Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноферментный анализ с использованием синтетических антигенов в диагностике лепры

РГб од

Госкомитет МЗЛ1П РФ саиэпндиядзора

МОСКОВСКИЙ научно-исследовательскип институт эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. габричевского

На правах рукописи

С У X Е Н К О Людмила Тимофеевна

ИДШУНОФЕРЛШ1ТНЫЙ АНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕПРЫ

14.00.36 — Иммунология и аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте по изучению лепры Министерства здравоохраненич и медицинской промышленности.

Научные руководители: кандидат медицинских наук А. А. ЮЩЕНКО, доктор химических наук Н. В. БОВИН.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л. В. КОЗЛОВ, кандидат биологических наук А. М. ПОНОМАРЕВА.

Ведущая организация — Институт иммунологии МЗМП РФ.

Защита состоится «. Ал» ^ж-аЛ^___ _ 1995 г.

в_часов на заседании диссертационного совета

К 17601.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Госкомитета РФ санэпиднадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала' Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке института.

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

О. В. Котельникова

-2т

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

- Актуальность проблемы. Общее снижение уровня заболеваемости лепрой еще не говорит о полном ее исчезновении. Существуют регионы в мире с высоким риском заражения лепрой. Так, по данным всемирной организации здравоохранения, в настоящее гремя в мире зарегистрировано 3,7 млн больных лепрой и 1,4 млрд человек подвержены риску заболевания этим недугом.

Лепра, как и туберкулез - хронические гранулематозные инфекции человека, в isbmaei.;!.' кислотоустойчивыми микобактериями.

Несмотря на ус lexii в области химиотерапии лепры и контроля за ее распространенностью, лепра остается первостепенной ыедико-социальной проблемой в странах Юго-Восточной Азии, Африки, Латинской Америки. Такое положение связано с отсутствием способов ее специфической профилактики, несовершенством биологических моделей, недоступностью культивирования возбудителя на искусственных питательных средах, а отсюда, трудностями наработки бактериальной массы для методов микробиологической и серологической диагностики М.leprae.

Единственным источником биомассы М.leprae, в настоящее время, являются экспериментально зараженные девятипоясные броненосцу, на которых удается воспроизводить лепрозную инфекцию (Kircheimer W.F. et al.y 1971), а в дальнейшем и бактериальную массу, необходимую для разработки диагностических препаратов и ' вариантов специфической протиьолепрозной вакцины.

Методы диагностики и профилактики лепры, основанные на применении очищенных ог тканей организма-хозяина М. leprae, оказались недостаточно совершенными для раннего прогнозирования и борьбы с лепрой. Эти методы также не совершенны для 0оценки.иммунологического состояния больных лепрой и экспериментально зараженных М.leprae животных,- определения антигенов М. leprae, и антител к ним в органах и тканях Сольного организма (Ющенко А.А. с саавт., 1978; Abe М, . et al., 1085). Поэтому эпидемиологические исследования при лепре основаны до сих пор на поиске клинически выраженных случаев заболевания и подтверждении : ' данными бактериологических и гистологических исследовании при достаточно запущенном процессе.

Необходимость разработки новых высокочувствительных мето--дов иммунодиагностики лепры диктуется задачами,.стоящими перед современной лепрологией. Иммунологические методы могут Сыть использованы для раннего выявления больных, оценки иммунологической реактивности контактных лиц, изучения механизма патогенеза при лепре, прогнозирования клинических форм заболевания, оценки эффективности химиотерпни и решения других задач.

В области иммунодиагностики лепры неоднократно изучались возможности использования различных методов, основанных на фе- , шмене связывания антигена с антителами] это такие методы как радиоиммунологический анализ (РИА),' гель-иммунодиффузия, пе- . рекрестный иммуноэлектрофорег. метод флуоресцентных лепрозных антител (FLA-ÁBS) (Harboe М. et al., 1978; Abe М. et al., 1980, 1985, 1987;, . Однако эти методы,' основанные на применении антигенов-экстрактов из М.leprae, имели ряд•существенных недостатков, •связанных с нивкой чувствительностью или специфичностью, ограничением количественной регистрации антигенов и антител и необходимостью использования специального, часто дорогостоящего, оборудования. '

Подобных недостатков лиаен метод иммуноферментного анализа (ИФА), который кроме высокой чувствительности и специфич-. ности обладает экономичностью, возможностью количественной оценки биологических проб, стабильностью применяемых реагентов, возможностью полной автоматизации - процесса . (stek М., 1978; Stanford J.L. et al., 1980; Сухенко Л.Т. с соавт., 1982, 1984, 1985; Дячина М.Н. с соавт. 1S35). В сообщениях ряда авторов публикуются сведения об использовании ИФА для выделения антител к М.leprae, комплексов антиген-антитело, антител к сульфокам, к мурашодилептиду у больных лепрой (Alonso J.M. et . al., 1978; Bahr G.M. et al., 1986). С помощью'теста'ИФА проведены сероэпидемиологич£ские исследования,больных- и их семей на наличие антител к юыплексу внутриклеточных' цитоплазматических антигенов из М.leprae и к поверхностным антигенам целой шко-бактериальной клетки (Douglas J.Т., 1984, 1987). Ибв=-тно также об использовании ¡.'OA для, вдентифпкации. и изучения серологической активности спецпфкческсго фенольного глнкслиппда -1 - и ионоклональных антител кз эг;т ишукодсьягнакгяь;:: антигенный

зпитоп в M.leprae (Aguado Sanchez G. et al., 1986; Mitchison N. et al., 19S3; Douglas J.Т. et al., 1987; Agis Г. et al., 1988).

Новые возможности в разработка имкунодиагностических . тестов открылись после обнаружения и выделения в 1982 голу Фе-. нолыгого глииодипида I (ФГЛ-I), представляющего собой трисаха-. рид, соединенный через фенольное кольцо с липэдным компонентом клеточной стенки микобактерий лепры (Hunter S.W. et al., 1981, 1982).

