Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунодиагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования рекомбинантного нуклеокапсидного антигена вируса

На правах рукописи

Ли Лариса Еновна

ИММУНОДИАГНОСТИКА ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО НУКЛЕОКАПСИДНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2005

Работа выполнена в лаборатории вирусных препаратов Уфимского филиала Федерального Государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства Здравоохранения и Социальной Защиты Российской Федерации «Иммунопрепарат»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Веселов Станислав Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бобкова Евгения Владимировна; доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович

Ведущая организация: Челябинская государственная медицинская

академия

Ш^^ри^т г. в

Защита состоится «(КуУ/^УМ^¿Уиэ г. В /у часов на заседании Регионального диссертационного" совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии Наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского филиала Федерального Государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства Здравоохранения и Социальной Защиты Российской Федерации «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105

Автореферат разослан

2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Лукманова КА.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является одним из наиболее распространенных в России, а также странах Азии и Европы зоонозных природно-очаговых заболеваний. На Республику Башкортостан приходится около половины всей заболеваемости по России (Хунафина, 1998). Причинным агентом, вызывающим заболевание в Республике и западной части Российской Федерации, является вирус геморрагической лихорадки Пумала, относящийся к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae. Инфекция характеризуется относительно тяжелым течением, поражением почек, сердечно-сосудистой и других систем организма. Эффективность лечения больных, а также предупреждение осложнений во многом зависит от своевременно поставленного диагноза. Достоверная клиническая диагностика ГЛПС связана с несколькими проблемами. Во-первых, многие инфекции в начале заболевания имеют неспецифические симптомы характерные и для ГЛПС. Наряду с этим, могут существовать нетипичные или клинически слабо выраженные формы геморрагической лихорадки, плохо диагностируемые даже в разгар болезни [Суздальцев АА и др., 2003].

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости лабораторной диагностики инфекции. Причем лабораторная диагностика должна использоваться не только для подтверждения диагноза врачей-клиницистов, но иметь самостоятельное значение, особенно, в случае, если она позволяет поставить диагноз в самом начале заболевания.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется метод флуоресцирующих антител. К недостаткам метода следует отнести его высокую трудоемкость и то, что он позволяет осуществлять только ретроспективную диагностику заболевания. Использование более производительного и чувствительного метода иммуноферментного анализа всегда было ограничено невозможностью наработки препаративного количества антигена из-за слабой репродуктивной активности вируса в культуре клеток. Только после того, как удалось получить системы для экспрессии рекомбинантных белков вируса, появились перспективы разработки новых препаратов для диагностики ГЛПС на основе иммуноферментного анализа.

Цель исследования

Разработать иммуноферментные тест-системы для диагностики ГЛПС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка (НКБ) вируса Пумала и оценить их диагностическую эффективность.

Задачи исследования

1. Отработать условия получения очищенного рекомбинантного НКБ.

2. Оптимизировать параметры иммуноферментного анализа IgM и IgG к НКБ вируса Пумала в сыворотках больных ГЛПС.

3. Исследовать возможность выявления вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью иммуноферментного анализа с повышенной чувствительностью.

4. Провести оценку чувствительности и специфичности полученных тест-систем на основе исследования сывороток больных ГЛПС, больных другими инфекционными заболеваниями и сывороток здоровых доноров.

Научная новизна

Разработан новый способ экстракции рекомбинантного нуклеокапсид-ного белка вируса из бактерий-продуцентов, позволяющий существенно повысить степень чистоты препарата. Установлено, что использование высоко-очищенного НКБ увеличивает специфичность диагностики заболевания.

Впервые разработаны четыре типа иммуноферментных тест-систем на основе нуклеокапсидного белка эндемичного для Башкортостана вируса Пумала штамма «CG-Иглино 12». Установлено, что созданная на его основе тест-система для определения IgM позволяет осуществлять эффективную диагностику ГЛПС на самых ранних этапах заболевания. Предложен новый метод оценки титра IgG к вирусному антигену у больных ГЛПС и реконва-лесцентов по одному разведению сыворотки. Метод существенно увеличивает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость.

Впервые показана возможность выявления нуклеокапсидного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью высокочувствительного иммуно-ферментного анализа с усилением сигнала.

Научно-практическая значимость работы

В процессе выполнения исследований был предложен новый способ экстракционной очистки рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС, позволяющий существенно повысить степень его гомогенности. Вы-

сокоочищенный белок может использоваться не только для производства ди-агностикумов, но и служить основой для создания вакцинных препаратов. Разработанные автором на основе НКБ четыре типа иммуноферментных тест-систем могут найти самое широкое применение в практике здравоохранения. Иммуноферментная тест-система для количественного определения НКБ используется в научном отделе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Имму-нопрепарат» для мониторинга рекомбинантного НКБ в процессе его экстракционной очистки из бактерий-продуцентов и выявления антигена в органах инфицированных грызунов. Кроме того, она будет совершенно необходима для стандартизации вакцинных препаратов на основе нуклеокапсидного антигена. Тест-системы для определения IgM и IgG к НКБ позволяют осуществлять эффективную серологическую диагностику ГЛПС и проводить сероэпи-демиологические исследования. Высокочувствительная иммуноферментная тест-система с усилением сигнала способна обнаруживать предельно низкие концентрации вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС. Это свойство может оказаться полезным при изучении патогенеза заболевания, а также при испытании вакцинных препаратов на животных.

Внедрение результатов исследования в практику

На основе результатов исследований, представленных в диссертации, составлена нормативно-техническая документация на иммуноферментную тест-систему для определения IgM к нуклеокапсидному белку вируса ГЛПС «ИФА-ГЛПС-IgM» и приготовлены три экспериментально-производственные серии препарата. Производство препарата предполагается осуществлять на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Иммунопрепарат».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование комбинированной экстракции рекомбинантного НКБ из бактерий-продуцентов позволяет повысить чистоту конечного продукта.

