Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Иммуногенетические механизмы электроакупунктурной анальгезии

На правах рукописи

\ \

ЦОГОЕВ Алан Сергеевич

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭЛЕКТРОАКУПУНКТУРНОЙ АНАЛЬГЕЗИИ

14.00.51 - Восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Тула- 2005

Работа выполнена в ГУП НИИ новых медицинских технологий (г. Тула) и на кафедре молекулярной биологии Хенаньского медицинского университета КНР

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор КАЧАН Александр Трофимович Доктор медицинских наук, профессор ХАДАРЦЕВ Александр Агубечирович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор ЖУРАВЛЕВ Борис Васильевич Доктор медицинских наук, профессор ТЕБЛОЕВ Константин Иналович Доктор медицинских наук, профессор АГАСАРОВ Лев Георгиевич

Ведущая организация - Московская медицинская академия им И.М.Сеченова

заседании диссертационного совета Д.208.27106 при Тульском государственном университете по адресу: 300600, г. Тула, ул. Болдина, 128.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тульского государственного университета по адресу: 300600, г. Тула, пр. Ленина 92.

Защита состоится

2005 года в часов на

Автореферат разослан «_»

2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А.З. ГУСЕЙНОВ

J0635W

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема боли является одной из самых актуальных и трудных проблем медицины и биологии, в частности восстановительной медицины. Изучение и объяснение иммуногенетических механизмов аку-пункгурной анальгезии с позиции современных данных о нейрональных и нейрохимических процессах организации и центральной интеграции «болевого потока», роли эндогенных антиноцицептивных систем в регуляции болевой чувствительности, а также нейрохимических механизмов опиатной и стимуляци-онной анальгезии, опиатных рецепторов и их эндогенных лигандов (нейропеп-тидов) важны для понимания этих процессов и поиска новых возможностей в борьбе с болью.

Ранее сообщалось, что метионин-энкефалиновая иммунореактивность (MEK-IR) и лейцин-энкефалиновая иммунореактивность (LEK-IR) в спинном мозге крыс после акупунктуры были ослаблены, из-за акупунктурной стимуляции высвобождения МЕК и LEK из спинного мозга, с обезболивающим эффектом (Han J. S.; 1984. Fei H., 1986.). В другом эксперименте также показано, что акупунктура может вызывать генную экспрессию c-fos и препроэнкефалина (ppENK) в хромаффинных клетках надпочечников крыс (Lieu F. Y., 1997).

Имеются сведения о том, что глия может играть более активную роль в си-наптической функции и механической анальгезии, продуцируемой периферическими повреждениями, и в спинальной глии была обнаружена экспрессия ин-дуцибельной синтазы окиси азота (¡NOS) матричной РНК (mRNA) (Meiler ST, 1994; McMicking J, 2002). Связь между акупунктуры и генной экспрессией iNOS, а также связь между эффектом акупунктуры и генной экспрессией c-fos, ppENK и iNOS в спинном мозге мышей до сих пор не освещена. Более того, нет сообщений об эффекте акупунктуры на MEK-IR и динорфиновую иммунореактивность (Dyn-IR) спинного мозга мышей.

Макрофаги - это один из видов иммунокомпетентных клеток, играющих важную роль в специфическом и неспецифическом иммунитете. Они способны высвобождать различные биологические медиаторы, включая нейротрансмит-теры и цитокинины. (Nobel С. S.,1995; Zurawski G., 1986). Кроме того, макрофаги возбуждают рецепторы для МЕК и Dyn, и могут высвобождать биологиче-

РОС H ХЦИОНаЛЬНДЗ) БИЬЛИОТГКА С Петербург

200 j PK

ски активные медиаторы, включая МЕК и Dyn (Weisinger G., de Cristofaro D., 1992; Cui X., 2003).

В проводимых ранее экспериментах было обнаружено воздействие акупунктуры на регуляцию макрофагов ¡NOS генной экспрессии (Guo, 1997; Ji RR, Zhang Q, Han JS., 1993), но о влиянии акупунктуры на макрофаги MEK-IR и Dyn-IR мышей не сообщалось, поэтому представляется актуальным выяснить возможности акупунктуры активировать генную экспрессию c-fos, ppENK и iNOS макрофагов.

Акупунктура может усиливать трансформацию лимфобластов, бактерицидные функции PMN и цитотоксичность NK (Cui X., 1995; Wang H., 1995; Sun W., 1996; McMicking J., 2002). В предшествующих работах было обнаружено, что E-розетки особенно активные, трансформация лимфобластов, а-нафтил-ацетат-эстераза (ANAE) фокальный паттерн лимфоцитов, Т4 субпопуляция и циркулирующие лимфоциты с метионин-энкефалин иммунореактивностью и их рецептор MEK-IR могут увеличиваться в акупунктурной группе; и лимфоциты с активным MEK-IR так же проявляли ANAE фокальный паттерн (Cui X., 1995; McMicking J., 1997; de Vera M E., 1996; Garcion E., 2001). Влияние акупунктуры на надрегуляцию генной экспрессии ppENK и c-fos у крыс также изучалось в предыдущих исследованиях. Генная экспрессия c-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах до сих пор не изучалось. Установлено, что электропунктура частотой 2 ГЦ может приводить к высвобождению МЕК, в то время как электростимуляция 100 Гц ассоциирована с выбросом ди-норфина в спинномозговую жидкость пациента (Martin J., Del Pozo V., 1997; Yokoyama M., 1996; Kwon O.J., 1997). Сообщений по изучению уровня MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов нами не было найдено. Влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fos и ppENK в мышиных лимфоцитах исследовалось с помощью situ гибридизации, РНК дот блотгинга; иммунореактивность Dyn и МЕК в мышиных лимфоцитах и плазме пациентов исследовалась нами методами иммуногистохимии и протеин дот блоттинга.

Цель исследования: выявить закономерности влияния анальгезии, вызванной методом электроакупунктуры, на экспрессию генов и иммунореактивность.

Задачи исследования:

1. Выяснение значимости iNOS/NO, как функционального маркера макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR взаимосвязи со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.

2. Изучение роли опиатной системы в обезболивании и ее зависимости от электроакупунктурного влияния.

3. Вьивление взаимосвязи между генной экспрессией МЕК и ppENK, c-fos и iNOS в перитонеальных макрофагах.

4. Выявление взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках, и разрешение существующих в этом вопросе противоречий.

5. Изучение влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах.

6. Изучение влияние акупунктуры на уровень MEK-IR и Dyn-Ir в плазме пациентов.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые выявлена и доказана взаимосвязь между анальгетическим эффектом и генной экспрессией c-fos, ppENK, iNOS и экспрессией МЕК и Dyn в спинном мозге и иммунных клетках, что свидетельствует о системных эффектах акупунктурной анальгезии.

Впервые исследовано влияние акупунктуры на генную экспрессию спинальной iNOS, и доказана возможность 5 Гц электроакупунктуры надрегулиро-вать генную экспрессию iNOSmRNA, в основном, локализованную в астроци-тах; c-fosmRNA - локализованную в III-V VII слоях спинного мозга.

Впервые обнаружена позитивная корреляция в альтерации между c-fosmRNA и ppENKmRNA и между c-fosmRNA и iNOSmRNA, iNOS активностью, и выявлено легкое повышение генной экспрессии ppENKmRNA, локализованной в поверхностном слое спинного мозга.

В результате проведенного исследования выяснено, что iNOS/NO, как функциональный маркер макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR имеют взаимосвязь со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.

5

Проведенное исследование выявило наличие межсистемной взаимосвязи между генной экспрессией с-Лю и ррЕЫК в спинном мозге и иммунных клетках. Экспрессия ррЕМКтЮЧА в спинном мозге следовала за экспрессией с-РоБтЯКА, предполагая, что для генной экспрессии спинальной ррЕЫК может требоваться новопротеин, как трансактиватор, в то время как с-йэзтКМА и ррЕЫКтЯЫА мышиных макрофагов и лимфоцитов показали одинаковую интенсивность сигналов экспрессии. Доказано, что фосфорилированная СПЕВ может являться трансактиватором экспрессии обоих генов в иммунных клетках, и что существуют различия экспрессии в спинном мозге и иммунных клетках.

Научно-практическая значимость исследования. Проведенное исследование позволило разрешить существующие в современной литературе противоречивые данные о взаимосвязи между генной экспрессией с-Аэб и ррЕГ^К в спинном мозге и иммунных клетках.

Выявлена четкая позитивная корреляция между надрегуляцией генной экспрессии с-Ров и ррЕЫК, сопровождающаяся выраженным анальгетическим эффектом, доказывающая наличие взаимосвязи между генной экспрессией с-Аэб и ррЁ>1К и участие с-Аов в транскрипции ррЕЫКшЯЫК.

Кроме того, показано, что Буп-Ж циркулирующих-Лимфоцитов был выше в электроакупунктурной группе в сравнении с контрольной, позитивно коррелируя с сигналами с-й)8т1ША и ррЕЫКтКМА,' это4 объясняется тем, что с-Аов протеин может вовлекаться в транскрипцию как ррБ, так и ррЕ, и количество животных с активным лимфоцитарным Бул-ГО. было выше, чем с активным лимфоцитарным МЕК-Ш. Результаты свидетельствуют о том, что при электростимуляции частотой 5 Гц высвобождение ¡гБуп гораздо менее активно, чем ¡гМЕК.

Проведенное исследование позволило изучить взаимосвязи между анальгетическим эффектом и генной экспрессией с-й«, ррЕМС, ¡N08 и экспрессией МЕК и Буп в спинном мозге и иммунных клетках. Нами было выяснено, что ¡Ы08/Ы0, как функциональный маркер макрофагов, макрофагаль-ные/лимфоцитарные с-Го$т1ША, ррЕЫКтКМА, МЕК-Ш и Бул-ГО. имеют взаимосвязь со спинальной ¡N08, с-Аоб, ррЕЫК и экспрессией МЕК и Буп в процессах нейроиммуномодуляции.

В настоящем исследовании доказана позитивная корреляция между возрастанием экспрессии ¡МОЭтЮ^А и выраженной анальгезией при акупунктур-ной стимуляции, и то, что легкая периферическая травма может приводить к надрегуляции генной экспрессии ¡N08 в спинномозговой глии, которая может быть вовлечена в синаптическую функцию, приводящую к анальгезии, а позитивная корреляция между спинальной ¡1ЧОЗтЯНА и с-йэятЮ^А, предполагает, что ¡N08 и с-Аэв гены могут иметь общие трансактиваторы.

к

Проведенное изучение влияния акупунктуры на регуляцию генной экспрессии ¡N08 и ¡N08 активности, позволило показать возможность данного > метода лечения повышать резистентность (иммунный ответ) к болезням, при

этом возрастающее количество высвобождающейся N0 не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры. Кроме того, стимулирующее воздействие электроакупунктуры на нейроиммуномоду-ляцию подтверждается в данной работе альтерацией МЕК и Буп в спинном мозге и макрофагах.

В проведенном исследовании изменение уровня болевого порога использовалось как маркер эффективности акупунктуры, и полученные результаты подтвердили надежность этого способа визуализации и объективизации получаемых в процессе работы данных.

Апробация работы. Материалы исследований доложены на 12 научно-практических конференциях (из них 7 - Международных, 2 - Всероссийских, 1- региональной). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на международном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); VI международном конгрессе научной акупунктуры (Стамбул, 1994); симпозиуме «Акупунктура и ци» \VFAS 95 (Стамбул, 1995); Первом конгрессе Европейской ассоциации акупунктуры (Бухарест, 1995); VII Международном конгрессе ЮМАЯТ (Дания, 1996); Втором научном конгрессе «Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты» (Чебоксары, 1996); конгрессе "Традиционная медицина - 2000" (Элиста, 2000); Международном конгрессе 1СМАЯТ (Эдинбург, 2002); 2ом Международном конгрессе интегративной медицины (Пекин, 2002); конференции «Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Владикавказ, 2003).

Апробация осуществлена на заседании ученого совета ГУЛ НИИ новых медицинских технологий и кафедры внутренних болезней Тул ГУ (2005).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в практическую работу врачей ВМУУЗ городской поликлинике №1 и Республиканского центра восстановительной медицины и ребилитации, г.Владикавказа. Материалы исследования вошли в систему теоретической и практической подготовки врачей, слушателей кафедры медицинской реабилитации и физических методов лечения СОГМА, в работу отдела новых технологий и восстановительной медицины Института биомедицинских исследований ВНЦРАН и Правительства РСО-Алания, г.Владикавказа и в работу ГУЛ НИИ новых медицинских технологий (Тула).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 4 статьи в зарубежных журналах и 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего публикации отечественных авторов и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована _таблицами и _рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

1. Электроакупунктура частотой 5 Гц оказывает активное влияние на нейроиммуномодуляцию и может надрегулировать как генную экспрессию c-fosmRNA и ppENKmRNA в мышином спином мозге и лимфоцитах, так и генную экспрессию c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA и iNOS активность в мышином спинном мозге и перитонеальных макрофагах.