Опубликованы сообщения о синтезе его аналогов - три, ди или моносахаридов ФГЛ-I, ...уммобшшеированных на белковые носители (ЕСА, БГГ). Coi/'едлооь о перспективности этих полусинте-твческих конъюгатов, лмитирующих ФГЛ-1, для применения в серодиагностике лепры (Г :jiwara Т. et al., 1S84, 1986; Hasan R. et al., 1989).

Учитывая достижения в области иммунодиагностики лепры, представляется перспективным разработка новых эффективных подходов к использованию в ишуноферментной диагностике антигенов природного и искусственного происхождения, особенно для раннего распознавания различных форм лепры.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка на основе твердофазного ИФА, с использованием искусственных моноспецифеских и природных полиспецифических антигенов, эффективных диагностических тест-систем для раннего обнаружения противолепрозных антител, и бактериальной насыщенности организма M.leprae, а также для контроля га развитием лепроэного процесса, у больных лепрой и экспериментальных животных, эффективностью химиотерапии, стабильностью регресса заболевания, контроля эффективности вакцинопрофилактики лепры.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать иммуноферментный Метод диагностики лепры на основе искусственных антигенов со специфичностью природного ФГЛ-I из M.leprae.

2. Изучить чувствительность и специфичность методов ИФА о использованием искусственных антигенных препаратов в сравнении с природны,... антигенами иа M.leprae.

3. Использовать методы ИФА на основе искусственных 'антигенов для исследования динамики изменения уровня антител у иммунизированных животных и больных лепрой лиц.

4. Изучить возможности использования методов ИФА, осно-' ванных на природных и искусственных антигенах, для диагностики и сероэпидемиологии микобактериозов (лепры).

5. Апробировать диагностические ИФА тёст-сиотемы.при се-роэпидемюдогяческих обследованиях населения в' эндемичных по лепре зонах.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩТУ

1. Участие в разработке системы мер борьбы с лепрой методами диагностики скрытой доклинической фазы болезни с помощью выявления антител . ФГЛ-1 современными' серологическими методами (ИЭА). '

2. Разработка методов оценки иммуногенности нативных, полностью искусственных и. комбинированных вариантов вакцин как в эксперименте. .

3. Предлагается простой способ' выделения' моноспецлфи-ческих антител из биологических жидкостей больных лепрой с помощью иммуносорбента, ■ содержащего . синтетический галтен 3,6-ди-О-метил-Д-глшоэу. Предполагается возможность применения этих антител для тестирования материала биопсии и для количественной диагностики бактериальной насыщенности пораженных участков кожи, а также для регистрации циркулирующего с током крови ФГЛ-1 М.leprae. ' '

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в лабораторных и полевых исследованиях материала от больных лепрой и экспериментальных животных, использованы искусственные антигены, содержащие 3,6-ди-О-ме.тил-Д-глюкозу (ДМГ) и разработанные на их основе диагностические тест-системы. Показано, что ¿ля специфического выявления антител к ОЕГЛ-1 достаточно небольшого его фрагмента - ДМГ на падхсгзщем носителе. Усовершенствован метод серологической диагностики лепры, благодаря чему созданы. ;Еог:.:ожностП повышения эффективности эпидемиологического надзора га • распространением :;кфицировай-

- б -

ности возбудителем лепры населения в эндемичных районах и контроля качества дэчонил амбулаторных больных лепрой и оценки эффективности вакцнкопрофилактики лепры.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ По материалам работы получено авторское свидетельство на изобретение способа получения искусственных антигенов, выдвинуты рационализаторские предложения по сбору крови в полевых условиях, разработана инструкция по применению диагностических тест-наборов для полевых исследований на наличие противолеп-роэных антителу больны?. и инфицированных М.leprae лиц в местах обследования населения на лепру. Материалы работы использованы при разработке карты комплексного иммунологического обследования Волыни в клинической лаборатории. Создан диагностический ША тест-набор на основе ДМГ и успешно внедрен в практику полевых эпидемиологических исследований в эндемичных районах Таджикистана (Памир) и Астраханской области.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В результате проведенных исследований была разработана диагностическая тест-система на основе полностью синтетического антигена, которая может применяться в различных эндемических ситуациях для установления корреляции между серопозя-тибностью и другими факторами риска, .приводящими к субклинической лепре, а затем к-клиническим проявлениям болевни.

ИФА может быть применен для анализа испытаний вакцинных препаратов как в эксперименте для оценки динамики нарастания иммунного антительного ответа, так и во время полевых испытаний разных видов противояепрогкых вакцин.

Применение сорбента на основе ДМГ для выделения моноспецифических • антител .из сывороток активных нелеченных больных даст ' возможность использовать эти. антитела для исследования антигенной насыщенности организма человека и животных а биологических жидкостях и в пораженных участках кожи у ЕИН-негатив-ных больных'. Методы регистрации повышения иди снижения уровня антигеноэ и антител у больных лепрой динамично свидетельствует о состоянии бактериальной нагрузки, служат для оценки успехов химиотерапк и течения болезни.

Разработка способа регистрации инфицнрованкости организма до начала появления клинических признаков заболевания помогает • решить проблемы эпидемиологии лепры, заключающиеся в выявлении доклинических состояний болезни или насыщенности возбудителем организма до появления выраженных клинических признаков пато- ;. логии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные положения диссертации доложены на. XII Международном конгрессе по лепре (Ныо-Дели, Индия, 1984), Всесоюзной июле-семинаре "Современные проблемы иммунобиотехнологии" (Астрахань, 1985), I Всесос ном симпозиуме "Иммунобиотехноло-гия-87" (Таллинн, 1937), межреспубликанской научно-практической конференц л по вопросам лепрологии (Астрахань, 1983), " XIII Международном конгрессе по лепре (Гаага, 1988), итоговой • научной конференции преподавателей, сотрудников и студентов АГПИ (Астрахань, 1992, 1993).

