Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноактивный пептид из оптических ганглиев кальмара

МИНИСТЕРСТВ О ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЗРЛЦИИ ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

рГВ ол

На правах рукописи

'ФЬ

ГАЖА АННА КШСТАНГИНШНА

ИММУНОШИВНЫЙ ПЕПТИД ИЗ ОПТИЧЕСКИХ ГАНГЛИЕВ КАЛЬМАРА

(14.00.36 - аллергодогня и иммунология)

Автореферат диссертация на ооаскание ученой степени кандидата медицинских наук

Злаянзосток - 1ЬЭ4

> А

/

.Диссертация выполнена в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Тихоокеанском НИИ рыбного хозяйства и океанографии (ТИНРО)

На.учиые руководители: член-корреспондент РАМН,

лауреат Государственной премии Н.Н.Беседнова

кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Г,Б. Кирилличева

Научный консультант -доктор биологических наук,

лауреат Государственной премии Л.М. ЭпштеЯн •

Ойкщальныа оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Б .М. Ковалев

кандидат медицинских наук Т.А. Кузнецова

Ведущее учреждение, дшодее внешний отзив о научно-практической ценности работы - Государственный научный центр по антибиотикам МЗ РФ, лаборатория фармакологии и патоглстолсгии, г, Москва.

на заседании Специализированного Совета К 084.24.05 яри Владивостокском Государственном медицинском институте по адресу: 690600 ГШ, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского института.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат иедицинских нвуа

Е.В. Власова

Актуальность проблемы. Поиск иммуностимуляторов и изучение ¡ехянизмов их действия на иммунную систему организма является дннм из ведущих направлений' теоретической и практической им-унологии и современной медицины (Р.В. Петров и соавт.. 1983, ■.В, Прозоровский и соавт., 1988),

Особую важность приобретает проблема регуляции иммунологи-еских процессов при инфекционных заболеваниях, являющихся одой из основных причин рязвития вторичных гакмунодефииитных сос-ояний, В последние годы наблюдается увеличение числа лиц с по-нженной резистентностью к инфекции, что создает благоприятные словия для роста заболеваемости, тяжелого и длительного тече-ия инфекционных болезней. Необходимость стимулирования кммун-ой системы возникает также при развитии вторичных иммунодефи-итов, вызванных опухолью, ревматическими заболеваниями, хирур-ическш вмешательством, стрессом и др. патологическими процес-ами.

Иммуностимулирующими свойствами обладает многие вещества, язличрюшиеся по химической природе и происхождению (A.B. Ники-ин и соавт., 1983,И , R . Diiuslo , 1985, Г.К. Закенфельд, 990, B.C. Шириинокий и соавт., 1990). Значительный интерес редставлялт иммунонодулирующие препараты пептидной природы, ии нетоксичны, легло выводятся из организма, применяются в не-олыяих дозах, могут быть получены синтетическим путем.

Наиболее тароко в практическом здравоохранении применяются рэпоратц, полученные из тимуся телят - гагалин (В.Г. Морозов и оавт., 1977), тактиэик (В.Я, Арион, РЭ81). Однако, сырье для олучения ятих препаратов, становится все болев дефицитным. Поэ-оцу весьма актуальным является поиск новых нетрадиционных ис-очников биологически активных веществ.

провой океан является богатейшей кладовой лекарственных редств. Поиск активных впшетв является перспективным и целе-ообразньгм, поскольку приводит к обнаружению новых веществ с азличным спектром биологической активности и фармакологичес-ой эффективности. При этом зачастуч биолчгкчески активные ве-ества гидробионтов лишены отрицательных характеристик, прису-их вешествям, получаемым из традиционное источников и содер-атся в большом количестве.

Б этой связи, Тихоокеанским институтом рыбного хозяйстве и

- г

океанографии и НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РЛМН осуществляется широкая программа поиска морских организмов с целью обнаружения среди них потенцивльиых источников веществ, обладающих иммуноыодулирушей активностью. Изучение так"х препаратов, в частности, пептидной природы, открывает перспективы регуляции иммунологических процессов и болое рациональной терапии инфекционных болезни.

Цель роботы. Исследование иммуноыодулирующей активности нового пептида - ганглиина - выделенного из оптических ганглиев х&лькара, изучение некоторых механизмов его действия на иммунную систему и факторы неспецифической резистентности организма.

Основные задачи исследования:

1= Оценить влияние ганглиина нп резистентность животных к некоторым экспериментальным инфекциям.

2. Изучить хярэктер влияния ганглиина на иммунные реакции гуморального и клеточного типов.

3. Исследовать влияние ганглиина на клеточные факторы неспецифической резистентности организма.

4. В экспериментах на пушных зверях и домашней птице оценить воэм'Шости использования ганглиика для профилактики и лечения некоторых бактериозов.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Новизна настоящей работы определяется тем, что в ней на широком экспериментально« материале впервые показана ишуномодулирушая активность нового тептида - ганглиина, вид' пенного из оптических ганглиев промысловых видов кальмара. Установлено, что парентеральное введение ганглиина повыпаег резистентность мышей к E.coli и S . typh.imuri.um . , ;ыплят - к S .-fcyphinuriun оказывает терапевтическое дьйствие при тл.тблом инфекционном заболевании норок - некрозе фаланг лап. Показано, что с помощью ганглиина возможно осуществление коррекции дефектов фагоцитоза полиморфноядкрннх лейкоцитов (ШВД) и клеток системы мононук-леарных фагоцитов (С®) - их поглотительной и бактерицидной функций - при сальмонеллезе, псевдотуберкулезе, стафилококковое, синегнзГной и коли-икфекциях. В тесте определения уровня активности б-нуклеэгидаэы макрофагов перитонеального экссудата мшсеЯ установлено, что введение ганглиина вызывает снижение

ферментативной активности клеток Г®, При внутривенном гааде-тл ганглиина дачм различных линий снижение активности 5-йу.*-яеотидазы отмечалось уже через 5 минут после г^чьекции. Уста-швлено, что иммуностимулирующее действие ганглиина заЕког^ эт времени суток (утренняя или вечерняя инъекции).