2. Под воздействием электроакупунктуры частотой 2-4 Гц происходит увеличение уровня MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов, особенно MEK-IR; а электроакупунктура частотой 5 Гц приводит к уменьшению спинальных irMEK и irDyn, особенно irMEK, и повышению уровня MEK-IR и Dyn-IR мышиных перитонеальных макрофагов, больше MEK-IR, доказывает большее высвобождение irMEK в сравнении с irDyn.

3. Имеются общие трансактиваторы для обоих генов с-Л>зт1ША и ¡МОЗтШЯА, такие как ОТ-карра р, а с-Роэ протеин вовлечен в генную экспрессию ррЕИК, равно как и в генную экспрессию ррЭ.

4. Фосфолирированная СЯЕВ может являться трансактиватором экспрессии обоих генов с-йип^ША и ррЕИКтЯЫА в иммунных клетках (макрофагах и лимфоцитах), и существует различие экспрессии этих генов в спинном мозге и иммунных клетках, проявляющееся временной разницей появления одинаковых по силе сигналов (через 4 часа после электроакупунктуры экспрессия ррЕМКтКЫА в спинном мозге следовала за экспрессией с-АэбгпЮЧА), предполагая, что для генной экспрессии спинальной ррЕ1ЧК может требоваться ново-протеин как трансактиватор.

5. Изменение болевого порога может быть использовано как маркер эффективности электроакупунктуры.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объект исследования

Проведено исследование спинного мозга, перитонеальных макрофагов, лимфоцитов 60 ВА1ЛЗ/С мышей весом 20-22гр (контрольная группа - 20) и плазмы крови 60 пациентов с острой болью (из них 42 человека с болью, обусловленной грыжами межпозвонковых дисков, 18 человек - с острой почечной коликой), для выяснение имеет ли ¿МОв/МО, как функциональный маркер макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные с-ГовтКЫА, ррЕИКтЮЧА, МЕК-Ж и Бул-ГО. взаимосвязь со спинальной ¡N08, с-Азя, ррЕТЧК и экспрессией МЕК и Оуп в нейроиммуномодуляции, и для выявления взаимосвязи между генной экспрессией с-Роя и ррЕЫК в спинном мозге и иммунных клетках и решения существующих в этом вопросе противоречий..

2. Методы исследования

2.1. Определение уровня болевого порога

80 ВАЬВ/с мышей весом около 20г-22г были инъецированы перитонеально 1.0 мл стерильного 4% крахмала растворимого в нормальном физрастворе и после 48ч разделены на 2 группы: а) электроакупунктурная группа, получавшая 1,5 в, 5 гц электроакупунктуру в билатеральные "Цзусаньли" точки в течение 15 мин; б) контрольная группа, не получавшая электроакупунктуру, но так же

9

фиксируемая в течение 15 мин. Порог болевой чувствительности определялся до и после электроакупунктуры или фиксации с помощью К+ ионофореза. Электростимуляция точек акупунктуры проводилась на аппарате фирмы «Шань си» Шанхай.

Периферическая кровь 60 пациентов с острой болью была взята до и после сеанса электроакупунктуры частотой 2-4 Гц и экспозицией 30 минут в билатеральные Zusanli и Hegu точки.

2.2. Техника выделение и обработка спинного мозга

Спинной мозг мышей, включая шейный и поясничный отделы, был извлечен, разделен на 2 порции: первая подготавливалась в парафиновых секциях для определения iNOSmRNA, ppENKmRNK и c-fosmRNA с помощью situ гибридизации. Другая порция замораживалась при -20°С. Замороженный спинной мозг смешивался с 0,1мл физраствора, как тканевым гомогенизатором, и спинномозговая суспензия помещалась в центрифугу 5000 об\мин на 20 минут, 10 мкл супернатанта блоттингировались на нитроцеллюлозную мембрану. Высохшие дот образцы, один дот на каждое животное, были приготовлены для РНК дот блоттинга (детекция iNOSmRNA, ppENKmRNK и c-fosmRNA) и протеин дот блоттинга (детекция iNOS активности). BCIP/NBT был использован, как субстрат для развития цвета. Физраствор был протеолизирован с рибонуклеазой для негативного контроля. Техника протеин дот блоттинга была использована согласно предыдущим исследованиям. Дот блот сигналы сканировались 528нм волнами на Shimadu TLC сканере и анализировались статистически.

2.3. Техника сбора и выделения перитонеальных макрофагов

Для сбора и выделения перитонеальных макрофагов каждой мыши вводился 1.0 мл физраствора перитонеально. Генная экспрессия c-fos, ppENK и iNOS определялась методами situ гибридизации и РНК дот блоттинга, iNOS активность определялась с помощью NADPN-NBT гистохимического анализа и протеин дот блоттинга. Суспензия макрофагов (10 мкл) в концентрации 1x10s клеток/мл блоттингировались на нитроцеллюлозную мембрану (NCM). Высохшие дот образцы, один дот на каждое животное, были приготовлены для детекции РНК и протеин дот блоттинга. BCIP/NBT (Promega) был использован, как субстрат для развития фиолетового цвета. Физраствор использовался, как заменитель субстрата и был протеолизирован с рибонуклеазой для негативного

10

контроля. Техника протеин дот блоттинга была использована, согласно предыдущим исследованиям. Дот блот сигналы сканировались 528 нм волнами на Shimadu TLC сканере и проанализированы статистически.

2.4. Техника сбора и выделения циркулирующих лимфоцитов

Циркулирующие лимфоциты извлекались из периферической крови по

градиентной плотности. Суспензия лимфоцитов концентрацией 1x10® клетки/мл разделялась на две части: одна часть блотгингировалась на предметное стекло для определения c-fosmRNA, ppENKmRNA методом situ гибридизации, и для определения MEK-IR и Dyn-IR с помощью иммуногистхимии. Другая часть блотгингировалась на NCM для детекции c-fosmRNA и ppENKmRNA с помощью РНК дот блоттинга, и определения MEK-IR и Dyn-IR протеин дот блот-тингом, один дот на каждое животное. BCIP/NBT был использован, как субстрат для развития фиолетового цвета, DAB - как субстрат для развития коричневого цвета, Физраствор был использован как заменитель для первого антитела и протеолизирован с рибонуклеазой для негативного контроля. Техника протеин дот блоттинга была использована согласно предыдущим исследованиям. Дот блот сигналы сканировались 528 нм волнами на Shimadu TLC сканере и анализировались статистически.

2.5. Техника подготовки дот проб

Два вида высохших дот проб, один дот для каждого животного, инкубировались с поликлональными анти-МЕК (INC) и анти-Dyn (INC) сыворотками (II ООО свежее разведение) 12 часов при температуре 4°С следом за инкубацией со вторым антителом (HRP-меченный стафилококковый протеин А), 1:40 свежеприготовленный раствор при З^'С 60 мин, DAB и Н202 были использованы в качестве субстрата для развития цвета. Физраствор был использован для первого и второго антител в качестве негативного контроля. Протеин дот блоттинг техника была использована согласно предыдущим исследованиям. Дот блот сигналы были сканированы 528 нм волнами на Shimadu TLC сканере и проанализированы статистически.

Первичная проба свободной меченой кДНК

The Prime-a-Gene labeling система основана на методе, открытом Feinberg и Vogelstein, в котором смесь свободных гексануклеотидов использовалась для синтеза начальной ДНК из нескольких линейных двойных нитей матричной

ДНК. С помощью этого простого метода стало возможным проводить пробы экстремально высокоспецифичной активности, в том числе использование фрагментов ДНК напрямую выделенных из агара. С тех пор как ДНК используется как образец и остается интактной в процессе реакции, минимальное количество ДНК (25нг) может быть маркировано высокой активностью. Обычно более 70% меченых дезоксирибонуклеотидов могут объединяться. Полученные результаты проб часто более чем на 50% длиннее оригинального образца. Для проведения пробы использовался ТЕ буфер (10 ммоль/л Tris-HCl, pH 8.0; 1 ммоль/л EDTA), маркировочный буфер (250 ммоль/л Tris-HCl, pH 8.0; 25 ммоль/л MgCl2; 10 ммоль/л DTT; 1 ммоль/л HEPES, pH 6.6; 26 А260 ед/мл свободные гексадеоксирибонуклеотиды), dNTPs, Bio-II-dUTP, меченых и немеченых dATP, dGTP, dCTP.

ppENK олигонуклеотидная проба:

Олигонуклеотидные пробы были синтезированы и очищены с помощью Operon Technologies. Для детекции ppENK mRNA использовался 45-мерный олигонуклеотид (15-GGAGGCAGGACCCAAGCGCTACGAGCCAGATGCA AAGTCTCAGGA) комплементарный к аминокислотам 4-15 крысиной ppENK (antisense oligonucleotide), который на 75,6% гомологичен с соответствующим порядком бычьего и человеческого ppENK и имеет G/C коэффициент в 60% случаях.

Определение чувствительности меченых проб■

Чувствительность меченых проб осуществлялась на нитроцеллюлозных мембранах с различной концентрацией немеченого ppENK олигонуклеотида, c-fos cDNA и iNOS cDNA (образцы): 1нг, ЮОпг, Юпг , 1пг , 0.1пг , Опг. Прошедшие гибридизацию меченые пробы в концентрации 10нг/20ммоль/л при 42°С 12-16ч, проходили дот иммунофильтрационную пробу в DIFA. Для демонстрации сигналов гибридизации использовался BCIP/NBT субстрат (BCIP-2,6 ммоль/л, NBT - 3,3 ммоль/л , буфер II - 750 ммоль/л ).

Процедура situ гибридизации RNA дот блоттингом ■

Процедура situ гибридизации RNA дот блоттингом проводилась на нитро-целлюлозной мембране с помощью 10 нг/20ммоль/л проб Bio-c-fos cDNA, Bio-iNOS cDNA и Bio-ppENK олигонуклеозидов (1:100 разведение) при 42°С 12-

16ч. Для демонстрации сигналов гибридизации использовался BCIP/NBT субстрат (BCIP 2,6 ммоль/л, NBT - 3,3 ммоль/л, буфер II - 750 ммоль/л).

Процедура situ гибридизации для слайдовых образцов:

Процедура situ гибридизации для слайдовых образцов проводилась соответственно протоколу (Larsoon L I, Hoigarrd 1990). Для демонстрации сигналов гибридизации использовался BCIP/NBT субстрат (BCIP 2.6ммоль/л, NBT З.Зммоль/л, буфер II - 750ммоль/л. Ткани приготовленные на покровных стеклах заливались парафином.

Иммуногистохимический анализ' I Иммуногистохимичиский анализ проводился на покровных стеклах блоки-

рованных 10% нормальной кроличьей сывороткой. В данном работе использовались Anti-MEK и Anti-Dyn (кроличьи поликлональные антисыворотки, 1:800 -1:1000). Для демонстрации MEK-IR или Dyn-IR применялся BCIP/NBT субстрат. Для негативного контроля Anti-MEK и Anti-Dyn заменялись на PBS

Протеин дот блоттинг

Протеин дот блоттинг проводилась на нитроцеллюлозной мембране. В эксперименте использовались Anti-MEK и Anti-Dyn (кроличьи поликлональные антисыворотки, 1:800 - 1:1000). Для демонстрации MEK-IR или Dyn-IR применялся BCIP/NBT субстрат. Для негативного контроля Anti-MEK и Anti-Dyn заменялись на PBS.

Гистохимический анализ t Гистохимический анализ проводился на покровных стеклах и нитроцел-

люлозной мембране, которые помещались в субстрат, состоящий из 1мг ß-NADPH, 0,5 мг NBT и 1 мл PBS pH 8,0. Негативный контроль осуществлялся 1 замещением субстрата на PBS.

2.6. Техническое оснащение и статистическая обработка

Детектор уровня болевого порога WQ-9E, аппарат детекции и электростимуляции точек акупунктуры CDMI-II «Шанхай», вакуумный сушильный шкаф, автоклав PYX-DHS-40, микроскоп «Olympus», рефрижератор «Sanyo», камера глубокой заморозки «Sanyo», сканнер CS-920 «Schimadu», жидкостный дозатор «Gilson».

Анализ полученных данных проводился на IBM-совместимом компьютере с помощью пакета программ «SPSS for Windows» фирмы SPSS Inc. (1999) и

«STATISTICА» фирмы «Statsoft» (1999) с обработкой материала по группам с помощью методов вариационной статистики, включающих вычисление средних значений, стандартных отклонений, ошибок средних и других параметров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Взаимосвязь между генной экспрессией c-fos. ppENK, iNOS и акупунктурой.