2. Иммуноферментный метод определения IgG к НКБ по одному разведению сыворотки обладает более высокой диагностической эффективностью по сравнению с методами, основанными на последовательном разведении сыворотки

3. Иммуноферментная тест-система для определения IgM к рекомби-нантному НКБ позволяет осуществлять диагностику ГЛПС на ранних стадиях заболевания

4. С помощью иммуноферментного анализа с усилением сигнала удается выявлять НКБ в сыворотках больных ГЛПС

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), на конференции «Практикующий врач» (Сочи, 2002), на Республиканской научной конференции молодых ученых «Медицинская наука 2002» (Уфа, 2002), на IV Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003) и на I Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологию) (Уфа, 2004).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа изложена на 116 страницах, содержит 15 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 250 источника (31 отечественных и 219 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка

Конструкция для экспрессии нуклеокапсидного белка была получена и любезно предоставлена Хайбуллиной С.Ф. и Морзуновым СП. (Университет г. Рено, штат Невада, США). Для получения генетической конструкции был использован штамм хантавируса, относящийся к серотипу Puumala «CG-Иглино 12». RT-PCR-амплификация вирусной РНК проводилась с использованием праймеров, специфичных для S-сегмента. Фрагмент ДНК, полученный в результате амплификации гена вирусного нуклеокапсидного белка, был клонирован в вектор pCRII. Переклонирование фрагмента ДНКпроизводили в вектор экспрессии pQE30. Полученной конструкцией трансформировали клетки продуценты Е. coli штамма M15(pRep4).

Культивирование клеток-продуцентов E.coli проводили в ферментере АКА-210 при 31°С в присутствии ампициллина и канамицина Экспрессию НКБ индуцировали изопропил-р-О-тиогалакгозкда IPTG («Sigma», США). Клеточную взвесь откручивали при 10000 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок обрабатывали раствором 8 М мочевины и озвучивали на УЗ-дезинтеграторе УЗДН-1 У4.2 при частоте 22 кГц.. Лизированные клетки откручивали при тех же условиях, надосадок отбирали и наносили на сорбент. Очистку НКБ проводили на никелиево-хелатном сорбенте («Sigma») в соответствие с инструкцией изготовителя.

Забор парных сывороток осуществлялся у больных с первичным клиническим диагнозом геморрагическая лихорадка с почечным синдромом и больных, отличными от ГЛПС заболеваниями, находящихся на стационарном лечении в г. Уфа. Сроки взятия сывороток составляли от 2 до 16 дней после появления первых симптомов заболевания. Интервал между забором парных сывороток составил 5-11 дней.

Метод флуоресцирующих антител

Титр антител IgG к хантавирусам в парных сыворотках определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием реагентов производства ИПиВЭ им. МП. Чумакова, в точном соответствии с инструкцией изготовителя.

Определение иммуноглобулинов класса М с помощью иммуно-ферментного анализа (ИФА)

Лунки планшета «Nunc MS» сенсибилизировали рекомбинантным НКБ в концентрации 1 мкг/мл. Планшеты инкубировали при 31 °С в течение 1,5 часов. После 3-х кратной промывки лунок, добавляли исследуемые сыворотки в разведении 1:400. Планшеты инкубировали и промывали. В лунки вносили конъюгат антител с пероксидазой хрена против IgM человека. Планшеты инкубировали, промывали и добавляли субстратную смесь, содержащую перекись водорода и тетраметилбензидин. Реакцию учитывали через 10 минут при 450 нм. Результаты считали положительными, если оптическая плотность исследуемого образца превышала среднее значение отрицательных контролей на 3 стандартных отклонения.

Иммуноферментное определение титров иммуноглобулинов класса G методом последовательных разведений

Планшет "Costar" сенсибилизировали рекомбинантным НКБ. Исследуемые сыворотки вносили в лунки в разведении 1:128 до 1:16384. После промывки в лунки вносили конъюгат антител с пероксидазой хрена против IgG человека и затем субстратную смесь, содержащую перекись водорода и о-фенилендиамин. Реакцию учитывали при 490 нм. За титр сыворотки принимали то ее наибольшее разведение, при котором еще возможно зарегистрировать оптическую плотность, превышающую значение 0.2.

Иммуноферментное определение титров иммуноглобулинов класса G по одному разведению сыворотки

Планшет «Costar» сенсибилизировали НКБ. Исследуемые парные сыворотки вносили в лунки в разведении 1:1024. Для построения калибровочного графика использовали пул сывороток больных ГЛПС. После промывки в лунки последовательно вносили конъюгат антител с пероксидазой хрена против IgG человека и субстратную смесь, содержащую перекись водорода и о-фенилендиамин. Титры сывороток определяли по калибровочной кривой, используя формулу:

А - обратная величина разведения исследуемой сыворотки, рассчитанная по графику зависимости хромофорного ответа реакции от разведения референс-сыворотки;

В - обратная величина разведения, в котором данная сыворотка исследуется в ИФА;

С - обратная величина титра референс-сыворотки

Иммуноферментное определение титров иммуноглобулинов класса М методом последовательных разведений

Осуществляли в точном соответствии с методикой для определения иммуноглобулинов класса G за исключением использования на последнем этапе конъюгата антител с пероксидазой хрена против IgM человека.

Количественное определение нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС в составе лизатов с помощью ИФА

Планшет "Costar" сенсибилизировали иммуноглобулинами морской свинки, иммунизированных НКБ. Лизаты клеток E.coli и очищенный НКБ вносили в лунки планшета в присутствие 1 М мочевины. После промывки в

лунки вносили кроличью сыворотку к НКБ и затем антитела против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой хрена Реакцию проявляли субстратной смесью, содержащей перекись водорода и о-фенилендиамин. Концентрацию НКБ в составе лизата определяли по калибровочной кривой.