ПУБЛИКАЦИИ '

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, получены авторские свидетельства на 1. изобретение, 3 рационализа- . горских предложения.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИЙ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и методов исследования, , собственных данных," обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, вкоочащего 55 литературных источников, опубликованных в отечественно;"! и 126 - в зарубежной пэча- . тн. Текстовая часть диссертации изложена на 118 страница;-; машинописного текста, включающего 4 таблицы и 18 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

' МАТЕРИАЛ И :.ЕТ0ДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ • Объектами для исследовании в данной работе были - больные лепрой,' прежйваовге а Астраханской области :: Т=глшкистане- с

- а -

клкн:гческш диагнозом от лепроматозно-полярного до туберкуяо-!одного спектра по классификации Рвдли-Дхоплинга: 5С больных с полярным и субполярным лепроматозом (LL) до и после лечения; погранично-лепроматозной лепрой (BL) - 14 человек и туберкуло-i одним типом лепры - 20 человек - до и после 2-10 лет лечения; бывиие больные лепрой со стойким регрессом (100) (амбулаторные я диспансерные больные); £00 контактных с больными лепрой родственников, состоящих на учете у врача-лепролога; население районов распространения 'лепры Астраханской области и Таджикистана. Исследовании подвергались сыворотки крови на наличие антител классов IgM и IeG.toothb комплекса антигенов М,leprae и специфического эгоп-ла М.leprae - фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1).

В контрольную группу вошли сыворотки крови от 30 больных активным туберкулезом легких; 50 здоровых доноров, не имевших контактов с бо.тьныии лепрой и туберкулезом легких; 20 больных венирическими заболеваниями; смесь (пул) 700 кадровых доноров-, а также сыворотки крови новорожденных детей (пуповшшая кровь).

На наличие антител IpG- и IgM . классов исследованы также сыворотки экспериментальных животных: 300 мышей линии СВА, вакцинированных синтетическим антигеном, имитирующим противо-лепрозную вакцину, Мышей иммунизировали разными дозами препарата (1, 5, 10 и 25 миг/мышь) методом внутрибрюшинного введения.

Для получения бактериальной массы М.leprae и приготовления водно-солевого экстракта по методу' Draper (1983) были использованы, зараженные M.leprae мыши (СВА), крысы (Вистар), девятипоясные броненосцы.

Кровь для исследовании у больных лепрой и контрольных групп брали из пальца, у больных с мутиляциями конечностей из уха или большого пальца в количестве 500-20 мкг в пробирку для микропроб, смоченную смесь» lZ-нсго раствора мертиолята Na с физиологическим раствором (0,9Х) в соотношении 1:100.

У экспериментальных животных кровь собирали путем тотального отсасывания пастеровской пипеткой;, либо надрезания края уха и сливания капель в пробирку, смоченную физиологическим растворам. . .

- я -

В группах животных, иммунизированных вакцинным препарат • том для изучения кмыукогекного аффекта, кровь у глазного синуса брали в динамике путем прокола пастеровской пипеткой и ' переносили в пробирку для микропроб, смоченную смесью раствора мертиолята Na и физраствора (1:100) в количестве 20-10 мкг от одной мызи.

Сыворотку отслаивали обычным способом, т.е. после 2-х часовой инкубзщш +37 °С и 15 часов С тонкой пастеровской пипеткой перекосили в сухую стерильную пробирку для микропроб п хранили до момента использования.

Для выявления специфических противолепрозных антител в 3®А был приготовлен ряд антигч гав различного состава:.

1. Природный антиген (АГ-Ш1)представляющий собой солевой раствор композитов разрушенных ультразвуком клеточных стенок и цитоплазмы М. leprae, выделенных их инфицированных тканей экспериментально зараженных животных методом, рекомен-доЕаяньп.: Дрейпером (Draper et al., 1976), (Дячина М.Н. - с соавт., 1977). . - . -

2. Оенольный глкколипид из'М.leprae (ОГЛ-1) - иммунодоми- . нантньш эпитоп М.leprae, локализующийся на поверхности'

leprae и з окружающих инфицированных тканях больных лепра,ia-тсзной лепрой и зараженных бронексоцев. Любезно представлен доктором Rees (Англия).-.

Синтетические антигенные препараты, полученные из синтетического гаптена - З.б-дл-О-метил^-Д-глюкозы (ДМГ) (терминаль-кого сахарида углеводной части ФГЛ-1), коньзгированкого с носителями различной природы. ' (Часть работы, выполненная в ИБХ ш, М.Ы.Шемякина РАН). На основе иммобилизации ДМГ с рааличньми носителями получена антигенные препараты, имитирующие ФГЛ-Ь

3. övu на бычьем сывороточном альбумине (ВСА) - растворимый антиген с молекулярной массой 80 кД (ДМГ-БСА)..

4. ДМГ на по.-.пакрилашде (ПАА) - растворимый антиген (для JKSA) с молекулярной массой 40 кД и содержанием ДМГ Б мольных процентов (ДМГ-БАА).

. 5. Ишуносербент - макропористое стекло (МПС) с содержанием 10 мвкромолей ДМГ из 1 г сггзма (ДвР-КЦС). ДМГ-МПС использовали для'выделения п?ликгсказакых антител к'агл-I ::г скворотой

-'lO -

крови больних многобактериальными формами лепры. После наслаивания в хрояатогрзфкческую колонку ДМГ-ШС, через сорбент пропускали сыворотку с экспозицией 1 час +4°С и после промывки колонки 5 объема).ш фосфатно-солевого буфера (pH 7,2) (ФСБ), злюи-ровали антитела 0,2М глицин-HCl буфером (pH 3,5). Сорбент промывали и хранили в 9SX этаноле.

5. Модельная вакцина, представляющая собой ПАА, на котором иммобилизована ДМГ и неспецифический иммуностимулятор - мура-милдипептвд (МДП) (ДМГ-ПАА-МДП). Применен в качестве модельного варианта векторной противолепроэной вакцины в эксперименте на мшах.

'* >

Перечисленные ан *игенные препараты АГ-МЛ, ДМГ-БСА, ДМГ-ПАА были использованы длг- сенсибилизации твердой фазы в иммунофер-ментном анализе специфических антител классов IgM и IgG против М.leprae и ее компонента ОГЛ-I в сыворотках крови исследуемых групп.