Впервые установлено, что ганглиин обладает адыовантными свойствами (обеспечивает накопление антителообразующих клеток з селезенках мышей, иммунизированных эритроцитами барана ОБ] , ювышает титры гемчгглютишшов к ЭВ в сыворотке крови) и оказывает выряженное влияние на клеточный иммунитет, увеличивая 1нтенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа, 1ндуцировянную у мше1 введением ЭВ.

Практическое значение работы. Результаты исследований показали перспективность использования ганглиш.1 в качестве южного лекарственного препарата - иммуномодулятора. В настоящее время ганглиин на основании документации, утверкдедной Зотфармсоиетом И и разрешающей применение ег-о в сельском хозяйстве, применяется в качестве профилактического и лечебного ¡редствя в пушном звероводстве. Выпуск его в 1992 году налажен

> НРП "Биомед" г. Пермь.

Ганглиин применяется как лечебно-профилакт'-чеекая добавка 1 мясные пресервы для плотоядных глвг>тных. Выпуск продукта нажжен на Лртемовском шсоперерабатываютпем па поде Приморского ;рая согласно НТД (ТУ № 9219-022-00472012-.М).

Иютитутом питания РАМН дано положительное заключение о юзмогглости использования гак ■тина в качестве пнчэвой добавки.

> соответствии с зтим в настоящее время разрабатывается Ш'Д на [еи^бно-профилпктические продукты, содержащие ганглиин.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новый пептид из оптических ганглиев кальмара - гангли-!н - оказывает выряженное влияние на специфические реакции гу-юрялъноги и клеточного типов, а также факторы неспецифической 1езистентности макрооргянизмв.

2. Ганглиин повышает естественную резистентность жкаотных различным инфекциям.

3. Одним из Основных механизмов действия ганглиина яаляет-я активация клеток системы мпчонуклеврних фагоцитоз.

4. Ганглиин может быть использован в сельском хозяйстве как профилактический и лечебный препарат имиуномодулирухяцего действия.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ . эпидемиологии и микробиологии СО РАЩ (Владивосток, 1934).

Материалы диссертации доложены на Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1988), на конференции молодых ученых (Новосибирск, 1989), на Всесоюзной конференции "Идауномо-дуляторы природного происхождения" (Владивосток, 1990), на международном симпозиуме по клинической гипотермии, актива--ционной, иммуномодулирующей я радиосенсибилизирующей терапии рака (Владивосток, Ï992).

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных раоот.

Структура и объем работ». Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографии. Работа содержит 15 таблиц и 12 рисунков. Библиография включает 216 наименований источников литературы, из которых 105 на русском языке.

МАТЕРИНЫ И ffiîOiÇi ЙССЩОВАЧЩ

Эксперименты проведены на 1020. мышах линии СВА, 8Q0 мышах-гибридах Fj( СБА х C^BI), 516 мышах линии C57BI, 508 мышах линии В AI В/С, 2940 неинбредкых ышах, 64 морских, свинках, 180 . пятидневных цыплятах, 17427 норках (самки) и 87ZV1 нсркдг (t*o-лодняк).

Объектом экспериментального' исследования был ганглиин -пептид из оптических ганглиев промысловых кальмаров Тихого океан/ (А.Г. Говоруха, Т.А, Шлыгина, Б.Я. Сыропятов, 1987). Ганглиин представляет собой смесь пептадных .фракций (45) с различной молекулярной массой. Основная масса ганглника представлена пептидами с молекулярной массой от 1 до 12,5 кД. Ганглиин - порошок белого цвета, без запаха, хорошо растворимый в воде и новокаине.

Ганглиин получен на базе лаборатории биохимии сырья Тихоокеанского НИИ рыбного хозяйства и океанографии под руководит-

ом доктора биологических наук Л.М. ЭггатеЯна.

Иямуномодулирующее действие ганглиина изучали по осноп-им показателям первого уровня (Методические материалы по экс-ериментальному и клиническому испытанию иммуномолулируютцего ействия фармакологических средств, М., 1934).

При изучении противоинфекпионной активности исследуемого рспарата в качество экспериментальных моделей были использо-аны сальмонеллозная инфекция и генерализованная коли-шфенция. ффект ганглиина оценивали по проценту вшивших животных в пытных и контрольных группах.

Степень завершенности фагоцитоза в лейкоцитах крови морс-их свинок в отношении У. pseudotuberculosis , Рз , aeruginosa,

aureus,s. byphimuri.um после подкожного введения животным англиина, определяли в соответствии с методом В.М. Бермана и .И. Славской (1958).

Изучение влияния ганглиина на функциональную 6 тивность акрофагов проводили в 2-х гест-системах: in vitro и в сметаной тест-системе.

