержание TGFßi было выше референсных значений только при высоком уровне общего ХС крови, что также косвенно можно соотнести с результатами экспериментального исследования Я.Ш. Шварц (2009) о стимуляции продукции макрофагами TGF-ß! и развитии фиброгенного ответа при гиперхолестеринемии (Шварц Я.Ш., Хощенко О.М., Душкин М.И., Феофанова H.A. Действие холестерина и агонистов гормональных ядерных рецепторов на продукцию трансформирующего фактора роста-ß в макрофагах // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. - 2009. -Т 148, №9. - С.294-29). Увеличение общего ХС более 6,2 ммоль/л сопровождалось нарастанием IL-2 и IL-10 по сравнению с уровнем ХС менее 5,0 ммоль/л (р<0,05), однако показатели цитокинов при этом не достигали референсных значений и оставались ниже их. Нарастание значений IL-2 и IL-10 при гиперхолестеринемии отражает реактивную симуляцию Т-лимфоцитов при усилении действия повреждающего стимула (избытка холестерина), что подтверждается выявленными корреляциями показателей (прямая средняя связь между IL-2 и ХС (г=0,58,р<0,05) и IL-10 и ХС (г=0,43,р<0,05) (рисунок 3). По данным литературы известно, что терапия рекомбинантным IL-2 способствует снижению холестерина и липопротеинов (Kwong, L.K. Acute dyslipoproteinemia induced by interIeukin-2: lecithin: cholesteryl acyl transferase, lipoprotein lipase, and hepatic lipase deficiencies / L.K.Kwong, D.N. Ridinger, M. Bandhauer [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1997. - Vol. 82, № 5. -

P. 1572-1581), а статины снижают уровень IL-2 (Zubelewicz-Szkodzinska, В. Simvastatin decreases concentration of interleukin-2 in hypercholesterolemic patients after treatment for 12 weeks / B. Zubelewicz-Szkodzinska, J. Szkodziriski, W. Romanowski [et al.] // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. - 2004. -Vol. 18, № 3-4. - P. 295-301). Уровень IL-17 также повышался при увеличении содержания общего ХС в крови (>6,2 ммоль/л) и превысил при этом показатели контроля (р=0,05), что свидетельствует об активации Th-17 под влиянием гиперхолестеринемии.

При оценке патогенетических особенностей течения воспаления при АС в зависимости от его локализации, определено, что у пациентов с АКА (ИБС) иммуноопосредованная провоспалительная активность была представлена высоким содержанием IL-ip и IL-6 (в 5,4 раза и в 2,4 раза, соответственно), по сравнению с показателями у здоровых. При этом, уровень IL-ip у пациентов с АКА (ИБС) был в 4,6 раз выше, чем у пациентов с преимущественными клиническими проявлениями ОАНК и невыраженном течении ИБС. Возможными причинами наиболее низкого уровня IL-ip при системном атеросклерозе (в пределах референсных значений) может являться - вероятная компенсаторная гиперпродукция антагониста цитокина - растворимого рецептора к IL-1 в условиях выраженной ишемии НК. Показатели TNF-a, IL-6 и IFN-y при ОАНК были выше, чем при АКА (ИБС) - в 2,1, в 1,5, в 1,8 раз, соответственно) и выше, чем у здоровых доноров (в 1,9, в 4,4, в 2,4 раз, соответственно). Усиленная продукция данных провоспапительных цитокинов при ОАНК может проявляться активацией макрофагов, выделением ими кислородных радикалов, оксида азота и гидролитических ферментов в условиях ишемического повреждения тканей НК, что потенцирует прогрессирование хронического воспаления по типу порочного круга (Запорожец, Т.С. Особенности иммунного и цитокинового статуса у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей / Т.С. Запорожец, К.В. Майстровский, В.Г. Раповка [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2011. - Т. 10, №3. - С. 68-75). При ОАНК зарегистрирована слабая корреляция между IL-6 и его растворимым рецептором (IL-6R) (г=0,31, р=0,04), что характеризует образование комплекса лиганд-рецептор с дальнейшим взаимодействием с мембранным протеином gpl 30, в результате чего проявляется выраженный провоспалительный эффект IL-6. Значения IL-17 при ОАНК были статистически значимо ниже, чем при АКА (ИБС), но при этом не отличались от контрольного уровня (р>0,05). С одной стороны, это можно рассмотреть как ограничение функциональной активности Th-17 при ОАНК и расценить как компенсаторный противовоспалительный эффект. Однако результатом этого может быть и нарушение активации нейтрофилов, что потенцирует развитие хронического воспалительного процесса и угнетение репаративных процессов при ишемическом повреждении тканей нижних конечностей (НК).

При анализе соотношения цитокинов в сыворотке крови определено выраженное снижение доли IL-2 (в 2,8 раз) и IL-10 (1,8 раз) при АКА (ИБС), по сравнению с ОАНК. Это может отражать процессы переключения продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками, превалирование локальной

выработки цитокинов, но и, возможно, свидетельствовать о более выраженной Т-клеточной иммуносупрессии и нарушении противовоспалительных механизмов реактивности при атерогенном поражении коронарных артерий.

У пациентов с ОАНК уровень ММР-9 был в пределах нормы, тогда как содержание Т1МР-1, напротив, было статистически значимо выше референсных значений. Это свидетельствует об активации механизмов контроля выработки ММР-9 ее ингибитором 1 типа при выраженных клинических проявлениях ОАНК, но с другой стороны усиленное связывание желатиназы В может отражать нарушение процессов ремоделирования сосудов в НК в ходе их длительной ишемии, способствовать развитию в них процессов фиброобразования и тромбоза.

Определены особенности изменений содержания лептина в зависимости от локализации и распространенности поражения артерий при АС. При АКА (ИБС) значения лептина были выше, чем у здоровых доноров (р=0,04) и пациентов с ОАНК (р=0,05). При этом у пациентов с ОАНК уровень лептина статистически значимо не отличался от референсных показателей (р>0,05). Отсутствие повышения лептина при ОАНК, вероятно, связано с ограничением выработки гормона адипоцитами с целью компенсации ишемии.

С помощью факторного анализа были установлены наиболее значимые факторы при различной распространенности и выраженности клинических проявлений АС. При ОАНК наиболее значимой нагрузкой - более 0,7, характеризовались: адипонектин, цитокины (1РЫ-у, ТЫР-а, 1Ь-6, 1Ь-2, 1Ь-10, ТвР-Рг), растворимые рецепторы к цитокинам (1Ь-2Я, ТЫР-аЯ1 ПМР-аЯН) и показатели деградации внеклеточного матрикса (ММР-9, ММР-9/Т1МР-2, Т1МР-1) (рисунок 4)._

Рисунок 4 - Факторный анализ показателей цитокинового статуса, системы ММР-9 и адипокинов у пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей (удельный вес (%) главных компонентов при оценке факторной нагрузки)

Факторы составляли 9 главных компонентов, при этом удельный вес каждого компонента был практически одинаковым, что характеризует их равнозначное участие в патогенезе системного атероскперотического поражения. I и III компоненты были комплексными - включали несколько показателей. Максимальной была доля I компонента - 10,5%, который был представлен: IFN-y, IL-2, TNF-a и IL-6, что подтверждает их участие в

I. {IFN-y,ll-2. TNF-a. 11-6) 12,0096 ------

VI. (ММР-9)

YS

-■"V. (IL-2R)

системном ишемическом повреждении тканей и отражает выраженную провоспалительную активность Th-1 типа. III комплексный компонент, представленный TNF-aRI и TNF-aRII характеризует компенсаторную противовоспалительную активность клеток в патогенезе АС, заключающуюся в связывании и инактивации TNF-a.