Основным эффектом акупунктуры является анальгезия и усиление резистентности к заболеваниям. Кроме того, акупунктура усиливает бактерицидные функции полиморфонуклеарных лейкоцитов и цитотоксичность NK. Макрофаги являются одним из видов иммунокомпетентных клеток и играют важную роль не только в специфическом и неспецифическом иммунитете, но также способны высвобождать различные биологические медиаторы, включая ней-ротрансмиттеры и цитокинины.

В предыдущих экспериментах было установлено регулирующее влияние электроакупунктуры на генную экспрессию iNOS макрофагов. В настоящем исследовании изучалась возможность акупунктуры регулировать генную экспрессию c-fos и ppENK мышиных макрофагов. Кроме того, исследовалась взаимосвязь между генной экспрессией ppENK, c-fos, iNOS и анальгетическим эффектом.

Величина уровня болевого порога перед акупунктурой была 0,02±0,04, ниже, чем после акупунктуры, 0,38+0.04., р<0,01.

Сигналы гибридизации и iNOS активности окрасились в сине-фиолетовый цвет и все локализовались в цитоплазме макрофагов. Все сигналы гибридизации ppENK, c-fos, iNOS и iNOS активности возросли в акупунктурной группе в сравнении с контрольной.

Сканированная величина оптической плотности (OD) сигналов c-fos, ppENK и iNOS РНК дот блоттинга и iNOS протеин дот блоттинга была следующей: (таб. 1)

Таблица 1

Сканирование OD X ±S сигналов дот блоттинга в макрофагах

c-fosmRNA ppENKmRNA iNOSmRNA INOS protein

эг 9,43±0,38 9,11 ±1,38 2,91±0,36 2,63±0,33

кг 6,16±0,62 6,34±0,96 1,50±0,28 1,72±0,38

р <0,005 <0,025 <0,01 <0,005

Сигналы дот блоттинга ррЕЫК, с-Аов, ¡N08 макрофагов были также сильнее в акупунктурной группе в сравнении с контрольной.

Все сигналы дот блоттинга позитивно коррелировали с повышением уровня болевого порога в ЭА группе (таб.2).

Таблица 2

Корреляция между величиной ОБ сигнала и степенью анальгезии

Анальгезия c-fos ppENK iNOS INOS активность

г= 0,74 0,86 0,57 0,92

Р <0,005 <0,0005 <0,005 <0,0005

Кроме того, наблюдалась позитивная корреляция альтерации между c-fosmRNA и ppENKmRNA (г=0,53, р<0,05).

Интактные клетки при situ РНК дот блоттинге и протеин дот блотгинге были использованы для определения c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA и iNOS активности, все сигналы могут быть сканированы с помощью Shimadu TLC сканера для получения сравнительной OD, что облегчает статистический анализ.

Результаты показали, что уровень болевого порога заметно возрос в акупунктурной группе, оставшись без изменения в контрольной, при этом более выраженная анальгезия наступила у животных No 2, 10, 25, 29, 40, 42. Наблюдалась позитивная корреляция между c-fosm RNA и ppENKmRNA сигналами в макрофагах акупунктурной группы, которая так же позитивно коррелировала с анальгетическим эффектом.

Экспрессия протоонкогена c-fos достигает пика через 2 ч, ppENK ген начинает инициировать через 4 ч и достигает пика в центральной нервной системе крыс через 48 часов после электроакупунктуры. По нашим наблюдениям, на предметных стеклах и NCM через 4 ч после электроакупунктуры, сигналы генной экспрессии c-fos и ppENK в машинных макрофагах похожи по интенсивности, и значительно более выражены, чем в контрольной группе. Martin сообщал, что очищенные натуральными макрофаги легко проявляют уровень ppENKmRNA.

Weisinger (1992) в своих исследованиях обнаружил, что генная экспрессия ppENK может быть стимулирована свежесинтезированной c-fos или фосфоли-рированной CREB (сАМР вызванный элемент), имея отличия в разных тканях и клетках. Позже сообщалось, что генная экспрессия ppENK и экспрессия c-fos происходят в макрофагах одновременно, в отличие от этих процессов в спинном мозге. В нашем эксперименте экспрессия обоих генов совпадала по времени. Позитивная корреляция альтерации между c-fosm RNA и ppENKmRNA макрофагов доказывает, что c-fos может бьггь тесно связан с транскрипцией ppENK.

Известно, что экспрессия iNOS или NOS2 макрофагами человека, лошади, коровы, овцы, крысы, мышей и курицы играют эссенциальную роль в цитоток-сической активности направленной на различные патогены, такие как вирусы, грибки, гельмиты, простейшие и опухолевые клетки. Кроме того, экспрессия iNOS была обнаружена в макрофагах, нейтрофилах, ацидофилах, звездчатых ретикулоэндотелиальных клетках, альвеолярных макрофагах и нейроглии.

Липосахариды (LPS) и цитокиназа, такие как INFy,TNFa, IL-Iß могут увеличивать, a TGFß, IL-10 наоборот уменьшать генную экспрессию iNOS в макрофагах. Высвобождение цитокинов, IL-1, INF и TNF из активированных макрофагов может усиливать генную экспрессию iNOS, вызывая продуцирование большого количества NO. Как уже сообщалось, существует тесное взаимодействие между цитокинами, эйкозаноидами и NO. Эйкозаноиды, главным образом, продукты активной формы циклоксигеназы (СОХ2) вовлекаются в процессы регуляции иммунной системы, таким образом, N0 генерируемое в активированных макрофагах является иммунорегуляторной молекулой. В настоящем исследовании генная экспрессия iNOSmRNA и iNOS активность были более

интенсивны в АГ, чем в КГ и позитивно коррелировали с анальгетическим эффектом, доказывая, что макрофаги могут бьггь активированы эндогенными ци-токинами, индуцированными акупунктурой. Greensberg (1998) сообщал, что NF Kappa р и API являются общими трансактивирующими факторами генной экспрессии iNOS стимулированной цитокинами и генной экспрессией c-fos, вызванной АР1 активатором.

Результаты исследования показали позитивную корреляцию между сигналами c-fosm RNA и сигналами iNOSmRNA, что позволяет предположить наличие общих трансактиваторов экспрессии этих генов. Если высвобожденный N0 преобразуется в пероксинитрит, то становится очень токсичным. Небольшие количества высвобожденного N0 могут способствовать васкулярной диля-тации путем регуляции сосудистого тонуса, в то время как избыточное количество может вызывать деструкцию тканей/клеток, приводя в результате к аутоиммунным заболеваниям, т.е. N0 может являться как цитопротектором, так и цитодеструктором. Акупунктура регулирует генную экспрессию iNOS и iNOS активности, повышая резистентность (иммунный ответ) к болезням, при этом возрастающее количество высвобождающейся N0 не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры.

В предыдущих исследованиях на морских свинках иммунореактивность метионин-энкефалина (MEK-IR) и иммунореактивность лейцин-энкефалина (LEK-IR) в их спинном мозге заметно снижались после акупунктуры, свидетельствуя о том, что акупунктура может стимулировать высвобождение МЕК и LEK из спинного мозга, вызывая анальгетический эффект. Кроме того, электроакупунктура может вызывать генную экспрессию c-fosm и ppENK в хромаф-финных клетках мышиных надпочечников, но влияние электроакупунктуры на генную экспрессию c-fosm и ppENK в мышином спинном мозге до сих пор не изучалось. Meiler сообщал о том, что глия может играть более активную роль в синаптической функции и в механической альгезии при периферической травме, и при этом выявлена iNOSmRNA экспрессия в спинальной глии. Известно, что акупунктура вызывает выраженный анальгетический эффект при периферической травме. В настоящем эксперименте исследовалась связь между влиянием акупунктуры и экспрессией iNOS и генной экспрессией iNOS, ppENK и c-fos в мышином спинном мозге.

Величина уровня болевого порога перед акупунктурой была ниже, чем после акупунктуры (0,38+0,04, р<0,01) (таб.3), в контрольной группе уровень болевого порога после фиксации практически не изменился - 0,02±0,03, р>0,05 (таб.4).

Таблица 3

Значения уровня болевого порога в электроакупунктурной группе

N0. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ЭГ» 0,15 0,30 0,25 0,23 0,25 0,40 0,35 0,40 0,30 0,20 0,28

ЭГ* 0,60 0,90 0,70 0,45 0,60 0,70 0,60 0,70 0,60 0,75 0,66

N0. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

ЭГ* 0,20 0,25 0,30 0,25 0,45 0,40 0,20 0,45 0,30 0,25 0,31

ЭГ* 0,50 0,65 0,55 0,60 0,90 0,85 0,60 0,65 0,70 0,50 0,65

N0. 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

ЭГ* 0,15 0,20 0,35 0,40 0,30 0,20 0,30 0,20 0,25 0,20 0,26

ЭГ* 0,60 0,65 0,55 0,75 0,80 0,60 0,75 0,65 0,75 0,60 0,67

N0. 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

ЭГ* 0,25 0,40 0,20 0,35 0,15 0,30 0,45 0,20 0,35 0,30 0,30

ЭГ* 0,55 0,75 0,45 0,75 0,50 0,70 0,75 0,60 0,75 0,80 0,66

N0. 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

ЭГ* 0,20 0,30 0,25 0,35 0,20 0,20 0,30 0,25 0,35 0,25 0,27

ЭГ* 0,60 0,80 0,65 0,70 0,60 0,55 0,70 0,70 0,65 0,65 0,66

N0. 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

ЭГ* 0,25 0,45 0,30 0,20 0,15 0,25 0,35 0,40 0,30 0,20 0,28

ЭГ* 0,55 0,75 0,65 0,45 0,60 0,65 0,60 0,80 0,75 0,65 0,66

Таблица 4

Значения уровня болевого порога в контрольной группе

N0. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

КГ* 0,25 0,20 0,25 0,20 0,45 0,70 0,45 0,50 0,30 0,20 0,35

КГ 0,35 0,50 0,30 0,25 0,20 0,50 0,45 0,50 0,40 0,25 0,37

N0. 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

КГ* 0,15 0,35 0,40 0,65 0,30 0,25 0,40 0,45 0,20 0,30 0,35

КГ 0,45 0,30 0,25 0,45 0,30 0,30 0,50 0,45 0,25 0,40 0,37

Примечание■ Акронимы ЭГ и КГ со значком * обозначают электроакупунктурную и контрольную группы перед акупунктурой или фиксацией Акронимы ЭГ и КГ со значком # обозначают электроакупунктурную и контрольную группы после акупунктуры/фиксации

Все сигналы окрасились в фиолетовый цвет. Сигналы с-Роэ локализовались в 1-И и У-УИ слоях спинного мозга и возрастали в акупунктурной группе.

Сигналы ррЕМКт1ШК гибридизации распределились в поверхностном слое спинного мозга и слегка усилились в электроакупунктурной группе.

Сигналы ¡N08 гибридизации локализовались в цитоплазме нейроглии, особенно, астроцитах, и усиливались в акупунктурной группе. Сканированная величина ОБ с-йэзт1ША и ¡Ж)8т1^А дот блота, ¡N08 протеин дот блота представлены в таб.5.

Таблица 5

Сканированная ОБ X ±8 дот блот сигналов в спинном мозге

c-fosmRNA ppENKmRNA ШОБтЯКА ¡N08 протеин

ЭГ 3.93±0,57 3,53±0,28 4,55±1,93 4,55±1,93

кг 1,48±0,18 2,35+0,29 3,02±1,08 3,02±1,08

ЭГ,КГ, р <0,005 <0,005 <0,05 <0,05

При сравнении акупунктурной группы с контрольной спинальные с-Кю, ppENK и ¡N08 дот блот сигналы усилились.

Сканированное значение ОЭ дот блота позитивно коррелировало с аналь-гетическим эффектом из-за возрастания болевого порога (таб.6).

Таблица 6

Корреляция между значениями ОБ дот блот сигналов и анальгетическим эффектом в электроакупунктурной группе

с-й» ^08 1Ж)8 активность

г= 0,55 0,88 0,71

Р <0,05 <0,005 <0,05

Кроме того, наблюдалась позитивная корреляция между с-Аозт1ША и ррЕ№Ст!ШК (г=0,75, р<0,005), и между с-Го8т!ША и iNOSmRNA (1=0,67, р<0).