Монослойные культуры макрофагов морских свинок готовили о методу И. И. Брауде (1965) и инфицировали взвесью следующих икроорганизмон: У, pseudotuberculosis , Ps . aeruginosa • t

aureus , E. coli, S.-byphiaurltim в соотношении макрофаг-микрсб :I0. При этом в ^мешанной тест-системе ганглиин морским евин ям вводили подкожно наканунз взятия мякрофагов. В опытах in Ltro ганглиин вносили нопосредственно в культуру макрофагов.

Активности б'-пукяеотидазьг - фермента плазматической мемб-аны макрофагов - определяли по методу Диксон и Пурдом (1973) модификации H.A. Туманян и Г.Б, Кирилличевой (1907). Актив-ость фермента выражали в процентах относительно контроля, ко-орый принимался за 100 %.

Для оценки иммуномодулкруюцих свойств ганглиина изучали оличество антителообрззутацих клеток (ЛОК) в селезенках мышей 1 лужидкой среде модифицированным методом А. Сщтхпс'аад Г968), титры гемагглютининов в скворотке крови иммунизирован-их животных, интенсивность реакции гиперчувствительности за-эдленного типа (ГЗТ), индуцированную у милей эритрогитями бч-зня (Р.... Lar grange et al , 1974), интенсивность рсякпии рансплантат прот а хозгинз (РГПХ) методом количественной 1енки реакции в регионарна узлах при локальном введении аллс-

генных кле 'ок.

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, отряжающую бактерицидный потенциал клеток, оценивали в тесте восстановления китрзеинего тетраэолия (НСТ-тест) (Н.Е. Виксман, А.Н. Иаянский, 1979).

В экспериментах на пушных зверях использовали сочетание инъекций ганглиина с лазерным облучением и облучением инфракрасным светом. {^пользовался гелий-неоновый лазер (633 км) и прин-M .^»ино новый аппарат "Крик-ЗД-57", позволяющий получить ..юно-sju'v» *,<iicKoi нелазерное излучение (инфракрасный свет).

Ci'c гисгическую обработку результатов проводили метком ;<\ >,гц/10ин0П статистики, используя критерий достоверности Стъю-дента (И.П. Атмарин, A.A. Воробьев, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе мы изучали некоторые моменту перестройки реактивности организма животных в отпет на введение ганглиина.

Наиболее чувствительным из них является количество лейкоцитов в периферической крови (Х.Ф. Басс-Шадхан и соавт,, 1977). Б то же время изменение числа лейкоцитов, наблюдаемое после введения иммуностимуляторов, характеризует биологическую активность исследуемых препаратов. В »дспериментях по изучению лейкоцитарной реакции установлено» что степень увеличения количества лейкоцитов, а также временные гзрактеристики реакций варьируют в . зависимости от используемой дозы ганглиина. Подкожное введение ганглиина мышам вызывало 2-х-фазную реякцив: незначительную лейкопению, сменяющуюся че^еэ 4 часа выраженным лейкоцитозом. Лейхоцитог сохранялся в течение ¿4-30 часов, после чего показатели лейкоцитарной реакции постепенно снижались до контрольных цифр.

В отдельных опытах установлено, что внутрибряшинное введение ганглиина мышам приводит к накоплению клеточных элементов в брюшной полости. При этом увеличивается пак общее количество клеток (в 2-2,5 раза), так и содержание макрофагов (с 23 % до 57 %) и п ол имо рфн о ядерных лейкоцитов (с 6 % до 22 %).

Йлитаие ганглиина на сопротивляемость животных к экспериментальным инфекциям. Суммарный эффект, слагающийся из действия многочисленных факторов, определяющих зап-.иту индивидуума от воз-

будителя инфекции, выражается в цг'Лом ti списобчости организма противостоять развитию инфекционного процесса.

Ш" изучили влияние ганглиина на развитие лнтиинфекцу.он-ной резистентности на моделях срльмонеллезной и коли-инфекций. Установлено, что одьонратное парентеральное или интраназальное введение ганглиина в дозах 0,05-0,С05 мг/кг за с^гки до заражения создает высокую резистентность мшей к S • typhimurlum и 3 .enterittdl3 , сопровождающуюся защитой 67-8п % стимулированных животных на фоне гибели 100 % животных контрольной группы. Лротектнвчый оффект ганглиина отмечался также и при воспроизведении сальмонеллеза у пятидневных цыплят. Подкожное введение ганглиина в яозе 0,005 мг/кг защищало 50 % цыплят от смертельной инфекции, вызванной введением 8 . typhinuriua.

При генералиэ"ванной токсикоинфекции, вызванной введением мышам Е. coli , в дозах, обеспечивающих гибель животных в течение 1-2 дней, введение ганглиина приводило к выживанию 79 % аи-в отных.

Полученные результаты позволяют обосноэать возможность использования ганглиина в качестве средства профилактики и лечения инфекции на ранних зтчпях, когда специфический иммунитет eqe не достигает необходимого уровня.

В последующих экспериментах мы попытались подоги к расшифровке некргорых ь-еханизмон обеспечивающих индукцию неспецифи-ческсй резистентности изучаемым пептидом.