Количественное определение нуклеокапсидного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью ИФА с усилением сигнала Планшет «Costar» сенсибилизировали иммуноглобулинами морской свинки, иммунизированных НКБ. Двукратные разведения исследуемых сывороток, содержащих вирусный антиген и очищенный НКБ, вносили в лунки. После промывки последовательно закапывали кроличью сыворотку и конъюгат антител с щелочной фосфатазой против иммуноглобулинов кролика. После инкубации и промывки вносили НАДФ и затем усилитель, содержащий растворы йоднитротетразолиума, алкогольдегидрогеназы, диафоразы и этанола. Реакцию учитывали при 490 нм. Количественное содержание НКБ в исследуемых сыворотках определяли по калибровочному графику.

Определение антигена в составе гомогената ткани легких мышей проводили с использованием разработанной нами тест-системы для определ-ния НКБ вируса и реагентов коммерческой тест-системы «Хантагност», производства ИПиВЭ им. М.П.Чумакова в соответствие с инструкцией.

Определение белка проводили по методу Бредфорд.

Разделение белков в полиакриламвдном геле (ПААГ) осуществляли с помощью электрофореза по методу Laemmli.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Статистика».

Результаты и их обсуждение

Оптимизацияусловий получения очищенногорекомбинантногоНКБ

На первом этапе наших исследований мы проводили проверку полученного бактериального штамма-продуцента. После индукции экспрессии генетической конструкции препаратом IPTG бактериальные препараты подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ электрофорезу (рисунок 1). Хорошо видно, что применение индуктора биосинтеза приводит к появлению на форе-грамме дополнительной линии с относительной молекулярной массой около 56 кДа. Это значение соответствует размеру полного рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса Пумала [Elgh F. et al., 1996].

Подлинность НКБ была подтверждена с помощью «вестерн блота». Окрашивание исследуемого белкового компонента наблюдалось только при обработке нитроцеллюлозной мембраны пулом сывороток от переболевших ГЛПС. Использование пула донорских сывороток, полученных от людей, не имевших в анамнезе ГЛПС, не вызывало окрашивания.

Далее перед нами стояла задача провести исследования по оптимизации условий получения очищенного рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС.

«7*Да ЩШ

17 «Да

1 г з

Рис 1. Электрофоретический анализ лизата бактериальных клеток, несущих генетическую конструкцию pCRII-NP

1 - метчики молекулярной массы; 2 - бактериальные клетки, неиндуциро-ванныеIPTG; 3 - бактериальные клетки, индуцированныеIPTG. Стрелкой указанрекомбинантныйбелок

Под оптимизацией условий получения НКБ в данном случае мы подразумеваем проведение мероприятий по увеличению выхода рекомбинантного продукта и степени его очистки. Контроль параметров выхода и очистки предполагает наличие инструмента количественного определения НКБ на разных стадиях его получения. Количественное определение НКБ мы проводили с помощью иммуноферментного анализа. Для этого была сконструирована тест-система с использованием иммуноглобулинов морской свинки к НКБ, сыворотки кролика к НКБ и антител против иммуноглобулинов кролика, меченых пероксидазой. Для извлечения НКБ из клеток Е. coli после индукции экспрессии в качестве солюбилизирующего агента используется 8 М

раствор мочевины. Необходимо было установить, каким образом может повлиять мочевина на результаты ИФА. Т.е. при какой концентрации мочевина, во-первых, не оказывает влияние на взаимодействие Аг-Ат и, во-вторых, все еще препятствует образованию мультимерных комплексов самого НКБ или НКБ с внутриклеточными компонентами Е. coli. При образовании комплексов может происходить экранирование антигенных детерминант и, как результат, - значительное искажение результатов реакции. Из рис. 2 А видно, что мочевина в концентрации от 0,08 М до 1 М не оказывала влияние на им-мунофсрментную реакцию. При исследовании НКБ с помощью ИФА в составе бактериального лизата было показано, что максимальный уровень хромофорного ответа наблюдался при концентрации мочевины 1 М (рис. 2Б). Таким образом, мы пришли к выводу, что необходимым и достаточным условием определения НКБ в составе клеточного лизата в ИФА является использование 1 М мочевины.

Рис 2. Влияние концентрации мочевины на определение НКБ в ИФА

А — очищенный НКБ, Б-НКБ в составе бактериального лизата

На следующем этапе исследований мы определяли влияние метода разрушения бактерий, содержащих в своем составе вирусный белок, на выход НКБ и степень его чистоты. Для этого бактериальные клетки (I) обрабатывали только 8 М мочевиной, (II) обработку клеток 8 М мочевиной проводили в

сочетании с воздействием ультразвуком, (III) суспензию клеток в физиологическом растворе подвергали только озвучиванию. Наряду с этим использовался вариант (IV), когда суспензию клеток в физиологическом растворе предварительно озвучивали, затем, после центрифугирования (на этом этапе получали надосадок 1), осадок ресуспендировали в 8 М растворе мочевины, озвучивали и повторно центрифугировали (на этом этапе получали надосадок 2). Наибольший выход НКБ наблюдался при обработке клеток мочевиной в сочетании с озвучиванием Меньший выход регистрировался при обработке мочевиной без озвучивания, и наиболее скудные показатели выхода НКБ были отмечены при обработке клеток ультразвуком без мочевины или при использовании 2-х этапного способа обработки Однако последний вариант обеспечивал наибольшую чистоту препарата НКБ. Содержание НКБ в препарате при этом составило около 17 %, тогда как обработка клеток мочевиной с озвучиванием обеспечивала присутствие в препарате только 8 % нуклеокап-сидного белка. Увеличение продолжительности воздействия ультразвука на бактериальную суспензию в растворе мочевины практически не влияло на выход НКБ и несколько снижало чистоту препарата

Рис. 3. Показатели выхода и чистоты нуклеокапсидного белка при двух-этапной обработке клеточного лизата ультразвуком и мочевиной

Другие результаты были получены при изменении продолжительности обработки бактерий ультразвуком бактерий суспендированных в физиологическом растворе в процессе применения метода 2-х этапного воздействия (рис 3) Максимальный выход вирусного белка во втором надосадке наблюдается при обработке клеток ультразвуком в течение 30 сек. В этих условиях удается получить наиболее очищенный препарат (содержание нуклеокапсид-ного белка составляет 25%) При этом выход НКБ находился в пределах 2,9 мг из одного литра бактериальной культуры. Дальнейшее увеличение времени озвучивания приводило как к уменьшению выхода НКБ, так и к уменьшению доли НКБ в препарате

Заключительную очистку НКБ из лизатов приготовленных по способу IV и П. проводили с помощью аффинной хроматографии на носителе с иммобилизованными ионами №+2. На рисунке 4 представлены результаты электрофореза фракций, элюированных с аффинной колонки. Как видно из рисунка, вирусный белок очищенный из лизата, обработанного по способу IV, является более гомогенным. В препарате отсутствуют примесь бактериальных белков с молекулярной массой больше 60 кДа.