Иммуноферментньй анализ (ИФА) проводили общепринятым методом для поиска антител, вариант ELISA (Воллер о соавт., 1977; Сухенко с соавт.,'1082-, 1984). ИВА проводили в несколько этапов, соответствующих сенсибилизации планшетов для ИФА, иммобилизаций специфических антител на эти антигены, обработки антител гкпериьмунными пероксидазными копнут атами анти-IgM или -анти IgG человека или мыши (либо в системе авидин-биотин) с . последующим проявлением пероксидазного комплекса хромогеном ортофенилендиамином) в присутствии Н,Ог.

Для каждого из описанных выше антигенов отрабатывались условия оптимизаций ИФА для достижения высокой чувствительности и специфичности реакции: pH среды, время и температура инкубации антигена на полистироле и антител на антигене, состав и свойства растворов для ИФА, концентрация сенсибилизирующего антигена, величина нагрузки ДОГ на носителе и разведение сыворотки для обнаружения минимальных количеств антител о высокой специфичностью.

Проводилась инструментальная (на спектрофотометре типа Polimack) и визуальная оценка результатов ИФА (по конечному титру).

Уровень антител определяли в единицах адсорбции (Еад) и-выражали как разницу показаний исследуемой сыворотки (Ео -средний показатель оптической плотности дублированных результатов одной пробы в 2-х лунках планшета) и контрольного образца (Ек - средняя оптическая плотность .дубля контрольной сыворотки) Еад-Ео-Ек, где на присутствие антител указывала величина Еад, превышающая пороговое значение.

Для оценки ИФА теста с различными антигенами вычисляли чувствительность, специфичность и прогностическую ценность. ИФА согласно рекомендациям БПсктап е1 а1. (1978) и КгопгаИ (1931).

Все результаты обсуждалась с учетом обработки общепринятыми методами вариационной статистики с учетом достоверности показателей по . кг терию Стыодента и достоверности различий по Фишеру.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Совместно с институтом биоорганической химии РАН впервые удалось синтезировать моноспецифический терминальный сахар тре-хуглеводной части ФГЛ-1,- 3,6-ди-О-мепш-Д-глюкозу. На основе зтого галтенз сделана попытка получить ряд антигенов и применить их в создании тестов на основе ИФА для решения вопросов распознавания лепры, контроля за успехами специфических и кес-пецифических методов лечения I! профилактики лепры.

Антигены ®^-ЕСА, ДМГ-ПАА. наряду с АГ-ЦЛ применены в качестве антигенной подложки на твердой фазе в ИФА, исследованы их антигенные свойства, активность, специфичность, стабильность в КФА. Испытаны ссрбционные свойства сорбента ДМГ-МПС для выделения специфических антител к СГЛ-1. Проведен контроль икмуко-генности искусственной противолелроэной еэкцины Дг.Г-ПАА-ГфЦ е эксперименте на мыза:: СБА в тесте Е2А с ДМГ-ПАА. ■

Для отработки специфичности и чувствительности КФА-дпаг-ностикума на лепру с этими антигенами предложены взриангы условий иммобилизации антигенов на планшете для ИФА: доза антигена, время, температура ! 2 мобилизации, рН и состав комплекс ирущего буфера для лучл-й-сорбции на'полпсг::"оловои по-

верхкости лунок; условия для создания оптимального режима образования комплекса антиген-антитело, а-также связывания антител с лерсясидагиый ккгшгатйм.. Все условия отрабатывали в сравнении с ранее применявпимса в КФА природным антигеном -водно-солевым экстрактом растворимых компонентов цитоплазмы и клеточной стенки мккзбактерий лепры, выделенных из инфицированных тканей экспериментальных животных (мыпей, крыс, броненосцев) и очищенных от тканей по методу Дрепера (1S75).

"словил иммуноферменткого анализа IjQ и IgM антител против ,М.leprae отработаны и применяются в институте лепры в клинической и эпидемиологической■--зктике для диагностики ранних форм лепры, эффективности лечения больных и прогноза течения лепроз-ного процесса (Сухенко с соавт., 1982; Сухенко с соавт., 1984; Sukhenko et al., 1S84;). Однако специфичность этого теста вызывает сомнения по причине отсутствия стабильности данной тест-системы и поливалентности антигена.

Для изучения оптимизации условий сорбции изучаемых антигенных препаратов были взяты разные доэы антигенов для сенсибилизации в лунках полистироловых планпетов и несколько разведений сывороток положительного и отрицательного контроля, где оптимальная доза в КФА тест-сывороток с антигеном (экстрактом из М.leprae, АГ-МЛ) составляла 100 мкг/мл по белку. Диагностический скрининг-титр для тест-сывороток в фосфатно-солевом буфере при рН 7,2 был 1:800, 1:1000, что согласуется с литературными данными. Для антигена ДМГ-БСА была определена концентрация, дающая наибольшую чувствительность в КФА для выявления IgM антител, равная Б-10 мкг/мл. Дальнейшее увеличение концентрации антигена не дает улучшения результатов ИФА. Для антигена ДМГ-ПАА исследования проводили в раститровке антигена от 10- мкг/мл уменьшая ее кратно двум, причем наивысшую чувствительность ДМГ-ПАА показал в концентрации 0,5-1 мкг/мл; снижение и увеличение концентрации «МГ-ПАА не повышало Еад. В результате титрования антигенов была выявлена активность изучаемых ДМГ-БСА и ДМГ-ПАА в ИЗА с сыворотками крови Сольных лепрой в скрининг-титрах антител: для антигена ДМГ-БСА 10-5 мкг/мл, для антигена ДМГ-ПАА 1-0,5 мкг/мл, отрицательные тест-сыворотки не показали ."положительных" Еад в И®А.