Влияние ганглиина на клето'гныа Фанторн неспецифической резистентности, Развитие инфекционного процесса во многом зависит от способности фагоцитирующих клеток захватывать И переваривать микроорганизмы. Особую важность фагоцитоз и необходимость его усиления приобретают при инфзкциончых процессах, вызываемых факультативными внутриклеточными паразитами, для которых фагоциты является местом их сохранения и преимущественного размножения. Н числу таких инфекций вносятся псевдотубеукугез я сальмонеллез (H.H. Беседнова, 1979, А.Ф. Блюгер и соавт., 1975). Имеются доказательства ведущей роли клеточного иммунитета и при стафилококковой игфекпии, возбудители которо" фагоцитируются, в основном, полиморфнопдернши лейкоцитами (A.A. Акатов и соавт. ,1980). Для полной элиминации названных возбудителей цз организма необходимо значительно активировр~"ь поглотительную и перевариваилцую активность и бантериртдиур-фун»«ции »¡1мро-и макрофагов. '

М

- а -

Фагоцитоз в полиыорфноядерянх лейкоцитах in vitro был изучен в экспериментах на морских свинках, получивших за I сутки до взятия крови исследуемый пептид. Фагоцитарная активность изучалась по отношению У. pseudotuberculosis , S.typhinorium, Ps. aeruginosa . Установлено, что во все исследуемые сроки (наблюдения велись до 21 дня) фагоцитарная активность нейтрофи-филов животных, получившх ганглиин, оставалась на значительно более высоком уровне по отношению ко всем исследуемым микроорганизмам, чем в контрольной.группе. При этом наиболее высоких значений достигали показатели фагоцитоза по отношению к У.раеийО' tubercul. и S. typhimuriwa (s 3-3,5 раза увеличилось число • клеток, участвующих в фагоцитозе, в 2,5-3 ряьа возросло количество микроорганизмов, поглощенных одним фагоцитом). Показатели завершенности фагоцитоза также во все сроки наблюдения в опыт ных группах превышали ати показатели в контроле. В случае исполь зования в опыте в качестве объекта фагоцитоза Ps. aeruginosa фагоцитоз.при введении ганглиина был завершенным в отличие от контрольной группы, где он носил ярко выраженный незавершенный характер.

Результаты этих экспериментов побудили нас изучить влияние ганглиина на уровень окислительно-восстановительных реакций ней-трофилов в тесте восстановления нитросинего тетразолия. Установлено, что у мышей, получивших ганглиин, индекс активацк. нейтро-филов в 14 раз превышал таковой у интектных животных.

■ Известно, что интенсивность реакции восстановления нитросинего тетразолия коррелирует с внутриклеточнш образованием перекиси водорода, которая вместе с йодом образует важную бактерицидную систему нейтрофильных фагоцитов (А,Н. Маянсиий, Д.Н. МаянскиЯ, 1983). Таким образом, НСТ-тест отражает итоговую реяк цию одной из ключевых ферментных систем, ответственных за цито-токсический потенциал клеток. В этой связи мы полагаем возможны сделать вывод о способности ганглиина стимулировать важнейший оффекторньш механизм нейтрофила, обеспечивающий бактерицидный потенциал клетки.

Как известно, важнейшая роль в осуществлении иммунологичес кого гомеостаза принадлежит макрофагам. Благодаря своей универсальности они выполняют многочисленный задачи в негпецифической противоинфекционной защите и в реакциях специфического иммунног ответа.

В последние? Года внимание исследователей привлек эктофер-«ент, локализующийся в плазматической мембране макрофагов -»'-нуклеотидаза - один из основных ферментов луринового катабо-1изма. Пуриновый обмен играет исключительно важную роль в рефляции метаболических процессов п клетке. Интерес к 5-нуклео-■идяэе обусловлен тем, что ятог фермент участвует в усвоении [уилеотидов, » энергетическом обеспечении клетки, является филологически важным регулятором метаболизм« циклического адено-шнмонофосфата. Считается, что 5-нухлеотидаЗа играет важную юль в восприятии клетками сигналов из окружающей среды (Г.Б. 'ириллкчева и еоавт., 1988). Продукт 5-нуклеотидазы - аденозин-| настоящее время рассматривают в качестве одного из основных егуляторов важнейших физиологических функций, в том числе им-унологическоЙ (Г.В. Кирилличева и соавт., 1988)

Вей вышеизложенное обусловило необходимость изучения актив-ости экто-5-нуклеотидазы в макрофагах перитонеальпго экссуда-а при действии ганглиина. Известно, что при введении различных ммуностимуляторов отмечается снижение активности этого фермен-я СГ.В. Кирилличева и соавт,, 1993). В связи с этим, И. Ь . агпоузТсу (1978), Р.Уап 3?иг№ (1982), ЯДПИааз (1982) пред-агапт снижение б-нуклеотвдазной активности в макрофагах рас-катрива-ч как один из характерных признаков их активации.

В наших экспериментах при подкожном введении ганглиина п-ам различных линий наблюдалось снижение ферментативной актиэ-ости Срие. I).

При внутрчвенном введения ганглиина шиам линий СВА и С§7В1 широком диапазоне доз снижение активности 5-нуклеотидазы от-эчаяось уже черей 5 минут после инъекции (до 38 ^ относительно энтроля).

В результате проведенных исследований установлено, что шглимн вызывает снижение уровня активности 5-нуклеотидазы и, гедоватеяьно, обладает выраженной иммуностимулирующей актив-зстью. Глубина и выраженность метаболических изменений зависят г исходного генетически детерминированного метаболического по-гнциала макрофагов.