V "

"Ж^Яни V/ (V

1 2 3 456789 10

Рис. 4. Электрофоретический анализ препаратов НКБ, очищенного с помощью аффинной хроматографии

Дорожки 1-5 колоночные фракции, полученные после очистки лизата, обработанного по способу IV; дорожки 6 -10 фракции, полученные после очистки лизата, обработанного по способу II

Денситометрия электрофореграммы показала, что гомогенность препарата НКБ из лизата, полученного по предложенному нами способу IV, оказа-

лась около 90 %. Гомогенность препарата вирусного белка из лизата, полученного по способу II находилась в пределах 70 % Выход препарата НКБ из 1 л бактериальной культуры в среднем составил 2 мг и 2,4 мг соответственно. Эти результаты в целом соответствуют данным по выходу очищенного ре-комбинантных НКБ хантавирусов, экспрессированных в Е. coli, который находился в пределах 1,3-2,4 мг/л [Jonsson С. et al., 2001]. Поскольку препараты НКБ, полученные по методу II и IV отличались по степени чистоты, мы решили исследовать влияние этого фактора на специфичность анализа сывороток, не имеющих иммуноглобулинов к вирусу ГЛПС, но содержащие в своем составе антитела к антигенам Е. coli.

Таблица 1

Результаты иммуноферментного анализа сыворотоклюдей, содержащих IgM к антигенам Е. coli, при использовании различных антигенов

№ штамм BL 21 штамм М15

сыво- Контроль (пустые лунки)

ротки Лизат нетранс-формированных бактерий НКБ из лизата, полученного по способу II НКБ из лизата, полученного по способу IV

пул 0,64 0,23 0,13 0,08

51 0,53 0,25 0,16 0,08

76 0,70 0,26 0,19 0,09

84 0,44 0,22 0,15 0,11

101 0,69 0,32 0,16 0,09

103 0,71 0,23 0,20 0,09

105 0,55 0,22 0,10 0,06

112 0,74 0,37 0,20 0,15

113 0,60 0,23 0,20 0,11

114 0,72 0,52 0,20 0,11

118 0,60 0,25 0,18 0,08

Это важно, так как при диагностике ГЛПС могут наблюдаться ложно-положительные реакции за счет присутствия антител к антигенам кишечной палочки.

Из таблицы 1 видно, что при постановке ИФА с НКБ, очищенным по способу IV, оптическая плотность хромогена в лунках не превышала значения 0,20. В то же время при использовании менее очищенного НКБ, во всех случаях наблюдалась более интенсивная реакция. Причем в 2-х случаях (сы-

воротки 101, 114) полученные значения оптической плотности по нашим данным позволяют отнести результаты к неопределенным, а в одном случае (сыворотка 112) к положительным.

Таким образом, в процессе работы нами предложена иммунофермент-ная тест-система для количественного определения нуклеокапсидного белка в составе грубого бактериального лизата. С помощью этой системы удалось контролировать выход и гомогенность вирусного белка при различных способах его выделения. Это позволило нам предложить оригинальную схему экстракции НКБ, которая в отличие от традиционной увеличивает степень его чистоты с 70 % до 90 %. Показано, что последнее обстоятельство в свою очередь может повысить специфичность анализа сывороток от больных с подозрением на ГЛПС. Наряду с этим, высокоочищенный НКБ может служить основой для создания вакцинных препаратов.

Иммуноферментная диагностика ГЛПСна основе определения^О

В настоящее время лабораторная диагностика ГЛПС строится преимущественно на определении нарастания титра IgG в парных сыворотках больных методом флюоресцирующих антител (МФА) или иммуноферментного анализа (ИФА).

Стандартные методики определения титров иммуноглобулинов с помощью МФА и ИФА предполагают процедуру последовательного разведения исследуемых сывороток. Это приводит к увеличению трудоемкости методов и ограничению диагностических возможностей, поскольку для постановки диагноза необходима регистрация увеличения титра антител во второй сыворотке не менее чем в 4 раза. Кроме того, стандартный вариант ИФА позволяет проанализировать на одном планшете не более трех-шести пар сывороток. Вместе с тем существуют подходы, предполагающие определение титра сыворотки по одному ее разведению [Веселов С.Ю. и др., 1989]. В связи с этим, мы поставили перед собой задачу разработать иммуноферментный метод определения титра IgG к нуклеокапсидному антигену вируса Пумала по одному разведению сыворотки больного и оценить его диагностическую эффективность.

2 1,8 1,6 1,4 1,2

о> □

О

1

0,8 0,6 0,4 0,2

0

7 8 9 10 11 12 13 14

Рис 5. Калибровочная кривая для определения титров антител к НКБ вируса ГЛПС (на графике представлены два стандартных отклонения от среднего значения титра)

по оси абсцисс- обратной величиныразведения сыворотки

В основе оценки титра сыворотки по одному ее разведению лежит использование калибровочной кривой, для построения которой мы использовали пул высокотитражных сывороток больных ГЛПС. На рисунке 5 представлена калибровочная кривая для определения титра методом ИФА по одному разведению исследуемой сыворотки.