Корреляционный анализ взаимодействия факторов между собой в группе пациентов с ОАНК выявил отрицательную обратную связь средней силы адипонектина с трансформирующими факторами роста (TGFßi и TGFß2) (г=-0,35 и г=-0,39, р<0,05), что вероятно, указывает на разнонаправленность действия этих показателей - при снижении адипонектина активируется продукция TGFßi и TGFß2, что может способствовать стимуляции процессов фиброзообразования.

Установлена отрицательная обратная связь средней силы (г=-0,34, р<0,05) между адипонектином с IL-10, что представляет компенсаторный механизм -снижение адипонектина и его противоагерогенных эффектов стимулирует продукцию противовоспалительного IL-10. Зарегистрированная прямая связь ММР-9 с IL-lß (г=0,71, р<0,05) - подтверждает взаимодействие данных показателей в ходе ремоделирования тканей при ОАНК.

Прямые связи TNF-a с TGF-ß, (г=0,50, р<0,05), с TIMP-1 (г=0,37, р<0,05), с IL-2R (г=0,47, р<0,05) и IFN-y - с MMP-9/TIMP-2 (г=0,5, р<0,05) - указывают на то, что провоспалительные цитокины: TNF-a и IFN-у обладают плеотропными эффектами, в частности, оказывают иммунорегуляторное действие и участвуют в процессах ремоделирования тканей при системном атеросклеротическом повреждении, с преимущественным повреждением нижних конечностей. При АКА (ИБС) выявлено 6 главных компонентов значимости факторов (рисунок 5).

I. (IL<2. IL-10. IL-lß)

Рисунок 5 - Факторный анализ показателей цитокинового статуса, системы ММР-9 и адипокинов у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий (удельный вес (%) главных компонентов при оценке факторной нагрузки) Из них I, III и V компоненты включали одновременное влияние нескольких факторов. Максимальный удельный вес отмечался у I компонента - 26,8%, составляющими которого являлись про- и противовоспалительными цитокины (IL-lß, IL-2 и IL-10). III компонент, доля которого занимала 7,8%, был сформирован IL-6 и IL-17, что, видимо, подтверждает синергичное действие цитокинов при ишемическом повреждении миокарда. Составляющими V

комплексного компонента были лептин и TIMP-1, что, характеризует их взаиморегуляцию и совместное участие в процессах сосудистого ремоделирования при коронарном атеросклерозе. Выявленные изменения у пациентов с АКА (ИБС) указывают на активацию клеток врожденного иммунитета (высокая значимость нагрузки >0,7 для IL-lß, для IL-6) и Th-17 (высокая значимость нагрузки >0,7 для IL-17) у пациентов с АКА (ИБС).

В группе пациентов с АКА (ИБС) зарегистрированы многочисленные прямые корреляции: IL-lß с IL-2, с растворимым рецептором IL-2 (IL-2R) (г=0,60 и 0,42, р<0,001), с IL-10 (r=0,27 р =0,02), с TIMP-1 (г=0,44, р=0,008), с MMP-9/TIMP-2 (г=0,35, р=0,005), с TNF-a (г=0,48, р =0,001), IL-17 (r=0,28, р =0,01), IL-6 (г=0,28, р =0,03), лептином (r=0,24, р =0,05), обратная корреляция IL-lß с адипонектином (г=-0,26, р=0,05), что доказывает его мультифакторное влияние на различные звенья иммунного ответа и процессы ремоделирования при ишемическом повреждении миокарда. Установлены прямые корреляции IL-2 с его растворимым рецептором (r=0,42, р=0,001), IL-10 (г=0,38, р=0,09), IL-17 (r=0,49, р=0,001), IFN-y (г=0,47, р=0,004) и обратная связь этого цитокина с адипонектином (г=-0,28, р =0,05), что свидетельствует о его многокомпонентном регуляторном действии. Интерлейкин-6 у пациентов с АКА (ИБС) прямо коррелировал с IL-17 (г=0,34, р =0,01), с IL-10 (г=0,35, р =0,03), TNF-a (r=0,45, р =0,002) и с TNF-aRII (г=0,36, р =0,05). Определялась прямая корреляция IL-10 с IL-17 (r=0,33, р =0,005), лептина с TIMP-1 и ММР-9/TIMP-1 (г=0,23 и 0,4, р <0,05). Выявленные корреляции подчеркивают взаиморегуляцию показателей.

При анализе полиморфизма иммунорегуляторных генов у как у пациентов с АС и у здоровых доноров выявлено, что доминантными аллелями являлись: С аллель гена TGFß, (-509 С/Т), G аллель гена TNFa (-308G/A), С - аллель гена IL6 (-174G/C), А аллель гена ILIO (-1082 G/A). Установлено увеличение частоты встречаемости гомозиготного варианта Т аллели гена TGFßi rsl 800469 (-509 С/Т) у пациентов с АС по сравнению с контролем, ОШ с ДИ 3,91 (1,3911,5) (рисунок 6).

контроль ■ атеросклероз

Рисунок 6 - Показатели полиморфизма генов цитокинов у пациентов с атеросклерозом и здоровых доноров (частота встречаемости (%)). Примечание * - достоверность различий с контролем р(х2)<0,05 При оценке особенностей полиморфизма генов при различной локализации и распространенности АС, выявлено, что при АКА (ИБС) определялась высокая частота встречаемости О/С варианта гена Т№-а

(-308G/A) и тенденция снижения его A/G варианта, по сравнению с контролем (Р(Х2)=0>05 и Р(Х2)=0>07, соответственно). При ОАНК частота встречаемости гетерозиготного С/Т варианта TGFPi (-509 С/Т) была статистически значимо ниже, чем в контроле и в группе пациентов с АКА (ИБС), р(х2)=0,03. Установлена сопряженность Т/Т варианта гена TGF01 (-509 С/Т), A/G и А/А генотипов TNFa (-308G/A), G/G варианта гена IL6 (-174G/C) с высоким уровнем общего холестерина крови в общей группе пациентов с АС (рисунок 7)._

TNFa (-308G/A) TGFJ31 (-509 С/Т) 11-6 (-174G/C )

■ ХС низкий ❖ ХС средние знач. ВХС высокий

Рисунок 7 - Ассоциация полиморфизма генов цитокинов с концентрацией общего холестерина крови пациентов с атеросклерозом (частота встречаемости %). Примечание * - достоверность различий частоты встречаемости вариантов генов цитокинов

(р(Х2)<0,05)

В общей кагорте пациентов с АС определена связь высокого уровня провоспалительных цитокинов: 1Ь-6 с гомозиготными С и О локусами гена 1Ь-6 (-174 О/С), увеличенных значений ТЖ-а - с гетерозиготным АЛЗ вариантом гена ТОР-а (-308С/А) (рисунок 8).

Рисунок 8 - Схематическое изображение уровня цитокинов у пациентов с атеросклерозом в зависимости от полиморфизма кодирующих их генов (I). Примечание * - достоверность различий с контролем (р<0,05) Выявленные изменения указывают на риск развития и прогрессирования воспаления и атерогенного повреждения артериальной стенки у носителей данных полиморфных вариантов генов.