Анализируя результаты отработки , оптимальной концентрации изучаемых антигенов можно отметить, .'что антиген ДМГ-ЕСА дает высокую чувствительность в ИФА с сыворотками больных лепрой, насыщенными IgM антителами против ФГЛ-I в скрининг-титре 1:S0Q с концентрацией антигена 10-5 мкг/мл.. Активность антигена по концентрации ДМГ-БСА в ИФА в этих условиях в 10-20 раз превышает активность антигена из М.leprae (АГ-МЛ), однако, уступает по чувствительности антигену ДМГ-ДАА в ИФА с теми же сыворотками в десять раз. • С увеличением дозы ДМГ-БСА антигена на поверхности планшета усиление иммунологической реакции не происходит. В ИФА с ДМГ-БСА после сенсибилизации полистирола антигеном введен дополнительный этап внесения 1Z , раствора БОА ла 1 час при +37 С. Равновесие и полная насыщенность антиген-антительного комплекса в ИФА с ДМГ-БОА наг-упает 'в дозах 5-10 мкг/мл и титре антител 1:800-1:1600 в растворе 0,5% БСА в 0,1 М ФСБ, рН 7,2. В ИФА с антигеном ДМГ-ЛАА это равновесие наступает при концентрации 0,5-1 икг/мл и титрах .антител 1:800-1:1600 в растворе 0,5% твин-20 в 0.1МФСБ о учетом отрицательных результатов ИФА в этих условиях контрольных сывороток больных.туберкулезом легких и здоровых доноров.

Таким образом, была показана более высокая.антигеная.активность ДМГ-IIAA в ИФА с IgM антителами против Ш1-: сывороток больных лепрой.

Отработанные дозы сенсибилизации планшетов позволили провести исследования сывороток крови больных разными формами лепры, больных туберкулезом легких и здоровых доноров, а такие к; имеющих перекресткореагируших антпкобактёрпальнкх антител сывороток крови новорожденных детей. Результаты анализов пека-залп, что наибольшей активностью в сравнительном ИФА обладаем антиген ДМГ-ЕАА, где ¿ал Igív! антител исследуемы:-: сывороток достигает 1,50-2,0 единиц, в то время как Еад контрольных сывороток (новорожденных, донорез и больных туберкулеза,:) не превышает 0,10 единил. Антиген АГ-МЛ выявляет г больших ксспиестгач з ИФА антитела класса IgG (0,95+0,03) в 92,8» случаев. Эти антитела признаны прогностически::; не играет диагност •:-"гкой рол; перккньк ъ доклинической ста--:::; депрегного процесса (Douiia;

имеют значение для спеки; состояния мх/нной системы больного во время лечения и для наблюдения з разные периоды течения болезни (Hasan et al., 1989).'

ДЯ^Е-ГА также выявляет IrG антитела (0,50*0,09) и IgM (0,9П±0,05), что, пс наиему мнении, объясняется проявлением в КФА .активности бычьего сывороточного альбумина и является интересным этапом дальнейшего изучения этого антигена в реакция;-, клеточного иммунитета и рол;: БСА в выявлении IgG. Е тесте ИФА с ДМГ-ПАА антитела класса IgG выявлялись в незначительных количествах как в исследуемых (0.35+0,03), гак и контрольных образца-: сывороток (0,1010,02}, где уровень антител класса IgM в среднем выражался величиной 0,7а±0,05 у бальных и 0,06+0,01 у здоровых доноров.

'-Ham данные согласуются о мнением Hasan с соавт., что уровень аяти-ДМГ IgS в К<5А с гликокониогатом D-BSA во всех случаях был ниже уровня IgM. Некоторые авторы считает, что антитела класса IgM кФГЯ-I наиболее показательны в смысле антигенной нагрузки, поскольку ФГЛ-1 является не только поверхностным антигеном, но и'т.алунодоминантным эпитопом клеточной- стенки (Fu-jiwara et al.. 1984). Как известно, последний является слабым антигеном, что диктует необходимость сложных методических манипуляций в ИФА. Поэтому сам.ФГЛ-I практически не пригоден для сероэпидемнологическш полевых обследований очагов лепры.

Простота использования.в ИФА, растворимость и устойчивость искусствен;-:^:: антигенов на основе моно, ди и три, сак аридных компонентов СГЛ-1 по сравнению с прир :>дным 03? Л- Г делает применение этих антигенов ъ системе ИЗА особенно перспективным. Ко-личестг лнное определен;» антител класса Ig'M к ДМГ-ПАА в KIA наряду с ■■ педеленпем Е>1Н дает возможность более полного обследования л;: • с цель и раннего выявления процесса размножения возбудителя в ерганпгме больных лепрой контактных с ними (Hasan et al., 1383).

5 сравнительном анализе антигенов АГ-1/Л, ДМГ-БСА и Д.Г-ПАА, последний сказался наиболее перспективным антигеном Е качестве д.-.полкнгелького серозпндемиологического анализа лепры методом ЛЗА 2 места:-; раг..рсс?ранения заболевания. Это связано не только с зксокс;': активкс-отья (а значит и больией зкономич-

костью) препарата, - так п устойчивость» при хран-нк:: (до 5 лет при С). Антиген ДМГ-ПАА превосходит по сенспбидизпрукщей ак- ' тивности (Г мкг/мл) в 10 раз ДМГ-БСА (10 мкг'мл) и е 100 раз • АГ-МЛ (100 мкг/мл). Это подтверждаете» однородностьк выражения результатов ЛФА с этим антигеном контрольных групп сывороток, которые почти в .1002 случаев не достигают порогового значения Еэд," равного 0,10 единицам.

Значительным показателем s оценке перспективно;tj: для эпидемиологических тестов 1 является специфичность я чувствительность теста (G.Kronvall, 1381). Оказалось, что АГ-МЛ и ДМГ-БСА при низкой специфичности ■ (50-60'») обладают высокой чувствительностью - 100Х в группах сывороток больных лепрой и 10* и 502 е контрольных для IgU и IgG антител. Сравнительно с другими антигенами,. ЖГ-ПАА, выявляя, в основном, IgM антитела-в тесте КОА, обладал высокой чувствительностью (100Х) в группах больных лепрой и 100S специфичностью.'Высокая специфичность метода, т.е.' отсутствие лож-ноположительных результатов срелл клинически здорового населения, обусловлена тем, что.идет реакция со строго специфичным доминантным антигеном, имитирующим ФГЛ-1. Ряд авторов (Kronvall,/ 1981; Burgess, 1938) считает, что даже незначительные изменения в специфичности метода резко изменяют прогностическое значение положительных результатов теста, особенно в случае слабой эндемичноети, поэтому целесообразна использовать тесты, стремящиеся к ЮОХ-ной специфичности.