Статистические расчеты показали, что наименьшая величина стандартного отклонения от величины среднего титра наблюдалась на средней части калибровочной кривой (004% 0,4-1,1). В пределах этой области соответствующие коэффициенты вариации составили 5,1-6,0. Разница между двумя средними принято считать достоверной с вероятностью 95 % при отсутствии перекрытия значений после добавления величины 2-х стандартных отклонений к средней с меньшим значением и вычитании величины 2-х стандартных отклонений из средней с большим значением [Лакин Г., 1990]. Тот же самый принцип применяют при замене стандартного отклонения соответствующим ему параметром коэффициента вариации. Поэтом)', в нашем случае, при максимальной величине коэффициента вариации 6 % разницу в

24 % при сравнении титров парных сывороток можно считать достоверной с вероятностью 95 %.

На следующем этапе работы мы проводили сравнение диагностической эффективности предложенного нами метода, метода иммуноферментно-го анализа, основанного на последовательном разведении сывороток и метода флюоресцирующих антител. Было показано, что из 27 образцов парных сывороток, полученных от больных с окончательным клиническим диагнозом ГЛПС, положительным в МФА оказался 21 образец. ИФА позволил выявить в качестве положительных 26 пар сывороток, титры которых определяли по графику и 21 пару методом последовательных разведений.

Следует отметить, что при исследовании 50 парных сывороток от больных с первичным клиническим диагнозом ГЛПС, у которых в итоге оказались другие инфекционные заболевания в МФА и в ИФА, основанном на титровании сывороток, все образцы оказались отрицательными. В ИФА, где титры рассчитывали по калибровочной кривой, один образец определился как положительный.

Таким образом, чувствительность ИФА для определения ^О к НКБ по графику и методом последовательного разведения сывороток, составила 96,3 % и 77,8 %, для МФА - 77,8 %. Специфичность методов оказалась соответственно 98 %, 100 % и 100 %.

Использование ИФА, где уровень антител определяется по графику, позволяет статистически достоверно выявлять разницу титра антител всего в 24 %, что позволяет существенно увеличить диагностическую эффективность анализа. Следует также отметить, что предполагаемый вариант ИФА может оказаться востребованным в связи с широким распространением иммуноде-фицитных состояний, при которых наблюдается снижение иммунного отклика на антиген.

Поскольку предлагаемый метод может быть использован не только для диагностики, но и для определения уровня иммунной прослойки среди населения, было интересно убедиться, насколько близки титры определенные 2-мя вариантами ИФА.

На рисунке 6 представлены результаты сопоставления титров сывороток, определенных в ИФА методом последовательного разведения и по калибровочной кривой

Как видно из рисунка в большинстве случаев наблюдаются близкие значения титров антител в сыворотках Коэффициент корреляции между уровнем IgG к НКБ, выявленных 2-мя методами, составил 0,87 (р<0,01).

Рис 6. Титры сывороток к нуклеокапсидному белку вируса ГЛПС, определенные методом последовательных разведений и по калибровочной кривой

Иммуноферментная диагностика ГЛПСна основе определения %М

Необходимость использования парных сывороток для диагностики ГЛПС на основе определения IgG существенно отодвигает сроки лабораторной постановки диагноза. Это в свою очередь препятствует раннему проведению мероприятий по лечению заболевания и профилактики осложнений. Определение IgM может позволить осуществлять диагностику на самых ранних этапах развития болезни. В литературе имеются противоречивые данные о чувствительности и специфичности тест-систем на основе выявления IgM [Kallio-Kokko К et а1., 1998; Hujakka К et а1., 2003]. В данном разделе приводятся результаты оценки диагностической эффективности иммунофермент-ной тест-системы для определения ^М к рекомбинантному НКБ эндемичного для Башкортостана вируса Пумала штамма «CG-Иглино 12».

В таблице 2 представлены результаты определения специфических ^М к нуклеокапсидному антигену в сыворотках больных, которые поступили в клинику с подозрением на ГЛПС. Из данных, приведенных в таблице, видно, что в 187 из 197 случаев с установленным диагнозом ГЛПС сыворотки были

оценены как положительные. В 4 случаях из 170, когда предварительный клинический диагноз ГЛПС не был подтвержден и оказалось, что у пациентов были другие заболевания (пиелонефрит, инфекционный гепатит А, лаку-нарная ангина, ОРВИ), сыворотки были оценены как положительные. При исследовании донорских сывороток 2 образца из 100 оказались положительными. Таким образом, общая специфичность тест-системы составила 97,7 %.

Таблица 2

Результаты определения специфических IgM к нуклеокапсидному антигену вируса Пумала с помощью иммуноферментного анализа

Сыворотки Кол-во Положит. в ИФА Отрицат. в ИФА Чувстви- тель-ность,% Специфи чность,%

больных ГЛПС положительные в тесте МФА 197 187 10 94,9

больных другими заболеваниями отрицательные в тесте МФА 170 4 166 97,6

доноры отрицательные в тесте МФА 100 2 98 98,0

всего (отрицательные в тесте МФА) 270 6 264 97,7

Анализ результатов иммуноферментной диагностики по дням от начала заболевания (были отобраны 104 сыворотки с точно установленным днем заболевания) показал, что чувствительность определения ^М в сыворотках возрастала с 1 по 3 день от начала заболевания и достигала 100 %, начиная с 4 дня (таблица 3).

Таблица 3

Эффективность определения специфических иммуноглобулинов «М» у

больных ГЛПС в разные дни от начала заболевания

день количество сывороток количество сыворо- % опреде-

заболе- от больных с клини- ток от больных по- ления

вания ческим диагнозом ложительных в

ГЛПС ИФА

1 5 4 80

2 9 8 88

3 15 14 93

4 13 13 100

5 12 12 100

6 20 20 100

7 5 5 100

8 7 7 100

9 7 7 100

10 3 3 100

11 5 5 100

13 2 2 100

16 1 1 100

Следует также отметить, что с увеличением продолжительности заболевания наблюдалось возрастание титра ^М (таблица 4).