Установлено, что у пациентов с ОАНК определялась более высокая сопряженность повышенного уровня 1Ь-6 в сыворотке крови с гомозиготным вариантом С аллели 1Ь-6 (-174С/С) по сравнению с группой пациентов с АКА (ИБС), при достоверности различий между группами р<0,05. Зарегистрировано,

что ассоциации С/Т варианта гена TGF01 (-509 С/Т) с высоким уровней TGFPi и A/G варианта гена TNFa (-308G/A) с повышенным содержанием TNF-a отмечались только в группе пациентов с ОАНК.

Ген "PTPN22 (protein-tyrosine phosphatase, non-receptortype 22 (lymphoid) кодирует образование тирозин фосфатазы (Lyp), экспрессирующейся на Т -лимфоцитах и контролирует активность Т-клеток. Полиморфизм PTPN22 (rs2476601) ассоциирован с изменением функциональной активности Т-регуляторных CD4+CD25+-mieTOK (контроля воспаления, обеспечения иммунологической толерантности, протекции аутоагрессии против собственных тканей) (Saccucci, P. Atherosclerosis and PTPN22: A Study in Coronary Artery Disease / P. Saccucci, M. Banci, E. Cozzoli [et al.] // Cardiology. -2011. - Vol. 119, №1. - P. 54-56). У пациентов с AC и у здоровых доноров зарегистрировано увеличение частоты встречаемости гомозиготного G/G варианта гена PTPN22. При этом установлено, что гетерозиготный - G/A вариант гена PTPN22 rs 2476601 был сопряжен с более высоким уровнем IL-2 в сыворотке крови здоровых людей и пациентов с АС, что характеризует его регуляторное влияние на выраженность иммунного ответа. При АС определено также стимулирующее влияние гетерозиготного G/A варианта гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) на функциональную активность преимущественно Th-1 лимфоцитов с увеличением системной продукции ими провоспапительных цитокинов: IFN-y и TNF-a (в 2,4 раза выше и в 1,9 раз выше, чем при G/G генотипе). Эти результаты свидетельствуют о том, что эффект G/A генотипа гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) у пациентов с АС обуславливает активацию и пролонгирование хронического воспалительного процесса.

При АКА (ИБС) сопряженность G/A варианта гена PTPN22 с увеличением уровня IFN-y в сыворотке крови была в 4,6 раз выше, чем при G/G генотипе, р<0,05). При этом носительство гомозиготного G/G варианта гена PTPN22 у пациентов с АКА (ИБС) сопровождалось более высоким содержанием IL-ip, IL-6 и IL-17 в сыворотке крови (IL-ip - выше в 3,3 раза, IL-6 в 4,2 раза, IL-17 в 3 раза выше, чем при гетерозиготном G/A варианте). При ОАНК высокие значения IL-17 и TNF-a определялись при носительстве G/G варианта гена PTPN22 (rs2476601)). Достоверность различий показателей по IL-17 в зависимости от полиморфизма гена PTPN22 rs 2476601 (G/A) между группами пациентов достигала рх2=0,02).

Зарегистрированы особенности изменений цитокинового профиля, гормонов жировой ткани и показателей межклеточного матрикса в зависимости от тяжести клинических проявлений АС. У пациентов с нестабильным течением стенокардии на фоне АКА уровень лептина более 4 нг/мл определялся у 72 % чел., а содержание IL-6>5 пг/мл - у 68 % чел. по сравнению со стабильным течением стенокардии (х2= 12,22, р=0,01 и х2=9,14, р=0,001, соответственно). При выполнении бинарного логистического регрессионного анализа и построении ROC кривой (интервал AUC для лептина и IL-6 был практически одинаковым (для лептина 0,91, для IL-6 0,94). Это доказывает качество модели и позволяет использовать содержание данных показателей в качестве дополнительных диагностических критериев нестабильного течения

стенокардии. При ИМ в анамнезе, раннем периоде времени после ИМ, нестабильном течении стенокардии определялось увеличение лептина в сыворотке крови, при нарастании степени ХСН, напротив отмечалось снижение его системного уровня. При увеличении степени ХСН, зарегистрированы: -низкий уровень IL-2, лептина, нарастание значений TGFp2, TIMP-1, ММР-9/TIMP-1 и MMP-9/TIMP-2, что свидетельствуют о супрессии клеточного иммунного реагирования, стимуляции процессов фиброзообразования, и включении компенсаторных энергосберегающих механизмов. При ОАНК -нарастание стадии ишемии НК сопровождалось увеличением продукции IFN-y, активацией процессов деградации межклеточного матрикса (увеличение ММР-9, MMP-9/TIMP-2 и снижение TIMP-1), угнетением выработки адипонектина (р<0,05, по сравнению с контролем). Синдром Лериша сопровождался высоким уровнем IFN-y, TGFP2 и MMP-9/TIMP-2 (р<0,05), что указывает на активацию процессов фиброзообразования.

Экспериментальный раздел исследования В ходе экспериментального моделирования АС было установлено, что наиболее выраженные признаки повреждения артерий наблюдались через 6 месяцев воздействия на организм животного патогенных факторов (ГЛ, АГ и угнетения процессов метаболизма). К этому сроку также были выявлены более значимые отклонения и в лабораторных тестах. При оценке состояния артериального русла с помощью метода магниторезонансной томографии (МРТ) у крыс опытной группы от 2 к 6 месяцу сочетанного воздействии на их организм факторов риска АС, наблюдалось сужение просвета внутренней сонной артерии, грудной части аорты, подвздошных артерий, определялось их неравномерное контрастирование (рисунок 9 а), по сравнению с контрольными животными (рисунок 9 б).

1 £

а - опытная крыса б - контрольная крыса

Рисунок 9 - МРТ артерий, отходящих от дуги аорты

Отмечалось уменьшение уровня NADPH-диафоразы в эндотелии сосудов, что свидетельствует о мультифокальности поражения артериального русла (рисунок. 10 а), по сравнению с контрольными животными (рисунок 10 б).

а - опытная крыса

б - контрольная крыса

Рисунок 10 - NADPH-диaфopaзa аорты, гистохимический метод определения, Увеличением 100, (камера АЧСаш МЯ.С, Германия)

Морфологические изменения артериальной стенки у опытных крыс, определяемые гистологическим методом, характеризовались нарушением архитектоники эластических волокон, смещением ядер миоцитов на периферию, утолщением эндотелия, клеточной инфильтрацией стенки, отложением в ней жировых включений, по сравнению с контрольными животными (рисунки 11, 12, 13).

■ .. ; •'•'' • "Х-*:*-:

. ••. .. ■ 'л Vл--*.^'''-'¡ЩШ

шашшё'ШШ

Рисунок 11 - Аорта опытной крысы Увеличениех 100, (камера А*Сат МКс, Германия), окраска гематоксилин и эозин

Г - 7 -

Ш / - / .

■ - • ■ ■ ■/ '

" *■•- ..¡-г"

жнЯнГР» < ^швввянг " -^г? \а

Рисунок 12 - Аорта опытной крысы Увеличениех400, (камера АхСат МЯс, Германия), окраска гематоксилин и эозин

• ' .ШФ

• >

<'Ж* ..