В последние года установлена тесная взаимосвязь ькжду нейро-[докрш .ой и макрофагальной системами (Е./>. Корнева и соавт., 188). Обнаружено -уцествование взаимосвязи мо-дду уровнем актив-(сти 5-нуклеотиДазы макрофагов и уровнем гл'скоксртккоидных гор-

Рис. I. Динамика изменения актитости 5-нуклеотидазы при введении гонглиимя в дозе О,ОС® иг/кг мытам различных линяй,(в Ж к контролю). По ост абцисс - время наблюдения (в су?.), по осян ординат - уровень активности Е>-нуклеотидазы в %.

I - линия СБА; 2 - линия 3 - линия ВА1В/С; 4 - ятт Рт(Сс^В1х®1)« К - К0К1<.аЛ6.

- л -

покой в крови (Г.Б, Ниридличсм» и еоавт., 1991). 'Лшуномодули-ру»щее действие грепаратов на метаболический потенциал макрофагов, зависит от времени суток и определяется особенностями цир-«адиых ритмов в активности иммунной системы (Г.Б. Ииридлнчева и :оавт., 1992). Изменяя лишь внутрисуточный момент воздействия «охно полупить диаметрально противоположнчй аффект. В наших экспериментах ми показали, что введение ганглиина мышам различных пиний в утренние и вечерние часы приводило к противоположным 1 шун омодул и рующ и и эффектам (рис, 2).

Максимальные различия в характере изменения 5-нуклеотидаэной жтивности совпадали с моментами времени, когда, по литератур-1ны данным, наблюдаются наибольшие различия о уровне глюкокор-гикоадкых гормонов в крови (Г^. Кирилличевя и соавт., 1992), >пир»ясь на эти дадаы»можно предположить, что аффект, оказывае-дей ганглиином, связан о взаииодейотшем иммунной и нейрозндоя-жнной систем организма..

Зависимость действия ганглиина от суточных биологических штмо9 имцунной и .нейроэидокринксй систем увеличивает вероят-юсть значительной вариабельности иимуномодулируидего эффекта, Iплоть до разнонаправленного. Использование суточного аргменно-'о фактора открывает новые возможности направленного регулироза-1йя действия ганглиина на иммунологические процессы.

Установлено, что аажи<гйиим метаболическим звеном, определяю-|им характер действия нммуномодулятсров на клетки системы шно-уклеарннх фагоцитов, является пуринобый обмен, в частности, :ермент пуринового катаболизм* 5-нунпеотидаза (Г.Б. Киридяи«ева !•. соарт.,1990). Вовмсжт, одним иа механизмов действ к? гедглии-а является его влияние на пуриноенй обмен в макрофагах, которое ыеет. сложный, многогранный характер и опосредовано влиянием вн-огенньи тиуяорвгудяторных факторов (ионокинга, горюнов и др.).

Опираясь на денное о взаимосвязи метаболического потенциа-а макрофагов в функциональной активностью этих кл-ток и уров-ем естественной зап?иТы организма, мы провели изучение влияния англиина на эф$вк<горн«е Функции иакрофагоо.

Наиболее универсальным методом доя определеньл функциеналь-ой активности клетей спс&ш кононуклеарных фагоцитов является зучение активности фагоцитоза и последующей внутриклеточного ереваривания. Влияние гангаи-'на на фагоцитарную активность мак-

Рис. 2. Динамика изменения активности 5-нуклеотидазы макрофагов при введении ганглиина в утренние и вечерние часы. По осям абцисе - время наблюдения (час); по осям орди-нат-уровень активности 5-нуклеотидазы (в %). I - мши СБА; 2 - Оз7В1; 3 - Р3( СВА>:С^?В1); 4 - ВА1В/С. А - утренняя инъекция (800); В - вечерняя инъекция (20°°); К - контроль.

рофагов было изучено ПО отношению Ч У. ^seudotuberculuais .

S . typhimuriua Рз, aorucinoaa t . аигвиз , E. coli , На рис. 3 отображены показатели ф.гоцитоэь для 2- ; тест-микро5ов! У. paeudotuberculosisH 1*з. aeruginosa .

Показано, что однократное парентеральное введение ганглии-на морским свинкам за сутки до получения от них перитонеальных макрофагов значительно стимулирует поглотительную и переваривающую активность этих клеток. Так, в культуре макрофагов, зараженных взвесью У .pseudotuberculosis уже в течение I часа в фагоцитарную реакцию в опыте включилось в 2,5 раза больше макрофагой9 чем в контроле, а количество микроорганизмов, поглощенных о,цчим макрофагом в 3,5 раза превышало контрольные п~1казагели. Черьз б и 12 часов микроорганизмы в макрофагах контрольной группы активно размножались, и к 12 часам начало проявляться цитопатогенное действие бйктермй. В опытной группе уже через 6 час^/в наблюдались процессы интенсивного переваривания и очищения макрофагов от иерсиний.

Невысокая степень фагоцитар'ой активности макрофагов по отношению к Вз . аегиь'лоаав большой мере обусловлена наличием у этого микроорганизма разнообразных факторов па*лгенности, препятствующих фагоцитозу (полисахарид слизи, 0-антиген, экзотоксин А и др.)с Введение ганглиина усиливало поглощение микроорганизмов макро^йгами в 2,5 раза по сравнению с интактными клетками» среднее число бактерий, захваченных одним макрофагом в 4 раза гсревьшало контрольный показатель. Фаза переваривания Р3. aeru.~ ginosaB стимулированных макрофагах длилась 6-12 часов, в то »ремя как в интактных макрофагах число внчтрикяеточ^лс опганиз-40B увеличивалось л отмечалось разрушение клеток, то есть фаго-дитоз но^ил ярко выраженный .чезавошенный характер.