Таблица 4

Геометрический титр IgM в сыворотках больных ГЛПС в зависимости от длительности заболевания

День от начала заболевания Геометрический титр сыворотки

2-3 (а) 8,9 ± 0,7*(бв)

4-5 (б) 11,2±0,5*(а)

6-8 (в) 11,7±0,5*(а)

Примечание. В таблице приведены средние значения и их ошибки *различия достоверны между вариантами, указанными буквами ср<0,01

Определение ревматоидного фактора (РФ) выявило его наличие в нескольких сыворотках больных ГЛПС. Однако, при разведении сыворотки 1:400, которое используется для определения ¡яМ, значение оптической плотности для сывороток с РФ не превышало уровень контроля

Таким образом, в процессе исследований была разработана иммуно-ферментная тест-система, которая позволяет с высокой степенью надежности осуществлять диагностику ГЛПС с 3-4 дня от начала заболевания.

Выявление вирусного антигена в биологических пробах

Серологические методы диагностики инфекционных заболеваний предполагают не только определение специфических антител, но и обнаружение самого антигена возбудителя. В доступной научной литературе мы не встречали сведений об определении антигенов вируса ГЛПС в биологических жидкостях у людей с помощью иммуноферментного анализа.

Рис. 7. Схема традиционного ИФА (I) и ИФА с усилением сигнала (II) ПНФФ - пара-нитрофенилфосфат; ПНФ - пара-нитрофенол; Ф - фосфат; Эт — этанол; Ац - ацетальдегид; ДФ - диафораза; АДГ- алкогольдегидроге-иаза; ОФ — окрашенный формазан; ПИНТ - пара-поднитротетразоль фиолетовый; НАД+ - никотинамиддинуклеотид (окисленный); НАД*Н - никоти-намиддинуклеотид (восстановленный)

Разработанная нами тест-система для определения НКБ с чувствительностью 2 нг/мл позволяла успешно выявлять вирусный антиген в легких инфицированных мышей, но не в сыворотках людей больных ГЛПС (данные

приведены в диссертации). По-видимому, это связано с очень низкой концентрацией антигена и ограниченной чувствительностью традиционного имму-ноферментного анализа. Можно предположить, что дальнейшее увеличение чувствительности ИФА все-таки позволит выявлять антиген вируса ГЛПС в сыворотках заболевших.

Модификация традиционного ИФА, существенно повышающая чувствительность анализа, была предложена С. Self (1985). Принцип метода основан на расщеплении молекулы НАДФ щелочной фосфатазой, конъюгиро-ванной с антителами, до молекулы НАД. Последняя затем вступает в окислительно-восстановительный цикл, в котором принимают участие ферменты алкогольдегидрогеназа и диафораза (рис. 7). Завершение каждого цикла приводит к редукции молекулы соли тетразолия с образованием окрашенного формазана. Чувствительность реакции при этом возрастает в 30-70 раз. На этом основании мы решили адаптировать вариант ИФА для определения НКБ вируса в сыворотках больных ГЛПС.

На рисунке 8 приведена калибровочная кривая для определения НКБ вируса Пумала с помощью иммуноферментного анализа с усилением сигнала.

0,2 —,—.—,—,—,—,—,—,—,—,—,—,—,—,— 0 0,1 0,2 0,3 0/ 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5

нг/мл

Рис. 8. Калибровочная кривая для определения НКБ в ИФА с усилением сигнала

Чувствительность такого варианта ИФА возросла по сравнению с традиционным в 50 раз и составила 40 пг/мл НКБ. Применение тест-системы с повышенной чувствительностью позволило обнаружить НКБ в 21 образце из 34 образцов сыворотки больных ГЛПС (таблица 5).

Таблица 5

Определение концентрации НКБ в сыворотках больных ГЛПС с помо-

щью иммуноферментной тест-системы с усилением сигнала

День от Количество Количество Концентрация НКБ в

начала отрицательных положительных положительных об-

заболе- образцов образцов разцах, пг/мл

вания

4 - 2 160 - 220

6 - 1 148

7 - 4 160-220

8 - 3 200-204

9 1 - -

10 4 3 120-268

11 2 1 120

12 1 -

13 - 1 146

14 2 1 320

16 2 2 142 -164

18 - 1 204

19 - 1 180

20 1 - -

21 - 1 162

23 1 - -

Концентрация антигена в сыворотках не зависела от времени забора материала и колебалась в пределах от 120 до 320 пг/мл. При исследовании сывороток 18 больных другими инфекционными заболеваниями только один образец был определен как положительный.

Чувствительность выявления вирусного антигена с помощью иммуно-ферментного анализа с усилением сигнала составила 61,8 %. Это примерно соответствует чувствительности определения вирусной нуклеиновой кислоты с помощью RT-PCR [Papa A. et al., 1998; Plyusnin A. et al., 1999], но значительно ниже чувствительности разработанного нами метода, основанного на определении IgM. По-видимому, это связано с тем, что антитела после их по-

явления достаточно длительное время сохраняют в крови свою концентрацию практически у всех индивидуумов. Напротив, период пребывания вирусного антигена в крови ограничен и, скорее всего, различен у каждого конкретного заболевшего ГЛПС. Во всяком случае, изучение сроков пребывания вирусного антигена наряду с вирусной РНК в крови может оказаться полезным для изучения патогенеза заболевания. Возможно, иммуноферментный анализ с усилением сигнала окажется достаточно рациональным применять для диагностики ГЛПС на ранних сроках заболевания, так как НКБ определялся во всех сыворотках полученных от больных на 4-8 день от начала заболевания.

Тест-система с усилением сигнала может также быть использована при испытании вакцинных препаратов на животных. Поскольку после проведения вакцинации и последующего заражения грызунов патогенным вирусом необходимо будет убедиться в отсутствие или наличие вирусного антигена во внутренних органах вакцинированного животного. И только высокочувствительный анализ позволит дать по этому поводу достоверное заключение.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый метод экстракционной очистки рекомбинантного нук-леокапсидного белка вируса Пумала из бактерий-продуцентов, позволяющий увеличить уровень гомогенности белка с 70 % до 90 % и повысить специфичность иммуноферментного анализа.