Рисунок 13 - Аорта контрольной (здоровой) крысы. Увсличениех400, (камера А*Сат МКс, Германия), окраска ГСМаТОКСИЛИН и эозин

Уже на 2 месяце исследования наблюдались признаки жировой дистрофии печени - множественные липидные включения и выраженная клеточная инфильтрация в портальных трактах, с прогрессированием изменений к 6 месяцу (рисунки 14,15).

При анализе крови опытных крыс было установлено нарастание концентрации уровня общего ХС, ЛПНП и КА по сравнению с контролем, что отражает выраженность комплексного воздействия факторов риска АС на организм животных. От 2 к 6 месяцу проведения эксперимента наблюдалось увеличение системного уровня 1Ь-1р, №N-7 и 1Ь-10 (р<0,05), что указывает на системную активацию про-, и противовоспалительных механизмов иммунного реагирования при воздействие ФР АС. Однако, мы не подтвердили результаты Н.С. Юбицкой с соавт. (2010) о системном увеличении содержания "ШР-а при ГЛ у крыс, что, вероятно, связано с активацией продукции естественных ингибиторов цитокина (Юбицкая, Н.С. Роль фактора некроза опухоли в развитии метаболического синдрома / Н.С. Юбицкая, М.В. Антонюк, Л.В. Веремчук, К.К. Ходосова // Тер. архив. - 2009. - № 11. - С. 59-63).Установленная обратная слабая корреляция между содержанием 1Ь-10 и Т№-а (г=-0,28, р=0,04) в сыворотке крови указывает на подавление выработки ТЫИ-а интерлейкином-10.

Значения ООА в крови опытных крыс превышали контрольные величины, без достоверной их разницы в периоде наблюдения - 2,4,6 месяцев. Увеличение уровня ООА, при отсутствии различий показателей АОА от значений контроля в динамике эксперимента характеризует системную активацию процессов перекисного окисления липидов и неадекватность антиоксидантных компенсаторных механизмов при комплексном воздействии ФР АС.

Выявлены корреляции между показателями цитокинов и параметрами липидного метаболизма в крови крыс: прямая сильная связь между ЛПНП и Т№-а (г= 0,89, р=0,04), обратная сильная связь между КА и 1Ь-10 (г=-0,9, р=0,03), что указывает на цитокинопосредованную регуляцию липидного обмена.

Рисунок 14 -Печень опытной крысы. Увеличение><400, (камера АхСат МЯс, Германия). Окраска гематоксилин и эозин

Рисунок 15 - Печень контрольной крысы. Увеличениех400, (камера АхСат МКс, Германия). Окраска гематоксилин и эозин

При определении цитокинового профиля сосудистой стенки установлена зависимость их локальной продукции от морфологии сосудов. Определено, что в бедренных артериях контрольных крыс содержание TNF-a было в 2,5 раза ниже, а IL-10 почти в 10 раз ниже, чем в аорте. Видимо, это обусловлено структурным различием сосудов (аорта - артерия эластического типа, тогда как бедренные артерии - мышечно-эластического типа). Особенности морфологического строения, скорость кровотока в сосуде, вероятно, оказывают влияние на функциональную активность клеток-продуцентов цитокинов. Зависимость особенностей функциональной активности сосудов от их морфологического строения показана разными исследователями (Robert, R. Different effects of interleukin-l on reactivity of arterial vessels isolated from various vascular beds in the rabbit / R. Robert, B. Chapelain, G.Néliat // Cire Shock. - 1993. - Vol. 40, № 2-3. - P. 139-143; Tirapelli, C. R. Effect of ethanol consumption on blood pressure and rat mesenteric arterial bed, aorta and carotid responsiveness / C.R. Tirapelli, A.F. Leone, E.B. Coelho [et al.] // J. Pharm. Pharmacol. - 2007. - Vol. 59, № 7.

- P. 985-993; Miller, A.A. NADPH oxidase activity is higher in cerebral versus systemic arteries of four animal species: role of Nox2 / A. A. Miller, G. R. Drummond, T.M. De Silva [et al.] // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2009

- Vol. 296, № 1. - P. 220-225). У опытных животных на 2 месяце эксперимента в аорте было выявлено увеличение продукции цитокинов: IL-1 р, TNF-a, IFN-y, IL-10, по сравнению с показателями контроля (р<0,05), однако к 4 месяцу исследования содержание TNF-a и 1L-10 снижалось и уже не отличалось от референсных значений, а IL-lß и IFN-y даже стали несколько ниже уровня контрольного уровня (р=0,06-0,08). К 6 месяцу эксперимента содержание IL-lß в аорте снизилось ниже контрольных значений в 5,5 раз, IFN-y - в 4,4 раза, IL-10 - в 1,9 раз, по сравнению с показателями здоровых крыс (р<0,05), при этом отличий TNF-a от контрольного уровня не отмечалось. Изменения в аорте опытных крыс на 6 месяце эксперимента характеризуют конечную 3 стадию повреждения эндотелия - истощения в результате жирового пропитывания сосуда, апоптоза клеточных элементов и функциональной инволюции клеточной стенки в условиях длительного воздействия ФР АС (р<0,05). В бедренных артериях крыс опытной группы на 2 месяце эксперимента также наблюдалось увеличение значений цитокинов: IL-lß в 3,2 раза, TNF-a в 2,2 раза, IFN-y - в 2,8 раз, IL-10 - в 2,4 раза по сравнению с показателями контроля. К 6 месяцу исследования определялось постепенное снижение IL-lß, IFN-y и нарастание TNF-a и IL-10. При этом содержание IFN-y, TNF-a, IL-10 оставалось выше контрольных значений, а показатели IL-lß снизились до контрольного уровня. Концентрация цитокинов в бедренных артериях опытных крыс к 6 месяцу эксперимента стала достоверно выше, чем в аорте (р<0,05). По-видимому, в бедренных артериях, в силу их морфологических особенностей, происходила более продолжительная реализация провоспалительной активности лейкоцитов, эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки в ответ на повреждение.

При оценке удельного веса цитокинов в аорте опытных крыс к 6 месяцу эксперимента выявлено увеличение доли TNF-a и IL-10, уменьшение - IFN-y и незначительное снижение содержания IL-ip. Изменения удельного веса цитокинов в бедренных артериях опытных крыс в основном повторяли их динамику в аорте - отмечалось нарастание доли TNF-a, при некотором снижении IFN-y и IL-ip, однако удельный вес IL-10 практически не изменялся. По нашему мнению, это свидетельствует о том, что иммуноопосредованное повреждение артерий сначала реализуется за счет активации продукции IFN-y и IL-ip, а затем - TNF-a, что согласуется с данными литературы (Tipping, P.G. Production of tumor necrosis factor and interleukin-l by macrophages from human atheromatous plaques / P.G. Tipping, W.W. Hancock // Am. J. Pathol. - 1993. -Vol. 142, №6.-P. 1721-1728).