Динамика изменения фагоцитарной активности при введении ^англиина по отнсаенад к s . typii.murium , St. aureus и E. coli 5ыла сходной с вышеописанной.

Таким образом, оценивая полученные результаты, можно ска-¡ать, что ганглиин оказывает влияние на уровень активности »-нуклеотцгазы макрофагов -одного из ^акторов неспецифической юзистентности организма, приводит к увеличению количества кле->ок системы мононуклеарных фагоцитов и полиморфноядерных лейко-[итов и усилению их функциональной активности. Это может явлться редпосылкой для дальнейшего изучения возможности использования

■рис. 3. Влияние ГЕлглиина на функциональную активность шкрофагоп «орских сеток. Ло оси абциес - время после заражения .макрофагов (дасн);

цо оси ,ординат - слева -г пргоеят фагоцитируших клеток (зайтрихоавнные столбики - опнт; светлые стоябикн - контроль); справа - количеств о. Айкрооргянизиов^ гт отделенных одним-,макрофагом СД - .{Яшг;'.В'-«встрйяь), I - У. РЕеийоггЛегси!о«а.£ } Н - Й . аегидиюаа.

гпнглиин» для коррекции дефектов фагоцитоза при мнфекиипх, иипоиих фагоиитяряыЯ механизм эапктн*

Епяякие ганглиина на иммунные реакции гуморального и клеточного .типов. При Оценке иммуномодулкрующей активности ганглиина мы сочли необходимым изучить Некоторые еспекты вли.иия этого препарата на гуморальный и клеточной иммунитет.

Показано, что парентеральное введение ганглиина приводит к поцтетт титров антител в сыворотке хрори мышей (гемагглюти-нинов) в 2 раза по сравнению с контролем,

Исследи,1№в числя антмтелообрэзуших клеток (ДОЮ в селезенках мышей, иммунизированных тимуезависишм антигеном - эритроцитами бяряня, показало, что под действием ганглиина достоверно увеличивалось Содержание ДОК в селезенках (число АОК в плите в 3 раза превышало контрольные цифры).

Стимулирующее влияние гангдяИмя наблюдалось при его введении явки иидуктйвную, так и в продуктивную фазы' вг-'ителообра-зованн* (тебя. 1.).

Таблит Г.

Влияние ганглиина на число ДОК в селезенках мкоей

""руппа кивотнъгх Индуктивная фаза Продуктивная фаза

Аокшоб) ЙЭТоГ А0К(х1Й ЙГДШ

"англиин т * 54й* 65067 * 1136*" 331 ± 27*к 62775±2864*к 0,005 :мг/кг) (277 - '¿73) (214*7 - 37991) (255 - 407) (54756-70794) 'внгдиин 340 * 20** 64977 * 4909** 321 ± 36х 57642±8909* б мг/кг) (284 - 3%) (63602 - 66352) (220 422) (32697-72587)

онтроль Ш (х 1(Р) Абсолютное число А0К

171 ± 12 29719 ± 2954 (139 - 2С4) (21447 - 37991)

р О,05

Увеличение одсля АОК в селезенках мышей при введении ганглиина .чая в индуктивную, так и в продуктивную фазы антителоге-неза дает возможность предположить» что ганглиин может влиять на лвбые из процессов, протекающие в эти фазы! в индуктивный период - за способность макрофагов поглощать и перерабатывать антигон, представлять антигенную информацию Т-лимфоцитам, воз-действеь&ть на процессы пролиферации и дифференцировки популяции предшественников АОК. В продуктивный период образования антятег ганглиин может осуществлять свое действие на уровне зреаадс ачтитежнтролуцентов.

Возможно, что усиление иммунного ответа ганглиином _су-ществляется следующим образом: стимулированные макрофаги приводят Т-лим$оцищ в активное состояние посредством повышенной секреции монокинов, усиливающих юа^унный ответ. Среди них имеются факторы, стимулирующие пролиферацию лимфоцитов, регулирующие функци" лимфоидных клеток (например, интерлеЙкин-1). Действие других монокинов на лимфоичты может быть опосредованно через активацию сывороточных профакторов (И.С. Фрейдлин, 1984).

Активированные Т-лимфоциты, в свою очередь, секретируют лимфокины, которые запускают неспецифическую клеточную реакцию (А.Н. Маянский и соавт., 1983). Ряд лимфокинов регулирует функцию макрофагов, кооперацию Т- и В-лимфоцитов с макрофагами, способствует дифференциации В-клеток в плазматические (Б.В. Брондз и С1 1вт., 1980).

Адыорчнтше свойства гвнглиина могут быть использованы с целью усиления иммунного ответа при ргде инфекций, поскольку многие возбудители являйте? слабыми антигенами.

Действие ганглиина на клеточно-опосредованный иммунитет было изучено нами нч модели реакции гиперчувствительности за-медльнного типа, индуцированной у мышей СВА введением эритроцитов барана.

Показано, что при введении изучаемого препарата в разные сроки относительно сенсибилизирующей дозы антигена наблюдалась статистически достоверное усиление реакции ГЗТ (табл. 2).

Что касается механизмов влиянии ганглиина на интенсивность реакции ГЗТ, то они могут быть опосредован!." способностью пептида (или прямо, или опосредовано, через монокины) усиливать процессы пролиферации Т-лимфоцитов. Кроме того, механизм действия

-. -

Таблица ¿.

Влияние ганглиина на интенсивность реакции ГЗТ.