2. Разработана иммуноферментная тест-система для определения титра

к нуклеокапсидному белку у больных ГЛПС и реконвалесцентов по одному разведению сыворотки. Такой подход увеличивает чувствительность анализа с 77,8 % до 96,3 %, а также снижает его трудоемкость и стоимость.

3. Разработана иммуноферментная тест-система для ранней диагностики ГЛПС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса Пу-мала. Тест-система позволяет выявлять ¡яМ на ранних стадиях заболевания с чувствительностью и специфичностью 95 % и 98 %, соответственно.

4. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения нуклеокапсидного белка вируса Пумала, которая позволяет определять до 2 нг/мл вирусного антигена. Данная тест-система используется для мониторинга нуклеокапсидного белка в процессе его экстракци-

онной очистки из бактерий-продуцентов и выявления антигена в органах инфицированных грызунов. 5. Разработана высокочувствительная иммуноферментная тест-система с усилением сигнала для определения предельно низких концентраций нуклеокапсидного антигена. С ее помощью показано, что в сыворотках больных нуклеокапсидный белок выявляется в течение 3-х недель заболевания в концентрации 120-320 пг/мл с частотой 61,8 %.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю Веселову СЮ. за ценные указания и постоянную поддержку, Хайбуллиной С.Ф. за предоставленный штамм-продуцент, а также Кулагину В.Ф. и Ишкильдину И.Б. за помощь при выполнении работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П., Хасанова С.С., Кулагин В.Ф., Ма-газов Р.Ш., Алсынбаев М.М., Ли Л.Е. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС, пригодного для создания иммунодиагности-ческих тест-систем. // Материалы Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» - Уфа, 2000. - С. 27-30.

2. Хасанова С.С., Хайбуллина С.Ф., Ли Л.Е., Мухаметханов Н.Х., Весе-лов С.Ю., Кулагин В.Ф. Поиск условий экономичного синтеза рекомбинант-ного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС для создания тест-систем. // Итоги биологических исследований за 2000 г. - Уфа, 2001. - вып. 6. - С.67-68.

3. Ли Л.Е. Ранняя серологическая диагностика ГЛПС. // Республиканская научная конференция молодых ученых «Медицинская наука 2002» -Уфа, 2002. -С.53.

4. Ли Л.Е., Веселое С.Ю., Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П. Иммунодиагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом. // Сборник материалов конференции «Практикующий врач» - Сочи, 2002. - С.74.

5. Веселов С.Ю., Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П., Хасанова С.С., Ли Л.Е., Гарипова М.И., Климчук Л.А., Сперанский В.В., Кулагин В.Ф., Магазов Р.Ш. Ранняя диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом

на основе использования рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса Пумала. // Журн. микробиол., 2003. - №1. - С. 55-59.

6.Ли Л.Е., Веселов С.Ю., Хайбуллина С.Ф., Морзунов С. П., Хасанова С.С., Гарипова М.И., Климчук Л.А., Сперанский В.В., Кулагин В.Ф., Магазов Р.Ш. Серологическая диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе определения специфических иммуноглобулинов класса М. // Итоги биологических исследований за 2001 г. - Уфа, 2002. - вып. 7 - С. 225-229.

7.Ли Л.Е., Веселов С.Ю., Алибаева С.Р., Хайбуллина С.Ф., Морзунов С.П. Серологическая диагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования одного разведения сыворотки. // Успехи современного естествознания, 2003. - № 8. - С. 60-61.

8.Ли Л.Е., Кулагин В.Ф., Веселов С.Ю. Оптимизация условий получения очищенного рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Материалы I Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» - Уфа, 2004. - С.58- 61.

9.Ли Л.Е., Алибаева С.Р., Кулагин В.Ф., Веселов С.Ю. Сравнительная эффективность диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом методами иммунофлуоресценции и иммуноферментного анализа // Итоги биологических исследований - Уфа, 2004. - вып. 8. - С. 167-171.

Ли Лариса Еновна

Иммунодиагностика геморрагической лихорадки с почечным синдромом на основе использования рекомбинантного нуклеокапсидного антигена вируса

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ответственный за выпуск Р. К. Каримова

Подписано в печать 27.12.04 г. Бум. офсетная. Формат 60x84 1/16. Гарнитура «Times New Roman Cyr». Отп. на ризографе. Усл. печ. л. 1,43. Уч.-изд. л. 1,47. Тираж 100 экз. Заказ № 1548

f4 \

РИО ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, филиал «Иммунопрепарйт» £ % \ Ъ , 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105, тел: (3472) 213-214J

\ ш

13 0E3 2CG5

Актуальность проблемы

Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) является одним из наиболее распространенных в России, а также странах Азии и Европы зоонозных природно-очаговых заболеваний. На Республику Башкортостан приходится около половины всей заболеваемости по России [Хунафина Д.Х., 1998]. Причинным агентом, вызывающим заболевание в Республике и западной части Российской Федерации, является вирус геморрагической лихорадки Пумала, относящийся к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae. Инфекция характеризуется относительно тяжелым течением, поражением почек, сердечно-сосудистой и других систем организма. Эффективность лечения больных, а также предупреждение осложнений во многом зависит от своевременно поставленного диагноза. Достоверная клиническая диагностика ГЛПС связана с несколькими проблемами. Во-первых, многие инфекции в начале заболевания имеют неспецифические симптомы характерные и для ГЛПС. Наряду с этим могут существовать нетипичные или клинически слабо выраженные формы геморрагической лихорадки, плохо диагностируемые даже в разгар болезни [Суздальцев А.А. и др., 2003].

Приведенные данные свидетельствуют о необходимости лабораторной диагностики инфекции. Причем лабораторная диагностика должна использоваться не только для подтверждения диагноза врачей-клиницистов, но иметь самостоятельное значение, особенно, в случае, если она позволяет поставить диагноз в самом начале заболевания.