Исходя из этого' и принимая 'во внимание стабильность теста, и суперустойчивость ДМГ-ПАА, что очень' важно в полевых условиях, можно рекомендовать для использования в И<ВА антиген ДМГ-ПАА, который покзеал высокую специфичность во всех группах с высокой чувствительностью в группе клинических больных лепрой и довольно низкой чувствительностью у больных с регрессом леп-роэкого процесса и, незначительным процентом чувствительности в группач лиц, контактных с больными лепрой," живущих в эндемичных •зонах, а также клинически здорового населения.

Данные чувствительности и специфичности тестов подтвержда- • ют результаты статистических единиц оптической плотности в исследуемых группах сывороток. . Все обследуемые контингенты бывших больных, находящихся под наблюдением врача, оказались, в выра-

жении Еад (0,23±0,01) антител к возбудителю, достоверно (р < 0,001) отличимы от группы больных клинически вырачекной лепрой, бактериовы,целителей (Еад= '0,79+0,05). Однако не всегда достоверно различны по уровню Еад IgM антител были перечисленные группы в тестах ИФА с АГ-МЛ и ДМГ-БСА. Так, группа амбулаторных больных (0,29Ю,03) не достигала достоверности (р > 0,05) в сравнении Еад больных туберкулезом . легких в ИФА о ДМГ-БСА (0,27iD,Q5). АГ-МЛ в тесте ИФА. для IgG показал достоверность отличий уровня Еад между группами контроля- (больные туберкулезом легких - 0,4б±0.09 и 0,27i0,09 - доноры) и многобактериальных больных (1,00±0,08), что дает право рекомендовать тест ИФА с АГ-МЛ для оценки реактивности больных с регрессирующей формой лепры и больных под наблюдением.

Достоверность различий _(р < 0,001) ыеаду группами больных с активными проявлениям! лепры (0,79±0,05), бывших больных со стойким регрессом (0,23±0,01) и контрольными, "отрицательными" в отношении лепры, группами обследуемых лиц (0,06±0,01), а также высокий процент выражения прогностической ценности ИФА с Д^Г-ПАА (Д+=100£), позволили признать ИФА тест-систему с ДОГ-ПАА наиболее перспективной в качестве дополнительного теста для целей серодиагностики ранних доклинических форм болезни или инфицированиелти организма М.leprae.

Иммуноферментная тест-система с использованием ДМГ-ПАА для выявления антител к микобактериям лепры, была испытала в сероэ-ппдешгологглесгак исследованиях больных и контактны*, с ними родственников в местах распространения лепры.

Наиболее перспективными для выявления субклинической инфекции лв"; "ятся, как известно, антитела класса' IgM против ФГЛ-I, ; ; с тальку в инкубационном периоде чувствительность IgM-тест а г .чительно выше IgrG-теста ИВА. Это согласуется с данными неп-лч.-рых исследований, в которых использовались синтетические кенгяга^ы, близкие по антигенным свойствам ФГЛ-I. Нами для этих целей успешно применен -антиген ДМГ-ПАА. При этом дан--ные наших 'исследований сравнимы с результатами ИФА сывороток о природным ITЛ-I, применяемым в качестве-антигена и искусственными неоконгпгатами (GCS), состоящими из синтезированных диез-харидных зпитопов ФГЛ-1, конъюгировакных с бычьим сывороточным

альбумином (D--E;jA) и бычьим глобулином (D-BGG) (по данным Brett et ai., Fujiwara et al., ChaLterjee et al.). Эти авторы'считают возможным успешное пршенение моносахарида ОГЛ-1 в серодиагнос-'тике ранних проявлений лепры.

В системе мер борьбы с лепрой методам ранней диагностики лепрозной инфекции придается особое значение. Необходима диагностика скрытой доклинической фазы болезни. Поэтому, использование для сенсибилизации в И5А. антигена ДМГ-ПАА на полистироло-1 вам планшете позволило применять ИФА-тест в исследованиях инфи-цированности у лиц, находящихся в семейном контакте с больными многобактериальной лепрой и живущих ■ в местах распространения лепры в Астраханской области и Таджикистана. В исследованиях Stanford J.L. et al. (1080)'у подобного контингента высокие уровни антител класса IgM выявлялись намного раньше, чем появлялись клинические признаки болезни или рецидива (по наблюдениям от 3-х месяцев до 3-х лет). Мы считаем важным предложить применение теста ИФА о ДМГ-ПАА в качестве дополнительного серо-эпидемиологического теста в местах распространения лепры для установления корреляции между серопозитивнс^гыо и другими факторами риска, приводящими к субклинической лепре, а затем ji клиническим проявлениям болезни.

Целям количественного анализа инфицировакности организма посвящены разработки методов определения циркулирующих антигенов, в частности выявление присутствия ®ГЛ-1 в крови Сольных лепрой и у лиц, находящихся в тесном-семейном контакте с ниш . (Сухенко .ЛЛ., 1985; Bartlett■et al., 1976). Однако для целей регистрации циркулирующих или локально расположенных в инфицированном организме антигенов М.lepras иммунологическими методами необходимы видоспецифические иди моноспецифические активные антитела. Известны случаи успешного применения для этих целей моноклонадышх антител (Xux ft., 1985). Наши работы по выделению из сывороток больных с активным лепрозыым процессом антител, • специфических к ФГЛ-I, имели целью разработку- высокочувствительных методов микроанализа для определения насыщенности организма продуктами метаболизма возбудителя, в частности уровня ОГЛ-I в крови инфицированных лодей. Сложности получения моноклонадышх антител для этих целей позволили нам надеяться на

возможность предложения простого способа выделения моноспецпфи-. ческих высокоактивных антител с достаточной степенью аффинности. Так, с помощью сорбента ДМГ-МЗС из сквортки больного (LL) получены анти-ОГЛ антитела с концентрацией около 1,8 мг/мл. В дальнейшем предполагался разработать варианты И5А ç этими антителами для тестирования материала' биопсий при диагностике бактериальной насыщенности пораженных участков кожи путем количественного выявления СГЛ-1. Это позволит разработать дополнительный. возможно более информативный подход к диагностике лепры. " .