Срок введения

Процент прироста веса лапки

гакгл..ииа

ганглшш (0,005 мг/кг) контроль

Одновременно с сенсибилизирующей дозой

За сутки до сенсибилизирующей дозы

31,1 ± 4,7х 14,2 ± 1,9

(10,9 - 43,3) (9,3 - К,1)

49,3 ± 3,7** 19,4 ± ? 7

(39,7 - 58,9) (12,4 - 26,4)

Через сутки после с енсибилизирующей дозы

33,6 ± 2,1** 19,4 ± 2,7

(28,1 - 39,1) . (12,4 - 26,4)

«р ^ о,С* 0,01

ганглиина на реакцию ГЗТ может бить связан с секрецией активированной лимфонцтами фактора, угнетающего миграцию макрофагов (>,355). О-итается, что основной биологической фикцией М® является кониентрацип фе^оцитпрующих к/кток в участках внедрения антигенного материала и в регионарных лимфбтических узлах (И.С. Фрейдлян, 1984). Наряду с этим активированные макрофаги начинают выделять факторы, привлекают^ все новые порции монолитов и лимфоцитов в очаг воспаления.

Действие ганглиина на развитие реакции трансплантат против xob-SHrm (РТПХ) юучали по методу количественной оценки РТПХ в регионарных узлах при локальном введении яллогенных клеток. Полученные данные п£ка.-?зли, что ганглиин в Использованных дозах ( от 100 до 0,005 мг/кг) . введенный рециш ,'нтам наряду с клетками лимфот;:ческкх узлов мышей родительского генотипа, не приводил к изменению интенсивности РТПХ и не оказывал влияния на трансплантационный иммуни-i с г.

Перспектив» исяользовани. ганглтыа для профилактики и лечения заболевший путаных зверей. Для изучения перспектив использования ганглиина в качестве профилактического и лечебного сродства для животных нями был проведем ряд экспериментов ,

в зверосовхозах Приморского края. Эксперименты проводились с участием сотрудников зверосовхоза в течение 1992 года. В опыт были взяты самки норок (17137 голов) и молодняк (67207 голов).

Было установлено, что среди животных, получавших инъекции ганглиина, наблюдался значи'. льно меньший падеж (в 2-8 раз по сравнению с контрольными группами) (табл. 3..)

Аналогичные результату получены и при введении ганглиина молодняку норок. Следует отметить, что никаких побочных негативных явлений у норок не отмечалось. Вышеприведенные материалы подтверждены актом, подписанным главным ветеринарным врачом зверосовхоза "Силинский" и утвержденным его директором.

В настоящее время ряд зверосовхозов использует ганглиин в качестве проф.тактического средства.

В следующей серии экспериментов мы применили ганглим« в сочетании с лазерным облучением для лечения тяжелого бактериоза норок - некроза фаланг конечностей (некротический дерматит). Это заболевание вызываетсяС1.рег£г1пеепа в ассоциации с гемоли тическими штаммами кишечной палочки и золотистого стафилококка, характеризуется гнойно-некротическим процессом на лапах. Традиционный метод лечения - антибиотикотерапия - малоэффективен.

В опыт было взято 5 Групп больных животных. Животным I группы облучали поверхность раны и подкожно вводили ганглиин, 2 группе облучали область тимуса, поверхность раны и вьодили ганглиин, норкам 3 группы облучали область тимуса и также вводили ганглиин, животные 4 группы получали только инъекцию ганглиина, а 5 группа служила контролем (животные получали тради- ■ ционкую химиотерапию). Данные этих экспериментов отражены на рис. 4.

Установлено, что комбинированный метод лечения некроза конечностей норок является высокоэффективным, Обращает на себя Бншяаьие тот факт, что введение ганглиина приводило к улучшению состояния я полному выздоровлению части животных.

В следующей серии экспериментов вместо лазера исполь -.овали облучение поверхности раны инфракрасным светом (агпарат КРИК -ЕД-57). Лечению было подвергнуто 3 группы животных: животных I Группы лечили традиционньм методом, норкам 2 группы облучали инфракрасным светом раневую поверхность и вводили ганглиин, животные 3 группы получали только инъекцию ганглиина (рис. 5).

¿¿шлица о.

Падеж норок, получивших (опыт)и не получивших (контроль) инъекции ганплиина.

Режим введения 0 с н о ] в н ы е с а м к и

ганглиина а п р ель май я в н ь

■ Число Число 0, Число Число 1 я , Число Число %

обра- пав- П'ВШИХ норок обра- пав- павших норок обра- пав- павших норок

ботан- ших ботан- ших ботан- ших

ных живот- ных живот- ных живот-

норок ных норок ных норок ных

Однократно 2804 40 1,4 ± 0,2 2764 26 0,8 * 0,2я 2738 33 1,2 ± 0,2**

- " - 2889 16 0,6 ± ОД** 2873 23 0,7 ± ОД®1 2В50 .46 1,3 ± 0.2**

- " - 2836 18 0,6 ± 0,1ю6 2818 22 0,7 ± ОД** 2796 25 0,7 ± 0,2**

3186 9 0,2 ± 0,08** 3177 9 0,2 ± 0,08** 3145 32 1,0 ± 0,2**

3-х кратно с ин-

тервялом в 2

дня 2656 II 0,4 ± ОД«5 2645 9 0,4 ± ОД5® 2627 18 0,6 ± 0,2**

Контроль 2766 46 1.7 - 0,2 2720 45 1,6 - 0,2 2645 75 2.8 - 0.3

* - Р -г 0,05 ** - р -г 0,01

Рис. 4. Влияние ганглиина и его сочетанного действия с лазерным облучением на течение некроза конечностей норок (в %), I, 2, 3, 4, 5 - группы животных. Условные обозначения: ШШ - Излечивание, цщ процесс эпителизации раны, ~ сохранение процесса,

- гибель животного.