Ha 2 месяце исследования в сосудах опытных крыс установлено увеличение коэффициентов ООА, АОА с постепенным снижением к 6 месяцу (ниже контрольного уровня), и достоверным нарастанием ОИ в аорте (р<0,05). Таким образом, мы подтвердили данные R. Marfella с соавт. (2011) об активации окислительного стресса в сосудах крыс в условиях гипотиреоза только в относительно раннем его периоде (Marfella, R. Innate immune activity in plaque of patients with untreated and L-thyroxine-treated subclinical hypothyroidism / R. Marfella, F. Ferraraccio, M.R. Rizzo [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2011. - Vol. 96, № 4. - P. 1015-1020). Выявленные изменения указывают на то, что при длительном воздействии ФР АС происходит системное и локальное истощение механизмов антиоксидантной защиты. Зарегистрирована прямая сильная связь между показателями АОА и уровнем NADPH-диафоразы в аорте опытных крыс (г=0,74 р<0,05), что характеризует зависимость активности NO-синтазы от окислительных процессов в ее стенке - подавление прогрессирования повреждения кофермента в условиях действия на организм ФР АС в результате активации механизмов антиоксидантной системы. В бедренных артериях к 6 месяцу эксперимента значения ООА и АОА также снижались, однако не происходило нарастания ОИ, по сравнению с группой контроля (р>0,05), что указывает на менее выраженное окислительное повреждение этих сосудов, по сравнению с аортой.

Установлено увеличение показателей ММР-9 на 2 месяце исследования в сосудах опытных крыс (р<0,05), что согласуется с данными литературы о повышении локальной продукции ММР-9 при АГ и гипотиреозе у крыс (Wu, М. The expression of CD40-CD40L and activities of matrix metalloproteinases in atherosclerotic rats / M. Wu, Y.G. Li // Mol. Cell. Biochem. - 2006. - Vol. 282, № 12. - P. 141-146). Однако, к 6 месяцу локальная продукция желатиназы В в аорте и бедренных артериях также снижалась, что, возможно, также свидетельствует о функциональном истощении клеток артериальной стенки, локальном подавлении выработки желатиназы В ее тканевыми ингибиторами (Jublanc, С. Serum levels of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 and tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP-1, are elevated in patients with autoimmune thyroid disorders: relevance to vascular inflammation / C. Jublanc, J. L. Beaudeux, F. Aubart

[et al.] // Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. - 2011. - Vol. 21, № 10. - P. 817-822), или противовоспалительными цитокинами такими как TGFßi или 1L-10 (Tziakas, D.N. Anti-inflammatory cytokine profile in acute coronary syndromes: behavior of interleukin-10 in association with serum metalloproteinases and proinflammatory cytokines / D.N. Tziakas , G.K. Chalikias, H.I. Hatzinikolaou [et al.] // Int. J. Cardiol. - 2003. - Vol. 92, № 2-3. - P. 169-175; Nomoto, T. Systemic delivery of IL-10 by an AAV vector prevents vascular remodeling and end-organ damage in stroke-prone spontaneously hypertensive rat / T.Nomoto, T.Okada, K.Shimazaki [et al.] // Gene. Ther. - 2009. - Vol. 16, № 3. - P. 383-391). Установлена сильная обратная связь между ММР-9 и IL-10 в аорте крыс (г=-0,78, р=0,05), что подтверждает дискордантность их взаиморегуляции. Уменьшение локального содержания ММР-9 может способствовать нарушению процессов ремоделирования артерий, снижению эластичности сосудистой стенки, склонности к развитию аневризмы и тромбоза.

Зарегистрированы корреляции: - прямая связь ЛПНП с - TNF-a (г=0,89, р=0,04) и обратная - между КА и IL-10 (г=-0,9, р=0,03), показывающие, что увеличение ЛПНП стимулирует системную продукцию TNF-a, нарастание КА способствует угнетению выработки IL-10. Установленная прямая связь между АОА и NADPH-диафоразой (г=0,74 р<0,05), свидетельствует о том, что снижение локальной АОА способствует окислительному повреждению эндотелия и угнетению продукции в нем выработки оксида азота.

На основе полученных данных разработана концептуальная модель патогенеза АС, в которой показано ведущее значение иммунного компонента в развитии эндотелиальной дисфункции и прогрессирования атерогенного повреждения сосудистой стенки (рисунок 16).

При проведении оценки иммунопатогенетической эффективности амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата (гапавита (Гт)) и полисахаридного 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии (митилана (Мт)) зарегистрировано их нормализующее влияние на системный липидный профиль животных, при этом Гт обладал более выраженным гиполипидемическим эффектом. Оба препарата способствовали нарастанию локальной и системной продукции ММР-9. 1,6-а-0-глюкан восстанавливал содержание ММР в аорте более эффективно по сравнению с амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидратом. Гт и Мт обладали модулирующим действие на цитокиновый профиль, с преимущественным нормализующим влиянием амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата на системный и локальный удельный вес TNF-a. Мт в большей степени влиял на снижение удельного веса провоспалителного IFN-y, и увеличение доли противовосплительного IL-10 в крови крыс обладал преимущественным локальным и системным антиоксидантным эффектом, нормализовал содержание ММР в аорте при длительном воздействии ФР. При этом оба препарата способствовали системному и локальному снижению ОИ, амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрат - за счет увеличения АОА, -1,6-а-О-глюкан - за счет снижения ООА.

ГЛ, АГ, снижение процессов метаболизма

Нарушение липидного обмена: ТХС.ТЛПНП, ÎKA

Макрофаг Т-клетка Эндотелиалъиая клетка, глэдкомышсчная клетка, Фибробласт Гепатоцит (жировая дистрофия)

Нарастание доли 1ИР, ГГО-у, и снижение удельного веса ТОТ-а и 1Ы0 в крови при длительном действии ФР

Активация ПОЛ Дсструкцнж клеточных мембран

Нарушение акгиоксидант-ной защиты ЦАОА)

Артериальная стенка

увеличение проницаемости, отложение жировых включений, клеточная инфильтрация моноцитами/макрофагами, лимфоцитами, гладкомышечными клетками

сужение просвета, нарушение архитектоники эластических волокон, смещение ядер миоцитов на периферию, утолщение эндотелия сосуда

АОРТА Более выраженные морфологические изменения, липидоэ, Ранняя активация: Т'ООА ^АОА, увеличение продукции 11.-10,1РМ-у, TNF-a и 11-10. Прогрессирующее нарастание ОИ и снижение продукции цитокинов при длительном действии ФР

(ММР-9 с дальнейшим прогрессирующим снижением ее уровня. Нарастание доли ТОТ-а и 1Ь-10 н спижеиие уд. веса ГОЧ-у н 1Ь-1Р при длительном действии ФР

[Снижение NADPH-» дкафоразы

способствует угнетению

эндотелиальной NOS ___*

1

Бедренные артерии: Рашш активация ООА АОА, длительное

стойкое увеличение продукции ШЫ-у, ТОТ-ан 11,-10

ТАГ-

>|ГЛ= порочный круг

Рисунок 16 Схема патогенеза эндотелиальной дисфункции и повреждения сосудистой стенки у крыс при воздействии факторов риска атеросклероза

Под влиянием препаратов происходило восстановление структуры и функции артериальной стенки и печени животных с более выраженным эффектом у амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата. Выявленные эффекты 1,6-а-О-глюкана и амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата позволяют считать их перспективными в плане применения в качестве средств комплексной патогенетической терапии, направленной на коррекцию механизмов повреждения артериальной стенки и снижение прогрессирования заболевания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении необходимо отметить, что при атеросклерозе дисбаланс системы цитокинов находится во взаимосвязи с показателями деградации межклеточного матрикса и гормонами жировой ткани и имеет отличительные особенности, зависящие от преимущественной локализации атеросклеротического процесса и выраженности клинических проявлений заболевания. Это позволит обосновано подходить к назначению иммуноопосредованной патогенетической терапии пациентам с различными клиническими проявлениями атеросклероза.