Результаты показали, что уровень болевого порога, определяемый с помощью К+ йонофореза, повышался только в акупунктурной группе, подтверждая влияние акупунктуры на мышей, особенно, на животных N0. 1, 2, 3, 5 и 10 ЭГ (Таб.3). С-Аэб протоонкоген принадлежит к ряду непосредственно ранних генов

(IEG). Экспрессия IEG быстра и скоротечна, несмотря на то, что большинство клеток в неактивированом состоянии показывают низкий уровень экспрессии c-fos. IEG экспрессия может трансформировать короткую стимуляцию в долгий ответ и его проявления меняются в различных микросредах. В гемогенных клетках c-fos экспрессия способствует клеточной пролиферации, но может вызывать апоптоз других митогенных сигналов. C-fos экспрессия в нейроне с амитозом может вызывать аккомодационный феномен и трансрегулировать другую генную экспрессию. Уже сообщалось об усилении c-fos экспрессии в крысиной ЦНС после электроакупунктуры. Guo сообщал о том, что в крысиной центральной нервной системе c-fos экспрессия достигает максимума через два часа после электроакупунктуры, в то время как экспрессия ppENK проявляется через 4 часа, а достигает своего пика через 48 часов после электроакупунктурной стимуляции. В настоящем исследовании мыши получали акупунктуру в билатеральные «Цзусаньли» утром, а спинной мозг извлекался только через 4 часа. Результаты показали, что сигналы c-fos локализовались в 1-Й и V-VII слоях мышиного спинного мозга в обеих группах, но возросли только в акупунктур-ной, получавшей электроакупунктуру в течение 15 минут. Присутствие сигналов c-fos в контрольной группе, видимо, связано с фиксацией мышей в течение 15 минут. В настоящем исследовании выявились только очень слабые проявления экспрессии ppENK локализованные в поверхностном слое спинного мозга контрольной группы и, слегка возросшие в электроакупунктурной группе, предполагая, что ppENK может начинать проявлять экспрессию через 4 часа после акупунктуры.

Существует много противоречивых сообщений о взаимосвязи между генной экспрессией ppENK и c-fos. Исследованиями Guo (1997) показано, что Fos и Jun могут стимулировать генную экспрессию препродинорфина (ppD), но не могут влиять на транскрипцию ppENK. Cui (1996), наоборот, выявил экспрессию немедленного раннего гена и ppENK гена в центральной нервной системе крыс, вызываемую акупунктурой, доказывая, что Fos/Jun могут действовать, как транскрибированные факторы для ppENK гена. Другие исследования отмечают, что c-Fos, действуя как трансактивирующий фактор, может стимулировать генную экспрессию ppENK в хромаффинных клетках. В нашем эксперименте наблюдалась позитивная корреляция между надрегуляцией генной экс-

прессии с-Аэв и ррЕМК, в основном сопровождающаяся выраженным анальге-тическим эффектом, что свидетельствует о взаимосвязи между генной экспрессией с-Аэб и ррЕ№С.

Позитивная корреляция альтерации между ррЕМКт1ШКи с-Азв предполагает, что с-Аэб может быть принимать участие в транскрипции ррЕМКтТШК, и позитивная корреляция между спинальной iNOSmRNA и с-(о5т1ША, предполагает, что ¡N08 и с-Кэб могут иметь общие трансактиваторы, такие как ОТ-ЛВ и Ар1.

Все вышеперечисленные данные убедительно показывают возможности энкефалинергических и динорфинергических систем опосредовать анальгети-ческую активность акупунктуры на сегментарном уровне. Было доказано, что электрическая стимуляция различной частоты может активировать различные системы сегментарного уровня: энкефалины или динорфины. Сейчас существует много убедительных доказательств того, что в развитии анальгетического эффекта большую роль играют прекурсоры энкефалинов. Например, прекурсор метионин-энкефалина Аг§6РЬе7, который является агонистом опиатных рецепторов и обладает более выраженной в сравнении с обычными энкефалинами анальгетической активностью при введении его в желудочки головного мозга или в серое вещество. Препроэнкефалин А является прекурсором метионин-энкефалина, продуцируется в хромаффинных клетках и принимает участие в иммунологических функциях. Препроэнкефалин мРНК представляет около четырех процентов мРНК в активированных Т-хелперах, но полностью отсутствует в неактивных. Остальные Т-хелперы содержат в своих мРНК от 0.1 до 0.5 процентов препроэнкефалина мРНК. Супернатант вызванных Т-хелперов содержит иммунореактивный МЕК. Продуцированные активированными Т клетками пептидные нейротрансмитеры идентифицирует сигнал, который потенцирует способность Т клеток модулировать нервную систему.

Каптоприл блокирует ферментативную деструкцию прекурсоров, усиливает и продлевает акупунктурную анальгезию, в то время как налоксон и антитела метионин-энкефалина А^^Ие7 приводят к ее ослаблению. Электроакупунктура с частотой 2 и 100 Гц вызывает заметно различающиеся варианты экспрессии Роб в крысином головном мозге, предполагая индивидуальные пути реализации акупунктуры различной частоты. Более того, 2 и 100 Гц стимуляция вызывает

различные проявления генной экспрессии: при частоте 2 Гц вызывается более экстенсивная и интенсивная экспрессия ppENKmRNA, чем при частоте 100 Гц, и абсолютно не прослеживается экспрессия ppDmRNA, которая значительно возрастает при стимуляции током 100 Гц. При этом обе частоты не оказывают никакого влияния на экспрессию POMCmRNA. В настоящем исследовании показано, что электроакупунктура повышает уровень нейрональной экспрессии ppENKmRNA в спинном мозге. Рост экспрессии ppENKmRNA был наиболее выражен в ипсилатеральных задних рогах спинного мозга (особенно III-IV слоях). Эти результаты свидетельствуют в пользу энкефалинергической теории акупунктурной анальгезии. Возрастающий в соответствующих ядрах головного мозга ppENKmRNA вовлекается в потенцирующее действие флюрамина. Значительное повышение ppENKmRNA в крысином мозге в процессе электроакупунктуры, потенцированное фенфлюрамином, прослеживалось в поясничном отделе спинного мозга (слои I, II), большом и дорзальном ядрах шва, околоводопроводном сером веществе, преоптической латеральной зоне, ядрах миндалевидного тела, хвостатом ядре. Умеренное повышение найдено в преоптической медиальной зоне, вентромедуллярных ядрах гипоталамуса, поясничном отделе спинного мозга (слои III, IV). Предыдущие исследования показали уменьшение MEK-IR и LEK-IR в спинном мозге морских свинок в процессе электроакупунктуры, свидетельствуя о том, что акупунктура может стимулировать высвобождение МЕК и LEK из спинного мозга, вовлекая их в реализацию анльгетического эффекта.

Центральные механизмы электроакупунктурной анальгезии продолжают исследоваться, вовлечение нейрональной популяции в процессы электроакупунктурной анальгезии до сих пор хорошо не известны, в основном, из-за трудности отслеживания нейрональных путей традиционными методами. Генная экспрессия c-fos и ppENK демонстрировалась с помощью биотинилированной c-fos-cDNA пробой и биотинилированной ppENK-Oligo-NT пробой соответственно. Показано повышение уровня болевого порога, что свидетельствует о возможности акупунктуры быстро и одновременно стимулировать генную экспрессию c-fos и ppENK в хромаффинных клетках и лимфоцитах, вовлеченных в реализацию эффекта акупунктуры. О взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK публикуется много противоречивых сообщений. Исследования

показали, что участки экспрессии c-fos, c-jun и pENK niRNA и протеин синтеза совпадают в центральной нервной системе. Результаты свидетельствуют о том, что Fos/Jun могут функционировать как транскрипционные регуляторы ppENK гена. Есть данные, что при экспрессии локализации ранних генов и ppENK, вызванной акупунктурой, Fos/Jun могут действовать как транскрипционные факторы для генной экспрессии ppENK в хромаффинных клетках.

Был применен иммуногистохимический метод с АР-1 антисывороткой для развития экспрессии c-fos, который может быть использован как маркер нейро-нальной активности в центральной нервной системе. Результаты свидетельствуют о способности акупунктуры активировать присущую боли модуляционную систему, включающую задние рога спинного мозга, затем угнетать экспрессию c-fos, вызванную болевой стимуляцией в околоводопроводном сером веществе. Fos-подобные иммунореактивные клетки, вызванные ампутацией, были обнаружены на стороне травмы в 1-Х слоях спинного мозга. Электроакупунктура "Huatuo", "Jiaji" точек угнетала экспрессию Fos вызванную ампутацией, что проявлялось уменьшением количества FLI клеток в спинном мозге. Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что импульсы электростимуляции подавляют активность болевых нейронов в спинном мозге, приводя к анальгезии. Электроакупунктурная стимуляция (100 Гц, 30 мин.) точки "Sanyin-jiao" так же вызывала экспрессию c-fos expression в крысином спинном мозге, что было продемонстрировано с помощью иммуногистохимического метода с использованием антител к c-fos. У крыс получавших электроакупунктурную стимуляцию заметное количество клеток с Fos иммунореактивностью наблюдалось в задних и передних рогах спинного мозга, с большей плотностью в III и IV слоях ипсилатеральной стороны. В I и II слое были обнаружены только единичные клетки. В противоположность этому клетки с Fos-подобной иммунореактивностью, вызванные болевой стимуляцией (5% формалин, введенный в заднюю лапу подкожно), в основном, располагались в I и II слоях, и гораздо меньше в III и IV. Экспрессия c-fos в контрольной группе, получавшей введение формалина, была очень низка в сравнении с электроакупунктурной. Это исследование определило различие специфики участков концентрации c-fos экспрессии, вызванной болевой стимуляцией и электроакупунктурой. Вовлече-

ние с-Лэя-иммунореактивных нейронов в реализацию эффекта элетроакупунк-турной анальгезии зависит от частоты стимуляции.

Воздействие токами 4 Гц и 100 Гц уряжает количество с-Аов-иммунореактивных нейронов в задних рогах спинного мозга, вызванных болевой стимуляцией на 58% и 50%, соответственно. Подавление экспрессии с-Аэв, вызванное 4 Гц электроакупунктурой полностью нивелировалось предварительным введением налоксона. С другой стороны, подавление экспрессии с-Лю, вызванной 100гц акупунктурой, только частично блокировалось опиатными антагонистами. Эти данные показывают, что высоко- и низкочастотная элктроа-купунктура способна ингибировать экспрессию с-Аэв, вызванную болевой стимуляцией, в задних рогах спинного мозга. Низкочастотная электроакупунктура включает в процесс, прежде всего эндогенные опиоидные системы, в то время как анальгезия, вызванная высокочастотной стимуляцией, реализуется не-опиоидными механизмами. Было продемонстрировано, что электроакупунктура частотой и 4 Гц и 100 Гц значительно повышают количество Ров-меченных нейронов в задних рогах Ь2 сегмента, латеральном парабрахиальном ядре, черной субстанции, ядрах шва, заднебоковом околоводопроводном сером веществе. Стимуляция частотой 4 Гц, в сравнении с контрольной группой, значительно повышало Рое присутствие в дорзальной и латеродорзальной областях околоводопроводного вещества, ядрах поводка, заднелатеральных и латеральных гипоталамических ядрах. И только одна структура ствола мозга проявлялась возрастанием РоБ-иммунореактивных нейронов в ответ на электроакупунктуру частотой 100 Гц - заднебоковые ядра продолговатого мозга Данные результаты показывают способность большого числа образований ствола мозга активироваться электроакупунктурой разной частоты, но некоторые зоны избирательно реагируют только на низкочастотную стимуляцию, что может быть связано с опиатной чувствительностью к данному виду воздействия. Эти данные говорят об индивидуальных особенностях ядер продолговатого мозга, которые могут играть роль в акупунктурной анальгезии. Низкочастотная электростимуляция точки "гизапИ" вызывает заметную экспрессию с-Азв в передней доле гипофиза и некоторых ядрах гипоталамуса. Похожий ответ передней доли гипофиза был получен при создании крысам стрессовой ситуации, но в этом случае Роб-иммунореактивные клетки распространялись до средней доли и были наиболее

изобильны в околожелудочковых ядрах. Это свидетельство того, что клетки переднего гипофиза, отвечающие на стресс, так же активируются акупунктурой или болевой стимуляцией, однако эти механизмы не одинаковы, так как в процесс включаются разные ядра гипоталамуса. Отсутствие обычных автономных ответов на физиологический стресс, таких как тахикардия или повышение артериального давления, предположило специфичность соматосенсорного посыла в гипоталамо-гипофизарную систему. После болевой стимуляции или акупунктуры не отмечалось повышения с-Азв ни в одном из этих участков у животных получавших капсаицин. Кроме того, не наблюдалось высвобождения в плазму адренокортикотропного гормона. В противоположность этому, активация гипо-таламо-гипофизарной с-Аов, спровоцированная иммобилизацией стресса, все-таки заметно уменьшается, не нивелируется капсаицином, в то время как высвобождение в плазму адренокортикотропного гормона остается без изменений.