Рис. 5. Влияние ганглиина и его сметанного действия с инфракрасным облучением на течение некрот конечностей норок (в Й.

I, 3 - группы животных. Условные обозначения: ШШ - изле^лвание.

процесс зпителизрт'ии раны, [ | - сохран; :ие процесса.

Полученные данныэ свидетельствуют о том, что наиболее аффективно лечение животных ганглиином в сочетании с инфракрьс-

светом. Лечение только ганглиином значигел но увеличивает 1Исло выздоровевших животных, а также норок, у которых о г* е• ;я процесс заживлений ран, однако эффективность такого метода Iсчет,я была несколько ниже, чем метода сочетаннои терапии.

По-видимому, положительное слияние ганглиина свяоано с его юздействием на естественную резистентность организма игаотньа.

В настоящее время метод сочетанной терапии с успехом прикинется в зверосовхозах Приморского края.

Таким образом, ( оценивая влияние ганглиина на макрооргаг-даии южно заключить, что он обладает широким спектром биологической !ктивн0сти: оказывает влияние ьд уровьнь активности ¡э-нуклеоти-¿азы макрофагов, клеточные факторы неспецифической резистентности, а ть.уже стимулирует имьунный ответ гуморального и кле-очного шпов, повышает резистентность животных к эксперимент альным инфекциям, эффективен в качестве профилактического и ечебного средства для пушных зверей. Полученные данные свиде-ельствуют о возможности регуляции иммуногенеза и факторов не^ пеиифической резистентнгсти оргяниэад введением ганглиино и ткрывщот перспективы его использования в медицине в качестве ммуномодулятора.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ганглиим - новый пептид, выделенный из птических ганглиев кальмара, обладает высокой биологической ак-.< ¿несли-'-

2. Ганглиин оказывает защитное действие при эксперимен-. зльных бактериальных инфекциях, что открывает перспективы его :пользования.при различных инфекционных болезнях, а также для эвышения естественной резистентности организма..

3. Одтчии из основных механизмов действия глмгл.чина являет I усиление функциональной активности клеток системы мононук-:прных фагоцитов.

4. ГанглииН вызывает снижение уровня активности 5-нуклео-щазы - одного из. основных ферментов пурк,-ового катаболизма.

Б. С помощыо Ганглиина возможна коррекции дефектов фагоцита при инфекциях, вызванных «'.рзеийоЬи'ЪегеиЗ.оз.гз .Зй.аигеиз ,

E.coli , S . typhimuxiuia , Ps. aeruginosa, выражающаяся в количественных и качественных изменениях клеток системы мононук-леарных фагоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов.

6. Ганглиин оказывает влияние на гуморальный и клеточный иммунитет: увеличивает количество антителообразующих клеток в селезенке мышей, повышает титры гемагглютинино'в в сыворотке крови, снижает уровень анафилактической реакции у морских свинок, повышает интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа.

V, Применение ганглиина, а также гелий-неонового лазерного облучения и инфракрасного нелазерного излучения в сочетании с • этим пептидом, является эффективным средством для профилактики и лечения инфекционного заболевания норок - некроза конечностей норок. В настоящее время этот метод с успехом применяется в зверосовхозах Приморского края.

8. Иммуностимулирующая активность и биологические свойства ганглиина открывают перспективы для его использования в клиник», в качестве иммуномодулятора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сергиенко А.К., Беседнова H.H., Смолина Т.П. йлмуномо-дулирущее действие ганглиина.-//Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов .-Тезисы докладой Всесоюзного совещания,-Владивосток, 1988,-с. 67-68.

2. Крылова Н.В., Сергиенко А,К., Боровская Г.А., Эпштейн

Л.И, Противовоспалительная активность пептидов природного проис-хоздения.-//Иммуност кмулятори природного происхоздения.-Тезисы докладов совещания,-Владивосток, l990.-c.72.

3. Сергиенко А.К., Соловьева М.С., Кирилличева Г.Б., Боровская Г.А., Эпштейн Л.М. Действие ганглиина на активность

эктоферентов плазматической мембраны макрофагов. Т°м же, с. 73.

4. Беседнова H.H., Запорожец Т.С., Сергиенко А.К., Крылова Н.В., Эпштейн Л.М., Боровская Г.А. Иммуноактивный пептид, полученный из оптических ганглиев кальмара.-//Антибиотики и химиотерапия ,-1991,-№ 7,-с. 35-37.

5. Сергиенко А.К., Стаценко Н.И. Некоторые аспекты действия ганглиина - пептида из оптических ганглиев кальмара на систему мононуклеарных фагоцитов. -//В сб.научных работ молодых ученых РИИЭМ СО РАШ-Новосибирск, 1992,-с. 90-94.

6. Gagja A.K., Krashovsky S.V. How natural Mopolymers affect OTMpoiesis of irradiated animals. // The international symposium a clinical hyporth'jnria, activational, iramunomodulatine and radio-cnaibiliztng therapy of tumors, Vladivostok, Kussia, vj-26 neptem-or 1992 : Tha abstract boolc. - Vladivostok, 1992. - P.94.