Установлены дополнительные диагностические критерии нестабильного течения стенокардии у пациентов ишемической болезнью сердца на фоне атеросклероза коронарных артерий, что позволит использовать их в клинической практике. Определена значимая роль полиморфизма иммуногегуляторных генов при атеросклерозе. Установлены генотипы, позволяющие определять предрасположенность к атеросклерозу, прогнозировать его течение и прогрессирование.

Разработана экспериментальная модель атеросклероза у крыс, на основе которой построена схема его патогенеза, установлены отличительные особенности иммуноопосредованного атерогенного повреждения сосудов различного морфологического строения (аорты и бедренных артерий), обоснована целесообразность применения амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии СгепотуШиз ^ауапиз для коррекции иммунной дисфункции, нормализации свободнорадикальных процессов, липидного обмена восстановления функциональных и структурных свойств артериальной стенки и печени при воздействии на организм факторов риска АС (гиперлипидемии, артериальной гипертензии и угнетения обменных процессов в ходе гипотиреоза). Полученный способ моделирования атеросклероза может быть использован для выявления новых патогенетических механизмов заболевания и изучения средств его патогенетической профилактики и терапии.

Результатами работы явились выводы и практические рекомендации, приведенные ниже. Можно констатировать, что проделанная работа позволила установить закономерности и особенности иммуногенетических и метаболических звеньев патогенеза при разных клинических вариантах атеросклероза . Полученные данные исследований могут быть использованы в перспективе при расшифровке иммуноопосредованных механизмов атерогенного повреждения сосудов.

ВЫВОДЫ

1. При атеросклерозе выявлен функциональный дисбаланс про- и противовоспалительных механизмов системного клеточного реагирования на уровне цитокинов (увеличение содержания в сыворотке крови IL-6, TGFp2, растворимых рецепторов:TNF-a RI, TNF-a RII, IL-2R, снижение уровня IL-2 и IL-10, увеличением доли IL-6, IL-ip, IL-17 и снижение удельного веса IL-2 и IL-10).

2. При атеросклерозе установлено высокое содержание комплекса ММР-9/TIMP-2 и прямая корреляция MMP-9/TIMP-2 с ММР-9, что отражает усиление продукции желатиназы В и ее преимущественное связывание с тканевым ингибитором 2 типа при атерогенном ремоделировании сосудистой стенки.

3. Установлены взаимосвязи между цитокинами: (IL-ip, TNF-a, IL-2, IL-2R IL-17, IL-10), гормонами жировой ткани (лептином, адипонектином), общим холестерином крови с показателями деградации межклеточного матрикса, что характеризует влияние регуляторных иммуновоспалительных механизмов на процессы ремоделирования артериальной стенки при атеросклерозе.

4. В патогенезе коронарного атеросклероза иммуноопосредованная провоспалительная активность представлена более высоким содержанием IL-ip, IL-17 и лептина, их высокой патогенетической значимостью, увеличением удельного веса IL-ip, снижением доли IL-2 и IL-10 в сыворотке крови. Выраженность провоспалительных механизмов у пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей определяется увеличением содержания IFN-y, TNF-a, TNF-aRII, IL-6, их высокой патогенетической значимостью, повышением доли IFN-y и TNF-a в системном соотношении цитокинов. Избыток TIMP-1, при нормальном уровне ММР-9 при облитерирующем атеросклерозе нижних конечностей в крови отражает более выраженную по сравнению с атеросклерозом коронарных артерий, ишемической болезнью сердца активацию процессов связывания желатиназы В в условиях ишемии нижних конечностей.

5. Высокая частота встречаемости Т/Т варианта гена TGFPi (-509 С/Т) у пациентов с атеросклерозом - свидетельствует о предрасположенности к заболеванию. Установлена сопряженность аллельных вариантов иммунорегуляторных генов с уровнем провоспалительных цитокинов (G/G и С/С гомозиготные варианты гена IL-6 (-174G/C) сопряжены с высоким уровнем в сыворотке крови IL-6; A/G вариант гена TNF-a (-308G/A) - с высоким уровнем TNF-a; G/A вариант гена PTPN22 (rs2476601) с высокими значениями IL-2, IFN-y и высоким содержанием общего ХС крови; G/G вариант гена IL-6 (-174G/C), Т/Т вариант гена TGF-pi (-509 С/Т), A/G и А/А варианты гена TNF-a (-308G/A)) - с уровнем общего холестерина крови>6,2 ммоль/л) у пациентов с атеросклерозом , что характеризует предрасположенность к более выраженной системной воспал Установлено, что высокий уровень TGFPi был ассоциирован с С/Т вариантом соответствующего гена только в группе пациентов с ОАНК. ительной активности и гиперхолестеринемии при носительстве данных генотипов.

6. У пациентов с различной распространенностью и локализацией атеросклероза установлены различия в сопряженности полиморфных вариантов имммунорегуляторных генов с содержанием про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови. Ассоциации С/Т варианта гена TGFpi (-509 С/Т) с высоким уровней TGFPi и A/G варианта гена TNFa (-308G/A) с повышенным содержанием TNF-a определялась только при системном атеросклерозе с преимущественным повреждением артерий нижних конечностей. Установлена высокая сопряженность повышенного уровня IL-6 в сыворотке крови с гомозиготным вариантом С аллели IL-6 (-174G/C), увеличенного содержания IL-17 в сыворотке крови с G/G вариантом гена PTPN22 (rs 2476601) у пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей. При атеросклерозе коронарных артерий с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца установлена ассоциация G/A варианта гена PTPN22 (G/A) с высоким содержанием IFN-y, G/G варианта гена PTPN22 (G/A) - с высокой концентрацией IL-ip, IL-6, IL-17 в сыворотке крови.

7. При длительном воздействии на организм крыс факторов риска атеросклероза (гиперлипидемии, гипотиреоза и артериальной гипертензии) получены изменения липидного профиля крови, локальной и системной продукции цитокинов, оксидантного статуса, содержания ММР-9, нарушения NO-синтетической активности эндотелия, установлены признаки структурного повреждения артериальной стенки и ткани печени животных, проанализированы взаимосвязи между лабораторными и инструментальными параметрами, на основе чего построена схема патогенеза атерогенного повреждения артерий.

8. При экспериментальном моделировании атеросклероза у крыс установлены взаимосвязи между показателями системы цитокинов, липидного метаболизма и оксидативной активности. В крови животных - увеличение липопротеинов низкой плотности стимулирует системную продукцию TNF-a, нарастание коэффициента атерогенности способствует угнетению выработки IL-10. В аорте крыс снижение общей антиоксидантой активности и провоцирует подавление продукции NADPH эндотелием и способствует локальному нарушению выработки оксида азота.

9. При сочетанном воздействия факторов риска атеросклероза на организм крыс определены особенности структурных и функциональных изменений сосудов в зависимости от их морфологического строения. В аорте (сосуде эластического типа) зарегистрировано раннее (со 2 месяца), прогрессирующее нарастание оксидативного индекса, увеличение продукции про- и противовоспалительных цитокинов: IL-ip, IFN-y, TNF-a и IL-10 с последующим снижением их локального уровня (с 4 по 6 месяц исследования), что характеризует раннее и более выраженное атерогенное повреждение стенки аорты (клеточная инфильтрация, липидоз, нарушение архитектоники эластических волокон) по сравнению с бедренными артериями. В бедренных артериях (сосудах мышечного типа) определено стойкое увеличение содержания IFN-y, TNF-a и IL-10 на протяжении всей динамики эксперимента,

что подтверждает более длительное сохранение функциональной активности клеток артериальной стенки.