Известно, что методы контроля га вакцинацией, также как и внедрение з систему мер профилактики лепры новых синтетических векторных клк смешанных еэкцинных' препаратор остаются актуальными (Fine et al., 1985; Burgess et al., 1988). Использование современных методов иммуноферменткого анализа в качестве контроля галмуногенности изучаемых Еакцин представилось нам интересным и необходимым. Поэтому антиген ДМГ-ПАА также был использован в тесте ИФА для оценки продукции антител у мышей, вакцинированных искусственной вакциной (ДМГ-ПАА-ВДП). Результаты исследования антител методом ИФА с ДМГ-ПАА подтверждают наличие первичного .'"'мунного ответа у животных, иммунизированных препа-' ратом, явлгх ,;шсн упрощенной моделью будущей искусственной про-тиволепрозкоп вакцины. Иммунный ответ поучали после однократного внутрибришинного введения нескольких доз препарата (1 ккг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл'25 мкг'/мл) с последующим наб.ведением динамики ЕыраЗотки антител методом ЛФА с антигеном ДОГ-ПДА, Проведений анализ антител класса IgM против ДМГ писазал, что sin ант::; та начинали появляться в крови иммунизированных животных не ,':-е супа с зкраженным "пикон" на 4-5 день после введения и СГ ,г.г!ШЯ'уровня на 7-8 день до полного их отсутствия. 3 группах мь,:гой с разными дозами препарата вне зависимости от способа введения, кратности иммунизации и дозы препарата, дина-ютса выработки антител отличалась постоянством. Наиболее активной дозой оказалась 10 мкг/мьшгь ДМГ-ПАА-МДП. Полученные резуль-■ таты подтверждают данные некоторых авторов о возможности получения искусственных векторных вакцин путем' конъюгирования синтетического гапгена с полимерном носителем и низкомолекулярнымя

адгювантами с высокими иммуностимулирующими свойствами типа му-рамилдипептвда (Зе1а М. , 1583; Дмитриев Б.А., 1936). Выраженная динамик выработки антител дает основания расширить экспериментальные исследования по создан™ специфических вакцинных препаратов, как полностью искусственных, так и комбинированных, используя при этом тест 1ЮА с ДМГ-ПАА1 наряду с другими методами контроля вакцинопрофилактики лепры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ' Актуальность внедрения в практику контроля и профилактики лепры новых чувствительных и высокосп&цифических меидов иммунодиагностики неоспорима. Неоднократно экспертами ВОЗ поднималась проблема применения в развивающихся странах, эндемичных по лепре, методов дифференциальной диагностики и внедрение их в практику сероэпидемиологических обследований населения в районах распространения лепры. Разработка и внедрение дополнительных методов в комплекс диагностических мер как в клинике, так и в эпидемиологии лепры привели к использованию, наряду с природным водно-солевым экстрактом М.leprae, искусственных антигенов на основе синтетического сахарида - 3,6-ди-О-метил-Д-глюкозы. . Впервые на основе ДМГ получен ряд антигенных препаратов: ДйГ-БСА (на бычьем сывороточном альбумине), ДМГ-ПАА (на полиак- . риламиде) - для серодиагностики методом ША; ДМГ-МПС' (на макропористом отекле) - сорбент для выделения' антител против ФГЛ-1; ДМГ-ПАА-МЦП - препарат модельного варианта синтетической вакцины.

Впервые на основе перечисленных антигенных препаратов были .разработаны серодиагностические тесты контроля за динзмикой наличия антигенов и антител к ним у больных лепрой и инфицированных М. leprae лиц,, контактных о больными лепрой.

Установлены оптимальные, параметры проведения иммунофер- . кентного анализа для выявления антител к М.leprae у больных лепрой и экспериментально зараженных лабораторных животных для антигенов: • природного АГ-МЛ о сенсибилизирующей дозой 100 мкг/ыц, полусинтетического ДМГ-БСА - 5 мкг/мл, синтетического ДМГ-ПАА - 0,5 мкг/мл.

В качестве антигена в ИФА для диагностики лепры наиболее перспективным оказался синтетический антиген ДМГ-ПАА, который отличает высокая чувствительность (100'.) и специфичность (1007.) теста, простота проведения'анализа в полевых условиях, стабиль-ноет:-, иммобилизованного на твердом носителе антигена ДМГ-ПАА.

. Антиген ДМГ-ПАА впервые прошел апробацию в полейых испытаниях во время эпидемиологического обследования населения Астраханской области и эндемичных районов Таджикистана. В этих гонах результаты ИФА на основе ДМГ-ПАА коррелировали с бактериоскопи-ческими.анализами, но были Солее чувствительными.

ИФА на основе ДМГ-ПАА был применен во время испытаний модельной вакцинны в эксперименте на мышах для оценки динамики нарастания иммунного антительного ответа на внутркбрюшинное введение препарата. "Пик" антител во всех дозах обнаружен на 4-5 день.

Тагам образом, впервые создан и прошел испытания диагностический ИФА тест-набор на основе ДМГ-ПАА для поиска специфических к М. leprae антител класса IgM, отражающих уровень бактериальной нагрузки организма больного лепрой; определяющий иммунологический статус инфицированного индивида.

Получен сорбент на основе ДМГ-иммунодоминант:-:ого эпитопа ФГЛ-I. Выделенные из крови больных лепрой с его помощью антитела могут применяться для измерения ФГЛ-I в сыворотках крови и других жидкостях и тканях организма. Оценка повышения или снижения уровня выявляемых в тесте ИВА антигенов (ФГЛ-I) и антител к ним будет динамично свидетельствовать о состоянии бактериальной нагрузки инфицированного организма, а также в качестве дополнительнее теста для оценки успехов химиотерапии и течения болезни.