Анальгетический эффект акупунктуры тесно связан с ее возможностью способствовать иммунорегуляции и иммунным функциям. За последние несколько лет в нескольких лабораториях изучалось влияние акупунктуры на ¡ЫОЗгпЯЫА и ¡N08. Окись азота является повсеместной биологической матричной молекулой, принимающей участие в васкулярной релаксации, иммунных функциях макрофагов и нейротрансмиссии центральной и периферической нервной системы. Эндотелиальная и нейрональная синтаза окисла азота значительно активируется введением кальция в клетки, в то время как, синтаза окисла азота макрофагов вызывается с новой РНК и синтезом протеина при иммунной стимуляции. Окись азота может принимать участие в высвобождение ней-ротрансмитеров, нейрональной проводимости, синаптических функциях и регуляции генной экспрессии. Избыточное продуцирование оксида азота нейро-токсично и вызывает различные неврологические расстройства. Продуцируемый из iNOS/NOS2 оксид азота может выполнять как защитную, так и деструктивную функции. Небольшие количества высвобожденного N0, как ней-ротрансмиттеры, могут способствовать росту нерва, синаптической пластичности, антитромботической васкулярной дилятации и защите тканей/клеток от различных патогенов. В то же время, большое количество высвобожденного N0 может вызвать поражение тканей/клеток или аутоиммунные заболевания.

Существует много сообщений о высоком уровне iNOS экспрессии в глии, особенно астроцитах при экспериментальных аутоиммунных энцефаломиелитах или других вирусных инфекциях центральной нервной системы. Некоторые авторы рекомендуют широко использовать ингибиторы iNOS в клинической практике. Wu и Meiler (1994) установили на крысах, что при хронических артритах и при периферической травме возрастает экспрессия iNOS в глии спинного мозга, участвуя в механизме гиперальгезии, предполагая, что спинномозговая глия играет роль в синаптической функции и влияет на уровень болевого порога. В настоящем исследовании доказана позитивная корреляция между возрастанием экспрессии iNOSmRNA и выраженной анальгезией при акупунк-турной стимуляции, и то что легкая периферическая травма может приводить к надрегуляции генной экспрессии iNOS в спинномозговой глии, которая может быть вовлечена в синаптическую функцию, приводящую к анальгезии.

Высокопродуктивные изоформы синтазы окисла натрия (NOS2 или iNOS) принимают активное участие во внутренних связях между природной и адаптивной иммунной системами. Непрерывный катализ происходит благодаря способности NOS2 прикреплять кальмодулин вне зависимости от усиления Са2+. Экспрессия NOS2 в макрофагах контролируется цитокининами и микробными продуктами, главным образом - транскрипционной продукцией. NOS2 была обнаружена в макрофагах человека, лошади, коровы, козы, крысы, мышей и курицы. Человеческая NOS2 наиболее легко просматривается в моноцитах или макрофагах пациентов с инфекционными или вирусными заболеваниями. Непрерывное продуцирование окиси азота обеспечивает макрофаги цитостати-ческой и цитотоксической активностью против вирусов, бактерий, грибков, простейших, гельмитов и опухолевых клеток. Антимикробная и цитотоксиче-ская активность N0 увеличивается под воздействием другой продукции макрофагов: кислот, цистеина, глутатиона, перекиси водорода. Кроме того, высокий уровень продукции окиси азота, возможно, участвует в процессе защиты организма от инфекций. Экспрессия iNOS была обнаружена и в нейтрофилах, ацидофилах, клетках Купфера, альвеолярных макрофагах и нейроглии. Мартин (1987) сообщал, что очищенные натуральные макрофаги обладают легко определяемым уровнем ppENKmRNA. Weisinger (1992) обнаружил, что генная экс-

прессия ppENK может вызываться свежесинтезированной c-fos или фосфори-

>

лированной CREB.

Липополисахариды и цитокиназа, такие как INFy, TNFa, IL-lß, могут регулировать генную экспрессию макрофагов. Высвобождение цитокининов IL-1, INF и TNF из активированных макрофагов может надрегулировать генную экспрессию iNOS к продуцированию большого количества окиси азота. Известно о существующем взаимодействии между цитокиназами, эйкосаноидами и окисью

* азота N0. Эйкосаноиды, в основном являются продуктами вызываемых форм циклоксигеназы (С0Х2) и вовлекаются в регуляцию иммунной системы. Таким

^ образом, N0, генерируемая в активированных макрофагах может рассматри-

ваться как иммунорегуляторная молекула.

Существуют доказательства, что не только макрофагальный тип синтазы окисла азота, но и эндотелиальный тип конститутивной NOS регулируется различными экзогенными раздражителями, включая цитокинины. Возможно, что патофизиологическая концентрация TNFa, выявленная у нескольких пациентов с хронической сердечной недостаточностью, может быть достаточна для уменьшения уровня конститутивной NOS и повышения вызываемых форм N0 синтазы. Постоянная физическая тренировка собак сопровождалась повышением коронаро-васкулярного уровня продукции N0 и устойчивым уровнем mRNA ecNO синтазы. Эндогенная N0 играет решающую роль в модуляции васкуляр-ного тонуса и подавления взаимодействия сосудистой стенки с моноцитами, нейтрофилами и тромбоцитами. Возможно, что альтерация ее синтеза или акти-

^ вация могут играть важную роль при некоторых кардиоваскулярных расстрой-

ствах, включая хроническую сердечную недостаточность. Последующее изуче-

* ние патофизиологической значимости N0 на экспериментальных или клинических моделях хронической сердечной недостаточности может подвести основу под улучшение терапевтических мер по усилению синтеза или активации эндогенной NO, или поддержание ее активности экзогенной донорской N0. Кроме того, в подтверждение исследованиям Melier о возможной активной роли глии в синаптической функции и механической альгезии, вызванной периферической травмой, в спинальной глии была обнаружена экспрессия iNOSmRNA. Известно, что акупунктура вызывает выраженный анальгетический эффект. Взаи-

мосвязь между акупунктурой и экспрессией ¡N08, и акупунктурой и генной экспрессией с-Аэв, ррЕЫК и ¡N08 в спинном мозге до сих пор не исследовалась.

2. Взаимосвязь между генной экспрессией с-йи. ppENK, МЕК-Ш и Пуп-Ш

Современные экспериментальные и клинические данные доказывают, что в реализации акупунктурной анальгезии принимают активное участие нейрогу-моральные механизмы. Сначала в исследованиях Пекинской группы было показано, что акупунктурная анальгезия развивается медленно и достигает своего максимума через 20-40 минут после начала стимуляции, а затем идет на спад. Динамика развития акупунктурной анальгезии не зависит от типа боли. Одинаковое развитие акупунктурной анальгезии было обнаружено при термических, механических, электрических видах воздействия на болевые рецепторы животных. Электрофизиологические исследования доказали, что после 20-25 минут активного воздействия на акупунктурные точки, угнеталась ответная реакция 5-го слоя задних рогов спинного мозга. Медленное развитие акупунктурной анальгезии не связано с высвобождением гуморальных факторов непосредственно в акупунктурные точки. Также это не было связи с вовлечением нейро-нальных ингибиторов, которые не могут продуцировать пролонгированный физиологический эффект. В экспериментах на собаках, кроликах, крысах было показано, что акупунктурные точки '^ивапН" и "Не{*и" могут вызывать анальгезию, которая определялась детекцией возрастания уровня болевого порога с помощью различных тестов не только на донорских животных, но и на реципиентах. Анальгетический эффект у реципиентов был, конечно, слабее, чем у доноров и также развивался с долгим латентным периодом. Выраженный анальгетический эффект был получен на кроликах в желудочки которых вводился лик-вор других кроликов, получивших акупунктурную анальгезию. Такой же результат наблюдался при введении подопытным кроликам сыворотки или экстракта головного мозга животных уже получивших акупунктурное воздействие. Было доказано, что анальгезия, вызванная с помощью сыворотки более выражена. Наименьший анальгетический эффект наблюдался при использовании экстракта головного мозга, вследствие присутствия энкефалинов, которые легко разрушаются, в отличие от сыворотки, которая богата медленно разрушаю-

щимся р-эндорфином, из-за чего достигается более выраженный анальгетиче-ский эффект.

Одним из путей выяснения роли эндорфина в акупунктурной анальгезии является измерение его количества в головном мозге, спинномозговой жидкости и плазме. При измерении уровня р-эндорфина в плазме при акупунктурной стимуляции были получены два противоположных результата. Хорошо известно, что острая боль значительно увеличивает уровень р-эндорфина в плазме, что является естественным физиологическим ответом. Такое возрастание р-эндорфина в плазме происходит вследствие его высвобождения из желудочков.

Изменение уровня р-эндорфина и АКТГ в плазме во время и после акупунктурной анальгезии измерялось высокочувствительным и специфичным ра-диолигандным методом. В то же время другие авторы в своих исследованиях, используя тот же метод, не смогли доказать повышения уровня р-эндорфина в плазме и усиления его выброса из желудочков. Роль эндогенных пептидов в реализации акупунктурной анальгезии была также доказана клиническими и экспериментальными данными о способности налоксона уменьшать или полностью нивелировать эффект акупунктурной анальгезии. Впервые это показал в своих исследованиях Mayer (1977). Кроме того, налоксон способен угнетать акупунктурную анальгезию при введении непосредственно под оболочку спинного мозга, что доказывает слабость опиоидных рецепторов и лигандов сегментарного уровня нервной системы в реализации эффекта акупунктурной анальгезии. Степень негативного влияния налоксона на акупунктурную анальгезию так же зависит от частоты электростимуляции точек. В данном исследовании под воздействием низкочастотной стимуляции наблюдалась медленно развивающаяся, но длительная по времени анальгезия, обусловленная эндор-финергическими процессами в ЦНС, особенно динорфином. При воздействии на точки акупунктуры высокочастотной стимуляцией достигается короткая по времени, но сильная анальгезия, связанная с другими нейрофизиологическими процессами.

На сегодняшний день накопилось много неразрешенных вопросов в теории пептидергических механизмов акупунктурной анальгезии. Существует много различных мнений о сравнительной степени важности роли энкефалина и эн-

дорфина и их корреляции. Значительное количество исследователей полагают, что эндорфины более важны в реализации акупункгурной анальгезии, т.к. медленно разрушаются и имеют длительный анальгетический эффект. Анальгети-ческая слабость энкефалинергической системы оспаривается многими исследователями, в первую очередь, Ъои О (1996). Он продемонстрировал на крысах акупунктурную анальгезию, вызванную активацией точек "гиБапН", сопровождающуюся повышением уровня ЬЕК и МЕК, определяемых радиоиммунологическим методом, в желудочках, полосатом теле, стволе головного мозга. Ин-травентрикулярная инъекция ингибиторов энкефалина значительно усиливает и удлиняет акупунктурную анальгезию, причем, уровень энкефалинов возрастает преимущественно в гипофизе и полосатом теле. Возникло предположение, что энкефалиновая система стимулируется афферентными сигналами, достигающими гипофиз, и это было доказано путем его выделения. Возрастание количества опиоидных пептидов вследствие акупунктурной анальгезии было так же обнаружено в хвостатом ядре и в околоводопроводном сером веществе кроликов. Введение энкефалиновай антисыворотки в околоводопроводное серое вещество заметно усиливало эффект акупунктурной анальгезии.

Доказано, что нейропептиды энкефалинового ряда - динорфины играют особую роль в сегментарном механизме акупунктурной анальгезии. По современным представлениям динорфины является наиболее избирательными ли-гандами опиатных рецепторов, которые концентрируются, в основном, в спинном мозге. Особенно большая концентрация иммунореактивного динорфина была обнаружена в желатинозной субстанции. Он имел меньшую анальгетиче-скую активность в сравнении с морфином и опиоидными пептидами, в то же время вызывал видимый эффект при интрацекальных инъекциях. Различные авторы показали анальгетическую активность динорфина при этом типе инъекций в 20 раз превышающую по мощности и устойчивее к инактивации в сравнении с морфином. Интрацекальное введение антидинорфиновой сыворотки заметно уменьшало анальгетический эффект акупунктуры у кроликов на протяжении четырех часов. В случаях введения сыворотки в околоводопроводное вещество среднего мозга уровень акупунктурной анальгезии не изменялся. Введение динорфина в ту же область не вызывало анальгезии.

Как показали наши предыдущие исследования, акупунктура может влиять на нейроиммуномодуляцию. Метионин-энкефалина (МЕК) и динорфина (Dyn) являются важными нейротрансмиттерами, ассоциированными с электроаку-пунктурной анальгезией различной частоты. Макрофаги являются одним из видов иммунокомпетентных клеток, играющих эссенциальную роль в специфическом и неспецифическом иммунитете. Более того, макрофаги обладают рецепторами к метионин-энкефалину и динорфину и могут высвобождать биологически активные медиаторы, включая МЕК и Dyn. Экспрессия iNOS в макрофагах, как иммунная функция, может надрегулироваться акупунктурой. Результаты данного эксперимента показали возможности акупунктуры влиять на иммуно-реактивность (IR) МЕК и Dyn мышиных макрофагов и спинного мозга.