10. Подтверждена патогенетическая эффективность амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрата и полисахаридного гликогеноподобного 1,4; 1,6-а-О-глюкана, выделенного из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus в модели экспериментального атеросклероза. Амино-диоксо-тетрагидро-фталазиндиона натрия дигидрат обладает более выраженным гиполипидемическим эффектом, способствует нормализации значений TNF-a (увеличивает удельный вес цитокина в крови, и снижает в аорте и бедренных артериях). 1,4; 1,6-а-О-глюкана в большей степени влияет на снижение удельного веса IFN-y, увеличивает уровень и удельный вес IL-10 в крови крыс, обладает преимущественным локальным и системным антиоксидантным эффектом, нормализует содержание ММР в аорте при длительном воздействии факторов риска.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Считать Т/Т генотип при оценке полиморфизма гена TGFßi (rsl800469) в качестве диагностического маркера предрасположенности к атеросклерозу. Для прогнозирования течения атеросклероза проводить типирование аллельных вариантов иммунорегуляторных генов: носительство G/G и С/С гомозиготных вариантов гена IL-6 (-174G/C) сопровождается высоким уровнем в сыворотке крови провоспалительного IL-6, A/G варианта гена TNF-a (-308G/A) - высоким уровнем TNF-a, G/A варианта гена PTPN22 (rs2476601) - высокими значениями провоспапительных цитокинов: IL-2 и IFN-y. Наличие в геноме G/G варианта гена IL-6 (-174G/C),T/T варианта гена TGF-ßl (-509 С/Т), A/G и А/А вариантов гена TNF-a (-308G/A)) ассоциировано с гиперхолестеринемией >6,2ммоль/л).

2. Дополнительными дифференциально-диагностическими критериями нестабильного течения стенокардии являются: уровень IL-6 > 5 пг/мл и лептина > 4 нг/мл в сыворотке крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Силаев, A.A. Исследование некоторых показателей иммунореакгивности у кардиохирургических больных / A.A. Силаев, Е.П. Турмова, В.В. Волков, Е.В. Маркелова, Д.Б. Андреев // Российский кардиологический журнал 2005. - № 5. - С.50-54.

2. Маркелова, Е.В. Значение трансформирующего фактора роста-ß и матриксной металлопротеиназы-9 в патогенезе атеросклероза / Е.В. Маркелова, Е.П. Турмова, A.A. Силаев, Н.И. Грачев, Е.А. Бычков, И.В. Чикаловец // Российский иммунологический журнал - 2010. - Т. 4 (13), №3.-С. 261-266.

3. Турмова, Е.П. Изучение продукции ММР-9 и ТФР-ß у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей / Е.П. Турмова, Е.А. Бычков, A.A. Левицкий // Актуальные вопросы аллергологии и иммунопатологии»: сб. статей 8-ой регион, научно-практ. конференции / под ред. Е.В. Просековой, В. В. Деркач - Владивосток, 2010. - С. 91-92.

4. Турмова, Е.П. Особенности регуляторного влияния цитокинов в патогенезе коронарного атеросклероза / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, A.A. Силаев, Н.И. Грачев, P.M. Громовой // Российский аллергологический журнал - 2010. -№5. - Труды межрегионального форума «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии-междисциплинарные проблемы, 27-30 сентября 2010, г. Санкт-Петербург. - С. 295-296.

5. Турмова, Е.П. Оценка уровня трансформирующего фактора роста ß у пациентов с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, A.A. Левицкий // Вестник уральской академической науки. - 2010. - № 2 (29). - Материалы VIII конференции иммунологов Урала, 28-30 июня 2010 г., Сыктывкар. - С. 213.

6. Турмова, Е.П. Патогенетические аспекты цитокиновой регуляции при атеросклерозе / Е.П.. Турмова, Е.В. Маркелова, A.A. Силаев A.A. Левицкий, Е.А.Бычков // Российский аллергологический журнал - 2010. - № 1. - Труды национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология -практическому здравоохранению», 25- 26 февраля 2010 г., Москва. -С. 173-174.

7. Turmova, Е.Р. Estimation of cytokines (IL-6,IL-8, IL-10, IL-2), soluble receptors (SRIL-6, SRIL-2) and nitrogen oxide at atherosclerosis: abstr. 14th intern, congr. of immunology, Kobe, Japan, Aug. 23, 2010 / E.P. Turmova, E.V. Markelova, A.A. Leevitskiy, E.A. Bichkov, A.A. Silaev, G. D Sim, R. M. Gromovoy , R. S. Pankratev, N. I Grachev, I. V. Chikalovets // Materials of 14 th international Congress of immunology Kobe. International Immunology - 2010. - Vol. 22, suppl. l.-P. 142.

8. Турмова, Е.П. К вопросу о роли цитокинов в патогенезе ишемической болезни сердца на фоне коронарного атеросклероза / Е.П. Турмова, A.A. Силаев, Н.И. Грачев, P.M. Громовой, И.Г. Домжалов //Дни иммунологии в Сибири: матер. Всерос. научно-практ. конф. с междун. участием. - Абакан: Изд-во Хакасского гос. ун-та им. Н.Ф. Катанова, 2011. - С. 86-87.

9. Турмова, Е.П. Мониторинг содержания цитокинов и липидного спектра при экспериментальной гиперлипидемии / Е.П. Турмова, A.A. Григорюк, П.А. Лукьянов, И.Г. Агафонова, A.B. Цыбульский // Сибирский медицинский журнал - 2011. - № 4. - С. 59-62.

10. Турмова, Е.П. Оксидантный статус и дисфункция эндотелия (экспериментальное исследование) /Е.П. Турмова, Е.А. Бычков, A.A. Григорюк, П.А. Лукьянов, Е.А. Чагина // Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - № 2. - С. 496-498.

11. Турмова, Е.П. Роль MMP-9/TIMP, TNF-a и его рецептора TNF-aRII в развитии послеоперационных осложнений в кардиохирургии / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, A.A. Силаев // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии: сб. статей и тезисов IX регион, научно-практ. конф. / под ред. Е.В. Просековой, В. А. Сабыныч - Владивосток, 2011. - С. 80-81.

12. Турмова, Е. П. Роль нарушений цитокинового статуса и общей антиоксидантной активности в развитии эндотелиальной дисфункции при экспериментальной гиперлипидемии [Электронный ресурс] / Е.П. Турмова, П.А. Лукьянов, A.A. Григорюк, Е.А. Бычков // Фундаментальная наука в медицине: мат. VI Научно- практ. конф. - Владивосток, 2011 - С. 80-88. -Режим доступа: http://www.piboc.dvo.ru

13. Способ моделирования атеросклероза»: пат. 2500041, Российская Федерация; МПК: G09B; G09B23/28 / Григорюк A.B., Турмова Е.П., Маркелова Е.В.; заявитель и патентообладатель Владив. гос. мед.ун-т; заяв. 20.12.2012; опубл. Бюл. № 33. - С. 1-23.