В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется метод флуоресцирующих антител. К недостаткам метода следует отнести его высокую трудоемкость и то, что он позволяет осуществлять только ретроспективную диагностику заболевания. Использование более производительного и чувствительного метода иммуноферментного анализа всегда было ограничено невозможностью наработки препаративного количества антигена из-за слабой репродуктивной активности вируса в культуре клеток. Только после того, как удалось получить системы для экспрессии рекомбинантных белков вируса, появились перспективы разработки новых препаратов для диагностики ГЛПС на основе иммуноферментного анализа.

Цель исследования

Разработать иммуноферментные тест-системы для диагностики ГЛПС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка (НКБ) вируса Пумала и оценить их диагностическую эффективность.

Задачи исследования

1. Отработать условия получения очищенного рекомбинантного НКБ.

2. Оптимизировать параметры иммуноферментного анализа IgM и IgG к НКБ вируса Пумала в сыворотках больных ГЛПС.

3. Исследовать возможность выявления вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью высокочувствительного иммуноферментного анализа с повышенной чувствительностью.

4. Провести оценку чувствительности и специфичности полученных тест-систем на основе исследования сывороток больных ГЛПС, больных другими инфекционными заболеваниями и сывороток здоровых доноров.

Научная новизна

Разработан новый способ экстракции рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса из бактерий-продуцентов, позволяющий существенно повысить степень чистоты препарата. Установлено, что использование высоко-очищенного НКБ увеличивает специфичность диагностики заболевания.

Впервые разработаны четыре типа иммуноферментных тест-систем на основе нуклеокапсидного белка эндемичного для Башкортостана вируса Пумала штамма «CG-Иглино 12». Установлено, что созданная на его основе тест-система для определения IgM позволяет осуществлять эффективную диагностику ГЛПС на самых ранних этапах заболевания. Предложен новый метод оценки титра IgG к вирусному антигену у больных ГЛПС и реконвалесцентов по одному разведению сыворотки. Метод существенно увеличивает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость.

Впервые показана возможность выявления нуклеокапсидного антигена в сыворотках больных ГЛПС с помощью высокочувствительного иммунофер-ментного анализа с усилением сигнала.

Научно-практическая значимость работы

В процессе выполнения исследований был предложен новый способ экстракционной очистки рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС, позволяющий существенно повысить степень его гомогенности. Вы-сокоочищенный белок может использоваться не только для производства ди-агностикумов, но и служить основой для создания вакцинных препаратов. Разработанные автором на основе НКБ четыре типа иммуноферментных тест-систем могут найти самое широкое применение в практике здравоохранения. Иммуноферментная тест-система для количественного определения НКБ используется в научном отделе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Иммунопрепарат» для мониторинга рекомбинантного НКБ в процессе его экстракционной очистки из бактерий-продуцентов и выявления антигена в органах инфицированных грызунов. Кроме того, она будет совершенно необходима для стандартизации вакцинных препаратов на основе нуклеокапсидного антигена. Тест-системы для определения IgM и IgG к НКБ позволяют осуществлять эффективную серологическую диагностику ГЛПС и проводить сероэпидемиологические исследования. Высокочувствительная иммуноферментная тест-система с усилением сигнала способна обнаруживать предельно низкие концентрации вирусного антигена в сыворотках больных ГЛПС. Это свойство может оказаться полезным при изучении патогенеза заболевания, а также при испытании вакцинных препаратов на животных.

Внедрение результатов исследования в практику

На основе результатов исследований, представленных в диссертации, составлена нормативно-техническая документация на иммуноферментную тест-систему для определения IgM к нуклеокапсидному белку вируса ГЛПС

ИФА-ГЛПС-IgM» и приготовлены три экспериментально-производственные серии препарата. Производство препарата предполагается осуществлять на базе ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СЗ РФ «Иммунопрепа-рат».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование комбинированной экстракции рекомбинантного НКБ из бактерий-продуцентов позволяет повысить чистоту конечного продукта.

2. Иммуноферментный метод определения IgG к НКБ по одному разведению сыворотки обладает более высокой диагностической эффективностью по сравнению с методами, основанными на последовательном разведении сыворотки.

3. Иммуноферментная тест-система для определения IgM к рекомби-нантному НКБ позволяет осуществлять диагностику ГЛПС на ранних стадиях заболевания.

4. С помощью иммуноферментного анализа с усилением сигнала удается выявлять НКБ в сыворотках больных ГЛПС.

Апробация работы

Полученные результаты были представлены на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000), на Республиканской научной конференции молодых ученых «Медицинская наука 2002» (Уфа, 2002), на конференции «Практикующий врач» (Сочи, 2002), на IV Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2003) и на I Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа изложена на 116 страницах, содержит 15 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 250 источников (31 отечественных и 219 зарубежных).

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый метод экстракционной очистки рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса Пумала из бактерий-продуцентов, позволяющий увеличить уровень гомогенности белка с 70 % до 90 % и повысить специфичность иммуноферментного анализа.

2. Разработана иммуноферментная тест-система для определения титра IgG к нуклеокапсидному белку у больных ГЛПС и реконвалесцентов по одному разведению сыворотки. Такой подход увеличивает чувствительность анализа с 77,8 % до 96,3 %, а также снижает его трудоемкость и стоимость.

3. Разработана иммуноферментная тест-система для ранней диагностики ГЛПС на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса Пумала. Тест-система позволяет выявлять IgM на ранних стадиях заболевания с чувствительностью и специфичностью 95 % и 98 %, соответственно.

4. Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения нуклеокапсидного белка вируса Пумала, которая позволяет определять до 2 нг/мл вирусного антигена. Данная тест-система используется для мониторинга нуклеокапсидного белка в процессе его экстракционной очистки из бактерий-продуцентов и выявления антигена в органах инфицированных грызунов.

5. Разработана высокочувствительная иммуноферментная тест-система с усилением сигнала для определения предельно низких концентраций нуклеокапсидного антигена. С ее помощью показано, что в сыворотках больных нуклеокапсидный белок выявляется в течение 3-х недель заболевания в концентрации 120-320 пг/мл с частотой 61,8 %.