У животных No. 2, 10, 25, 29, 40, 42 наблюдался более выраженный аналь-гетический эффект (Таб.7). Уровень болевого порога поднялся в акупунктурной группе (0,38±0.04, р<0,01), но не в контрольной группе (0,02±0,03, р>0,05) (таб.8).

Таблица 7

Альтерация уровня болевого порога в электроакупунктурной группе

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X

+0,45 +0,60 +0,45 +0,22 +0,35 +0,30 +0,25 +0,3 +0,3 +0,55

No 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

+0,30 +0,40 +0,25 +0,35 +0,45 +0,45 +0,40 +0,20 +0,40 +0,25

No 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

+0,45 +0,45 +0,20 +0,35 +0,50 +0,40 +0,45 +0,45 +0,50 +0,40 +0,38

No 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

+0,30 +0,35 +0,25 +0,40 +0,35 +0,40 +0,30 +0,40 +0,40 +0,50

No 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

+0,40 +0,50 +0,40 +0,35 +0,40 +0,35 +0,40 +0,45 +0,30 +0,40

No 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

+0,45 +0,30 +0,30 +0,35 +0,25 +0,45 +0,40 +0,40 +0,45 +0,45

Таблица 8

Альтерация уровня болевого порога в контрольной группе

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X

+0,10 +0,30 +0,05 +0,05 -0,25 +0,20 0 0 +0,10 +0,05

No 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 +0,02

+0,30 -0,05 -0,15 +0,20 0 +0,05 +0,10 0 +0,05 +0,10

Величина оптической плотности протеин дот блоттинга MEK-IR спинного

мозга в электроакупунктурной группе (33,41 ±3,52), была ниже, чем в кон-

31

трольной (68,83±7,98, р<0,01), негативно коррелируя с анальгетическим эффектом (р<0,05). Величина оптической плотности протеин дот блоттинга Оуп-Ш спинного мозга в электроакупунктурной группе (37,75±3,54), так же была ниже, чем в контрольной группе (65,46±4,42, р<0,05), негативно коррелируя с анальгетическим эффектом (г=0,60. р<0,05). Разница спинальной МЕК-Ш контрольной и электроакупунктурной групп была (3,52±0,81), меньше, чем спинальной Оуп-Ж (3,38±0,95, р<0,0005). Величина оптической плотности МЕК-Ш макрофагов в электроакупунктурной группе (65,93±8,81), была выше, чем в контрольной группе (35,12±5.52, р<0,025), позитивно коррелируя с анальгетическим эффектом ' г=0,66, р<0.025). Величина оптической плотности Оуп-Ш макрофагов в электроакупунктурной группе (10,38±1,13), была выше чем в контрольной (9,33±2,21, р<0,005), позитивно коррелируя с анальгетическим эффектом (г=0,62. р<0,025). Разница МЕК-Ж макрофагов в группах была (0,31 ±0.10), меньше чем Оуп-Ж макрофагов (1,28±0,46, р<0,025).

Протеин дот блоттинг характеризуется поддерживанием натуральных свойств протеина за счет отсутствия влияния фиксации и воздействия парафина в процессе подготовки образцов. Протеин дот блоттинг сигналы могут быть легко определены тонкослойным хроматографическим сканнером и статистически проанализированы.

Известно, что нМЕК в спинномозговой жидкости пациентов возрастал на 36,7% после 2 Гц чрезкожной стимуляции, а ¡гБуп повышался на 49% после 100 Гц воздействия. Кроме того, сообщалось, что генная экспрессия препроэнкефа-лина (ррЕЫК) может быть стимулирована как током частотой 2 Гц, так и 100 Гц; и что экспрессия протоонкогена с-Аэб в различных отделах головного мозга крыс может быть вызвана или 2 Гц или 100 Гц воздействием. В настоящем исследовании выявлено выраженное уменьшение МЕК-Ж и Буп-Ж в мышином спинном мозге, вызванное стимуляцией частотой 5 Гц, и доказано, что 5 Гц электроакупунктура оказывает большее влияние на мышей, чем на крыс. Уменьшение спинальной ¡гМЕК было более значительным, чем спинальной ¡гБуп, что предполагает меньшее высвобождение ¡г-Буп, чем ¡г-МЕК из спинного мозга под воздействием 5 Гц у мышей. Выявлена негативная корреляция между уменьшением 1Г-МЕК и ¡г-Оуп и анальгетическим эффектом.

В настоящей работе МЕК-ГО. и Бул-Ш возрастали в акупунктурной группе в сравнении с контрольной в перитонеальных макрофагах, из-за того, что рецепторы для МЕК и Буп могли увеличиваться под воздействием акупунктуры. МЕК-Ш и Вуп-Ш включают иммунореактивность рецепторов связанных с эндогенными лигандами, МЕК и Буп, и цитоплазматическими ¡г-МЕК и ¡г-Оуп. В данном исследовании возрастание МЕК-Ш было более значительным, чем Буп-Ж в плазме пациентов с болевым синдромом после 2-4 Гц электроакупунктуры. Однако, возрастание МЕК-Ж в макрофагах было не столь значительно, как Буп-Ж, из-за, вероятно, меньшего высвобождение из макрофагов иОуп, чем 1гМЕК. Известно, что МЕК и Буп могут регулировать функции иммунных клеток. Альтерация МЕК и Буп в спинном мозге и макрофагах, вызванная электроакупунктурой, подтверждает, что акупунктура может влиять на нейроиммун-номодуляцию.

В предыдущих наших исследованиях было обнаружено, что Е-розетки, особенно активные, лимфобластные трансформации, Т4 субпопуляция и циркулирующие лимфоциты с метионин-энкефалин иммунореактивностью и их рецептор МЕК-Ж возрастали в акупунктурной группе. Как сообщалось, электроакупунктура частотой 2 Гц может способствовать высвобождению МЕК, в то время как стимуляция частотой 100 Гц ассоциирована с высвобождением динорфина в спинномозговой жидкости пациентов. Настоящее исследование выявило изменение уровня МЕК-Ж и Буп-Ж в плазме пациентов под воздействием низкочастотной стимуляции.

Сканированная величина оптической плотности сигналов МЕК-Ж плазмы пациентов после сеанса электроакупунктуры была 4,51 ±0,57 - больше чем до лечения (1,94±0,22, р<0,01). Оптическая плотность сигналов Буп-Ж так же усилилась, но в значительно меньшей степени' до электростимуляции 2,02±0,34, после - 3,05±0,40 (р<0,05). Значит, в плазме пациентов под воздействием акупунктуры уровень МЕК-Ж и Буп-Ж может увеличиваться, хотя возрастание МЕК-Ж (3,22±0,61), под воздействием тока 2-4 Гц значительно выше в сравнении с увеличением сигналов Бул-Ж (1,01 ±0,49, р<0.05).

В электроакупунктурной группе уровень болевого порога мышей после

процедуры увеличился (0,38±0,04, р<0,01), в то время как альтерация уровня

болевого порога в контрольной группе была незначительна (0,02±0,03, р>0,05).

['ОС ПАНИНА '>>Н \Я I Г>;!Б. ¡ИОН \ I С I отI .00 г к <

NBT/BCIP окрасил сигналы в сине-фиолетовый цвет, a DAB придал сигналам желто-коричневую окраску. Все сигналы c-fos, ppENK, MEK-IR, Dyn-IR располагались в цитоплазме лимфоцитов и были сильнее в электроакупунктур-ной группе по сравнению с контрольной.

Сканированная величина оптической плотности сигналов c-fos, ppENK, MEK-IR и Dyn-IR представлена в таб.9.

Таблица 9

Альтерация сигналов c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR

в мышиных лим< юцитах

c-fosmRNA ppENKmRNA MEK-IR Dyn-IR

ЭГ 3,64±0,27 2,35±0,41 2,34±0,55 3,02±0,52

КГ 1,94±0,33 1,88±0,25 1,35+0,21 2,32±0,37

ЭГ,КГ, р <0,05 <0,01 <0,025 <0,05

Дот блот сигналы с-АэвтИМА, ррЕЫКт1ША, МЕК-1Я, Бул-Ш усилились в электроакупунктурной группе, позитивно коррелируя с анальгетическим эффектом (таб.10).

Таблица 10

Корреляция между значениями ОБ дот блот сигналов и

Анальгезия с c-fos ppENK MEK-IR Dyn-IR

i= 0,58 0,71 0,79 0,71

Р <0,05 <0,01 <0,01 <0,01.

Кроме того, наблюдалась позитивная коррелляция альтерации между с-АовпЛЫА и ррЕЫКтНЫА (г=0,60, р<0,05) и Буп-Ж (г=0,67, р<0,025). Корреляции между ррЕМКп^ША и МЕК-ГО. не выявлена (р>0,05).

Сигналы протеин дот блоттинга использовались для определения уровня МЕК-Ж и Оуп-Ж в плазме пациентов и сканировались с помощью тонкослойной хроматографии, которая очень удобна для определения величины оптической плотности и облегчает сравнительный анализ сигналов дот блоттинга.

Электростимуляция частотой 4 Гц и 100 Гц может активировать большое количество ядер ствола головного мозга, но некоторые ядра селективно активируются только при частоте стимуляции 4 Гц. Выраженная экспрессия

ppENKmRNA в крысином головном мозге может быть вызвана электроакупунктурой частотой 2 Гц, возрастание ppDmRNA стимулируется электроакупунктурой с частотой 100 Гц. Экспрессия Fos в различных отделах головного мозга крыс может вызываться стимуляцией частотой 2 Гц и 100 Гц, в то время как экспрессия ppDmRNA только частотой 100 Гц. По наблюдениям Han уровень irMEK в спинномозговой жидкости пациентов повышался на 36,7% при чрезкожной стимуляции (TENS) частотой 2 Гц, a irDyn увеличивался на 49% при 100 Гц TENS. В настоящем эксперименте уровень плазменного и MEK-IR и Dyn-IR увеличивались при низкочастотной 2-4 Гц электроакупунктурной стимуляции в сравнении с контрольной группой, хотя возрастание плазменного MEK-IR было значительно выше, чем плазменного Dyn-IR.

Генная экспрессия c-fosmRNA и ppENKmRNA в мышиных лимфоцитах также может надрегулироваться электроакупунктурой частотой 2-4 Гц. Прослеживаются позитивная корреляция сигналов c-fosmRNA и сигналов ppENKmRNA с похожей интенсивностью в лимфоцитах, и позитивная корреляция с анальгетическим эффектом, что предполагает одновременную экспрессию c-fos протоонкогена и ppENK гена под воздействием акупунктуры. Образцы спинномозговой экспрессии c-fos и ppENK генов отличаются от лимфоци-тарных, экспрессия c-fos достигала своего пика через 2 часа, а экспрессия ppENK инициировалась через 4 часа и достигала максимального уровня через 48 часов после электроакупунктуры. В настоящем эксперименте интенсивность irMEK мышиных лимфоцитов не соответствовала интенсивности сигналов ppENKmRNA, несмотря на то, что ppENK является предшественником МЕК. Лимфоцитарный МЕК способен высвобождаться из клеток, воздействуя на нервную систему и гипофиз. Более того, лимфоцитарный MEK-IR может проявлять метионин-энкефалин в цитоплазме лимфоцитов и связывать рецепторы для МЕК с периферией лимфоцита.

Настоящие результаты показали, что лимфоцитарные ppENKmRNA и MEK-IR возрастали в акупунктурной группе в сравнении с контрольной. Это доказывает возможность электороакупунктуры стимулировать клеточный иммунитет, особенно Т-хелперов, вовлеченных в нейроиммунологическую модуляцию через нейроэндокриноиммунную сеть.

В своих работах Guo (1996) обнаружил, что Fos и Jun протеины вовлекаются в транскрипцию ppD, охотнее, чем ррЕ генная экспрессия mRNA. Предшественником динорфина (Dyn) является препродинорфин (ppD). Результаты показали, что Dyn-IR циркулирующих лимфоцитов был выше в электроаку-пунктурной группе в сравнении с контрольной, позитивно коррелируя с сигналами c-fosmRNA и ppENKmRNA, предположительно за счет вовлечения c-Fos протеина в транскрипцию ppD и ррЕ, и количество животных с активным

«

лимфоцитарным Dyn-IR было выше, чем с активным лимфоцитарным MEK-IR. Результаты свидетельствуют о том, что при электростимуляции частотой 5 Гц высвобождение irDyn гораздо менее активно, чем irMEK. «

ВЫВОДЫ

1. Электроакупунктура 5 Гц может надрегулировать генную экспрессию c-fosmRNA and ppENKmRNA в мышином спином мозге и лимфоцитах, а также надрегулировать генную экспрессию c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA и iNOS активность в мышином спинном мозге и перитонеальных макрофагах, что доказывает влияние электроакупунктуры на нейроиммуномодуляцию, свидетельствуя об эффекте системного воздействия.