14. Турмова, Е. П. Влияние 1,6-0-глюкана из дальневосточной мидии «Crenomytilus Grayanus» (Митилана) на липидный спектр и цитокиновый профиль сыворотки крови при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, В.Е. Красников, Бычков Е.А., Лукьянов П.А. Чикаловец И.В., Григорюк A.A. // Фундаментальные исследования. - 2012.- № 11. - С. 46-50.

15. Турмова, Е. П. Изучение применения иммуномодулятора «Галавит» при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, A.A. Григорюк, Е.А. Бычков , Е.В. Маркелова, И.В. Чикаловец // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85) - С. 323-326.

16. Турмова, Е.П. К вопросу об иммунных механизмах патогенеза атеросклероза / Е.П. Турмова, A.A. Силаев, И.Г. Домжалов, P.M. Громовой // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 4. - С. - 361-366.

17.Турмова, Е.П. К вопросу о влиянии биоглюкана из дальневосточной мидии Crenomytilus grayanus (Митилана) на цитокиновый профиль при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, В.Е. Красников, Е.А. Бычков, П.А. Лукьянов, И.В. Чикаловец // Российский аллергологический журнал - 2012. - № 5 (вып.1). - Труды межрегионального форума «Клиническая иммунологияи аллергология -междисциплинарные проблемы», 25-27 сентября 2012 г., Казань. - С. 260-261.

18 Турмова, Е.П. Мониторинг показателей структурно-функционального повреждения сосудов при экспериментальном атеросклерозе / Е.П. Турмова, A.A. Григорюк, Е.В. Маркелова, Е.А. Коцюрбий, О.Б. Щедрина, И.Г. Агафонова, В.Е. Красников, Н.К. Пашко // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. 19, № 2. - С. 276-279.

19 Турмова, Е.П. Развитие эндотелиальной дисфункции при экспериментальной гиперлипидемии / Е.П. Турмова, П.А., Лукьянов, A.A. Григорюк, Е.А. Бычков, A.B. Цыбульский // Тихоокеанский медицинский журнал - 2012. - № 1. - С.97-100.

20. Здор, В.В. Изменения уровня цитокинов и морфологических параметров под влиянием эндокринных и метаболических нарушений в организме крыс в эксперименте / В.В. Здор, Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, Я.Н. Тихонов, A.A. Григорюк // Российский аллергологический журнал -2013. - № 2. - Труды XII

Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии», 11-13 марта, 2013 г., Москва. - С. 108-109.

21. Силаев, A.A. Анализ эффеетивности цитокинотерапии в послеоперационном периоде у пациентов с коронарным атеросклерозом /

A.A. Силаев, Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, P.M. Громовой, И.Е. Голуб, Е.В. Шкорик, A.A. Хелимский // Тихоокеанский медицинский журнал -2013. -№3.- С. 18-21.

22. Турмова, Е.П. Анализ генетического полиморфизма при коронарном атеросклерозе / Е.П. Турмова, A.A. Силаев, В.Г. Раповка, В.Е. Красников, И.Е. Голуб, М.Л. Филипенко, H.A. Оськина // Российский аллергологический журнал - 2013. - № 2. - Труды XII Международного конгресса «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии», 11-13 марта, 2013 г., Москва. - С. 292-293.

23.Турмова, Е.П. Изменение продукции цитокинов при развитии послеоперационных воспалительных осложнений у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий / Е.П. Турмова, A.A. Силаев,

B.Г. Раповка, Е.В. Маркелова, И.Е. Голуб // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -

2013. -№ 1 (89) - С. 190-193.

24. Турмова, Е.П. Патогенетическое обоснование применения иммуномодулятора «Галавит» при облитерирующем атеросклерозе нижних конечностей / Е.П. Турмова, Е.А. Бычков, A.A. Семенихин // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии: сб. статей и тезисов XI регион, научно-практ. Конференции, 11 апр.2013, Владивосток / под ред. Е.В. Просековой, В. А. Сабыныч - Владивосток, 2013. - С. 85-87.

25. Турмова, Е.П. Особенности цитокинового статуса у больных с атеросклерозом / Е. П. Турмова, Е. В. Маркелова, A.A. Силаев, П.А. Лукьянов, И.В. Чикаловец // Медицинская иммунология. - 2014. -Т. 16, № 4. -С. 323-332.

26. Турмова, Е.П. Оценка полиморфизма гена PTNFRS2476601 (G/A) в патогенезе атеросклероза / Е.П. Турмова, A.A. Силаев, Е.А. Чагина // Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики: сб. статей и тезисов XII регион, научно-практ. конференции, 2930 апр.2014, Владивосток / под ред. Е.В. Просековой, В. А. Сабыныч, Е.В. Маркеловой - Владивосток, 2014. - С. 43-44.

27. Турмова, Е.П. Оценка полиморфизма генов-кандидатов иммуноопосредо-ванного воспаления для определения предрасположенности к атеросклерозу: информ. письмо / Е.П. Турмова, Е.В. Маркелова, A.A. Силаев. - Владивосток,

2014.-15 с.

28. Шкорик, Е.В. Оценка роли трансформирующего фактора роста ßl в развитии осложнений у пациентов с ишемической болезнью сердца после аортокоронарного шунтирования / Е.В. Шкорик, Е.В. Маркелова, А.А.Силаев, Е.П. Турмова, П.В. Шелленберг // Фундаментальные исследования. - 2014. - № 7. - С.604-609.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - артериальная гипертензия АС - атеросклероз

АКА (ИБС) - атеросклероз коронарных артерий с выраженными клиническими проявлениями ишемической болезни сердца АОА-антиоксидантная активность ГЛ - гиперлипидемия Гт - галавит

ИБС - ишемическая болезнь сердца ИМ - инфаркт миокарда КА-коэффициент атерогенности Мт — митилан

ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛПВП - липопротеины высокой плотности НК - нижние конечности

ОАНК - облитерирующий атеросклероз нижних конечностей

ОИ - оксидантный индекс

ООА - общая оксидантная активность

ПОЛ - перекисное окисление липидов

РААС- ренин-ангиотензин-альдостероновая система

САС - симпато-адреналовая система

ТГ-триглицериды

ФР - факторы риска

ХС - холестерин

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

IFN-y- интерферону

IL-2R - растворимый рецептор к IL-2

IL-6R - растворимый рецептор к IL-6

ММР-9 - матриксная металлопротеиназа-9

NADPH-диафораза - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate - diaphorase PTPN22 - ген протеин-тирозин фосфатазы, не рецепторного типа 22 (регулирующий функциональную активность лимфоцитов). TGF-P - транформирующий фатор роста р Th - Т-хелперы

TIMP-1 и 2 -тканевой ингибитор металлопротеиназы-9 - 1 и 2 типа TNF-a - фактор некроза опухоли a

TNF-aRI и TNF-aRII - растворимые рецепторы к факторам некроза опухоли а 1 и 2 типа

На правах рукописи

Турмова Екатерина Павловна

АТЕРОСКЛЕРОЗ: ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЗВЕНЬЯ ПАТОГЕНЕЗА (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология 14.03.03 - Патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

I

Челябинск - 2015

Подписано в печать 12.03.15 Формат 60x84/ie.

Бумага писчая. Уч.- изд. л. 2,0. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии ООО "Литера V", 690091, г. Владивосток, ул. Светланская, 31В e-mail: litera_v@mail.ru

1 5 - - 5 2 7 3

2010017085

2010017085