Разрасгл здный способ регистрации инфицированности организма до начала появления клинических признаков заболевания может Сыть использован при решении актуальных проблем эпидемиологии лепры, т.е. при определении групп повышенного риска заболевания, появлении доклинических стадий болезни или оценки насыщен-.ности возбудителем организма до появления выраженных клинических признаков патологии.'

в ы В О д К

I Разработаны три варианта иммуноферментной тест-системы ■ для выявления антител к М.leprae, различающихся природой антигена, иммобилизованного на твердой фазе:

1) солевой экстракт ¡,;пкобактерий лепры - АГ-МЛ;

' 2) конъюгат синтетического гаптена'с белком - ДМГ-БСА;

3) конъюгат синтетического гаптена с полимером - ДМГ-ПАА.

II Показано, что тест-система с ДМГ-ПАА облздает максимальными параметрами специфичности и чувствительности в определении иммунологического ответа как у больных лепрой, так и экспериментально зараженных и иммунизированных жиеотных.

III Создан тест-набор для иммуноферыентного выявления прогностических антител класса IgM к специфическому углеводному

' антигену М.leprae с количественным инструментальным и полуколичественным визуальным учетом результатов. Тест-набор.апробирован при эпидемиологически.; обследовании населения эндемичных по лепре регионов. Показана его пригодность как дополнительного теста для целей эпидемиологического контроля распространения лепры и эффективности лечения больных лепрой.

IY Показано, что разработанная на основе ИФА тест-система с ДМР-ЙАА, пригодна для оценки динамики антительного ответа при испытании в эксперименте профилактической противолепрозной вакцины.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. ДячинаМ.Н., Первухин Ю.;В., Ворбьева В.Г., Сухенко Л.Т. . Выделение М. leprae , и М. lepraemuriuin из инфицированных тканей животных с экспериментальной инфекцией // Материалы Каракалп. реей, иауч.-сракт. конф. лепрологоа.-Нукус: Каракалпакстан, 1S77.-C.24-26. '

- 22 - ,

2, Сухенга Л.Т., Ермолин Г.А., Дячина М.Н. О диагностической ценности реакции энаим-меченых антител при лепре // Актуальные вопр., современной микробиологии и иммунобиологии. -Астрахань, 1982.-С.Б8-59.

' 3.'Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Ющенко A.A. Диагностическая •ценность реакции энзим-меченых антител (РЭМА) при лепре // Венерические и кожные заболевания.Алма-Ата, 1983,-С.140-143.

4;. Сухенко Л.Т., Дячина М.Н., Ермолин Г.А. Диагностические тест-системы для выявления антител-к микобактериям лепры на основе реакции энзим-меченых антител // Актуальные вопр. лепрологии.-Астрахань, 1984.-С.84-89.

5.Sukhenko L. Т., Dyachina M.N., Juscenko A.A. Diagnostic value of ELISA in leprosy // XII International Leprosy

, Congress:. Abstracts.-New Delhi, 1984.-Abstr. !! 11/47.

6. Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Ющенко A.A., Ермолин Г.А.

. Диагностические тест-системы на основе иммуноферментного метода при лепре J/ Журя, микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.-1985.-М' 1.-С.64-68.

7. Сухенко Л.Т. Применение ИОА для выявления-микобактери-альных антигенов в крови больных лепрой /■/ Восьмой Всесоюэ. съезд* дерматовенерологов: Тез. докл.-М.,. 1985.-4.2.-С.418-418.

8. Дячика М.Н., Воробьева 3.Г., Сухенко Л.Т., Ющенко A.A. Иммунодиагностика лепры // Тез.. докл. пленума Науч. совета по •дерматологии и венерологии АМН СССР совместно с респ. конф. дерматовенерологов Лит. ССР.-Каунас, 1986.-С.42-43.

■ 9. Дячина М.Н., Сухенко Л.Т., Воробьева 3.Г., Дуйко В.В. Сероэпидемичебкие исследования при лепре // Сб. статей и тез. докл. плеитлз правления ВНМОДВ.-Душанбе, 1988.-С.'194-195.

10. Югичга A.A., Бовин H.3.-, Байрамова Н.Э., Сухенко Л.Т. Искусственник антигены на основе фенольного гликолипида в серодиагностике лепры // Сб. статей и тез. докл. пленума правления ВНМОДВ.-Дуианбе, 1983.-С.275-275;

11. Juscenko A.A., Bovin N.V., Sukhenko L.T., Urlyapova N.G., Bairamova U.E., Dyachina M.N. Use of artificial antigens

• with M.leprae '- PGL-I properties for the studies in leprosy // Int. J. Lepr.-1988.-Vol.57.-No.l (Suppl.)-p.409.

- 23 -

12. Бовин H.B.Байрамова Н.Э., Сухенко Л.Т., Ющенко A.A. Споссоб получения искусственных антигенов: A.c. М 16142202 (СССР) // Открытия. Изобретения,-1990.- N 46.-С.256.

13. Васильев А.Э., Сароянц Л.В.,- Сухенко Л. Г, Первый опыт применения тимогена в комплексном лечении больных лепрой // Тез. докл. обл. науч.-практ. конф. сотр. мед. ин-та и врачей Ао'трах. обл.-Астрахань, 1990.-С. 194-195'.

14. Сухенко Л.Т. Синтетический антиген о вакцинными . свойствами// Теэ. докл. итог. науч. конф. АГПИ им. С. М.Кирова. -Астрахань, 19Ö2.-С.68-58.

16. Сухенко Л.Т; Изучение синтезированных микобактериаль-ных антигенов, имитирующих поверхностный- фенольный гдиколи-пид-I из М Дергав' // Тез. докл. итог. науч. конф., АГПИ им, С.М.Кирова.-Астрахань, 1993.-С.33-33.