2. Электроакупунктура 2-4 Гц увеличивает уровень MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов, особенно MEK-IR; 5 Гц - способна повышать MEK-IR и Dyn-IR мышиных перитонеальных макрофагов, больше MEK-IR, и уменьшать спинальные irMEK и irDyn мышей, особенно irMEK; результаты доказывают ^ большее высвобождение irMEK в сравнении с irDyn.

3. Позитивная корреляция между генной экспрессией c-fosmRNA и iNOSmRNA в мышином спинном мозге и макрофагах доказывает наличие об- * щих трансактиваторов, NF-kappa р, API для обоих генов.

4. Позитивная корреляция между генной экспрессией c-fos и ppENKmRNA и/или Dyn-IR в мышином спинном мозге, макрофагах и лимфоцитах, доказывает, что c-Fos протеин вовлечен в генную экспрессию ppENK, равно как и в генную экспрессию ppD.

5. Через 4 часа после электроакупунктуры экспрессия ppENKmRNA в спинном мозге следовала за экспрессией c-fosmRNA, потому что для генной экспрессии спинальной ppENK требуется новопротеин как трансактиватор, в то

время как с-й>5т1ША и ррЕЫКтЯЫА мышиных макрофагов и лимфоцитов показали одинаковую интенсивность сигналов экспрессии, доказывая, что фосфо-лирированная СЯЕВ может являться трансактиватором экспрессии обоих генов в иммунных клетках и что может быть разная экспрессия в спинном мозге и иммунных клетках.

6. Эффект электроакупунктуры постоянно позитивно коррелировал с аналыетическим эффектом, показывая, что анальгезия может быть использована как маркер эффективности акупунктуры и как проявление системности процессов в организме человека, обеспечивающей возможности использования внешних управляющих воздействий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Проведенное изучение влияния акупунктуры на регуляцию генной экспрессии ¡N08 и ¡ЫОБ активности, позволило показать возможность данного метода лечения повышать резистентность (иммунный ответ) к болезням, при этом возрастающее количество высвобождающейся N0 не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры, что необходимо использовать в разработке методов восстановительного лечения.

Стимулирующее воздействие электроакупунктуры на нейроиммуномоду-ляцию и анальгезию (показанное в данной работе альтерацией МЕК и Буп в спинном мозге и макрофагах) потверждает ее возможности в лечении широкого спектра заболеваний и нуждается во внедрении в систему оздоровительных, реабилитационных и восстановительных учреждений.

В проведенном исследовании изменение уровня болевого порога использовалось как маркер эффективности акупунктуры, и полученные результаты показали надежность этого способа визуализации и объективизации получаемых в процессе работы данных.

Тонкослойной хроматография очень удобна для определения величины оптической плотности и облегчает сравнительный анализ сигналов дот блот-тинга. Полученные результаты могут использоваться в научных исследованиях, при разработке восстановительных технологий в учреждениях здравоохранения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Акупунктура задержки мочеиспускания в остром периоде спинальной травмы//Материалы Международного конгресса «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты». - Москва, 1994. - с.92

2. The treatment of the breaches of urination caused by spinal pathology, of traumatic genesis by the method of acupuncture //VI the world congress of scientific acupuncture in the framework of medicine. -Istanbul, 1994. - P. 102.

3. The treatment of the spinal patbology, of traumatic genesis by the method of acupuncture //WFAS 95 Symposium on acupuncture and Q. - Istanbul, 1995. - P.36.

4. The Effect of Acupuncture on Urinary Bladder Detrusor Tone in Acute Spinal Injury// First congress of the European association of acupuncture. - Romania, 1995 -p/48.

5. Rehabilitation of the patients with urinary bladder disfanction. //The VII ICMART world congress. - Denmark, 1996. - p.56.

6. Влияние акупунктуры на тонус детрузора мочевого пузыря при острой травме спинного мозга. Второй научный конгресс. Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты. - г.Чебоксары, Россия, 1996.

7. Акупунктура расстройств мочеиспускания и двигательных нарушений при травме спинного мозга. Методическое пособие для врачей. Санкт-Петербург 1996.

8. Effects of electroacupuncture on the mouse lymphocyte c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR and Dyn-IR. World J. Of Acupuncture - Moxibition. № 4, Vol.10 2000,41-45pp.

9. Влияние акупунктуры на MEK-IR и DYN-IR в мышинном спинном мозге и перитонеальных макрофагах. Сборник материалов конгресса "Традиционная медицина - 2000" г.Элиста, 27-29 сентября 2000г. 103-105 стр.

10. Влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA и iNOS в мышиных перитонеальных макрофагах. Сборник материалов конгресса 'Традиционная медицина - 2000" г.Элиста, 27-29 сентября 2000г. 105-107стр.

11. Acupuncture effect on gene expression of c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA, and iNOS activity in the mouse spinal cord. World J. Of Acupuncture -Moxibition. № 1, Vol.10 2000, 45-50pp.

12. Electroacupuncture effect on met-enkephalin and dynorphin in the spinal cord and peritoneal macrophages of the mouse. ICMART International Symposium, Berlin, 14-17 June 2001, 78-81pp.

13. Relationship between acupuncture analgesia and met-enkephalin and dynorphin. World J. Of Acupuncture - Moxibition. № 2, Vol.11 2001, 36-39pp.

14. Acupuncture effect on gene expression mouse peritoneal macrophage. J. Acta Anatómica Sinica, Vol.32, №1, Jan.2001,68-71pp.

15. Electroacupuncture effect on the mouse lymphocyte MEK-IR and Dyn-IR. ICMART World Congress, Edinburg 3ri-6lh may 2002

16. Acupuncture effect on the mouse lymphocyte c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR and Dyn-IR, and on the patient plasma MEK-IR and Dyn-IR//The 2nd World Integrative Medicine Congress. - Beijing, 2002.

17. Нейроэлектромиография в диагностике травм периферических нервов// Материалы конференции «Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии.». - Владикавказ, 2003 - с.98.

18. Лечение ожирения методом ИРТ //Сборник статей по рефлексотерапии. - Владикавказ, 2003 - с.77.

19. Влияние электроакупунктуры на генную экспрессию c-fosmRNA и pENKmRNK активность в мышином спинном мозге. Владикавказский медико-биологический вестник. 2004. - Т. IV, №8. - с. 58-60.

20. Взаимосвязь акупунктурной анальгезии и генной экспрессии iNOSmRNA и iNOS активности в спинном мозге и перитонеальных макрофагах. /ВНМТ. -2004 - Т. XI, №4. - с.69-70.

21. К вопросу о физиологической значимости изменения формы, ультраструктуры и флуоресценции эритроцитов периферической крови при их трансформации в стоматоциты. /ВНМТ. - 2004 - Т. XI, №4. - с.8-12.

22. Влияние акупунктуры на лимфоцитарные ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR //ВНМТ. - 2005 - Т. XII, №1. - с.73-74.

23. Лимфоцитарные ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR при электроакупунктуре // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. -. Т. 139. -№5.-С. 163-166.

24. Взаимосвязь акупунктурной анальгезии с генной экспрессией с-fosmRNA и ppENKmRNA //ВНМТ. - 2005 - Т. XII, №2. - с.43-44.

39

25. Альтерация МЕК-Ж и БУМ-Ж под воздействием электроакупунктуры //ВНМТ. - 2005 - Т. XII, №2. - с.75-77.

26. Взаимосвязь акупунктурной анальгезии с генной экспрессией ¡ЫОЗшЯЫА и ¡N08 активностью //ВНМТ. - 2005 - Т. XII, №2. - с.91-93.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ANAE а-нафтил ацетат эстераза BCIP 5-бромо 4-хлоро 3-индол фосфат CREB сАМР вызванный элемент DAB диаминобензедин Dyn динорфин NOS синтаза окиси азота

iNOS индуцибельная (макрофагальная) синтаза окиси азота

IR иммунореактивность

Lc лимфоциты

LEK лейцин энкефалин

Мф макрофаги

МЕК метионин-энкефалин

NBT нитроголубой тетразолиум

NCM ннтроцеллюлозная мембрана

N0 окись азота

ONT олигонуклеотид

ppENK препроэнкефалин

ppD препродинорфнн

SPA стафилококковый протеин А

TENS чрезкожная электростимуляция нерва

TLC тонкослойный хромотограф

TTBS промежуточный 20 триз-буферный физраствор.

«

Информационно-издательский отдел Северо-Осетинской государственной медицинской академии Подписано в печать 22 03 05г Тираж 100 экз Формат издания 60x84 Уел пен л 1,8 Заказ №42

РНБ Русский фонд

2005-4 47765

г л

/Ю

Г i ! f 4 » Я

Il M

С5

901

Боль изначально является жизненно важным защитным биологическим феноменом, в нормальных условиях играющим роль основного физиологического механизма защиты. Она мобилизует все необходимые для выживания организма функциональные системы, позволяющие преодолеть вредоносные воздействия, спровоцировавшие боль, или избежать их. Около 90% всех заболеваний связано с болью. По данным разных исследователей, от 7 до 64% населения периодически испытывают чувство боли, а от 7,6 до 45% страдают рецидивирующей или хронической болью.

Несмотря на постоянный рост числа анальгезирующих фармацевтических средств, несмотря на увеличение физиотерапевтических, нейрохирургических, психотерапевтических методов лечения, несмотря на широкое распространение нейровизуальных и нейрофизиологических способов выявления скрытых и латентно протекающих органических поражений, эффективность лечения пациентов, страдающим различными видами болевых синдромов остаётся очень низкой. Это приводит к частому и неоправданному использованию сильнодействующих и наркотических препаратов, к возникновению опасных лекарственных осложнений и аддикций.

Проблема боли является одной из самых актуальных и трудных проблем медицины и биологии, в частности восстановительной медицины. Изучение и объяснение иммуногенетических механизмов акупунктурной анальгезии с позиции современных данных о нейрональных и нейрохимических процессах организации и центральной интеграции «болевого потока», роли эндогенных антиноцицептивных систем в регуляции болевой чувствительности, а также нейрохимических механизмов опиатной и стимуляционной анальгезии, опиатных рецепторов и их эндогенных лигандов (нейропептидов) важны для понимания этих процессов и поиска новых возможностей в борьбе с болью.

Ранее сообщалось, что метионин-энкефалиновая иммунореактивность (MEK-IR) и лейцин-энкефалиновая иммунореактивность (LEK-IR) в спинном мозге крыс после акупунктуры были ослаблены, из-за акупунктурной стимуляции высвобождения МЕК и LEK из спинного мозга, с обезболивающим эффектом (Han J. S.; 1984. Fei H., 1986.). В другом эксперименте также показано, что акупунктура может вызывать генную экспрессию c-fos и препроэнкефалина (ppENK) в хромаффинных клетках надпочечников крыс (Lieu F. Y., 1997).

Имеются сведения о том, что глия может играть более активную роль в синаптической функции и механической анальгезии, продуцируемой периферическими повреждениями, и в спинальной глии была обнаружена экспрессия индуцибельной синтазы окиси азота (iNOS) матричной РНК (mRNA) (Meller ST, 1994; McMicking J, 2002). Связь между акупунктуры и генной экспрессией iNOS, а также связь между эффектом акупунктуры и генной экспрессией c-fos, ppENK и iNOS в спинном мозге мышей до сих пор не освещена. Более того, нет сообщений об эффекте акупунктуры на MEK-IR и динорфиновую иммунореактивность (Dyn-IR) спинного мозга мышей.

Макрофаги - это один из видов иммунокомпетентных клеток, играющих важную роль в специфическом и неспецифическом иммунитете. Они способны высвобождать различные биологические медиаторы, включая нейротрансмиттеры и цитокинины. (Nobel С. S.,1995; Zurawski G., 1986). Кроме того, макрофаги возбуждают рецепторы для МЕК и Dyn, и могут высвобождать биологически активные медиаторы, включая МЕК и Dyn (Weisinger G., de Cristofaro D., 1992; Cui X., 2003).

В проводимых ранее экспериментах было обнаружено воздействие акупунктуры на регуляцию макрофагов iNOS генной экспрессии (Guo, 1997; Ji RR, Zhang Q, Han JS., 1993), но о влиянии акупунктуры на макрофаги MEK-IR и Dyn-IR мышей не сообщалось, поэтому представляется актуальным выяснить возможности акупунктуры активировать генную экспрессию c-fos, ppENK и iNOS макрофагов.

Акупунктура может усиливать трансформацию лимфобластов, бактерицидные функции PMN и цитотоксичность NK (Cui X., 1995; Wang Н., 1995; Sun W., 1996; McMicking Jr, 2002). В предшествующих работах было обнаружено, что Е-розетки особенно активные, трансформация лимфобластов, а-нафтил-ацетат-эстераза (ANAE) фокальный паттерн лимфоцитов, Т4 субпопуляция и циркулирующие лимфоциты с метионин-энкефалин иммунореактивностью и их рецептор MEK-IR могут увеличиваться в акупунктурной группе; и лимфоциты с активным MEK-IR так же проявляли ANAE фокальный паттерн (Cui X., 1995; McMicking J., 1997; de Vera M E., 1996; Garcion E., 2001). Влияние акупунктуры на надрегуляцию генной экспрессии ppENK и c-fos у крыс также изучалось в предыдущих исследованиях. Генная экспрессия c-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах до сих пор не изучалось. Установлено, что электропунктура частотой 2 ГЦ может приводить к высвобождению МЕК, в то время как электростимуляция 100 Гц ассоциирована с выбросом динорфина в спинномозговую жидкость пациента (Martin J., Del Pozo V., 1997; Yokoyama M., 1996; Kwon O.J., 1997). Сообщений по изучению уровня MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов нами не было найдено. Влияние акупунктуры на генную экспрессию c-fos и ppENK в мышиных лимфоцитах исследовалось с помощью situ гибридизации, РНК дот блоттинга; иммунореактивность Dyn и МЕК в мышиных лимфоцитах и плазме пациентов исследовалась нами методами иммуногистохимии и протеин дот блоттинга.

Управление болью - один из многих лечебных эффектов акупунктурного воздействия и является, вероятно, наиболее тщательно исследованной областью применения акупунктуры. Исследования в этом продвигаются вперед по мере прогресса науки о нервной деятельности, и мы ожидаем, что акупунктура как биомедицинская техника с многотысячелетней историей, будет применяться во всем мире.

Таким образом, открытие принципиальной возможности целенаправленного влияния с помощью ЭА на систему опиоидных пептидов предоставляет новый нетривиальный подход к разработке нефармакологических методов воздействий на базисные нейрохимические механизмы функционирования ЦНС, лежащие в основе процессов восприятия боли, формирования эмоционального статуса, реакции на стресс, нейроиммуномодуляции.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выявить закономерности влияния анальгезии, вызванной методом электроакупунктуры, на экспрессию генов и иммунореактивность.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выяснение наличия взаимосвязи iNOS/NO, как функционального маркера макрофагов, макрофагальных/лимфоцитарных c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR со спинальными iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.

2. Изучение роли опиатной системы в обезболивании и ее зависимости от электроакупунктурного влияния.

3. Выявление взаимосвязи между генной экспрессией МЕК и ppENK, c-fos и iNOS в перитонеальных макрофагах.

4. Выявление взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках, и разрешение существующих в этом вопросе противоречий.

5. Изучение влияние акупунктуры на генную экспрессию с-fos и ppENK в ассоциации с MEK-IR и Dyn-IR в мышиных лимфоцитах.

6. Изучение влияние акупунктуры на уровень MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенного исследования впервые выявлена и доказана взаимосвязь между анальгетическим эффектом и генной экспрессией c-fos, ppENK, iNOS и экспрессией МЕК и Dyn в спинном мозге и иммунных клетках, что свидетельствует о системных эффектах акупунктурной анальгезии.

Впервые исследовано влияние акупунктуры на генную экспрессию спинальной iNOS, и доказана возможность 5 Гц электроакупунктуры надрегулировать генную экспрессию iNOSmRNA, в основном, локализованную в астроцитах; с-fosmRNA - локализованную в I II-V VII слоях спинного мозга.

Впервые обнаружена позитивная корреляция в альтерации между c-fosmRNA и ppENKmRNA и между c-fosmRNA и iNOSmRNA, iNOS активностью, и выявлено легкое повышение генной экспрессии ppENKmRNA, локализованной в поверхностном слое спинного мозга.

В результате проведенного исследования выяснено, что iNOS/NO, как функциональный маркер макрофагов, макрофагальные/лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, МЕК-IR и Dyn-IR имеют взаимосвязь со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в нейроиммуномодуляции.

Проведенное исследование выявило наличие межсистемной' взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках. Экспрессия ppENKmRNA в спинном мозге следовала за экспрессией c-fosmRNA, предполагая, что для генной экспрессии спинальной ppENK может требоваться новопротеин, как трансактиватор, в то время как c-fosmRNA и ppENKmRNA мышиных макрофагов и лимфоцитов показали одинаковую интенсивность сигналов экспрессии. Доказано, что фосфорилированная CREB может являться трансактиватором экспрессии обоих генов в иммунных клетках, и что существуют различия экспрессии в спинном мозге и иммунных клетках.

НАУЧНО - ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Работа включает экспериментальный и клинический материал по изучению закономерностей влияния анальгезии, вызванной методом электроакупунктуры, на экспрессию генов и иммунореактивность.

Проведенное исследование позволило разрешить существующие в современной литературе противоречивые данные о взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK в спинном мозге и иммунных клетках.

Выявлена четкая позитивная корреляция между надрегуляцией генной экспрессии c-fos и ppENK, сопровождающаяся выраженным анальгетическим эффектом, доказывающая наличие взаимосвязи между генной экспрессией c-fos и ppENK и участие с-fos в транскрипции ppENKmRNK.

Кроме того, показано, что Dyn-IR циркулирующих лимфоцитов был выше в электроакупунктурной группе в сравнении с контрольной, позитивно коррелируя с сигналами с-fosmRNA и ppENKmRNA, это объясняется тем, что c-fos протеин может вовлекаться в транскрипцию как ppD, так и ррЕ, и количество животных с активным лимфоцитарным Dyn-IR было выше, чем с активным лимфоцитарным MEK-IR. Результаты свидетельствуют о том, что при электростимуляции частотой 5 Гц высвобождение irDyn гораздо менее активно, чем irMEK.

Проведенное исследование позволило изучить взаимосвязи между анальгетическим эффектом и генной экспрессией c-fos, ppENK, iNOS и экспрессией МЕК и Dyn в спинном мозге и иммунных клетках. Нами было выяснено, что iNOS/NO, как функциональный маркер макрофагов, макрофагальные/ лимфоцитарные c-fosmRNA, ppENKmRNA, MEK-IR и Dyn-IR имеют взаимосвязь со спинальной iNOS, c-fos, ppENK и экспрессией МЕК и Dyn в процессах нейроиммуномодуляции.

В настоящем исследовании доказана позитивная корреляция между возрастанием экспрессии iNOSmRNA и выраженной анальгезией при акупунктурной стимуляции, и то что легкая периферическая травма может приводить к надрегуляции генной экспрессии iNOS в спинномозговой глии, которая может быть вовлечена в синаптическую функцию, приводящую к анальгезии, а позитивная корреляция между спинальной iNOSmRNA и с-fosmRNA, предполагает, что iNOS и c-fos гены могут иметь общие трансактиваторы.

Проведенное изучение влияния акупунктуры на регуляцию генной экспрессии iNOS и iNOS активности, позволило показать возможность данного метода лечения повышать резистентность (иммунный ответ) к болезням, при этом возрастающее количество высвобождающейся N0 не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры. Кроме того, стимулирующее воздействие электроакупунктуры на нейроиммуномодуляцию подтверждается в данной работе альтерацией МЕК и Dyn в спинном мозге и макрофагах.

В проведенном исследовании изменение уровня болевого порога использовалось как маркер эффективности акупунктуры, и полученные результаты подтвердили надежность этого способа визуализации и объективизации получаемых в процессе работы данных.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследований внедрены в практическую работу врачей ВМУУЗ городской поликлинике №1 и Республиканского центра восстановительной медицины и реабилитации, г.Владикавказа. Материалы исследования вошли в систему теоретической и практической подготовки врачей, слушателей кафедры медицинской реабилитации и физических методов лечения СОГМА. Результаты исследований внедрены в работу отдела новых технологий и восстановительной медицины Института биомедицинских исследований ВНЦРАН и правительства РСО-Алания, г.Владикавказ и в работу ГУП НИИ новых медицинских технологий (Тула).

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы исследований доложены на 12 научно-практических конференциях (из них 7 - Международных, 2 — Всероссийских, 1 - региональной). Основные положения диссертации доложены и обсуждены на международном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); VI международном конгрессе научной акупунктуры (Стамбул, 1994); симпозиуме «Акупунктура и ци» WFAS 95 (Стамбул, 1995); Первом конгрессе Европейской ассоциации акупунктуры (Бухарест, 1995); VII Международном конгрессе ICMART (Дания, 1996); Втором научном конгрессе «Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты» (Чебоксары, 1996); конгрессе "Традиционная медицина - 2000" (Элиста, 2000); Международном конгрессе ICMART (Эдинбург, 2002); 2-ом Международном конгрессе интегративной медицины (Пекин, 2002); конференции

Актуальные вопросы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии» (Владикавказ, 2003).

Апробация осуществлена на заседании ученого совета ГУП НИИ новых медицинских технологий и кафедры внутренних болезней Тул ГУ (2005).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, из них 4 статьи в зарубежных журналах и 7 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

СТУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 225 наименования (175 отечественных и 50 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 45 рисунками.

выводы

1. Электроакупунктура 5 Гц может надрегулировать генную экспрессию c-fosmRNA and ppENKmRNA в мышином спином мозге и лимфоцитах, а также надрегулировать генную экспрессию c-fosmRNA, ppENKmRNA, iNOSmRNA и iNOS активность в мышином спинном мозге и перитонеальных макрофагах, что доказывает влияние электроакупунктуры на нейроиммуномодуляцию, свидетельствуя об эффекте системного воздействия.

2. Электроакупунктура 2-4 Гц увеличивает уровень MEK-IR и Dyn-IR в плазме пациентов, особенно MEK-IR; 5 Гц -способна повышать MEK-IR и Dyn-IR мышиных перитонеальных макрофагов, больше MEK-IR, и уменьшать спинальные irMEK и irDyn мышей, особенно irMEK; результаты доказывают большее высвобождение irMEK в сравнении с irDyn.

3. Позитивная корреляция между генной экспрессией с-fosmRNA и iNOSmRNA в мышином спинном мозге и макрофагах доказывает наличие общих трансактиваторов, NF-карра |3, API для обоих генов.

4. Позитивная корреляция между генной экспрессией c-fos и ppENKmRNA и/или Dyn-IR в мышином спинном мозге, макрофагах и лимфоцитах, доказывает, что c-fos протеин вовлечен в генную экспрессию ppENK, равно как и в генную экспрессию ppD.

5. Через 4 часа после электроакупунктуры экспрессия ppENKmRNA в спинном мозге следовала за экспрессией сfosmRNA, потому что для генной экспрессии спинальной ppENK требуется новопротеин как трансактиватор, в то время как c-fosmRNA и ppENKmRNA мышиных макрофагов и лимфоцитов показали одинаковую интенсивность сигналов экспрессии, доказывая, что фосфолирированная CREB может являться трансактиватором экспрессии обоих генов в иммунных клетках и что может быть разная экспрессия в спинном мозге и иммунных клетках.

6. Эффект электроакупунктуры постоянно позитивно коррелировал с анальгетическим эффектом, показывая, что анальгезия может быть использована как маркер эффективности акупунктуры и как проявление системности процессов в организме человека, обеспечивающей возможности использования внешних управляющих воздействий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Проведенное изучение влияния акупунктуры на регуляцию генной экспрессии iNOS и iNOS активности, позволило показать возможность данного метода лечения повышать резистентность (иммунный ответ) к болезням, при этом возрастающее количество высвобождающейся NO не повреждает ткани и клетки благодаря двухфазному регулирующему эффекту акупунктуры, что необходимо использовать в разработке методов восстановительного лечения.

Стимулирующее воздействие электроакупунктуры на нейроиммуномодуляцию и анальгезию (показанное в данной работе альтерацией МЕК и Dyn в спинном мозге и макрофагах) потверждает ее возможности в лечении широкого спектра заболеваний и нуждается во внедрении в систему оздоровительных, реабилитационных и восстановительных учреждений.

В проведенном исследовании изменение уровня болевого порога использовалось как маркер эффективности акупунктуры, и полученные результаты показали надежность этого способа визуализации и объективизации получаемых в процессе работы данных.

Тонкослойной хроматография очень удобна для определения величины оптической плотности и облегчает сравнительный анализ сигналов дот блоттинга. Полученные результаты могут использоваться в научных исследованиях, при разработке восстановительных технологий в учреждениях здравоохранения.